頭頸部癌のペリオラル侵食を評価する生体内モデルにおけるひよこチョリオアラントIC膜

Medicine
 

Summary

ペリニューラル侵来は、頭頸部扁平上皮癌および他の腫瘍に対する積極的な表現型である。ひよこ絨毛膜モデルは、血管新生、癌の侵入、転移の研究に使用されています。ここでは、このモデルを生体内のペリニューラル侵入を評価するためにどのように利用できるかを示します。

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Schmitd, L. B., Liu, M., Scanlon, C. S., Banerjee, R., D’Silva, N. J. The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. J. Vis. Exp. (148), e59296, doi:10.3791/59296 (2019).

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Abstract

周神経侵襲は、癌が神経を取り囲むか、または侵入する表現型である。頭頸部扁平上皮癌および他の癌の不十分な臨床結果に関連している。機械的研究は、神経と腫瘍細胞の間の分子クロストークが物理的相互作用の前に起こることを示しています。生体内のモデルには、特に身体的神経腫瘍相互作用が起こる前に、特に早期進行を調べるために、ペリニューラルの侵入を研究するモデルはほんのわずかです。ひよこ絨毛膜モデルは、絨毛性上皮の地下膜がヒト上皮組織の膜を模倣するので、癌の侵入を研究するために使用されてきた。ここでは、ひよこ絨毛膜モデルを再利用して、ラット背面根神経節とヒト頭頸部扁平上皮細胞を絨毛上皮上皮上皮上皮上皮に移植した。このモデルは、生体内の神経組織に侵入する癌細胞の能力を評価するうえでどのように有用であるかを実証した。

Introduction

ペリニュール細胞侵食(PNI)は、頭頸部扁平上皮癌(HNC)1の患者における高疾患の再発および生存率の低下に関連する癌における研究対象の表現型である。PNIは、神経2、3内または周囲の腫瘍細胞として顕微鏡的に定義される。PNIが検出されると、患者は選択的頸部解剖および/または放射線療法4、5などのアジュバント療法を受ける可能性がい。しかし、これらの治療法は積極的であり、PNI特異的ではありません。実際、PNIを遮断する治療法はなく、主に神経腫瘍相互作用の根底にあるメカニズムがまだ十分に理解されていないためです。

異なる分子メカニズムは、神経腫瘍の引力に関与しています。腫瘍および間質細胞は神経ペプチドおよび成長因子を放出し、ニュー泌形成を促進する6,7.インビトロで一緒に培養した場合、HNC細胞と後根神経節(DRG)の両方が強い応答を持っています。腫瘍細胞の侵入およびニューリトジェネシスに及ぼす影響は、培養6、8、9の数日後に見ることができる。しかし、侵入前に腫瘍神経相互作用を要約する生体内モデルには適切な欠如がある。ここでは、HNC細胞と神経6との初期相互作用を研究するインビボPNIモデルを提示する。我々は、ひよこ絨毛膜(CAM)モデルを神経成分を含むように適応し、CAMにDRGを移植し、続いて癌細胞の移植片を行い、内側の腫瘍微小環境を模倣した。

CAMモデルは、地下膜を介した細胞の侵入を評価するために成功し、癌腫および黒色腫の早期侵襲段階を模倣し、10、11、12。CAMは、上絨毛性上皮、介在間異泉、および下部有限性上皮で構成される。絨毛性上皮は、コラーゲンIVを豊富に含む基底膜が基礎結合組織から経口上皮を分離する基底膜をシミュレートするという点で、ヒト上皮10、13と構造的に類似している。1913年14月に最初の腫瘍移植片がCAMで行われたので、血管新生15、16、17、腫瘍進行、および腫瘍進行の評価を可能にするために、この方法の多くの適応が開発された。転移18.重要なことに、CAMに腫瘍を移植する技術はほとんど変わっていませんが、アプリケーションは継続的に進化しています。薬物スクリーニング19、骨組織工学20、およびナノ粒子系抗癌剤21を含む、複雑化のアッセイが発表されている。

私たちの研究室では、哺乳類のDRGを単離し、上部のCAMの表面に移植するCAM-DRGモデルを使用しています。DRGがCAMに組み込まれた後、HNC細胞はDRGの近くに移植され、生体内システム全体が収穫および分析される前にDRGと相互作用することを可能にする。重要なことに、このシステムは、DRGおよび腫瘍細胞の蛍光標識によってDRGおよび腫瘍の両方の生体内観察を可能にする。このプロトコルは、卵のインキュベーションからCAMの収穫まで、17日以内に行われるさまざまなレベルの複雑さの複数のステップで構成されています(図1)。目的とする異なるタンパク質を発現する細胞は、このモデルで、癌の神経侵入を引き起こす分子経路を解明し、また神経侵来を直接標的とする薬物をスクリーニングするために試験することができる。候補薬で前処理された細胞は、CAM上に移植することができ、未処理の対照と比較して調査されたPNIの発生。実際、CAMモデルは、げっ歯類19におけるインビトロ研究と前臨床試験との間の中間ステップとして薬物スクリーニングに使用されている。

