Halvledar sekvensering för preimplantatorisk genetisk testning för aneuploidi

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här introducerar vi en halvledarsekvenserings metod för preimplantatorisk genetisk testning för aneuploidi (PGT-A) med fördelarna med kort handläggningstid, låg kostnad och högt dataflöde.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Gui, B., Zhang, Y., Liang, B., Kwok, Y. K. Y., Lui, W. T., Yeung, Q. S. Y., Kong, L., Xuan, L., Chung, J. P. W., Choy, K. W. Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy. J. Vis. Exp. (150), e59273, doi:10.3791/59273 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kromosomalt aneuploidi, en av de främsta orsakerna som leder till embryonal utveckling gripande, implantation misslyckande, eller graviditet förlust, har väl dokumenterade i mänskliga embryon. Preimplantatorisk genetisk testning för aneuploidi (PGT-A) är ett genetiskt test som avsevärt förbättrar reproduktiva resultat genom att detektera kromosomavvikelser hos embryon. Nästa generations sekvensering (NGS) ger en hög genomströmning och kostnadseffektiv metod för genetisk analys och har visat klinisk tillämplighet i PGT-A. Här presenterar vi en snabb och låg kostnad halvledare sekvensering-baserade ngs metod för screening av aneuploidi i embryon. Det första steget i arbetsflödet är hela arvsmassan amplifiering (WGA) av biopsier embryo prov, följt av byggandet av sekvenserings bibliotek, och efterföljande sekvensering på halvledar systemet sekvensering. Generellt, för ett PGT-A-program, kan 24 prover laddas och sekvenseras på varje chip genererar 60 − 80 miljoner läsningar vid en genomsnittlig Läs längd på 150 bas par. Metoden ger ett förfinat protokoll för att utföra mallförstärkning och berikning av sekvenserings bibliotek, vilket gör PGT-A-detekteringen reproducerbar, hög genomströmning, kostnadseffektiv och tidsbesparande. Körtiden för denna halvledare Sequencer är endast 2 − 4 timmar, förkorta handläggningstiden från att ta emot prover till utfärdande rapporter i 5 dagar. Alla dessa fördelar gör denna analys till en idealisk metod för att upptäcka kromosomala aneuploidies från embryon och därmed underlätta dess breda tillämpning i PGT-A.

Introduction

Att välja god kvalitet livskraftiga embryon med normala kromosom kopienummer (euploid) för överföring i assisterad befruktning bidrar till att förbättra graviditetsutfall. Traditionellt används det väletablerade morfologiska klassificeringssystemet allmänt för embryoutvärdering på grund av dess enkla tillgänglighet och icke-invasiv natur. Det har emellertid visats att morfologisk bedömning endast kan ge begränsad information om embryokvalitet1 och implantationspotential2. En grundläggande orsak är dess oförmåga att utvärdera den kromosomala sammansättningen av embryona.

Kromosomalt aneuploidi (onormal kopia antal kromosomer) är en av de viktigaste orsakerna som leder till embryonal utveckling gripande, implantation misslyckande eller graviditet förlust. Förekomsten av aneuploidi har dokumenterats väl i mänskliga embryon och står för 60% − 70% i klyvning-steg embryon3,4 och 50% − 60% i blastocyster5. Detta har till viss del bidragit till flaskhalsen för att förbättra graviditets frekvensen för in vitro-fertilisering (IVF) behandling, som har hållit på runt 35% − 40%6,7. Därför, att välja euploid embryon för överföring tros vara fördelaktigt för att förbättra graviditetsutfall. För detta ändamål har preimplantatorisk genetisk testning för aneuploidi (PGT-A) vidareutvecklats för att undersöka embryots lönsamhet med hjälp av genetiska metoder. Det finns ett ökande antal randomiserade kontrollerade studier och kohortstudier som stöder den avgörande roll som PGT-A. Det har bevisats att tillämpningen av PGT-A minskar missfall frekvensen och ökar den kliniska dräktighets frekvensen och implantations frekvensen8, pågående graviditetsfrekvens och levande födelse kurs9.

Historiskt har olika metoder tillämpats i PGT-A, såsom fluorescens in situ hybridisering (fisk), jämförande genomisk hybridisering (CGH), array-CGH och Single nukleotid polymorfism (SNP)-microarray. Tidigare studier har visat att PGT-A för embryon från klyvning av fisk ger resultat som är dåligt överensstämmande med de som erhålls genom omfattande kromosom screening (CCS) av motsvarande blastocyster med 59273array-CGH eller SNP-microarray5927310. Dessa avvikelser kan hänföras till kromosomala mosaicism, fisk tekniska artefakter, eller embryonal självkorrigering av kromosom segregering fel under utveckling11. Det har allmänt erkänt att använda blastocyststadiet trophectoderm (te) biopsier för Array-baserade PGT-A såsom array-CGH eller SNP-microarray är effektivt för att identifiera kromosomala obalansen i embryon10,12. Nyligen ger Single-cell nästa generations sekvensering (ngs) en hög genomströmning och kostnadseffektiv metod för genetisk analys och har visat klinisk tillämplighet i PGT-a13,14,15, vilket gör det till en lovande alternativ till för närvarande tillgängliga metoder.

Här presenterar vi en snabb, robust och låg kostnad halvledare sekvensering-baserade ngs metod för screening av aneuploidi i mänskliga embryon. Den första steg om arbetsflödet är helhet genom förstärkning (WGA) om biopsier embryo prov, användande en enkel-cell WGA utrustning, följde efter vid byggningen av sekvenseringen bibliotek, och följande sekvenseringen på det Semiconductor sekvenseringen system.

