A membrana Chorioalantoica Chick in vivo modelo para avaliar invasão perineural em câncer de cabeça e pescoço

Medicine
 

Summary

A invasão perineural é um phenotype agressivo para carcinomas de pilha Squamous da cabeça e da garganta e outros tumores. O modelo de membrana corioalantoica de pintinho tem sido usado para estudar angiogênese, invasão de câncer e metástase. Aqui nós demonstramos como este modelo pode ser utilizado para avaliar a invasão perineural in vivo.

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Schmitd, L. B., Liu, M., Scanlon, C. S., Banerjee, R., D’Silva, N. J. The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. J. Vis. Exp. (148), e59296, doi:10.3791/59296 (2019).

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Abstract

A invasão perineural é um phenotype em que o cancro circunda ou invade os nervos. É associado com o resultado clínico pobre para a carcinoma de pilha Squamous da cabeça e da garganta e os outros cancros. Estudos mecanísticos mostraram que a conversa cruzada molecular entre nervos e células tumorais ocorre antes da interação física. Há somente alguns modelos in vivo para estudar a invasão perineural, especialmente para investigar a progressão adiantada, antes que as interações físicas do nervo-tumor ocorram. O modelo de membrana corioalantoica do pintinho tem sido usado para estudar a invasão do câncer, pois a membrana basal do epitélio coriônico imita a do tecido epitelial humano. Aqui nós reaproveitado o modelo da membrana do chorioalantoic do pintainho para investigar a invasão perineural, o gânglio dorsal da raiz do rato da transplantação e a cabeça humana e as pilhas de carcinoma de pilha Squamous da garganta no epitélio coriónico. Demonstramos como esse modelo pode ser útil para avaliar a capacidade das células cancerosas de invadir o tecido neural in vivo.

Introduction

A invasão perineural (PNI) é um fenótipo subestudado no câncer, que está associado com alta recorrência da doença e baixa sobrevida em pacientes com carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço (HNC)1. PNI é definido microscopicamente como pilhas do tumor dentro ou que cercam os nervos2,3. Quando a PNI é detectada, é provável que os pacientes recebam terapias adjuvantes, como dissecção de pescoço eletiva e/ou radioterapia4,5. No entanto, essas terapias são agressivas e não específicas de PNI. Na verdade, não há terapia para bloquear a PNI, principalmente porque os mecanismos subjacentes às interações nervo-tumor ainda são pouco compreendidos.

Os mecanismos moleculars diferentes foram implicados na atração do nervo-tumor; tumores e células estromais liberam neuropeptídeos e fatores de crescimento para promover a neuritogênese6,7. Quando cultivadas juntas in vitro, as células HNC e os gânglios da raiz dorsal (DRG) têm uma resposta robusta; efeitos na invasão de células tumorais e neuritogênese podem ser observados após alguns dias nacultura 6,8,9. Entretanto, há uma falta de modelos in vivo apropriados para recapitular interações tumor-nervosas antes da invasão. Aqui nós apresentamos um modelo in vivo de PNI para estudar interações precoces entre células HNC e nervos6. Nós adaptamos o modelo da membrana corioalantoica do pintainho (CAM) para incluir um componente neural, transplantar um DRG no CAM, seguido por um enxerto de células cancerosas para imitar um microambiente inervado do tumor.

O modelo CAM tem sido utilizado com sucesso para avaliar a invasão de células através da membrana basal, imitando estágios invasivos precoces de carcinomas e melanoma10,11,12. O CAM é compreendido do epitélio coriónico superior, do mesenchyme de intervenção, e do epitélio alantoic mais baixo. O epitélio coriônico é estruturalmente semelhante ao epitélio humano10,13 em que a membrana basal colágeno-IV-rica simula a membrana basal que separa o epitélio oral do tecido conjuntivo subjacente. Desde que os primeiros enxertos tumorais foram realizados no Cam em 191314, muitas adaptações do método foram desenvolvidas para permitir a avaliação da angiogênese15,16,17, progressão tumoral e metástase18. Importante, a técnica de enxertia tumores no CAM mudou muito pouco, mas as aplicações estão evoluindo continuamente. Foram publicados ensaios de complexidade crescente, incluindo a triagem de medicamentos19, engenharia de tecidos ósseos20e medicamentos anticâncer baseados em nanopartículas21.