実験計画は仮説によって異なります。例えば、PNI上の特定のタンパク質の役割をテストする場合、実験グループは、タンパク質を過剰発現する腫瘍細胞で移植されたDRGを含み、対照群は空のベクターで安定にトランスフェクトされた細胞を有するDRGを含むべきである。いくつかの異なる実験計画を使用して、特定の質問に対処できます。

Protocol

倫理声明:このプロトコルでラットを使用するすべての実験は、当社の機関のIACUC(施設動物管理および使用委員会)の規則に従って行われます。この研究における卵の実験は、IACUC規制から免除される。

1. 卵のインキュベーション(推定タイミング:5分、日ゼロ)

  1. 病原体を含まない受精市販のローマンホワイトレグホーン卵を、好ましくは受精後の最初の日に入手する。卵加湿インキュベーターで実験群ごとに6個の卵を38°Cでインキュベートし、1時間に1回の回転で8日間54%の湿度を加えます。卵の定期的な回転を使用して、胚が卵膜に付着するのを防ぎます。
    注:インキュベーションの前に、卵を18°Cの冷蔵庫に入れ、胚の発達を最大1週間停止します。

2. DRGの収穫と調製(推定タイミング:2時間、8日目)

注:マウスおよびラットを用いての実験は(IACUC)からの承認を必要とする。一部の国では、鶏卵の使用も承認が必要です。

  1. DRGを抽出するために6〜7週齢のスプラーグドーリーラット(体重〜200g)を取得します。
    注:1匹のラットは、約40の頚部および胸部DRGを得るべきである。
  2. 層状流れキャビネットでは、他の場所で公開されたマウスDRG抽出のためのプロトコルに続いて頸部および胸部領域からDRGを収穫する。DRG の収集方法については、図 2に従ってください。
    1. ケタミン/キシラジンを経後に心臓穿刺によりラットを安楽死させる。70%のエタノールでラットの皮膚をきれいにし、はさみを使用してラットの背骨を取り除きます。これは子宮頸部DRGを損傷するので、子宮頸部脱臼を行わなすな。
    2. 図 2A-Dで提供される概略解剖表現および総画像に従って、同じはさみで頸部、胸部および腰部領域を分離する。1x PBSで10cmの培養皿に脊椎のセクションを置き、ティッシュを濡らさないようにします。
    3. 繊細な骨はさみで、背部と腹部の側面で脊椎骨を開き、脊椎を2つの側面の半分に分離する(図2E-F)。 新鮮な1x PBSときれいな10センチメートルの皿にティッシュセクションを置きます。
    4. 鉗子を使用して、脊椎骨から脊髄をそっと切り離してDRGを視覚化する(図2G)。
    5. 各DRGの下に細かい鉗子を保持し、それをつかみ、それが置かれる骨の空洞からそれを引き出す。これは組織の損傷を引き起こすので、直接DRGを保持しないでください。DRG (図 2H)から軸軸バンドルをトリムしないでください。
      注: これらは CAM 内の統合を減少させるため、腰部 DRG の使用は避けてください。DRG 領域の場所については、図 2A-Dの概略図と総解剖画像に従います。
  3. 収穫直後、各DRGを2%ペニシリン/ストレプトマイシン(ペン/ストレプ)と10%熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)を補充したDMEM培養培地に入れ、DRGsの細菌汚染を防ぐのに役立ちます。培養培地の4mLを持つ培養皿。
  4. すべてのDRGを収穫した後、2%ペン/ストレッププラス10%FBSを補充し、赤色蛍光色素の1.25 μg/mLを含むDMEM培養培地で新しい培養皿にそれらを転送します。細胞培養インキュベーターで1時間インキュベートする。この間、卵を準備して、以下に説明するDRGを受け取る(ステップ3)。
    注:DRGの収穫と蛍光標識の完了までの間隔は、卵を準備するのに十分であるべきです。DRGSはインキュベーターで数時間保つことができる。