Genom att detektera de H+ -joner som släpps ut från varje deoxyribonucleosid-trifosfatinkorporering under DNA-strandsyntesen, överför systemet de kemiska signalerna (pH-förändring) som fångas upp av halvledar elementen till direkt digital data , som ytterligare tolkas i DNA-sekvensinformation. Eliminerar kravet på dyra optisk detektering och komplexa sekvensering reaktioner, denna enkla sekvensering kemi minskar totala reagenskostnaden och förkortar sekvenseringen körtid i 2 − 4 timmar16. Ännu viktigare, baserat på tillverkarens prestandaspecifikationer, kan halvledar sekvensering plattformen generera upp till 15 GB sekvenserings data (beror på kvaliteten på biblioteket) per körning, vilket är betydligt högre än några av de andra sequencers producera endast runt 3 − 4 GB data (med 2 x 75 BP Läs längd)17. I kliniska tillämpningar av PGT-A kan denna plattform uppnå 24 prover per chip genererar upp till 80 000 000 läsningar17 och minst 1 000 000 unika läsningar av varje prov. Läs djupet kan säkerställa att varje prov har minst 0,05 x hela genomtäckning. Ovanstående fördelar med denna plattform gör det till en idealisk screeningmetod och därmed underlätta dess breda tillämpningar i PGT-A18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etiskt godkännande beviljades av det gemensamma kinesiska universitetet i Hongkong ― nya territorier East Cluster klinisk forskning etikkommittén (referensnummer: 2010,432). Forsknings licensen godkändes av rådet för Human reproduktiv teknik i Hongkong (nr R3004).

1. helgenomamplifiering

  1. Innan start, Kontrollera volymen av magnetiska pärlor (tabell över material) för att säkerställa att det inte är mindre än 135 μl (med en 20% överskott) för varje prov. Förvara de magnetiska pärlorna i rumstemperatur (RT) i minst 30 min. Förbered 720 μL (med 20% överskott) på 70% etanol för varje prov. Utrusta en termisk apparat (bordlägga av material) med uppvärmt lock på 105 ° c.
    Anmärkning: den nyberedda 70% etanol (tabell över material) bör användas inom 3 dagar.
  2. Provberedning
    Anmärkning: i rutin praktiken biopsieras 5 till 10 trophectoderm-celler i blastocysten enligt praxis riktlinje19.
    1. Suspendera biopsier i 2 μL 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i ett enda 0,2 mL-polymeras-kedje reaktionsrör (PCR).
    2. Snurra snabbt röret på en minicentrifug för 3 s för att samla upp dropparna.
  3. Cell Lys och extraktion
    1. Tina cell extraktionsbufferten (tabell över material) och extraktionsenzymbufferten (tabell över material) på is, Vortex och snurra kort på en minicentrifug för 3 s före användning.
    2. Tillsätt 3 μL cell extrahering buffert till varje tub från steg 1.2.2.
    3. Förbered en 5 μL cell lysis Master Mix för varje prov genom att tillsätta 4,8 μL extraktion enzym utspädnings buffert och 0,2 μL cell utvinning enzym (tabell över material). Blanda väl och alikvot i varje tub från steg 1.3.2. Vänd röret försiktigt och snurra snabbt på en minicentrifug i 3 s.
      Anmärkning: tips bör inte röra vätskan som innehåller cellproverna när du lägger till Master Mix.
    4. Inkubera röret från steg 1.3.3 i termocyklaren med uppvärmt lock. Kör programmet med följande inställningar: 10 min vid 75 ° c, 4 min vid 95 ° c, håll vid 4 ° c.
  4. Ger
    1. Tina upp preamplifieringsbufferten (tabell över material) på is, Vortex och snurra kort på en minicentrifug för 3 s före användning.
    2. Förbered en Master Mix på 5 μL för varje prov genom att tillsätta 4,8 μL preamplifieringsbuffert och 0,2 μL preamplifieringsenzym (tabell över material). Blanda väl och alikvot i varje tub från steg 1.3.4. Vänd röret försiktigt och snurra snabbt på en minicentrifug i 3 s.
      Anmärkning: tips bör inte röra vätskan som innehåller DNA-proverna när du lägger till Master Mix.
    3. Inkubera röret i termocyklaren med uppvärmt lock. Kör programmet med flödande inställningar: 2 min vid 95 ° c; 12 cykler för 15 s vid 95 ° c, 50 s vid 15 ° c, 40 s vid 25 ° c, 30 s vid 35 ° c, 40 s vid 65 ° c, 40 s vid 75 ° c; Håll vid 4 ° c.
  5. Förstärkning
    1. Tina upp amplifieringsbufferten (tabell över material) på isen, Vortex och snurra kort på en minicentrifug för 3 s före användning.
    2. Bered en 60 μL förstärknings Master Mix för varje prov genom att tillsätta 25 μL amplifieringsbuffert, 0,8 μL amplifieringsenzym (tabell över material) och 34,2 μl nukleasfritt vatten för WGA (tabell över material). Blanda väl och alikvot i varje tub från steg 1.4.3. Vänd röret försiktigt och snurra snabbt på en minicentrifug i 3 s.
    3. Inkubera röret i termocyklaren med uppvärmt lock. Kör programmet med följande inställningar: 2 min vid 95 ° c; 14 cykler för 15 s vid 95 ° c, 1 min vid 65 ° c, 1 min vid 75 ° c; Håll vid 4 ° c.
  6. Rening av den som WGA-produkter
    1. Överför varje WGA-produkt från steg 1.5.3 till nya 1,5 mL-rör. Tillsätt 112,5 μL av de magnetiska pärlorna i varje tub. Vortex och inkubera vid RT i 5 min.
      Obs: blanda de magnetiska pärlorna helt före användning.
    2. Placera rören på ett magnetiskt stativ (tabell över material) i 3 min tills supernatanten är klar. Kassera alla supernatanten utan att störa pärlorna.
    3. Tillsätt 300 μL 70% etanol till varje tub. Rotera varje rör 180 ° för att låta pärlorna köra genom etanol och rotera tillbaka till den ursprungliga positionen. Kassera alla supernatanten efter att pärlorna har slagit sig utan att störa pärlorna. Upprepa detta steg en gång.
      Obs: Håll röret på magnet stativet medan du vrider röret horisontellt.
    4. Snurra snabbt varje tub på en mini-centrifug i 3 s. Placera rören på magnet stativet tills restsupernatanten är klar. Kassera alla kvarvarande supernatanten utan att störa pärlorna. Lufttorka pärlorna vid RT i cirka 3 minuter.
    5. Ta bort rören från magnet stativet och Omsuspendera de torkade pärlorna genom att tillsätta 35 μL låg Tris-EDTA (TE) buffert (tabell över material). Inkubera vid RT i 5 minuter.
    6. Placera rören på magnet stativet i 3 minuter tills supernatanten är klar. Överför alla supernatanten som innehåller eluerat DNA till nya 1,5 mL-rör utan att störa pärlorna.

