색도계 분석의 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동 S. 구 균 Biofilm에서

Bioengineering

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Summary

이 원고에서 우리 96-잘 조직 배양 플레이트에서 미 균 biofilm 문화에서 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동을 계량 하는 높은 처리량 방법 설립

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Danikowski, K. M., Cheng, T. Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm. J. Vis. Exp. (146), e59285, doi:10.3791/59285 (2019).

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Abstract

알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 간결한와 진 핵 세포에서 표현 하는 일반적인 효소 이다. 그것은 인산 염 monoesters 기본 pH에 많은 분자에서의 가수분해를 catalyzes 고 인산 대사에 필수적인 역할을 한다. 인간에서는, 진 핵 ALP cholestasis 구루병 등 다양 한 질병을 진단에 가장 자주 사용된 효소 신호 중 하나입니다. , ALP 세포 막;에 감지 되 그것은 또한 뿐만 아니라 분 비 양식으로 표현 된다. 그러나, 약간 biofilm 형성에서 기능에 대 한 알려져 있다.

이 원고의 목적은 단백질 격리를 필요로 하지 않는 미 균 biofilm에서 ALP 활동 측정을 신속 하 고 신뢰할 수 있는 분석 결과 개발 하는 것입니다. P-nitrophenyl 인산 염 (pNPP)를 사용 하 여 기판으로, 96-잘 조직 배양 배지에서 형성 된 미 균 biofilm에서 ALP 활동을 측정 했습니다. 활동은 405 nm 흡 광도 측정 성 반응 제품의 형성을 기반으로 합니다. 96 잘 조직 문화 접시 방법의 높은 처리량 자연 ALP 활동 분석에 대 한 과민 하 고 재현할 수 있는 방법을 제공합니다. 같은 실험 설정 또한 biofilm 형성에 관련 된 다른 세포 외 분자 마커 측정을 확장할 수 있습니다.

Introduction

알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산)는 모두 간결한 및 진 핵 세포1편 표현 됩니다. 그것은 다른 분자 뉴클레오티드, 단백질, 알 카 로이드, 인산 에스테 르, 인산의 anhydrides 등에서 monophosphate의 가수분해를 촉매 수 있습니다. 인간에서는, 진 핵 ALP는 간, 뼈, 내장과 태 반2를 포함 하 여 많은 조직에 존재. 그것은 단백질 인 산화, 세포 성장, apoptosis, 줄기 세포 프로세스 뿐만 아니라 정상적인 골격 강화에 중요 한 역할을 한다. 진 핵 ALP는 또한 뼈, 간, 그리고 다른 조직/장기 상승 하는 때에 질병의 존재에 대 한 주요 혈 청 지표3,4.

간결한 ALP 토양8에서 대장균5, S. 구 균6,7 및 몇 가지 일반적인 제일 위 박테리아 등 세균성 세포의 다양 한에서 검색 되었습니다. 세균성 ALP 활동은 농약, 중 금속9 및 세균 오염10의 검출 바이오 센서로 사용 되었습니다. ALP의 제정 식 포도 상 구 균11 을 식별 하 고 Serratia Enterobacter12에서 차별화 하는 데 사용 되었습니다. 그것은 추가 제정 ALP 생산 포도 상 구 균13pathogenicity와 상관은 좋습니다. ALP 다른 설정3,4, 공부는 비록 아직 약간 biofilms 문화에 그것의 기능과 활동에 대 한 보고 됩니다.

Biofilm는 그것의 자유 롭 살아있는 세균성 세포 대응14에 비해 다르게 작동 세균성 생활을 문서화 되었습니다. S. 구 균, biofilm의 형성 다양 한 임상 조건 및 항 생 저항 및 만성 염증15,16에 대 한 계정에서에서 확인 되었습니다. 많은 분자 등 다 당 류, 단백질, 핵 산, 지질, biofilm 매트릭스에서 찾을 수 보고 왔다 하지만 biofilm 형성의 메커니즘은 완전히 이해14. Biofilm 형성에서 ALP의 역할을 이해 하려면 우리 미 균 biofilms 96 잘 조직 배양 접시에 배양 하 고 파라-nitrophenylphosphate (pNPP)를 사용 하 여 높은 산 활동 측정.