3. DRG移植用卵の調製(推定タイミング:1ダースの卵の場合は1時間、8日目)

  1. 層流キャビネットで、光を薄暗くし、生存性と胚相を確認するために卵を透過します。貧しい血管系の卵、非受精卵、または8日目の受精後と一致しない卵を除外する。自然発生する空気嚢で卵を光源に向かって優しく保持します(図3A)。
  2. 鉛筆で卵殻に印を付けて開口部を受け取ります(図3A-B)。
    1. まず、発生する胚のCAMへの付着を卵膜に付着した暗い移動血管として識別し、この領域への介入を避けるためにこの領域をマークします。
    2. 第二に、胚の付属品から少なくとも2センチメートルの血管領域として操作ウィンドウ領域を選択し、1.5センチメートルの直径の円を描きます。操作ウィンドウから約1cm、より少ない血管領域に0.5cmの正方形を描きます。
    3. 第3に、空気嚢領域を描画して操作領域から除外します。空気嚢の真ん中に十字架をマークします。
  3. 回転ツールと彫刻ドリルで、直径3mm、マークされた正方形に卵殻をドリルします(図3C)。鈍い鉗子を使用して、外側の卵殻膜(シェルの真下の白い膜)を取り除かずに卵殻を取り除きます(図3D)。この膜の偶発的な穿起を避けるために慎重に働く。
  4. ステップ3.3と同じドリルを使用して、卵に空気の流れを可能にするために、空気嚢領域のマークされた十字にピンポイント穿孔を行います(図3E)。卵にあまりにも多くの圧力をかけないように注意してください。
  5. 正方形の開口部に30 μLのHBSSを置き、無傷の外卵殻膜の上に置きます(図3E)。30-G注射器の針を使用して、この正方形の領域の外膜にピンポイント穿出を行います(図3F)。
  6. 卵を光源に入れ、空気嚢を可視化します。スポイトゴム球に圧力をかけ、空気嚢領域で作られた小さな穿孔に置きます(ステップ3.4)。操作ウィンドウ領域の2つの膜の分離が見えるまで、電球内の圧力を解放します(図3G)。操作窓区域の膜の完全な分離を達成するために必要な回数このステップを繰り返す。
  7. すべての卵に対して手順 3.1-3.6 を繰り返します。
  8. ステップ3.3と同じドリルを使用して、外卵殻膜を破裂しないように注意して円形の操作ウィンドウをドリルします(図3H)。粘着テープをそっと貼り付けて卵表面をきれいにし、ゆるい粒子をすべて取り除きます。
  9. 鈍い鉗子で、掘削された区域から卵の殻を取り除く(図3I-J)。次に、同じ鉗子で、外側の卵殻膜(図3K)を取り除き、汚染を最小限に抑えるために卵の中に小さな貝の粒子を導入しないように注意する。
  10. 卵表面から約1cmの深さでCAMを識別します。汚染を避けるために、開いた各卵をパラフィンワックス膜で一時的に覆う(図3L)。
  11. すべての卵に対して手順 3.8-3.10 を繰り返します。DRGが移植の準備ができるまで、卵を回転せずに卵インキュベーターに戻します。

4. CAM上のDRGの移植(推定タイミング:40分、8日目)

  1. HBSS培地で6cm培養皿を準備し、移植前にDRGを洗浄する。調製した卵を細胞培養層層流キャビネットに持ち込みます。卵からパラフィン膜を取り出す(図4A)。
  2. 微細な生殖不能鉗子で、培養培地の中から1つのDRGをそっとつかむ。HBSS培地に浸し、蛍光色素を含む過剰な培地を除去します。DRGを非常に穏やかに保持します。それ以外の場合は、鉗子に固執します。
  3. DRGをCAMに置き、膜を穿刺しないように注意してください(図4B-C)。必要に応じて、別の鉗子を使用して、CAM に配置するときに、鉗子の先端から DRG を取り外します。
    注:DRGをHBSS培地で濡らしたままにしておくと、鉗子からの剥離も容易になります。
  4. 滅菌透明フィルムドレッシングで卵を覆います。細菌汚染を避けるために卵殻で作られたすべての窓と穿刺をカバーします(図4D)。
  5. すべての卵にDRGを移植した後、回転することなく、38°Cと54%の湿度で加湿インキュベーターで卵をインキュベートします。