2. kvalitetskontroll av WGA-produkterna

  1. Kvantifiera varje renad WGA-produkt från steg 1.6.6 med en fluorometeranalys (tabell över material) enligt tillverkarens manual med 1 μl WGA-produkt som utgångsmaterial.
    Anmärkning: den accepterade koncentrationen av WGA-produkten är ≥ 10 ng/μL. Alla produkter under denna tröskel rekommenderas inte att gå vidare till nästa steg.

3. fragmentering av WGA-produkter

  1. Innan start, värm en torr block värmare till 37 ° c. Bered 6 μL (med 20% överskott) av 0,5 M EDTA för varje prov. Baserat på koncentrationen, alikvot 300 ng av DNA från varje renad WGA-produkt i steg 1.6.6 till nya 0,2 mL PCR-rör och bringa volym till 16 μL med nukleasfritt vatten för varje tub.
  2. Fragmentering
    1. Förbered en blandning av 4 μL dubbelsträngad DNA (dsDNA)-fragmentering för varje prov genom att tillsätta 2 μL reaktionsbuffert för dsDNA-fragmentering (tabell över material) och 2 μl dsDNA-fragmenteringsenzymer (tabell över material). Blanda väl och alikvot i varje tub från steg 3,1. Vortex och snurra kort på en minicentrifug för 3 s. Inkubera rören i 25 min vid 37 ° c i en termisk apparat med uppvärmt lock.
    2. Tillsätt 5 μL av 0,5 M EDTA omedelbart till varje tub. Blanda väl genom vortexa och kort snurra på en mini centrifug för 3 s.
  3. Rening och resuspension
    1. Överför varje produkt från steg 3.2.2 till nya 1,5 mL-rör. Tillsätt 37,5 μL av de magnetiska pärlorna till varje tub. Blanda med vertexing och inkubera vid RT i 5 min.
    2. Rena produkterna enligt beskrivningen i steg 1.6.2 till steg 1.6.4.
    3. Eluera varje renad produkt enligt beskrivningen i steg 1.6.5 och 1.6.6 genom att tillsätta 32 μL låg-TE-buffert.

4. biblioteks konstruktion

  1. Blunt- e nd r epairment, storleksval och rening
    1. Förbered en 20 μL trubbig reparationsblandning för varje prov genom att tillsätta 9,5 μL av nukleasfritt vatten, 10 μL 5x reparations buffert (tabell över materialrör från steg 3.3.3. Vortex och snurra kort på en minicentrifug för 3 s.
    2. Tillsätt 50 μL av de magnetiska pärlorna till varje tub från steg 4.1.1. Vortex och inkubera vid RT i 5 min.
      Obs: blanda de magnetiska pärlorna helt före användning.
    3. Placera varje tub på magnet stativet i 3 minuter tills supernatanten är klar. Överför alla supernatanten till nya 1,5 mL-rör där 25 μL magnetiska pärlor tillsätts för varje. Vortexblanda rören med den överförda supernatanten och inkubera vid RT i 5 min.
    4. Renodla produkterna i de inkuberade rören enligt beskrivningen i steg 1.6.2 till steg 1.6.4.
    5. Eluera varje renad produkt enligt beskrivningen i steg 1.6.5 och 1.6.6 genom att tillsätta 32 μL låg-TE-buffert.
      Anmärkning: Detta är en säker stopp punkt; Det renade DNA från detta steg är stabilt vid 4 ° c i högst 24 timmar.
  2. Adaptern l navigerings och p urification
    1. Bered en 17 μL adapterligationsblandning för varje prov genom att tillsätta 10 μL nukleasfritt vatten, 5 μL 10X ligasbuffert (tabell över material), 1 μl P1-adapter (tabell över material) och 1 μl DNA Ligase (tabell över material). Blanda väl med vortexa för 5 s och snurra på en mini centrifug för 15 s, och alikvot i varje tub från steg 4.1.5.
    2. Tillsätt 1 μl av adaptrarna (tabell över material) till varje tub från steg 4.2.1 enligt prov bladet (tilläggsfil: prov blad för adapterligering). Vortex och snurra kort på en minicentrifug för 3 s. Inkubera rören vid RT (20 − 25 ° c) i 20 min.
    3. Tillsätt 75 μL av de magnetiska pärlorna till varje tub från steg 4.2.2. Blanda med vertexing och inkubera vid RT i 5 min. Sedan, rena produkter som beskrivs från steg 1.6.2 till steg 1.6.4.
    4. Eluera varje renad produkt enligt beskrivningen i steg 1.6.5 och 1.6.6 genom att tillsätta 15 μL låg-TE-buffert. Överför alla supernatanten som innehåller eluerat DNA till nya 0,2 mL 8-rörstrips.
      Anmärkning: Detta är en säker stopp punkt; Det renade DNA från detta steg är stabilt vid 4 ° c i högst 24 timmar.
  3. Amplifiering och rening
    1. Bered en 50 μL förstärknings Master Mix för varje prov genom att tillsätta 47,5 μL Super mix (tabell över material) och 2,5 μl primer mix (tabell över material). Blanda väl genom vortexa och kort snurra på en mini centrifug, och alikvot i 0,2 ml 8-rör remsor från steg 4.2.4.
    2. Vortex remsorna i 30 s och snurra kort på en minicentrifug för 3 s. Inkubera remsorna i termocyklaren med uppvärmt lock. Kör programmet med följande inställningar: 20 min vid 72 ° c; 5 min vid 95 ° c; 10 cykler för 15 s vid 95 ° c, 15 s vid 62 ° c, 1 min vid 70 ° c; 5 min vid 70 ° c; Håll vid 4 ° c.
    3. Överför varje produkt från steg 4.3.2 till nya 1,5 mL-rör. Tillsätt 97,5 μL av de magnetiska pärlorna till varje tub. Blanda med vortexa och inkubera vid RT i 5 min.
    4. Rena produkterna enligt beskrivningen i steg 1.6.2 till steg 1.6.4.
    5. Eluera varje renad produkt enligt beskrivningen i steg 1.6.5 och 1.6.6 genom att tillsätta 25 μL låg-TE-buffert.