Nosso laboratório usa um modelo CAM-DRG no qual um DRG de mamíferos é isolado e enxertado na superfície do CAM superior. Depois que o DRG se torna incorporado no CAM, as pilhas de HNC são enxertadas perto do DRG e permitidas interagir com o DRG antes que o sistema in vivo inteiro esteja colhido e analisado. Importante, o sistema permite a observação visual ex-vivo do DRG e do tumor pela rotulagem da fluorescência de DRG e de pilhas do tumor. Este protocolo compreende múltiplos passos com diferentes níveis de complexidade realizados no prazo de 17 dias, desde a incubação dos ovos até a colheita do CAM (Figura 1). Células que expressam diferentes proteínas de interesse podem ser testadas neste modelo para elucidar as vias moleculares responsáveis pela invasão nervosa no câncer, e também para a triagem de drogas para direcionar diretamente a invasão neural. As células pré-tratadas com um fármaco candidato podem ser enxertadas no CAM e a ocorrência de PNI investigada em comparação com os controles não tratados. De fato, o modelo CAM tem sido utilizado para triagem de fármacos como um passo intermediário entre estudos in vitro e ensaios pré-clínicos in vivo em roedores19.

O delineamento experimental variará com a hipótese. Por exemplo, se testando o papel de uma proteína específica em PNI, o grupo experimental incluiria DRG enxertado com as pilhas do tumor que superexpressam a proteína, quando o grupo de controle deve incluir DRG com as pilhas transfected estàvel com vetor vazio. Diversos projetos experimentais diferentes podem ser usados para endereçar perguntas específicas.

Protocol

Declaração de ética: todos os experimentos que usam ratos neste protocolo são feitos de acordo com as regras do IACUC (Comitê institucional de cuidado animal e uso) da nossa instituição. Experimentos com ovos neste estudo estão isentos do Regulamento IACUC.

1. incubação do ovo (tempo estimado: 5 min, dia zero)

  1. Obtenha ovos comerciais de Lohmann White Leghorn sem patógenos, preferencialmente no primeiro dia de pós-fertilização. Incubar seis ovos por grupo experimental em uma incubadora de umidificação de ovos a 38 ° c e 54% de umidade por 8 dias com rotação horária. Use a rotação regular dos ovos para impedir o embrião de furar às membranas do ovo.
    Nota: antes da incubação, mantenha os ovos em um refrigerador de 18 ° c para travar o desenvolvimento do embrião por um máximo de 1 semana.

2. colheita e preparação de DRGs (tempo estimado: 2 h, dia 8)

Nota: experimentos com camundongos e ratos necessitam de aprovação do (IACUC). Em alguns países, o uso de ovos de frango também requer aprovação.

  1. Obtenha seis a sete ratos Sprague Dawley de uma semana de idade (~ 200 g em peso) para extrair DRGs.
    Nota: um rato deve render ~ 40 DRGs cervicais e torácicos. mouse DRG também se integra no CAM, no entanto, as condições para esta espécie precisa ser otimizado de forma independente.
  2. Em um armário do fluxo laminar, DRGs da colheita das regiões cervicais e torácicas que seguem o protocolo para a extração do rato DRG publicou em outra parte22. Siga a Figura 2 para obter orientação sobre como colher DRGs.
    1. Eutanizar o rato por punção cardíaca após a administração de cetamina/xilazina injetada intraperitonealmente. Limpe a pele de rato com 70% de etanol e retire a espinha de rato usando uma tesoura. Não realize luxação cervical porque isso danificaria os DRGs cervicais.
    2. Separar as regiões cervical, torácica e lombar com a mesma tesoura, seguindo a representação anatômica esquemática e as imagens brutas fornecidas na Figura 2a-D. Coloc as seções da espinha em um prato da cultura de 10 cm com 1X PBS para manter os tecidos molhados.
    3. Com uma tesoura óssea delicada, abra os ossos vertebrais nos aspectos dorsal e ventral, separando a coluna vertebral em duas metades laterais (Figura 2e-F).  Coloque as seções de tecido em um prato limpo de 10 cm com 1X PBS fresco.
    4. Usando fórceps, retire suavemente a medula espinhal dos ossos vertebrais para visualizar os DRGs (Figura 2G).
    5. Com o fórceps fino prendido abaixo de cada DRG, agarre-o e puxe-o para fora da cavidade do osso em que é alojado. Não segure o DRG diretamente porque isso causará dano tecidual. Não aparar os feixes de AXON do DRG (Figura 2h).
      Nota: Evite usar DRGs lombares desde que estes reduziram a integração no CAM. Para a localização da região DRG, siga a ilustração esquemática e as imagens anatômicas brutas na Figura 2a-D.
  3. Imediatamente após a colheita, coloque cada DRG em meio de cultura DMEM suplementado com 2% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep) e 10% de soro fetal bovino inativado por calor (FBS) para ajudar a prevenir a contaminação bacteriana dos DRGs. Agrupe todos os DRGs nos mesmos 6 cm prato de cultura com 4 mL de meio de cultura.
  4. Após a colheita de todos os DRGs, transferi-los para um novo prato de cultura com meio de cultura DMEM suplementado com 2% Pen/Strep mais 10% FBS e contendo 1,25 μg/mL de corante fluorescente vermelho. Incubar por 1 h na incubadora da cultura de pilha. Durante este tempo, prepare os ovos para receber o DRG como descrito abaixo (passo 3).
    Nota: o intervalo entre os DRGs de colheita e a conclusão da rotulagem de fluorescência deve ser suficiente para preparar os ovos; Os DRGs podem ser mantidos por algumas horas na incubadora.