5. CAM上の腫瘍細胞の移植(推定タイミング:1時間30分、10日目)

  1. 細胞を移植する前の48時間で、培養プレートに必要な細胞をプレート化する。UM-SCC-1細胞の卵当たり0.5~1x106細胞を計算し、CAMで3次元腫瘍を生成します。セル番号はセルラインによって異なる場合があることに注意してください。
  2. 吸引培地を吸引し、1%ペン/ストレッププラス10%FBSおよび2.5 μg/mLの緑色蛍光色素を添加したDMEM培養培地を添加する。細胞培養インキュベーターで37°Cで1時間インキュベートする。次いで、顕微鏡上の蛍光強度を確認し、吸引培地を吸引し、1x PBSで1回洗浄し、最大10分間0.25%トリプシンを添加する。
  3. 250 x gで4分間遠心分離機を形成し、細胞ペレットを形成する。吸引DMEM培地をHBSSで再停止し、過剰な蛍光色素を洗浄する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。
  4. 細胞培養層層流キャビネットに卵を持参します。はさみと鉗子で、卵を覆う透明なフィルムドレッシングを開きます(図4E-F)。
  5. 計算された細胞数を再度遠心分離し、HBSS培地を吸引し、同じ培地の5μL当たり0.5〜1x106細胞の最終濃度で再中断する(図4G)。卵の総数に必要な量(卵1個につき細胞懸濁液の5μL)を準備します。
  6. DRGから約2mmのカム上に5μLのセル溶液を置きます(図4H)。DRG とセルの間の距離を均一に保ちます。細胞の広がりを最小限に抑えるために卵を邪魔しないように非常に注意してください。
    注:細胞移植を開始するには、CAM表面が視覚的に乾燥している卵を選択します。表面が濡れすぎると、細胞が広がり、規則的な腫瘍を形成しない。
  7. ステップ4.4のように新しいフィルムドレッシングで卵をカバーします。すべての卵に細胞を移植します。湿気のあるインキュベーターで卵を38°C、湿度54%で7日間、回転せずにインキュベートします。

6. CAMの収穫(推定タイミング:12個の卵、17日目)

  1. 4%PFA(パラホルムアルデヒド)pH7.0、卵1個につき1ウェル、井戸あたり2mLで6ウェルプレートを準備します。
  2. 実験室のベンチに卵を持って来なさい。注射器に取り付けられた針を使用してフィルムドレッシングを穿通し、CAMの上にPFAの約300 μLを落とし、CAMをわずかに硬くし、収穫プロセスを容易にする。すべての卵に対してこれを繰り返します。
  3. はさみで、カムを取り付けた状態で卵殻の上半分(操作ウィンドウがある場所)を取り外します(図4I)。この半分の大きさを直径約3cmに縮小し、DRGと腫瘍細胞を中心に移植したCAMの部分を中央に保つ(図4J)。細かい鉗子でCAMをつかみ、PFAに入れながら卵殻から取り外します。DRGとがん細胞を上向きに向けて配します(図4K-L)。
    注: 3 cm の領域には、DRG とセルの両方を含める必要があります。DRGはCAMに付着した小さな塊として容易に見られるが、腫瘍細胞は粗末な検査で識別することが困難な場合がある。
  4. または、はさみで、CAMを所定の位置に保ちながら、卵の上から卵殻を取り除く操作ウィンドウを広げ、その場に置きます。操作ウィンドウ (図 4M)を超えて約 1 cm を取り外し、CAM 上の DRG とセルを識別します (図 4N-O)。繊細な細かい鉗子で、縁の1つでCAMを保持し、穏やかに持ち上げます。鋭い繊細なはさみで、CAMをそっと切り取り、直径約3cm(図4P)の円形領域を取り除き、DRGとがん細胞を上向きにしてPFAにCAMを配置します。
    注:顕微鏡検査のアーティファクトを生成する可能性のある組織の損傷を最小限に抑えるために、複数の場所に鉗子でCAMを伸ばしたり保持したりしないようにしてください。
  5. 各CAM膜を1つの井戸に入れます(図4L)。CAMの端をそっとつかんで、PFAで開いた組織を広げたり、CAMが展開されるまでプレートを静かに振ったりして、折りたたみアーティファクトを避けます。
  6. 迅速な切断によって胚(17日目)を安楽死させる。PFAで収穫した組織を室温で4時間固定します。固定後、PFAを1x PBSに交換し、切り分け用のパラフィンに埋め込むまで4°CでPBSに組織を保存します。CAMの繊細な血管系を損傷する過度の固定を避けてください。
  7. 蛍光立体顕微鏡を使用して、蛍光シグナルを失うことを避けるために、収穫後2日以内に膜を撮影します。

Representative Results

最適化された場合、このメソッドは CAM 内の 100% DRG 統合に近い。DRG統合の代表的な結果を図5A-Bに示す。CAMにおけるDRGの統合は、実験中にDRG組織に生存率を提供するので重要です。顕微鏡的に、DRGはCAM(H&E染色)の結合組織内で見られる。血管はDRG組織の内部でよく見られ、CAM血液供給が移植された組織を育成していることを示唆している。移植された腫瘍はまたH&EによってCAMで識別される;どの程度の侵来が存在するかによって、結合組織に侵入する多数の腫瘍島に腫瘍が存在しない可能性がある(図5C-D)。代表図5E-Fは、ブライトフィールドイメージング上の収集されたCAMを示し、蛍光をマージした。ガラニン受容体2を過剰発現するUM-SCC-1細胞は、対照細胞と比較してDRGの増加した侵食を示した(図5G-H)。がんとDRGの相互作用は、DRGに向かって方向侵食を示す癌細胞として観察される(図5H)。