5. kvalitetskontroll och utspädning av DNA-biblioteket

  1. Kvantifiera varje preparerade DNA-bibliotek från steg 4.3.5 genom fluorometeranalysen enligt tillverkarens bruksanvisning med hjälp av 2 μL DNA-bibliotek som utgångsmaterial.
  2. Den godkända koncentrationen av DNA-biblioteket är ≥ 0,5 ng/μL och den positiva kontrollen (tabell över material) är ≤ 15 ng/μl. Om koncentrationen av den positiva kontrollen varierar för mycket från 15 ng/μL, upprepa kvantifieringen av den positiva kontrollen tills koncentrationen är nära 15 ng/μL. Om bibliotekets koncentration är under 0,5 ng/μL, starta om från fragmentering (avsnitt 3).
    Observera: se till att koncentrationen av den positiva kontrollen når det accepterade värdet innan DNA-biblioteket kvantifieras.
  3. Späd varje bibliotek till 100 pmol genom att tillsätta Nuclease-fritt vatten. Tillsätt 1 μL av biblioteket till n μl nukleasfritt vatten. beräkna n med ekvationen nedan:
    Equation
    där Q är koncentrationen av varje bibliotek mätt med fluorometeranalysen och C är koncentrationen av den positiva kontroll som mäts genom fluorometeranalysen.