3. preparação de ovos para enxerto de DRG (tempo estimado: 1 h para uma dúzia de ovos, dia 8)

  1. Em um armário do fluxo laminar, escurecer a luz e transiluminar os ovos para verific para ver se há a viabilidade e a fase embrionário. Excluir ovos com vasculatura pobre, ovos não fertilizados ou ovos não consistentes com o dia 8 pós-fertilização. Segure o ovo suavemente com o saco de ar que ocorre naturalmente em direção à fonte de luz (Figura 3a).
  2. Com um lápis, marque a casca do ovo para receber as aberturas (Figura 3a-B).
    1. Primeiro, identifique o apego do embrião em desenvolvimento ao CAM como um navio em movimento escuro anexado à membrana do ovo e marque esta área para evitar intervenções nesta região.
    2. Em segundo lugar, escolha a área de janela de funcionamento como uma área vascularized do poço pelo menos 2 cm do acessório do embrião e desenhe um círculo do diâmetro de 1,5 cm. Aproximadamente 1 cm da janela de funcionamento, desenhe um quadrado de 0,5 cm em uma área menos vascularized.
    3. Em terceiro lugar, desenhe a região do saco de ar para excluí-la da área de operação. Marque o meio do saco de ar com uma cruz.
  3. Com uma ferramenta rotativa e broca de gravura, 3 mm de diâmetro, perfurar o escudo do ovo no quadrado marcado (Figura 3C). Use o fórceps sem corte para remover o escudo do ovo without remover a membrana exterior do escudo do ovo (a direita branca da membrana o escudo) (Figura 3D). Trabalhe com cuidado para evitar a perfuração acidental desta membrana.
  4. Usando a mesma broca que na etapa 3,3, faça uma perfuração pontual na Cruz marcada na área do saco de ar para permitir o fluxo de ar no ovo (Figura 3E). Tenha cuidado para não aplicar demasiada pressão ao ovo, para evitar quebrar ou danificá-lo.
  5. Coloque 30 μL de HBSS na abertura quadrada, sobre a membrana exterior intacta do escudo do ovo (Figura 3E). Com uma agulha de seringa de 30 G, faça uma perfuração pontual na membrana externa nesta área quadrada (Figura 3F).
  6. Coloque o ovo na fonte de luz para visualizar o saco de ar. Aplique a pressão a um bulbo de borracha do conta-gotas e coloc o na perfuração pequena feita na área do saco de ar (etapa 3,4). Solte a pressão no bulbo até ver a separação das duas membranas na área de janela operacional (Figura 3G); Repita esta etapa quantas vezes você precisa de conseguir a separação completa das membranas na área da janela de funcionamento.
  7. Repita os passos 3.1-3.6 para todos os ovos.
  8. Usando a mesma broca como na etapa 3,3, perfure a janela de funcionamento circular que tem cuidado para não romper a membrana exterior do escudo do ovo (Figura 3h). Limpe a superfície do ovo delicadamente furando uma fita adesiva para remover todas as partículas frouxas.
  9. Com fórceps sem corte, retire a casca do ovo da área perfurada (Figura 3I-J). Em seguida, com o mesmo fórceps, retire a membrana exterior do escudo do ovo (Figura 3K), sendo cuidadoso não introduzir partículas pequenas da casca dentro do ovo para minimizar a contaminação.
  10. Identifique o came aproximadamente em uma profundidade de 1 cm da superfície do ovo. Cubra cada ovo aberto temporariamente com a membrana da cera de parafina para evitar a contaminação (Figura 3L).
  11. Repita os passos 3.8-3.10 para todos os ovos. Coloc os ovos para trás na incubadora do ovo sem rotação até que os DRGs estejam prontos para transplantar.