データ分析はさまざまな方法で実行されます。DRGに向かう癌細胞の方向侵食は二分変数として観察され、この侵食パターンを示す卵の数は、各群でカウントされる。グループ間の統計的差異は、比率の二項検定を使用して計算されます。がん細胞とDRGとの近接性と腫瘍領域をImageJ6を用いて測定し、学生のt検定を用いてグループ間の差異を評価する。ImageJ 解析の精度を確保するには、同じ実験のすべての画像を同じ光と露出の設定で撮影する必要があります。同じ基準を使用してすべての画像の画像閾値と明るさを調整した後、分析粒子ツールを使用して腫瘍面積を測定し、線形測定ツールは腫瘍-DRG距離を測定します。異なるグループ間のすべての画像について分析されたパーティクルのサイズの一定の設定を使用することが重要です。場合によっては、腫瘍が厚くなり、デジタルキャリパーで手動で測定できるため、体積測定が可能になります。

パラフィン埋め込みCAM組織の切片を用いて、上皮細胞に対するH&E染色または免疫組織化学(ヒト種に対する抗サイトケラチン抗体反応性)を行うことができ、結合組織内の侵入の評価を可能にする。侵食は、卵当たりの結合組織における腫瘍性の島の数として定量される。コラーゲンIVに対する免疫蛍光は、地下膜を強調するために使用することができる。また、GFP標識癌細胞を用いた場合、組織切片におけるこれらの細胞の同定は、サイトケラチンに対する免疫組織化学を行わずに容易化される。CAM実験における転移および血管新生分析は、他の場所で議論される10,17.

Figure 1
図1:0日目、8日目、10日目、17日目の主要なステップを含む実験タイムライン。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 8 日目の DRG 抽出.A.脊椎の解剖学的位置を示すラットの概略図。B.異なる身体領域を示すラット椎骨構成の図;子宮頸部用は緑色、胸部はダークブルー、腰部はオレンジ、仙骨には水色。C-D.外科的切除後のラット脊柱の腹腹部;Bに示すように領域の分離 。椎を開き、脊椎骨を開き、脊椎体をDRGsを含む2つの側面に分離する。F.開いた胸椎の総態様。G.脊髄が変位した後、DRGは脊椎管(矢印ヘッドが3つのDRGを指す)で容易に見える。H.対応する軸ゾンバンドル(矢印ヘッド)を持つ1つのDRG(矢印)のステレオ顕微鏡画像。スケールバー: C, D, F, G, 1 cm;H,1 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:8日目の卵の調製。A -B手順の前に卵の血管系とマーキングの識別。Aの矢印は、自然発生する空気嚢を指します。C-D.正方形の開口部の印の卵の貝殻の掘削そして開く。Dの矢印は、鈍い鉗子の助けを借りてシェルを取り除いた後、無傷の外卵殻膜を指しています。E.空気嚢の印が付いている十字架は卵(矢印の頭部)への空気の流れを可能にするためにドリルで穿孔される。HBSS培地の30μLは、正方形開口部の外卵殻膜上に置かれる。F.細かい注射器の針によって、外の卵の貝膜はHBSSが前に置かれたところで穿起される。G.空気嚢に穴あけ穴に取り付けながらゴムスポイト球根に圧力がかかります。指圧が解放されると、空気が真空化され、操作ウィンドウまで伸びる人工空気嚢(白い矢印)が発生します。H.操作ウィンドウの端は、偶発的な穿開を避けるために、卵殻にほぼ平行な位置で掘削されます。I-J.鈍い鉗子による卵殻の除去。K.外側の卵殻膜を鈍い鉗子で取り除き、CAMに粒子を入らない(表面の下1cmで観察)。L.卵はパラフィンワックス膜で一時的に覆われ、インキュベーターに戻されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:DRGの移植、細胞、CAMの収穫:8日目:A.CAMはパラフィンワックス膜除去後に容易に観察される。B-C.微細な鉗子によって、DRGはCAMに置かれる。D.卵はフィルムドレッシングで覆われ、インキュベーターに入れます。矢印は、カバーされている開口部を指します。10日目:E-F.フィルムドレッシングが除去され、DRGが配置されます(Fの矢印ヘッド)。G-H.5 μLのセル溶液は、DRGから約2mmの距離でCAM上に落とされます。17日目:I-LとM-Pは、CAMを収穫するために使用される2つの異なるアプローチを示しています。の殻は、卵の上半分が取り除かれるまで、空気嚢掘削穿孔から始まる細かいはさみで開きます。CAMを含む卵殻は約3cmにサイズを縮小する。 微細な鉗子によって、CAMは卵の殻から取り外され、PFAに置かれる。M-O.操作ウィンドウの拡大は、CAM上のDRGおよび癌細胞を視覚化するために行われる。矢印は腫瘍を指し、矢印は DRG を指します。P.CAMは細かい鉗子でつかみ、鋭いはさみで切り取り、Lに示すようにPFAに置かれる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:代表的な結果。A. CAM 内の DRG の統合を示す H&E セクション。B. Aの高い倍率;矢印はDRGのCAM血管を示す。C.UM-SCC-1細胞をCAMに移植し、移植後4日後に収穫した(H&E染色)。D.CAM結合組織(矢印)における侵襲性腫瘍性島を示すCの高倍率。 UM-SCC-1-GALR2細胞とラットDRGを移植したCAMの総立体顕微鏡画像を17日目に採取した。F.緑色で標識された赤色および癌細胞で標識されたDRGを強調表示する蛍光および明視野画像をマージした。G-H.DRGおよびUM-SCC-1-GALR2対対対対制御細胞を移植したCAMの蛍光立体顕微鏡検査は、DRG(H)へのUM-SCC-1-GALR2細胞の指向性侵入を示す。スケールバー: A-D, 500 μm;E-H,2 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ステップ 問題 理由 ソリューション
3.2.1 胚の添付ファイルを識別できません。 卵がまだ残っている間、取り付け位置が見えにくいです。 卵を素早く横に回転させ、卵膜に付着した長い血管を見ることができるようにします。
3.3および3.8 掘削中の外卵殻膜の穿開。 ドリルの位置が間違っています。 ドリルを掘削中に、卵殻にほぼ平行に配置します。ステップ3.3で膜が穿当されている場合、ステップ3.5に記載されているように針でさらに穿出を行う必要はありません。出血が発生した場合は、卵を捨てます。
4.3年 DRGは鉗子に固執する。 DRGは乾燥しています。 HBSSで再びDRGを濡らしたり、鉗子からDRGを取り外すのに役立つ細かい針を使用します。
5.2年 細胞は蛍光色素で完全に標識されていません。 インキュベーション時間。一部のセルでは、ラベル付けに時間がかかります。 蛍光色素を含む培当てに1時間細胞を保持します。
5.6年 セルドロップ上の気泡。 ピペット先端のすべての流体を使用しています。 所望の体積より1μL多くロードし、細胞を移植する際にピペットの最終μLを使用しないでください。これは、細胞の混合中の気泡を回避します。
6.3年 CAM の収集時に DRG またはセルを識別できません。 小さなDRG、DRGは変位し、癌細胞は広がる。 DRGが見られない場合は、CAMのより大きな領域を収穫し、固定のためにより大きな容器に置きます。ステレオ顕微鏡で蛍光下のDRGと細胞位置を確認し、パラフィン埋め込み用にCAMを小さいサイズにトリミングします。