분자 pNPP 높은 산에 대 한 준비-사용 기판 이며 ALP 활동6,,1718측정에 널리 사용 되었습니다. 이 색도계 분석 결과 파라 nitrophenyl 인산 염 (pNPP)의 변환에 파라-nitrophenol 405에서 색된 제품의 결과를 기반으로 nm. 와 같은 agarose 젤 전기 이동 법19, 밀 세균 agglutinin (WGA) 강 수, WGA HPLC20이 분석 결과 매우 구체적인 다른 기존의 ALP 분석 결과에 비해, 민감한, 쉽게 재현, 그리고 가장 중요 한 것은, 허용 높은 처리량입니다.

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Protocol

1. 매체 준비

  1. 1 L Tryptic 간장 국물 (TSB)의 준비:로 1 L 증류수, 카 제인, 콩 식사, 3 g의 염화 나트륨, 포도 당의 2.5 g와 dipotassium 인산 염의 2.5 g의 papaic 다이제스트의 5 g의 췌 장 소화의 15 g 추가. 사용 하기 전에 소독.
  2. TSB, 1 리터에 한 천 15 g을 추가 하는 대 한 Tryptic 간장 Agar (TSA), 오토 클레이 브. 다음 그것은 실내 온도 아래로 멋진 보자. 그런 다음 페 트리 접시 (100 m m x 15 m m) 당 20 mL의 비율로 붓는 다.
  3. Biofilm 문화 매체: 압력가 TSB의 1 리터에 포도의 10 g를 추가. 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 여과 하 여 소독.

2. 96 잘 조직 배양 플레이트에서 미 균 Biofilm 형성

참고: S. 구 균 biofilm는 앞에서 설명한6,21으로 교양 이다.

  1. TSB의 10 mL에 TSA에서 S. 구 균 에의 한 개별 식민지를 접종 하 고 하룻밤 37 ° c.에 성장
  2. 1: 100 (v/v) 비율로 TSB/포도 당 (10 g/L)의 10 mL에 숙박 문화를 희석. 일관 된 농도 대 한 혼합을 부드럽게 소용돌이.
  3. 한 96 잘 접시에서 18 우물 (실험 그룹, ALP 활동6관계 제안 비 biofilm 컨트롤에 대 한 더 많은)의 총에 희석 문화의 200 mL를 전송. 세 쌍둥이 사용 하 여 각 시간 포인트: 0 분, 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 및 75 분. 3.2 단계를 참조 하십시오.
  4. Biofilm 형성6,2124 h에 대 한 37 ° C에 96 잘 접시를 품 어.
  5. 열망 하 여는 상쾌한을 가만히 따르다.
  6. 각 씻어 잘 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS, pH 7.4) x 1, 15000 x g 에 5 분 동안 원심과 포부에 의해는 상쾌한 가만히 따르다.

3. S. 구 균 Biofilm에서 ALP 활동의 측정

참고: ALP 활동 설명된6,18로 측정 되었다.

  1. 버퍼링 된 ALP 기판 단계 2.6에서에서 각 잘 상용 pNPP의 구성의 75 mL를 추가 하 고 시간 기록을 시작 합니다. 3 중에 각 시간 포인트를 기록 합니다.
  2. 다양 한 시간에 대 한 부 화 후: 0 분 (제어), 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 및 75 분 각각 75 µ L 반응을 중지를 5 M NaOH의 추가.
  3. 15000 x g에 5 분 동안 접시 원심
  4. 색도계 측정을 위한 새로운 96 잘 접시에 상쾌한의 100 µ L를 전송 합니다.
  5. 각각의 흡 광도 측정 405 nm를 사용 하 여에서 잘 한 96 잘 접시 리더. 0 분 시간을 사용 하 여 405 nm 배경 잡음에 대 한 제어를 우물을 가리킨.
  6. 3 개별 96 잘 접시에서 전체 실험을 반복 합니다.

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Representative Results

그림 1 96 잘 조직 배양 플레이트에서 미 균 의 biofilm 문화에서 ALP 활동의 대표적인 결과 보여 줍니다. 상업적으로 사용 가능한 pNPP 솔루션의 75 μ 각각 잘 하 고 실 온에서 incubated에 추가 되었습니다. 서로 다른 시간에 대 한 부 화 후 (0 분, 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 및 75 분, 각각) 75 μ 5 M NaOH의 반응을 중지에 추가 되었습니다. 제품은 다음 405에서 96 잘 접시 리더에서 측정 되었다 nm. 각 시간 점에 단일 96 잘 접시에서 세 쌍둥이에 반복 되었다 그리고 전체 실험 3 개별 96 잘 접시에 반복 되었다.