4. enxertia DRG no CAM (tempo estimado: 40 min, dia 8)

  1. Prepare um prato de cultura de 6 cm com meio HBSS, para lavar os DRGs antes da implantação. Traga os ovos preparados para o gabinete de fluxo laminar de cultura celular. Retire a membrana de parafina do ovo (figura 4a).
  2. Com fórceps estéril fino, segure delicadamente um DRG de dentro do meio de cultura. Mergulhe-o no meio HBSS para remover o meio em excesso que contém o corante fluorescente. Segure o DRG muito suavemente; caso contrário, ele vai ficar com o fórceps.
  3. Coloque o DRG no CAM, tendo cuidado para não perfurar a membrana (Figura 4B-C). Se necessário, use outro par de fórceps para ajudar a separar o DRG da ponta da pinça ao colocá-lo no CAM.
    Nota: manter o DRG molhado com o meio HBSS também facilitará o descolamento do fórceps.
  4. Cubra o ovo com um curativo de filme transparente estéril. Cubra todas as janelas e furos feitos na casca do ovo para evitar a contaminação bacteriana (Figura 4D).
  5. Após a enxertia de DRGs em todos os ovos, incubar os ovos em uma incubadora de umidificação a 38 ° c e 54% de umidade por 2 dias, sem rotação.

5. enxertia células tumorais no CAM (tempo estimado: 1 h 30 min, dia 10)

  1. Em 48 h antes de enxertar as células, placa as células necessárias em placas de cultura. Calcule 0,5 para 1 x 106 células por ovo para células de um-SCC-1, a fim de gerar tumores tridimensionais no Cam. Esteja ciente de que o número da célula pode variar por linha celular.
  2. Aspirar meio e adicionar meio de cultura DMEM suplementado com 1% Pen/Strep mais 10% FBS e 2,5 μg/mL de corante fluorescente verde. Incubar por 1 h a 37 ° c na incubadora da cultura celular. Em seguida, verifique a intensidade de fluorescência no microscópio, aspirado médio, lave uma vez com 1X PBS e adicione 0,25% de tripsina por até 10 min. neutralize a tripsina com meio suplementado com DMEM.
  3. Centrifugue a 250 x g durante 4 min para formar um pellet de células. Aspirar DMEM médio e re-suspender em HBSS para lavar o excesso de corante fluorescente. Contagem de células usando um Hemocytometer.
  4. Traga os ovos para o gabinete de fluxo laminar de cultura celular. Com tesouras e fórceps, abra o curativo de filme transparente que cobre o ovo (Figura 4E-F).
  5. Centrifugue novamente o número calculado de células, Aspire o meio HBSS e Resuspenda a uma concentração final de 0,5 a 1x106 células por 5 μl do mesmo meio (Figura 4G). Prepare a quantidade necessária para o número total de ovos (5 μL de suspensão celular por ovo).
  6. Coloque 5 μL de solução celular no CAM, cerca de 2 mm do DRG (Figura 4h). Mantenha distâncias uniformes entre o DRG e as células. Tenha muito cuidado para não perturbar o ovo para minimizar a propagação das células.
    Nota: para iniciar a implantação da célula, escolha os ovos nos quais a superfície CAM está visualmente seca. Se a superfície está muito molhada, as células podem se espalhar e não formam tumores regulares.
  7. Cubra o ovo com um novo curativo de filme como na etapa 4,4. Enxertar as células em todos os ovos. Incubar os ovos em uma incubadora de umidificação a 38 ° c e 54% de umidade por 7 dias, sem rotação.

6. colhendo a came (tempo estimado: 1 h para dúzia de ovos, dia 17)

  1. Prepare 6 placas de poço com 4% de PFA (paraformaldeído) pH 7,0, um poço por ovo, 2 mL por poço.
  2. Traga os ovos para um banco de laboratório. Usando uma agulha acoplada a uma seringa para perfurar o curativo de filme, solte cerca de 300 μL de PFA sobre o CAM para enduçar ligeiramente o CAM, facilitando assim o processo de colheita. Repita isso para todos os ovos.
  3. Com uma tesoura, retire a metade superior da casca do ovo (onde a janela de funcionamento está localizada) com o CAM anexado a ele (Figura 4I). Reduza o tamanho desta metade para aproximadamente 3 cm de diâmetro, mantendo a porção do CAM onde as células DRG e tumorais foram enxertadas no centro (Figura 4J). Segure o CAM com fórceps fino e retire-o do escudo do ovo ao coloc o no PFA. Oriente o DRG e as células cancerosas voltadas para cima (Figura 4K-L).
    Nota: a área de 3 cm deve incluir o DRG e as células. O DRG é facilmente visto como um pequeno nódulo anexado no CAM, no entanto as células tumorais são às vezes difíceis de identificar no exame bruto.
  4. Alternativamente, com uma tesoura, alargar a janela de funcionamento removendo a casca de ovo do topo do ovo, mantendo o CAM no lugar; Remova aproximadamente 1 cm para além da janela de funcionamento (Figura 4m) e identifique o DRG e as células no CAM (Figura 4n-o). Com fórceps fino delicado, segure o CAM em uma das bordas e levante-a delicadamente. Com tesouras delicadas afiadas, corte delicadamente o came para remover uma área circular, aproximadamente 3 cm no diâmetro (Figura 4P), e coloc o Cam em PFA com DRG e as pilhas de cancro que enfrentam para cima.
    Nota: Evite esticar ou segurar o CAM com fórceps em vários locais para minimizar os danos nos tecidos que podem gerar artefatos de microscopia.
  5. Coloque cada membrana CAM em um poço (Figura 4L). Segure suavemente as bordas do CAM para espalhar o tecido aberto no PFA ou agitar suavemente a placa até que o CAM é desdobrado, para evitar dobrar artefatos.
  6. Eutanizar o embrião (dia 17) por decapitação rápida. Fixar os tecidos colhidos na PFA durante 4 h à temperatura ambiente. Após a fixação, substitua PFA por 1X PBS e armazene os tecidos em PBS a 4 ° c até a incorporação em parafina para corte. Evite a sobrefixação que danificará a vasculatura delicada do CAM.
  7. Usando um stereomicroscope da fluorescência, fotografe as membranas no prazo de 2 dias após a colheita para evitar sinais fluorescentes de perda.