表 1: トラブルシューティング表

Discussion

ここで提示される生体内モデルのCAM-DRGは、腫瘍細胞による神経の物理的な侵入の前に神経腫瘍相互作用を実証することによって、以前のモデルの欠陥に対処する。PNIの生体内研究のほとんどは、腫瘍の広がりおよび運動機能の阻害に焦点を当て、坐剤神経への腫瘍細胞の直接注射依存する23、24、25。坐剤神経注射は、癌細胞がマウスまたはラット坐神経に注入され、その後腫瘍が成長するPNIのインインインビボモデルである。注射モデルは、神経内の腫瘍細胞から生じる破壊的な腫瘍の進行および痛みを示すのに有用である。坐神経モデルは、がん細胞が神経内で繁栄することを可能にする因子の研究にも適していますが、神経鞘をバイパスして細胞を直接神経に導入するため、PNIの初期段階を評価する能力を欠いています。別のアプローチでは、外科的に移植されたオルトトピック腫瘍移植片は、前立腺癌の進行を促進する上でアドレナリンおよびコリン作動性神経線維の重要性を特徴付けるために使用され、したがって、腫瘍進行における神経の顕著な役割を示唆した。26.このモデルは、マウス交感神経および副交感神経の化学的切除から成っていた。副交感神経繊維は腫瘍組織に浸潤し、PNIに関連するプロセスであるが、このモデルは神経と腫瘍との物理的相互作用を評価するために特に使用されなかった。CAM-DRGモデルはPNIの間の神経および癌間の相互作用の調査を可能にする。さらに、マウスモデルはCAMモデルと比較して高価で時間がかかります。我々は、PNIの機械的研究のためにCAM-DRGモデルを使用することをお勧めします。

CAM-DRGアプローチのいくつかの利点は、腫瘍増殖、転移、血管新生などのPNIおよび他の表現型の評価を含む。下部CAMおよび/または肝臓におけるヒトDNAの同定は、ヒト癌細胞株10の転移の検出に使用することができ、組織断面および染色に比べてより敏感な実験的アプローチであり、これは小さな転移を明らかにしないかもしれない。