6. sekvensering

  1. Före start, Förbered 48 μL (med 20% överskott) av 1 M NaOH för varje prov och en nukleasfri 1,5 mL tub. Tina den Mastermix-PCR-bufferten (tabell över material) (2000 μl i volym) vid RT. ta med sfär partiklarna (tabell över material) till RT.
  2. Biblioteks sammanslagning
    1. Virvel varje utspädd bibliotek från steg 5,3 och kort snurra 4x på en mini centrifug för 3 s varje gång. Ta 5 μL av varje bibliotek för att pool i Nuclease-fria 1,5 mL röret. Vortex det blandade biblioteket och snurra kort på en mini centrifug för 3 s.
  3. Emulsion PCR med ett emulsionssystem
    1. Tillsätt 150 μL brytande lösning till 2 nya återvinnings rör (tabell över material). Installera de nya återställnings rören, återställningsroutern och förstärknings plattan.
    2. Blanda genom att invertera oljeflaskan (tabell över material) 3 gånger. Se till att både olje-och återvinnings lösningen (tabell över material) är minst 2/3 full.
    3. Vortex Master Mix PCR buffert för 30 s och kort snurra på en mini centrifug för 3 s. Vortex sfär partiklarna och det blandade biblioteket från steg 6.2.1 i 1 min och snurra kort på en minicentrifug för 3 s.
    4. Bered en 2400 μL ligeringsblandning genom att tillsätta 172 μL nukleasfritt vatten, 8 μL blandat bibliotek från steg 6.3.3, 120 μL Enzymblandning (tabell över material) och 100 μl av sfär partiklar till röret som innehåller en 2000 μl MASTERMIX PCR-buffert.
    5. Ställ in en pipett till 800 μL. Ladda ligationsblandningen från steg 6.3.4 till reaktions filtret (tabell över material) genom prov porten. Använd en 1000P-pipett för att lägga till 200 μL reaktions olja i reaktions filtret.
    6. Välj programmet Proton: ion PI Hi-Q OT2 200 kit, och välj sedan assisterad knappen för att säkerställa att enheten har ställts in korrekt genom att följa instruktionerna på bildskärmen. Klicka sedan på Nästa för att starta programmet.
  4. Berikning genom ett automatiskt anriknings system
    1. När emulsionspcr-programmet är slutfört klickar du på Nästaoch sedan på Final spin för att snurra i 10 minuter. Ta ut 2 återhämtning rören efter att ha klickat Öppna locket.
    2. Kassera supernatanten från de 2 återställnings rören tills 100 μL finns kvar i varje tub och märk därefter. Blanda lösningen väl och överför till ett nytt 1,5 mL-rör.
    3. Tillsätt 200 μL nukleasfritt vatten till varje återvinnings rör, tvätta genom att Pipettera upp och ner flera gånger och överför all lösning till 1,5 mL-röret i steg 6.4.2. Upprepa tvättsteget en gång.
    4. Tillsätt 200 μL nukleasfritt vatten till en av återvinnings rören och tvätta genom att Pipettera upp och ner flera gånger. Överför all lösning till det andra återvinnings röret och tvätta genom att Pipettera upp och ner flera gånger. Överför sedan all lösning till samma 1,5 mL-rör från steg 6.4.3. Vortex 1,5 mL-röret för 30 s och Centrifugera i 8 min vid 15 500 x g.
      Anmärkning: den slutliga totala volymen av emulsionspcr-produkten i detta steg bör vara cirka 1200 μL.
    5. Kassera supernatanten i röret och behåll 20 μL av emulsionspcr-produkten. Tillsätt 80 μL resuspension lösning (tabell över material) till röret. Blanda genom att Pipettera upp och ner.
    6. Förbered en 320 μL smält-off lösning för varje chip genom att lägga till 280 μL av polyetylenglykol sorbitan glycerolmonolauratdiacetat lösning (tabell över material) och 40 μl av 1 M NaOH.
      Anmärkning: 1 M NaOH ska förvaras vid 4 ° c eller nyberedd. Vortex före användning.
    7. Vortex röret innehåller C1 pärlor (tabell över material) för 30 s. Ta 100 μL C1-pärlor till ett nytt 1,5 mL-rör. Placera 1,5 mL-röret på det magnetiska stativet i 2 minuter vid RT. Kassera alla supernatanten efter att pärlorna har lösts utan att störa pärlorna.
    8. Tillsätt 1 mL tvättlösning C1 (tabell över material) till röret från steg 6.4.7. Vortex för 30 s. Placera röret på magnet stativet i 2 minuter vid RT. Kassera alla supernatanten efter att pärlorna har lösts utan att störa pärlorna. Omsuspendera pärlorna genom att tillsätta 130 μL pärla fångst lösning (tabell över material).
    9. Anriknings system (ES) installationsprogrammet
      1. Fyll på provet (100 μL emulsionspcr-produkt) från steg 6.4.5, de tvättade pärlorna (130 μL) från steg 6.4.8, ES-tvättlösning (300 μL) (tabell över material) och smält-off-lösning (300 μl) från steg 6.4.6 till 8-rörs remsan. Layoutordningen är: prov (tub 1), tvättade pärlor (tub 2), ES-tvättlösning (rör 3, 4, 5) och smält-off-lösning (tub 7). Håll rören 6 och 8 tomma.
      2. Placera 8-rörs remsan från steg 6.4.9.1 på ES. Installera en pipett spets och en ny 0,2 mL röret och starta programmet.
        Observera: Kontrollera att pipettering fungerar normalt.
    10. Tvätta sfär partiklarna efter att anrikningen har slutförts.
      1. Centrifugera 0,2 mL-röret från steg 6.4.9.2 i 5 min vid 15 500 x g. Kassera supernatanten och behåll 10 μL av anriknings medlet. Tillsätt 200 μL nukleasfritt vatten till röret. Blanda genom vortexing.
      2. Centrifugera 0,2 mL-röret från för 5 min vid 15 500 x g. Kassera supernatanten och behåll 10 μL av anriknings medlet. Tillsätt 90 μL nukleasfritt vatten till röret. Blanda genom vortexing.
  5. Förberedelse av mall
    1. Vortex den positiva kontrollen och snurra kort. Tillsätt 5 μL positiv kontroll till 100 μL-mallen (anriknings produkten från steg 6.4.10.2). Vortex och Centrifugera i 5 min vid 15 500 x g. Kassera supernatanten och behåll 10 μL av mallen.
    2. Tillsätt 20 μL sekvenserings primer (tabell över material) och 15 μl glödgningsbuffert (tabell över material) till mallröret från steg 6.5.1. Vortex röret och snurra kort på en mini centrifug för 3 s.
    3. Inkubera röret från steg 6.5.2 i termocyklaren med uppvärmt lock. Kör programmet med följande inställningar: 2 min vid 95 ° c, 2 min vid 37 ° c, håll vid 4 ° c.
    4. Tillsätt 10 μL lastbuffert (tabell över material) till röret från steg 6.5.3. Blanda genom att Pipettera upp och ner.
  6. Initiering av sekvenserare
    1. Kontrollera tanktrycket av kvävgas (totalt tryck ≥ 500 PSI, utgångstryck ≥ 10 PSI, optimal 20-30 psi). Top-up 100 mL avjoniserat vatten (18,2 MΩ) till C1 och C2 rör (tabell över material) och installera dem till motsvarande C1 och C2 positioner på sekvenseraren.
    2. Bered W1 (32 μL av 1 M NaOH) och W3 (40 − 50 mL av W3-buffert [tabell över material]) lösningar. Bered W2 lösning genom att tillsätta 1920 mL avjoniserat vatten (18,2 MΩ), en hel flaska W2-buffert (tabell över material) och 8 − 12 μl 1 M NaOH och Invertera 4 − 8 gånger för att blanda.
      Obs: eftersom vattenkvaliteten varierar geologiskt, justera volymen 1 M NaOH efter behov. Start pH för W2 är 5,9 − 6,1, och det optimala intervallet efter justering är 7,4 − 7,6. Ändra och installera nya reagensrör och använda nyligen används chip för tvättning.
    3. Förbered de 4 nya tomma rören från sekvenserings tillägg Kit (tabell över material). Märk de 4 rören som dGTP, dCTP, dATP och dTTP, och tillsätt 70 μL av dGTP, dCTP, dATP eller dTTP (tabell över material) till motsvarande rör (dvs. 70 μl dgtp till röret märkt som dgtp, etc.). Vortexblanda rören före användning. Installera rören till motsvarande positioner som anges på Sequencer (tabell över material).
  7. Chip Wash
    1. Tvätta spånan (tabell över material) en gång genom att injicera 100 μl isopropanol i Spånens lastbrunn. Avlägsna den utvisade vätskan från motsatt brunn.
    2. Tvätta chippet två gånger genom att injicera 100 μL av Nuclease-fritt vatten i inläsnings brunnen på chip. Avlägsna den utvisade vätskan från motsatt brunn.
    3. Tvätta chippet en gång genom att injicera 100 μL av 0,1 M NaOH in i lastbrunnen på chip. Avlägsna den utvisade vätskan från motsatt brunn. Inkubera vid RT i 1 min.
    4. Tvätta spånan en gång genom att injicera 100 μL nukleasfritt vatten i spånan. Avlägsna den utvisade vätskan från motsatt brunn.
    5. Tvätta chippet två gånger genom att injicera 100 μL isopropanol i inläsnings brunnen på spånan. Avlägsna den utvisade vätskan från motsatt brunn. Torka genom att blåsa kväve på spånan. Förvaras åtskilt från ljus.
  8. Prov lastning och sekvensering
    1. Blanda 55 μL prov från steg 6.5.4 genom att Pipettera upp och ner och lasta provet till lastbrunnen på spånan.
      Obs: Förvara pipettspetsen och 0,2 mL PCR-röret som används i detta steg.
    2. Placera chippet på chip mini centrifug (tabell över material) när du
    3. Bered två nya 1,5 mL-rör för glödgningsbuffert och spolningslösning. Bered 50% glödgning buffert genom att tillsätta 500 μl glödgningsbuffert och 500 μl av nukleasfritt vatten. Bered spollösningen genom att tillsätta 500 μL glödgningsbuffert och 500 μL 100% 2-propanol.
    4. Bered två nya 1,5 mL-rör och Förbered den skummande blandningen genom att blanda 49 μL av 50% glödgningsbuffert och 1 μL skum lösning (tabell över material) i båda rören.
    5. Ställ in en pipett till 100 μL. gör bubblor genom att Pipettera luft in i skummande blandningen från en av de två rören från steg 6.8.4. Gör > 120 μL av bubblorna och håll pipettering tills inga synliga bubblor kan ses. Ladda 120 μL av bubblorna i Last brunnen.
      Obs: se till att det inte finns några utestående synliga bubblor. Annars, börja den över.
    6. Överför den överdrivna utvisade vätskan från utloppet väl från steg 6.8.5 till laddnings brunnen genom pipettering. Pipettera inte bubblor. Centrifugera chip för 30 s på chip mini centrifug.
    7. Upprepa steg 6.8.5 genom att använda det andra röret som innehåller skum blandningen från steg 6.8.4.
    8. Tillsätt 55 μL av 50% glödgningsbufferten till 0,2 mL-röret som hålls i steg 6.8.1. Använd den hållna pipettspetsen i steg 6.8.1 för att Pipettera uppåt och nedåt. Ladda alla 55 μL glödgningsbuffert till last brunnen. Centrifugera chip för 30 s på den utsedda chip mini centrifug.
    9. Ladda 100 μL av spolnings lösningen i spånan och kassera den utvisade vätskan från utloppet väl. Upprepa det här inläsnings steget en gång.
      Obs: om det finns bubblor i chippet, utvisa små bubblor av stora bubblor och spola genom spolning lösning. Detta kan åstadkommas genom att Pipettera 100 μL spolningslösning och lämna 5 μL luft under spollösningen. Därför, när Pipettera 105 μL i chip, luft kommer att bilda en stor bubbla som kan utvisa de små bubblorna, och sedan, den stora bubblan kan drivas ut av följande spolning lösning.
    10. Fyll på 100 μL av 50% glödgningsbufferten i spåninlastningsbrunnen. Upprepa detta laddningssteg för totalt 3 gånger.
    11. Tillsätt 6 μL av sekvenserings enzymet i 60 μL av 50% glödgningsbufferten till ett nytt 1,5 mL-rör. Blanda genom att Pipettera upp och ner. Ladda 65 μL av denna blandade lösning i spånlastningen väl. Pipettera långsamt för att undvika skumbildning.
    12. Håll spånan borta från ljus och inkubera vid RT i 5 minuter.
    13. Efter inkubationen, omedelbart ladda chip på Sequencer och klicka på Starta sekvensering köras på skärmen för att starta sekvensering.
      Anmärkning: sekvensering rådata och filer för kvalitetskontroll kommer att överföras automatiskt till företaget för dataanalys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Baserat på detta modifierade protokoll var plattformen för halvledar sekvensering för första gången tillämpad för PGT-A. Vi testade på biopsier från både klyvning Stadium blastomerer och blastocyst-stadiet embryon. Det föreslås att de biopsier cellerna genomgå WGA så snart som möjligt för att förhindra någon nedbrytning av DNA. En tidigare studie jämförde prestandan hos olika WGA-metoder och indikerade att den metod vi beskrev här hade den bästa likformigheten vid papperskorgen på 100 KB20. Med tanke på prestandan hos både enhetlighet och median absolut Pairwise skillnad (MAPD)21valdes denna WGA-metod för PGT-A med hjälp av halvledar sekvenatorn. Genom en retrospektiv statistisk analys på 186 klyvning skede och 1135 blastocyststadiet embryon, konstaterade vi att WGA framgång priser var 95,4% i biopsi prover och 96,9% i blastocyststadiet prover (figur 1). Reningssteget före biblioteks konstruktionen som ett urvalsförfarande var avgörande för att sekvensera kvalitet genom att fånga stora DNA-fragment. Dessutom underlättade det input beloppet för 300 ng för biblioteks konstruktion. Den enzymatiska fragmenteringsmetoden möjliggjorde en effektiv klippning av WGA-produkter till cirka 160 BP.