Representative Results

Quando otimizado, este método tem perto 100% DRG integração no CAM. Os resultados representativos da integração do DRG são mostrados na Figura 5a-B. A integração da DRG no CAM é importante, pois fornece viabilidade ao tecido DRG durante o experimento. Microscopically, o DRG é visto dentro do tecido conexivo do came (mancha de H & E). Os vasos sanguíneos são freqüentemente vistos dentro do tecido DRG, sugerindo que o suprimento sanguíneo CAM é Nutrir o tecido enxertado. Tumores implantados também são identificados no CAM por H & E; dependendo de quanta invasão está presente, os tumores podem apresentar-se com nenhum a numerosas ilhas tumorais invadindo o tecido conjuntivo (Figura 5C-D). O representante Figura 5E-F mostra a came colhida na imagem latente do brightfield e na fluorescência fundida. Células UM-SCC-1 que superexpressam o receptor de galanin 2 apresentaram maior invasão do DRG em comparação às células controle (Figura 5g-H). A interação câncer-DRG é observada como células cancerosas que apresentam invasão direcional em direção ao DRG (Figura 5h).

A análise dos dados é realizada de maneiras diferentes. A invasão direcional das células cancerosas em direção ao DRG é observada como uma variável dicotômica e o número de ovos que apresentam esse padrão de invasão é contado em cada grupo. As diferenças estatísticas entre os grupos são calculadas por meio de um teste binomial de proporções. A proximidade entre as células cancerosas e a DRG e a área tumoral são medidas utilizando-se o ImageJ6 e as diferenças entre os grupos são avaliadas pelo teste t de Student. Para assegurar a exatidão com análise de ImageJ, todas as imagens do mesmo experimento devem ser tomadas em ajustes iguais da luz e da exposição. Depois de ajustar o limiar da imagem e o brilho de todas as imagens usando os mesmos critérios, a ferramenta analisar partículas é usada para medir a área tumoral e a ferramenta de medição linear mede as distâncias tumoral-DRG. É importante usar a configuração constante do tamanho das partículas analisadas para todas as imagens em diferentes grupos. Em alguns casos, os tumores crescem mais grossos e podem ser medidos manualmente com um compasso de calibre digital, permitindo uma medida do volume.

Usando seções de parafina-encaixou o tecido da came, a mancha de H & E ou immunohistochemistry para pilhas epithelial (anticorpo do anti-Cytokeratin reactivo para a espécie humana) pode ser executado, permitindo a avaliação da invasão dentro do tecido conexivo. A invasão é quantificada como o número de ilhas tumorais no tecido conjuntivo por ovo. A imunofluorescência para o colagénio IV pode ser usada para destacar a membrana do porão. Também, se usando células cancerosas GFP-etiquetadas, a identificação destas pilhas nas seções do tecido é facilitada sem um immunohistochemistry para o Cytokeratin. A análise da metástase e da angiogénese em experiências da came é discutida em outra parte10,17.