CAM-DRG法には、短い観測時間枠を含むいくつかの制限があります。胚の免疫系は、18日目27日目までに生理的に活性であり、拒絶反応および炎症過程が起こり、実験時間を制限する。また、DRGに近い腫瘍細胞を移植する際の距離を考慮することも重要です。DRG癌の距離が大きいほど、腫瘍細胞と神経との分子相互作用が損なわれたり、モデルの両方の構成要素間の物理的な接触が遅れたりする可能性があります。また、胚がこのプロトコルで規定されているよりも古い場合、胚の動きは腫瘍細胞を置き換える可能性があります。したがって、細胞移植のための10日目の受精後と一致する卵を使用することが重要である。

免疫系は18日目27日までに完全に発達していないため、CAMの腫瘍微小環境は、がん研究によく用いられる免疫抑制マウスモデルのそれと類似している。したがって、このモデルは、腫瘍進行における免疫細胞の役割を評価するのに有用ではない。もう一つの制限は、抗体、サイトカイン、プライマーなどの鶏肉種に対する試薬の入手が制限されている。

このプロトコルを正確に実行するには、練習が必要です。しかし、それは専門のコア設備を必要としないで実験室のメンバーによって行うことができる。卵殻の掘削には訓練が必要です。食料品(非受精)卵の練習は、初めてこのモデルを試みる前にお勧めします。感染を避けるためにいくつかの重要なステップに従えば、高い胚の生存とモデルの成功を達成することができます:2%ペン/ストレップでのDRGsの適切な抗生物質予防、層状流れキャビネットで働き、卵殻粒子の分散を回避カムに。また、卵のインキュベーション時間全体の間に安定した湿度を維持することも重要です。技術が習得されるまで、グループあたりの卵の数を増やすことをお勧めします。経験の浅い実験室の人員のための最も頻繁な問題は卵の汚染および細胞移植のための不正確な技術である。

DRGの収穫はまた訓練を必要とします。インビボモデルを試みる前にインビトロ実験8のためのDRGの収穫の練習をお勧めします。インビトロDRG培養は、条件を最適化し、DRG抽出の持続時間を短縮する技術を改善する機会です。DRGを鉗子でつかむ際には、収穫技術に特に注意が必要です。DRG を直接保持しないでください。圧力は、その下に適用されるべきです。抽出中に DRG をより視覚化するために、拡大レンズを使用することをお勧めします。

重要なのは、このモデルを初めて実行する場合は、すべての条件を目的のセルラインに合わせて最適化する必要があります。このモデルはラットDRGおよびHNC細胞株UM-SCC-1のために最大限に活用された。マウスDRGおよび他の癌細胞タイプの使用は、最適化を必要とする場合があります。移植細胞の濃度が高いと、腫瘍は厚く硬くなり、腫瘍の測定を容易にする傾向がある。各群に複数の卵と各卵に対する適切な細胞濃度を考慮して、実験ごとに数百万個の細胞が必要になる場合があります。計画を容易にするために、細胞の倍増時間の知識を考慮する必要があります。このプロトコルのいくつかの重要な手順については、トラブルシューティング テーブルが用意されています(表 1)。

Disclosures

著者は、競合する利益を宣言しません。

Acknowledgments

この作業は、NIH/NIDCR 交付金 DE027551 および DE022567 (NJD) によってサポートされました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco # 25200-056
ACE light source SCHOTT North America, Inc. Used to transilluminate the eggs
CellTracker Green CMFDA fluorescent dye Life Technologies # C7025 Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium.
CellTracker Red CMTPX fluorescent dye Life Technologies # C34552 Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium
Cordless rotary tool DREMEL # 866 Used to drill the egg shell
DMEM (1x) Gibco # 11965-092 Dulbeecco`s Modified Eagle Medium
DMSO Fisher Bioreagents # BP231-100 Dimethyl Sulfoxide
Dumont # 5 fine forceps Fine Science Tools (FST) # 11254-20 Used to harvest DRG
Egg incubator GQF  Digital Sportsman # 1502 Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls
Engraving cutter DREMEL # 108 Used to drill the egg shell
Extra fine Graefe forceps, curved Fine Science Tools (FST) # 11151-10 Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17
Extra fine Graefe forceps, straight Fine Science Tools (FST) # 11150-10 Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17
Fertilized Lohmann White Leghorn eggs Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. 
Filter Forceps EMD Millipore # XX6200006P Blunt forceps used to remove the egg shell
Fine surgical straight sharp scissor Fine Science Tools (FST) #14060-09 Used to harvest the CAM tissue on day 17
HBSS (1x) Gibco # 14025-092 Hank`s Balanced Salt Solution
HI FBS Gibco # 10082-147 Heat-inactivated Fetal Bovine Serum
Paraffin wax membrane Parafilm laboratory film # PM-996 Used to  temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8
PBS (1x) pH 7.4 Gibco # 10010-023 Phosphate Buffered Saline
Pen/Strep Gibco # 15140-122 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin
PFA (paraformaldehyde solution) Sigma-Aldrich # P6148-1KG Dilute in water to make a 4% PFA solution
Sprague Dawley rats (females) Charles River laboratories Strain code: 001 6-7 weeks old (190-210g in weight)
Tegaderm Transparent Film Dressing 3M # 9505W Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation

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References

  1. Schmitd, L. B., Scanlon, C. S., D'Silva, N. J. Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. Journal of dental research. 97, (7), 742-750 (2018).
  2. Liebig, C., Ayala, G., Wilks, J. A., Berger, D. H., Albo, D. Perineural invasion in cancer: a review of the literature. Cancer. 115, (15), 3379-3391 (2009).
  3. Schmitd, L. B., et al. Redefining Perineural Invasion: Integration of Biology With Clinical Outcome. Neoplasia (New York, N.Y). 20, (7), 657-667 (2018).
  4. Chinn, S. B., et al. Impact of perineural invasion in the pathologically N0 neck in oral cavity squamous cell carcinoma. Otolaryngology--head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 149, (6), 893-899 (2013).
  5. Tai, S. K., Li, W. Y., Yang, M. H., Chu, P. Y., Wang, Y. F. Perineural invasion in T1 oral squamous cell carcinoma indicates the need for aggressive elective neck dissection. The American journal of surgical pathology. 37, (8), 1164-1172 (2013).
  6. Scanlon, C. S., et al. Galanin modulates the neural niche to favour perineural invasion in head and neck cancer. Nature communications. 6, 6885 (2015).
  7. Amit, M., et al. Upregulation of RET induces perineurial invasion of pancreatic adenocarcinoma. Oncogene. 36, (23), 3232-3239 (2017).
  8. Huyett, P., Gilbert, M., Liu, L., Ferris, R. L., Kim, S. A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Journal of visualized experiments : JoVE. (119), (2017).
  9. Ayala, G. E., et al. In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction: redefining perineural invasion in prostate cancer. The Prostate. 49, (3), 213-223 (2001).
  10. Liu, M., et al. The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Translational oncology. 6, (3), 273-281 (2013).
  11. Busch, C., Krochmann, J., Drews, U. The chick embryo as an experimental system for melanoma cell invasion. PloS one. 8, (1), e53970 (2013).
  12. Li, M., et al. The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma. Journal of visualized experiments : JoVE. (104), (2015).
  13. Ota, I., Li, X. Y., Hu, Y., Weiss, S. J. Induction of a MT1-MMP and MT2-MMP-dependent basement membrane transmigration program in cancer cells by Snail1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (48), 20318-20323 (2009).
  14. Murphy, J. B. TRANSPLANTABILITY OF TISSUES TO THE EMBRYO OF FOREIGN SPECIES : ITS BEARING ON QUESTIONS OF TISSUE SPECIFICITY AND TUMOR IMMUNITY. The Journal of experimental medicine. 17, (4), 482-493 (1913).
  15. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay. Nature. 1, (1), 85-91 (2006).
  16. Auerbach, R., Arensman, R., Kubai, L., Folkman, J. Tumor-induced angiogenesis: lack of inhibition by irradiation. International journal of cancer. 15, (2), 241-245 (1975).
  17. Banerjee, R., et al. The G protein-coupled receptor GALR2 promotes angiogenesis in head and neck cancer. Molecular cancer therapeutics. 13, (5), 1323-1333 (2014).
  18. Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer research. 40, (7), 2300-2309 (1980).
  19. Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17, (4), 779-804 (2014).
  20. Moreno-Jimenez, I., et al. The chorioallantoic membrane (CAM) assay for the study of human bone regeneration: a refinement animal model for tissue engineering. Scientific reports. 6, 32168 (2016).
  21. Vu, B. T., et al. Chick chorioallantoic membrane assay as an in vivo model to study the effect of nanoparticle-based anticancer drugs in ovarian cancer. Scientific reports. 8, (1), 8524 (2018).
  22. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC research notes. 9, 82 (2016).
  23. Cavel, O., et al. Endoneurial macrophages induce perineural invasion of pancreatic cancer cells by secretion of GDNF and activation of RET tyrosine kinase receptor. Cancer research. 72, (22), 5733-5743 (2012).
  24. Guo, K., et al. Interaction of the sympathetic nerve with pancreatic cancer cells promotes perineural invasion through the activation of STAT3 signaling. Molecular cancer therapeutics. 12, (3), 264-273 (2013).
  25. Deborde, S., et al. An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion. Journal of visualized experiments : JoVE. (134), (2018).
  26. Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. 341, (6142), Science. New York, N.Y. 1236361 (2013).
  27. Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).

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