Data analys utfördes med hjälp av Euclidean distans och cirkulär binär segmentering (EDCBS) analyssystem. In-House validering utfördes för att utvärdera robustheten i denna bioinformatiska algoritm. Vi etablerade en referensdatabas exklusivt för PGT-A genom sekvensering 379 WGA produkter från 66 cellinjer med kända karyotyper genom att analysera en bin storlek på 100 KB. I den här databasen anges ett referensintervall som tröskelvärde för CNV-anrop (Copy Number variant) och 10 MB har angetts som cutoff för identifieringsnivån. Både känslighet och specificitet nådde över 99% vid detta tröskelvärde (tabell 1). I ansökan om PGT-A på embryobiopsier var fönsterstorleken satt till 400 KB med en glidande fönster metod för att nå tillräckligt läsningar. Kvalitetskontroll (QC) av varje prov bestämdes av unika läsningar, MAPD och standardavvikelse av kopiera nummer variant (CNV ∙ SD). Exempel bortom ett av de tre indexen definierades som QC-fel (figur 2C). Tolkning av kromosom spridningsdiagram (figur 2A,B, D) utfördes av kvalificerade genetiker efter ett arbetsflöde genom att jämföra de identifierade CNV-databaserna med DECHIFFRERA, DGV eller Clingen. Enskilda avvikelser kontrollerades av ett expert förfarande för kurering. Kromosomala avvikelser grupperades i aneuploidi och mosaik i blastocystprover. En kopiera numrerar vinst eller förlust inom spänna av 30% − 70% klassificerades som bära mosaik kromosom sammansättning; annars skulle resultatet tolkas som antingen euploidy eller aneuploidy. I denna studie var euploid-satserna 45,2% i blastomerer och 52,3% i blastocyster, vilket upprepades på publicerade data22,23.

Figure 1
Figur 1: demografisk statistik om 1321 embryobiopsier som testats med denna metod. A) uppgifter från embryon från 186 klyvning-steg. B) Data från 1135 blastocyststadie-embryon. WGA framgång priser är över 95% i båda typerna av prover. Sekvensering av felfrekvenser för kvalitetskontroll är 3,4% i gruppen med Cleavage-steg och endast 1,9% i gruppen blastocyst-Stage. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representativa resultat av PGT-en klinisk tillämpning av embryot för 23 kromosomer. Representativa resultat av aeuploidi. B) aneuploidi (SEQ [GRCh37] (2) x3, (21) x3). (C) SEKVENSERING QC misslyckades prov på grund av CNV ∙ SD vid 0,6571 (acceptans ≤ 0,4); Dsegmentell mosaik borttagning (55%) på 4p 16,3 p 15,1 (29,50 MB). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tröskelvärde för CNV
(-0,23, 0,20) (-0,32, 0,26) (-0,41, 0,32) (-0,51, 0,37) (-0,62, 0,43) (-0,73, 0,48)
Känslighet 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 98,30% 96,02%
Specificitet 72,41% 81,03% 91,38% 99,10% 99,54% 100,00%