Figure 1
Figura 1: cronograma do experimento, incluindo os principais passos nos dias 0, 8, 10 e 17. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: extração de DRG no dia 8 . A. rato esquemático ilustrando a localização anatômica da coluna vertebral. B. diagrama da configuração das vértebras de ratos mostrando diferentes regiões do corpo; verde para cervical, azul escuro para torácico, laranja para lombar e azul claro para vértebras sacrais. C-D. Aspecto ventral da espinha de rato após excisão cirúrgica; separação das regiões como ilustrado em B. E. dissecção das vértebras para abrir o canal da medula espinhal, separando os corpos vertebrais em duas seções laterais contendo os DRGs. a seção deve cortar o aspecto dorsal e ventral de cada osso vertebral na linha média. F. aspecto bruto da espinha torácica aberta. G. depois que a medula espinal é deslocada, os DRGs são facilmente visíveis nos canais vertebrais (cabeças de seta que apontam 3 DRGs). Imagem de H. stereomicroscopic de um DRG (seta) com os pacotes correspondentes do AXON (cabeça da seta). Barras da escala: C, D, F, e G, 1 cm; H, 1 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: preparação dos ovos no dia 8. A-B. Identificação de vasculatura do ovo e marcações antes do procedimento. Setas em um ponto ao saco de ar de ocorrência natural. C-D. Perfuração e abertura do escudo do ovo na marca de abertura quadrada. A seta em D aponta à membrana exterior intacta do escudo do ovo após ter removido o escudo com a ajuda de fórceps sem corte. E. a Cruz marcada no saco de ar é perfurada com a broca para permitir o fluxo de ar no ovo (cabeça da seta). 30 μL de meio HBSS é colocado na membrana exterior do escudo do ovo na abertura quadrada. F. com uma agulha fina da seringa, a membrana exterior do escudo do ovo é perfurada onde o HBSS foi coloc previamente. G. pressure é aplicado a um bulbo conta-gotas de borracha ao anexá-lo à perfuração perfurou no saco de ar. Quando a pressão do dedo é liberada, o ar é aspirado, gerando um saco de ar artificial (setas brancas) que devem estender à janela de funcionamento. H. as bordas da janela de funcionamento são perfuradas em uma posição quase paralela ao escudo do ovo, para evitar a perfuração acidental. I-J. Remoção do escudo do ovo com fórceps sem corte. K. Retire a membrana exterior do escudo do ovo com fórceps sem corte, sendo cuidadoso não introduzir as partículas no CAM (observado em ̴1 cm abaixo da superfície). L. Eggs são cobertos temporariamente com uma membrana da cera de parafina e põr para trás na incubadora. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: enxertia de DRG, células e colheita de Cam: no dia 8: a. CAM facilmente observado após a remoção da membrana de cera de parafina. B-C. Com fórceps fino, DRG é coloc no CAM. D. Egg é coberto com a película que veste e põr na incubadora; as setas apontam para as aberturas que são cobertas. No dia 10: E-F. O curativo de filme é removido e o DRG está localizado (cabeça de seta em F). G-H. 5 μL da solução da pilha são deixados cair no CAM a uma distância de ~ 2 milímetros do DRG. No dia 17: I-L e M-P demonstram duas abordagens diferentes usadas para colher o Cam. I. o escudo do ovo é aberto com uma tesoura fina que começa no saco de ar perfurou a perfuração até que a metade superior do ovo esteja removida. J. o escudo do ovo que contem o Cam é reduzido no tamanho a aproximadamente 3 cm. K-L. Com fórceps fino, CAM é destacado do escudo do ovo e coloc em PFA. M-O. O alargamento da janela de funcionamento é executado para visualizar o DRG e as células cancerosas no CAM. A ponta de seta aponta para o tumor e aponta para o DRG. P. a came é agarrada com fórceps fino, cortado com uma tesoura afiada, e coloc em PFA como mostrado em L. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: resultados representativos. A. H &Amp; E seção mostrando a integração do DRG no Cam. B. maior ampliação de A; as setas mostram os vasos sanguíneos CAM no DRG. Células C. um-SCC-1 ENXERTADAS no Cam e colhidas quatro dias após a enxertia (mancha de H & e). D. maior ampliação de C mostrando ilhas tumorais invasivas no tecido conjuntivo Cam (setas). E. imagem base bruta do Cam enxertada com pilhas de um-SCC-1-GALR2 e DRG do rato, colhidas no dia 17. F. fusão de fluorescência e imagens brightfield destacando o DRG rotulado em vermelho e células cancerosas rotuladas em verde. G-H. A fluorescência estereomicroscópica do CAM enxertada com DRG e UM-SCC-1-GALR2 versus células de controle, ilustrando a invasão direcional de células de UM-SCC-1-GALR2 ao DRG (H). Barras de escala: A-D, 500 μm; E-H, 2 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Passo Problema Razão Solução
3.2.1 Incapaz de identificar o acessório do embrião. Posição de fixação é difícil de ver enquanto o ovo ainda está. Gire o ovo rapidamente para os lados para ser capaz de ver um longo navio anexado à membrana do ovo.
3,3 & 3,8 Perfuração da membrana exterior do escudo do ovo ao perfurar. Posicionamento incorreto da broca. Posicione a broca quase paralela à casca do ovo durante a perfuração. Se a membrana é perfurada na etapa 3,3, não há nenhuma necessidade de executar uma perfuração mais adicional com a agulha como indicada na etapa 3,5. Se o sangramento acontecer, descarte o ovo.
4,3 DRG adere ao fórceps. DRG está seco. DRG molhado novamente em HBSS e/ou usar uma agulha fina para ajudar a separar DRG de fórceps.
5,2 As células não são perfeitamente rotuladas com corante fluorescente. Tempo de incubação. Algumas células exigem mais tempo para rotular. Mantenha as células por uma hora adicional na mídia com corante fluorescente.
5,6 Bolha de ar na gota da pilha. Usando todo o fluido na ponta da pipeta. Carregar 1 μl mais do que o volume pretendido e não utilizar o μL final da pipeta ao implantar as células. Isto evitará bolhas de ar na mistura das pilhas.
6,3 Não é possível identificar DRG ou células ao colher o CAM. DRG pequeno, DRG foi deslocado, células cancerosas espalhadas. Se o DRG não é visto, colha uma área maior do CAM e coloc em um recipiente maior para a fixação. Verifique DRG e posição da célula fluorescência em um microscópio estéreo e, em seguida, aparar o CAM para um tamanho menor para a incorporação de parafina.