Figure 1
그림 1: S. 구 균 biofilm 문화 다른 시간 (0 분, 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 75 분)에 대 한 pNPP 기판으로 incubated 했다와 그들의 ALP 활동 405에서 측정 했다 nm. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

우리의 분석 결과 우리 ALP 기판으로 pNPP를 사용합니다. ELISA를 위한 작업 솔루션 이며 아무 희석이 필요 하다. 높은 산에 의해 가수분해, 후 노란색 제품 개발 하 고 405에서 측정 될 수 있다 nm. 효소 반응의 끝에, 우리는 간단히 96 잘 접시를 centrifuged 하 고 신선한 96 잘 접시 플레이트 리더를 사용 하 여 흡 광도 측정 하는 상쾌한 전송. 우리는이 여분의 원심 분리 단계는 중요 한, 일관성 405에서 흡 광도의 증가 때문에 발견 nm, 아마도 효소 반응 동안 발생 가능한 정지 셀을 제거 하 여.

Biofilm 형성에 대 한 우리 보고6,21로 숙박 문화에 대 한 1: 100 (v/v) 희석의 200 μ 사용합니다. 이것은 다른 희석 (데이터 표시 되지 않음)에 비해 biofilm 형성 S. 구 균 에 대 한 최적의 희석 이다. 이 문서의 목적은 biofilm에서 ALP 활동을 측정 하는, 이후 중요 한 우리가 최적의 biofilm 문화 상태를 유지 했다. 이것은 최적의 biofilm 성장610 g/L에서 포도 당을 사용 하 여 선택에 의해 더 강조 된다. 희석 비율과 포도 당 농도 다른 세균성 세포 biofilm 형성을 위해 사용 하는 경우 최적화가 필요 합니다.

PNPP 기판 biofilm 문화권의 부 화, 동안 컬러 제품 개발을 위한 시간이 소요 됩니다. 우리는 15 30 분 시간 포인트 때 보이는 노란색 색상 관찰 후 ALP 활동을 측정. 현재 농도와 우리 최대 75 분에 대 한 활동을 증가 ALP를 발견 하는 그림 1에 표시 된 대로. 75 분 후 알프 활동의 증가 관찰 되었다.

마지막으로, 이후 S. 구 균 에서 ALP는 독점적으로 막 단백질7, 그것의 활동은 세포 세포의 용 해 하지 않고 테스트할 수 있습니다. 전체 세포 파괴를 요구 하지 않는 효소 활동 분석 결과에 대 한 혜택을 확인 하 고 있습니다. 특히, 단백질 격리 프로세스 때로는 낮은 활성 효소 수량22를 얻을 수 있습니다. 그러나,이 프로토콜 ALP의 막 바인딩 폼에 없는 경우 사용할 수 없습니다.

이전에 보고 된6, ALP 활동은 플라톤 대응에 비해 biofilm 문화에서 상승 된. 현재 연구에 사용 된 실험 설정 S. 구 균 biofilm에서 ALP 활동에 영향을 주는 요인/화합물을 조사 하기 위해 확장할 수 있습니다. 이러한 연구 결과 세균의 biofilm 형성을 제어 하는 방법에 대 한 추가적인 통찰력을 제공할 것입니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는 이러한 실험을 실시 시설에 대 한 시카고에 일리노이의 대학 윌리엄 Rainey Harper 대학 감사. 우리는 또한 그들의 관대 한 지원에 대 한 맥 그로 힐 재단을 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar VWR 9002-18-0
Eppendorf Centrifuge Thomas Scientific 5810
Gluose VWR 50-99-7
NaOH pellets VWR SS0550-500GR
Para-nitrophenylphosphate (pNPP)  Sigma P7998-100ML Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature.
10x PBS, pH7.4.
173 mM NaCl,
2.7 mM KCl,
8 mM Na2HPO4,
2 mM KH2PO4
Sigma P3288-1VL
Plate Reader Biotek ELx808
S. aureus ATCC ATCC25923
Tryptic Soy Agar       15 g/L TSB VWR 9002-18-0
Tryptic Soy Broth:      g/L
Pancreatic Digest of Casein............ 15.0
Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00
Sodium chloride.............................. 3.00
Dextrose........................................  2.50
Dipotassium phosphate..................2.50
VWR 90006-098
96 well tissue culture plates BD 6902D09 U shaped bottom

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References

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