Tabell 1: känslighet och specificitet mellan olika log R-förhållanden av halvledar sekvenatorn. Sammanlagt 240 prover med kända euploid karyotyp resultat testades med denna metod och kallas vid olika log R nyckeltal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Skiljer sig från andra sekvensering kemiska sammansättningar, Sequencer beskrivs här använder halvledare för detektion av nukleotider. Chippet i sig är en elektronisk apparat som detekterar vätejoner genom Polymerase-driven bas inkorporering17, vilket möjliggör en 2 − 4 h sekvenserings tid för protonprogrammet. Dessutom chip är en mikrobrunn chip som gör lokalisering av en målmolekyl, som skiljer sig från flödet cell sekvensering kemi av andra Sequencer providers. Detta protokoll är ett modifierat protokoll som optimerats för tillämpning av PGT-A. Optimeringen omfattar fragmentering av förstärks DNA av enzymatisk metod i stället för ultraljudsbehandling för att minska risken för kontaminering samt storleksval och PCR-system för bättre prestanda med lägre kostnader. I den kliniska inställningen använde vi dessutom en verifierad egen pipeline för variantanrop.

Det finns kritiska steg att vara medveten om under praktiken. Etanol för rening måste vara nyberedd innan experimentet, som en hög koncentration av etanol skulle orsaka otillräcklig tvätta av förorenat DNA medan en låg koncentration skulle orsaka förlust av måldna. Fluorometern måste kalibreras av den positiva kontrollen med en känd koncentration för att säkerställa noggrannheten. Dessutom är en adekvat lastning av mallen avgörande för sekvensering. Bubblor av rätt storlek hjälper till att driva mallen sfär att falla i mikrobrunnar, men för stora bubblor kan orsaka otillräcklig lastning. Användare kan ändra antalet exempel (inte nödvändigtvis 24) för att sekvenseras för varje körning. Det finns 96 index avsedda för detta chip. Men sekvensering läsdjup kommer att minska med ökande prover per chip. Ett av de vanligaste problemen är låg biblioteks koncentration, som kan hänföras till en låg eller dålig kvalitet DNA-utgång från rening på grund av kvarvarande etanol eller magnetiska pärlor, eller sprickbildning av pärlor som tidigare nämnts. En suboptimala DNA-utgång kan också bero på låg verkningsgrad för PCR, som kan korrigeras genom försiktig beredning av Mastermixen med noggranna prov ingångar och temperaturkontroll av värmecyklarna. För sekvensering QC-misslyckade prover, såsom de med höga CNV ∙ SD-värden (figur 2C), det rekommenderas att köra proverna på en bioanalyzer för storleksfördelning analys.

En av begränsningarna med denna metod är dess högre falska single-nucleotide samtalsfrekvens jämfört med andra plattformar. Felprocenten är 1% jämfört med endast 0,1% indel falskt positiva ränta av andra sequencers17. Detta är dock inte en avgörande faktor för CNV-anrop eller PGT-A-analys. Jämfört med andra plattformar minimerar applicering av emulsionssystemet operativa avvikelser och pipettering av fel, vilket ökar biblioteks kvaliteten. Detta är en stor fördel med vår metod jämfört med andra plattformar eftersom dsDNA-koncentrationen är mycket låg och en korrekt kvantifiering krävs för följande biblioteks sammanslagning. Vår metod införde kalibrering av fluorometerkvantifiering med hjälp av en standard positiv kontroll för att kontrollera detekterings felet.