Tabela 1: tabela de resolução de problemas

Discussion

O modelo de CAM-DRG in vivo apresentado aqui aborda os déficits de modelos anteriores demonstrando interação nervo-tumor antes da invasão física do nervo por células tumorais. A maioria de estudos in vivo do foco de PNI na propagação e na inibição do tumor da função de motor, e dependem em cima da injeção direta de pilhas do tumor em nervos ciático23,24,25. A injeção do nervo ciático é um in vivo modelo de PNI onde as pilhas cancerosas são injetadas em um rato ou em um nervo ciático do rato onde o tumor cresça subseqüentemente. Modelos de injeção são úteis para mostrar a progressão do tumor destrutivo e dor resultante de células tumorais dentro dos nervos. O modelo do nervo ciático é igualmente apropriado para o estudo dos fatores que permitem que as pilhas de cancro prosperem no nervo mas não faltam a habilidade de avaliar a fase adiantada de PNI, porque introduz pilhas diretamente no nervo, ignorando bainhas do nervo. Em uma aproximação diferente, os enxertos transplantação orthotopic do cirùrgica implantados do tumor foram usados para caracterizar a importância de fibras de nervo adrenérgicos e colinérgicos em promover a progressão do cancro da próstata, assim sugerindo um papel proeminente dos nervos na progressão do tumor o modelo 26. this consistiu na ablação química de nervos simpáticos e parassimpáticos murino. As fibras parassimpáticas infiltraram tecidos tumorais, um processo relacionado à PNI, mas o modelo não foi especificamente utilizado para avaliar as interações físicas entre o nervo e o tumor. O modelo CAM-DRG permite a investigação de interações entre o nervo e o câncer durante a PNI. Além disso, os modelos murinos são dispendiosos e demorados quando comparados com o modelo CAM. Sugerimos o uso do modelo CAM-DRG para estudos mecanísticos de PNI.

Algumas vantagens para a abordagem CAM-DRG incluem a avaliação de PNI e outros fenótipos, como crescimento tumoral, metástase e angiogênese. A identificação do ADN humano no CAM mais baixo e/ou no fígado pode ser usada para a deteção da metástase de linhas de célula cancerosas humanas10, uma aproximação experimental mais sensível comparada ao seccionamento e à mancha do tecido, que não podem revelar metástases pequenas.

O método CAM-DRG tem algumas limitações, incluindo o curto período de tempo de observação. O sistema imunológico do embrião é fisiologicamente ativo no dia 1827, quando a rejeição e um processo inflamatório podem ocorrer, limitando o tempo experimental. É igualmente importante considerar a distância ao transplantar pilhas do tumor perto do DRG; as distâncias maiores do DRG-Cancer puderam prejudicar as interações moleculars entre pilhas e nervo do tumor, ou poderiam retardar o contato físico entre ambos os componentes do modelo. Também, se os embriões são mais velhos do que estipulado neste protocolo, os movimentos do embrião puderam deslocar as pilhas do tumor. Portanto, é importante usar ovos consistentes com o dia 10 pós-fertilização para enxerto celular.

Desde que o sistema imunitário não é desenvolvido inteiramente antes do dia 1827, o microambiente do tumor no Cam é similar àquele dos modelos murino immunosuprimidos usados frequentemente para estudos do cancro. Portanto, este modelo não é útil para avaliar o papel das células imunes na progressão tumoral. Outra limitação é a disponibilidade restrita de reagentes para espécies de frango, como anticorpos, citocinas e primers.

Executar com precisão este protocolo requer prática; Entretanto, pode ser feito por um membro do laboratório sem necessidade para uma facilidade especializada do núcleo. A perfuração do escudo do ovo exige o treinamento. Praticar em ovos de mercearia (não fertilizados) é recomendado antes de tentar este modelo pela primeira vez. A sobrevivência embrionária elevada e o sucesso do modelo podem ser conseguidos se algumas etapas críticas para evitar a infecção forem seguidas: profilaxia antibiótica apropriada de DRGs em 2% Pen/strep, trabalhando em um armário do fluxo laminar, e evitando a dispersão de partículas do escudo de ovo para o CAM. É igualmente crucial manter a umidade estável durante o tempo total da incubação do ovo. Recomendamos aumentar o número de ovos por grupo até que a técnica seja dominada. Os problemas os mais freqüentes para o pessoal inexperiente do laboratório são contaminação do ovo e técnica imprecisa para a transplantação da pilha.

A colheita de DRG também requer treinamento; prática na colheita de DRGs para experimentos in vitro8 antes de tentar o modelo in vivo é recomendado. A cultura DRG in vitro é uma oportunidade para otimizar as condições e melhorar a técnica para encurtar a duração da extração de DRG. Atenção especial para a técnica de colheita é necessária quando agarrando o DRG com fórceps. O DRG não deve ser mantido diretamente; pressão deve ser aplicada por baixo. Recomendamos o uso de lente de ampliação para visualizar melhor o DRG durante a extração.

Importante, ao executar este modelo pela primeira vez, todas as condições devem ser otimizadas para a linha celular desejada. Este modelo foi otimizado para DRG de ratos e a linha de células HNC UM-SCC-1. O uso de mouse DRG e outros tipos de células cancerosas pode exigir otimização. Com uma concentração mais elevada de pilhas enxertadas, os tumores tendem a crescer mais grossos e mais duros, que facilita medidas do tumor. Levando em consideração vários ovos para cada grupo e uma concentração adequada de células para cada ovo, vários milhões de células podem ser necessárias para cada experimento. Para facilitar o planeamento, o conhecimento do tempo de duplicação das pilhas deve ser tomado na consideração. Para algumas etapas críticas neste protocolo, uma tabela de solução de problemas é fornecida (tabela 1).

Disclosures

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por concessões NIH/NIDCR DE027551 e DE022567 (NJD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco # 25200-056
ACE light source SCHOTT North America, Inc. Used to transilluminate the eggs
CellTracker Green CMFDA fluorescent dye Life Technologies # C7025 Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium.
CellTracker Red CMTPX fluorescent dye Life Technologies # C34552 Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium
Cordless rotary tool DREMEL # 866 Used to drill the egg shell
DMEM (1x) Gibco # 11965-092 Dulbeecco`s Modified Eagle Medium
DMSO Fisher Bioreagents # BP231-100 Dimethyl Sulfoxide
Dumont # 5 fine forceps Fine Science Tools (FST) # 11254-20 Used to harvest DRG
Egg incubator GQF  Digital Sportsman # 1502 Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls
Engraving cutter DREMEL # 108 Used to drill the egg shell
Extra fine Graefe forceps, curved Fine Science Tools (FST) # 11151-10 Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17
Extra fine Graefe forceps, straight Fine Science Tools (FST) # 11150-10 Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17
Fertilized Lohmann White Leghorn eggs Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. 
Filter Forceps EMD Millipore # XX6200006P Blunt forceps used to remove the egg shell
Fine surgical straight sharp scissor Fine Science Tools (FST) #14060-09 Used to harvest the CAM tissue on day 17
HBSS (1x) Gibco # 14025-092 Hank`s Balanced Salt Solution
HI FBS Gibco # 10082-147 Heat-inactivated Fetal Bovine Serum
Paraffin wax membrane Parafilm laboratory film # PM-996 Used to  temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8
PBS (1x) pH 7.4 Gibco # 10010-023 Phosphate Buffered Saline
Pen/Strep Gibco # 15140-122 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin
PFA (paraformaldehyde solution) Sigma-Aldrich # P6148-1KG Dilute in water to make a 4% PFA solution
Sprague Dawley rats (females) Charles River laboratories Strain code: 001 6-7 weeks old (190-210g in weight)
Tegaderm Transparent Film Dressing 3M # 9505W Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation

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References

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