Som en hög genomströmnings plattform med kort handläggningstid är halvledar sekvenseraren idealisk för PGT-A och kan tillämpas i stor utsträckning på IVF-patienter med PGT-A kliniska indikationer såsom avancerad moderns ålder24. Deleye et al. genomförde parallell sekvensering av humana blastocyster för att jämföra prestandan hos halvledar sekvenatorn med andra sequencers25. Dessutom har detta PGT-ett kit fått "särskilda godkännandeförfarande för innovativa medicintekniska produkter" från China Food and Drug Administration och har kliniskt använts för tusentals embryon. I fråga om kostnad, priset på denna plattform är halva priset per Giga baser jämfört med en annan vanligt förekommande plattform i PGT-A marknaden. De trophectoderm cellerna kan pålitligt föreställa den genetiska konstitutionen av embryot26. Denna metod kan potentiellt utvecklas för PGT för monogena/Single gen sjukdomar (PGT-M) som Treff et al. har visat27. I sin modell, de underlättade 300 MB till 1 GB genomströmning på PGT-M av 16 embryobiopsier och jämförde resultaten med två konventionella PGT-M metoder. Genom att fånga och ladda 16 prover, deras metod nådde minst 100x Läs djupet i den riktade regionen och resulterade i 100% tillförlitlighet och reproducerbarhet27. Genomströmningen av halvledare Sequencer av vårt protokoll kan nå 15 GB och det finns 96 streckkoder konstruerade; Därför, om den tillämpas på riktade PGT-M, kan ett stort antal embryobiopsier sekvenseras av ett chip på ett högt läsdjup.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av den allmänna forskningsfonden (Ref nr 14162417) från Hong Kong, National Natural Science Foundation i Kina (Ref nr 81860272), den stora forskningsplanen för Provincial Science and Technology Foundation i Guangxi (Ref nr. AB16380219), och China postdoktorala stiftelsen Grant (Ref nr. 2018M630993) från Kina.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PCR tubes, 0.2 mL Axygen PCR-02D-C
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 ThermoFisher 15575020
PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free ThermoFisher 10010023
1.0 M NaOH (1.0N) solution SIGMA-ALDRICH S2567 For Melt-off solution. Molecular grade
Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL Fisher Scientific 13-698-791
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or
Equivalent 18 MΩ water system
ThermoFisher 4474524
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
PicoPLEX WGA Amplification buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Amplification enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion OneTouch Amplification Plate In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5
Ion PI Annealing Buffer
MyOne Beads Capture Solution
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939AA
Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) In kit: Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 ThermoFisher 65001
PicoPLEX WGA Cell extraction buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00.
PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion PI Chip Kit v3 ThermoFisher A26771
Ion Chip Minifuge, 230 V ThermoFisher 4479673
Ion PI dATP ThermoFisher A26772
Ion PI dCTP ThermoFisher A26772
Ion PI dGTP ThermoFisher A26772
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
ThermoQ–Temperature Dry Bath TAMAR HB-T2-A
NEBNext dsDNA Fragmentase New England Biolabs M0348L
NEBNext dsDNA Fragmentase New England Biolabs M0348L
Ion PI dTTP ThermoFisher A26772
Ion OneTouch 2 Instrument ThermoFisher INS1005527 ThermoFisher Catalog number: 4474778.
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Ion One Touch ES ThermoFisher 8441-22 ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5
Ethanol SIGMA-ALDRICH 51976 This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol.
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01.
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02.
Qubit 3.0 Fluorometer ThermoFisher Q33216 This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226.
Qubit ds DNA HS Assay kit ThermoFisher M2002-02
Qubit Assay Tubes ThermoFisher Q32856
Ion PI Foaming Solution ThermoFisher A26772
Index for barcoding of libraries BaseCare this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517)
Ion PI Loading Buffer ThermoFisher A26772
Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer ThermoFisher 4389764
Agencour AMPure XP Kit Beckman Coulter A63880
DynaMag-2 magnet (magnetic rack) ThermoFisher 12321D
Ion PI Master Mix PCR buffer
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Micro 17 75002430
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252
Nuclease-free water ThermoFisher AM9922 This can be replaced by other brand.
PicoPLEX WGA Nuclease-free water Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion OneTouch Oil bottle Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
double-strand DNA standard This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library.
PicoPLEX WGA Preamplification buffer Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Preamplification enzyme Rubicon Genomics R30050 This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Library Amplification Primer Mix ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
Ion OneTouch Reaction Filter Extended kit component in Sheet 5
Recovery Router Extended kit component in Sheet 5
Recovery Tubes Extended kit component in Sheet 5
ISP Resuspension Solution
Ion Proton ThermoFisher DA8600 This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610.
Ion PI Hi?Q Sequencing Polymerase ThermoFisher A26772
Ion PI Sequencing Primer
server for sequencer Lenovo T260
Ion PI Sphere Particles
Platinum PCR SuperMix High Fidelity ThermoFisher 4471252
Nalgene 25mm Syringe Filters ThermoFisher 724-2045 Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids.
Ion PI Hi?Q W2 Solution ThermoFisher A26772
Ion PI 1X W3 Solution ThermoFisher A26772
Ion OneTouch Wash Solution C1
The Ion PGM Hi?Q View Sequencing Kit ThermoFisher A30044 Extended kit component in Sheet 2
Ion Plus Fragment Library Kit ThermoFisher 4471252 Extended kit component in Sheet 3
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) ThermoFisher A26772 Extended kit component in Sheet 4
Ion PI Hi?Q OT2 200 Kit ThermoFisher A26434 Extended kit component in Sheet 5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balaban, B., Urman, B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reproductive BioMedicine Online. 12, (5), 608-615 (2006).
  2. Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: An observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29, (6), 1173-1181 (2014).
  3. Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. P. Chromosomal abnormalities in embryos. Molecular and Cellular Endocrinology. 183, 29-34 (2001).
  4. Trussler, J. L., Pickering, S. J., Ogilvie, C. M. Investigation of chromosomal imbalance in human embryos using comparative genomic hybridization. Reproductive BioMedicine Online. 8, (6), 701-711 (2004).
  5. Fragouli, E., et al. Cytogenetic analysis of human blastocysts with the use of FISH, CGH and aCGH: Scientific data and technical evaluation. Human Reproduction. 26, (2), 480-490 (2011).
  6. Calhaz-Jorge, C., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2013: Results generated from European registers by ESHRE. Human Reproduction. 32, (10), 1957-1973 (2017).
  7. Dyer, S., et al. International committee for monitoring assisted reproductive technologies world report: Assisted reproductive technology 2008, 2009 and 2010. Human Reproduction. 31, (7), 1588-1609 (2008).
  8. Dahdouh, E. M., Balayla, J., García-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: A meta-analysis. Fertility and Sterility. 104, (6), 1503-1512 (2015).
  9. Chen, M., Wei, S., Hu, J., Quan, S. Can Comprehensive Chromosome Screening Technology Improve IVF/ICSI Outcomes? A Meta-Analysis. PloS One. 10, (10), e0140779 (2015).
  10. Northrop, L. E., Treff, N. R., Levy, B., Scott, J. T. SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts. Molecular Human Reproduction. 16, (8), 590-600 (2010).
  11. Barbash-Hazan, S., et al. Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential. Fertility and Sterility. 92, (3), 890-896 (2009).
  12. Fragouli, E., et al. Comprehensive cytogenetic analysis of the human blastocyst stage. Fertility and Sterility. 90, (11), S36 (2008).
  13. Fiorentino, F., et al. Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos. Fertility and Sterility. 101, (5), 1375-1382 (2014).
  14. Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29, (12), 2802-2813 (2014).
  15. Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51, (8), 553-562 (2014).
  16. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, (1), 1-13 (2012).
  17. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17, (6), 333-351 (2016).
  18. Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35, (10), 938-944 (2015).
  19. Harton, G. L., et al. ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS). Human Reproduction. 26, (1), 41-46 (2011).
  20. Liu, W. Q., et al. The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32, (2), 1-8 (2018).
  21. Zhang, X., et al. The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection. Bioscience Reports. 37, (4), BSR20170252 (2017).
  22. Munné, S., Grifo, J., Wells, D. Mosaicism: “survival of the fittest” versus “no embryo left behind”. Fertility and Sterility. 105, (5), 1146-1149 (2016).
  23. Del Carmen Nogales, M., et al. Type of chromosome abnormality affects embryo morphology dynamics. Fertility and Sterility. 107, (1), 229-235 (2017).
  24. Harton, G. L., et al. ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD. Human Reproduction. 26, (1), 33-40 (2011).
  25. Deleye, L., et al. Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts. Fertility and Sterility. 104, (5), 1276-1285 (2015).
  26. Bielanska, M., Tan, S. L., Ao, A. Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome. Human Reproduction. 17, (2), Oxford, England. 413-419 (2002).
  27. Treff, N. R., et al. Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease. Fertility and Sterility. 99, (5), 1377-1384 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics