Le modèle Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo pour évaluer l'invasion périnéale dans le cancer de la tête et du cou

Medicine
 

Summary

L'invasion perineural est un phénotype agressif pour les carcinomes squamous de tête et de cou de cellules et d'autres tumeurs. Le modèle de membrane chorioallantoic de poussin a été employé pour étudier l'angiogenèse, l'invasion de cancer, et la métastasie. Ici nous démontrons comment ce modèle peut être utilisé pour évaluer l'invasion perineural in vivo.

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Schmitd, L. B., Liu, M., Scanlon, C. S., Banerjee, R., D’Silva, N. J. The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. J. Vis. Exp. (148), e59296, doi:10.3791/59296 (2019).

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Abstract

L'invasion périnéale est un phénotype dans lequel le cancer entoure ou envahit les nerfs. Il est associé à de mauvais résultats cliniques pour le carcinome épidermoïde de tête et de cou et d'autres cancers. Des études mécanistes ont montré que le croisement moléculaire entre les nerfs et les cellules tumorales se produit avant l'interaction physique. Il n'y a que quelques modèles in vivo pour étudier l'invasion périneural, particulièrement pour étudier la progression tôt, avant que les interactions nerveuses-tumorales physiques se produisent. Le modèle de membrane chorioallantoic de poussin a été employé pour étudier l'invasion de cancer, parce que la membrane de sous-sol de l'épithélium chorionique imite cela du tissu épithélial humain. Ici nous avons réconçu le modèle chorioallantoic de membrane de poussin pour étudier l'invasion perineural, greffant des ganglions de racine dorsal de rat et les cellules humaines de carcinome squamous de tête et de cou sur l'épithélium chorionique. Nous avons démontré comment ce modèle peut être utile pour évaluer la capacité des cellules cancéreuses à envahir le tissu neural in vivo.

Introduction

L'invasion perineural (PNI) est un phénotype sous-étudié dans le cancer, qui est associé à la répétition élevée de la maladie et à la survie pauvre dans les patients présentant le carcinome squamous de tête et de cou (HNC)1. PNI est défini au microscope comme des cellules tumorales à l'intérieur ou autour des nerfs2,3. Lorsque le PNI est détecté, les patients sont susceptibles de recevoir des thérapies adjuvantes telles que la dissection élective du cou et/ ou la radiothérapie4,5. Cependant, ces thérapies sont agressives, et non spécifiques à PNI. En fait, il n'y a aucune thérapie pour bloquer PNI, principalement parce que les mécanismes sous-jacents des interactions nerf-tumeur sont encore mal compris.

Différents mécanismes moléculaires ont été impliqués dans l'attraction de nerf-tumeur ; les tumeurs et les cellules stromales libèrent des neuropeptides et des facteurs de croissance pour favoriser la neuritogenesis6,7. Lorsqu'ils sont cultivés ensemble in vitro, les cellules HNC et les ganglions de racine dorsal (DRG) ont tous deux une réponse robuste ; effets sur l'invasion des cellules tumorales et la néuritogénèse peut être vu après quelques jours dans la culture6,8,9. Cependant, il y a un manque de modèles in vivo appropriés pour récapituler des interactions tumeur-nerf avant invasion. Ici, nous présentons un modèle In vivo PNI pour étudier les interactions précoces entre les cellules HNC et les nerfs6. Nous avons adapté le modèle de membrane chorioallantoic de poussin (CAM) pour inclure un composant neural, greffant un DRG dans le CAM, suivi d'une greffe des cellules cancéreuses pour imiter un microenvironnement innervé de tumeur.

Le modèle CAM a été utilisé avec succès pour évaluer l'invasion des cellules à travers la membrane du sous-sol, imitant les premiers stades invasifs des carcinomes et du mélanome10,11,12. Le CAM est composé de l'épithélium chorionique supérieur, du mésenchyme intervenant, et de l'épithélium allantoïque inférieur. L'épithélium chorionique est structurellement similaire à l'épithélium humain10,13 en ce que la membrane de sous-sol riche en collagène IV simule la membrane du sous-sol qui sépare l'épithélium oral du tissu conjonctif sous-jacent. Depuis les premières greffes de tumeur ont été effectuées dans le CAM en 191314, de nombreuses adaptations de la méthode ont été développées pour permettre l'évaluation de l'angiogenèse15,16,17, progression tumorale, et métastase18. Fait important, la technique de greffe des tumeurs sur le CAM a très peu changé, mais les applications sont en constante évolution. Des essais de complexité croissante ont été publiés, y compris le dépistage des médicaments19, l'ingénierie des tissus osseux20, et les médicaments anticancéreux à base de nanoparticules21.

Notre laboratoire utilise un modèle CAM-DRG dans lequel un DRG de mammifères est isolé et greffé sur la surface de la CAM supérieure. Une fois que le DRG est incorporé dans le CAM, les cellules HNC sont greffées près du DRG et autorisées à interagir avec le DRG avant que l'ensemble du système in vivo ne soit récolté et analysé. Fait important, le système permet l'observation visuelle ex-vivo du DRG et de la tumeur par l'étiquetage de fluorescence des cellules d'Adn et de tumeur. Ce protocole comprend plusieurs étapes avec différents niveaux de complexité effectuées dans les 17 jours, de l'incubation des œufs à la récolte de la CAM (Figure 1). Les cellules exprimant différentes protéines d'intérêt peuvent être testées dans ce modèle pour élucider les voies moléculaires responsables de l'invasion nerveuse dans le cancer, et aussi pour le dépistage des médicaments pour cibler directement l'invasion neuronale. Les cellules prétraitées avec un médicament candidat peuvent être greffées sur la MCA et l'apparition de PNI étudiée par rapport aux contrôles non traités. En fait, le modèle CAM a été utilisé pour le dépistage des médicaments comme une étape intermédiaire entre les études in vitro et les essais précliniques in vivo chez les rongeurs19.

La conception expérimentale variera en fonction de l'hypothèse. Par exemple, si l'essai du rôle d'une protéine spécifique sur PNI, le groupe expérimental inclurait DRG greffé avec des cellules de tumeur surexprimant la protéine, alors que le groupe témoin devrait inclure DRG avec des cellules poignardées transfected avec le vecteur vide. Plusieurs conceptions expérimentales différentes peuvent être utilisées pour répondre à des questions spécifiques.

Protocol

Déclaration d'éthique : Toutes les expériences à l'aide de rats dans ce protocole sont effectuées conformément aux règles de l'IACUC (Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux) de notre établissement. Les expériences avec des œufs dans cette étude sont exemptées de la réglementation de l'IACUC.

1. Incubation d'oeufs (temps estimé : 5 min, jour zéro)

  1. Obtenez des œufs commerciaux de Lohmann White Leghorn sans agent pathogène, de préférence le premier jour après la fécondation. Incuber six œufs par groupe expérimental dans un incubateur humidifiant les œufs à 38 oC et 54 % d'humidité pendant 8 jours avec rotation horaire. Utilisez une rotation régulière des œufs pour empêcher l'embryon de coller aux membranes de l'œuf.
    REMARQUE : Avant l'incubation, conservez les œufs dans un réfrigérateur de 18 oC pour arrêter le développement de l'embryon pendant un maximum d'une semaine.

2. Récolte et préparation des DrG (horaire estimé: 2 h, jour 8)

REMARQUE : Les expériences avec des souris et des rats nécessitent l'approbation de l'IACUC. Dans certains pays, l'utilisation d'œufs de poulet doit également être approuvée.

  1. Obtenez des rats Sprague Dawley de six à sept semaines (200 g de poids) pour extraire les DRG.
    REMARQUE : Un rat doit produire 40 DRG cervicaux et thoraciques. La souris DRG s'intègre également dans le CAM, mais les conditions de cette espèce doivent être optimisées indépendamment.
  2. Dans une armoire à débit laminaire, récoltez les DRG des régions cervicales et thoraciques suivant le protocole d'extraction d'extraction d'orgde de souris publié ailleurs22. Suivez la figure 2 pour savoir comment récolter les DrG.
    1. Euthanasier le rat par ponction cardiaque après administration de la kétamine / Xylazine injecté intrapéritonement. Nettoyez la peau du rat avec 70 % d'éthanol et retirez la colonne vertébrale du rat à l'aide d'un ciseau. Ne pas effectuer la dislocation cervicale parce que cela endommagerait les DRG scoléraux.
    2. Séparez les régions cervicales, thoraciques et lombaires avec les mêmes ciseaux, suivant la représentation anatomique schématique et les images brutes fournies dans la figure 2A-D. Placez les sections de la colonne vertébrale dans un plat de culture de 10 cm avec 1x PBS pour garder les tissus humides.
    3. À l'aide d'un délicat ciseau osseux, ouvrez les os vertébraux dans les aspects dorsales et ventrales, séparant la colonne vertébrale en deux moitiés latérales (Figure2E-F).  Placer les sections de tissu dans un plat propre de 10 cm avec 1x PBS frais.
    4. À l'aide de forceps, détacher délicatement la moelle épinière des os vertébraux pour visualiser les DRG (Figure 2G).
    5. Avec de fines forceps sous chaque DRG, saisissez-le et retirez-le de la cavité osseuse dans laquelle il est logé. Ne tenez pas le DRG directement parce que cela causera des dommages aux tissus. Ne coupez pas les faisceaux d'axone du DRG (Figure 2H).
      REMARQUE : Évitez d'utiliser des DrG lombaires car ceux-ci ont réduit l'intégration dans le CAM. Pour l'emplacement de la région DRG, suivez l'illustration schématique et les images anatomiques brutes sur la figure 2A-D.
  3. Immédiatement après la récolte, placez chaque DRG dans le milieu de culture DMEM complété par 2 % de pénicilline/streptomycine (Pen/Strep) et 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (SGF) pour aider à prévenir la contamination bactérienne des DRG. Groupe tous les DRG dans le même 6 cm plat de culture avec 4 ml de milieu de culture.
  4. Après la récolte de tous les DRG, transférez-les dans un nouveau plat de culture avec un milieu de culture DMEM complété de 2% De Pen/Strep plus 10% de FBS et contenant 1,25 g/mL de colorant fluorescent rouge. Incuber pendant 1 h dans l'incubateur de culture cellulaire. Pendant ce temps, préparer les œufs pour recevoir le DRG tel que décrit ci-dessous (étape 3).
    REMARQUE : L'intervalle entre la récolte des DRG et l'achèvement de l'étiquetage de la fluorescence devrait être suffisant pour préparer les œufs; Les DrG peuvent être conservés pendant quelques heures dans l'incubateur.

3. Préparation des œufs pour la greffe d'Or (horaire estimé : 1 h pour une douzaine d'œufs, jour 8)

  1. Dans une armoire à débit laminaire, tamiser la lumière et transéclairer les œufs pour vérifier la viabilité et la phase embryonnaire. Exclure les œufs dont la vascularisation est pauvre, les œufs non fécondés ou les œufs qui ne correspondent pas au jour 8 après la fécondation. Maintenez l'œuf doucement avec le sac d'air naturel vers la source de lumière (figure 3A).
  2. À l'aide d'un crayon, marquez la coquille d'œuf pour recevoir les ouvertures (Figure 3A-B).
    1. Tout d'abord, identifier l'attachement de l'embryon en développement à la MCA comme un vaisseau sombre en mouvement attaché à la membrane de l'œuf et marquer cette zone pour éviter les interventions dans cette région.
    2. Deuxièmement, choisissez la zone de fenêtre d'opération comme zone bien vascularisée à au moins 2 cm de l'attachement de l'embryon et dessinez un cercle de 1,5 cm de diamètre. À environ 1 cm de la fenêtre d'opération, dessinez un carré de 0,5 cm dans une zone moins vascularisée.
    3. Troisièmement, dessinez la région du sac d'air pour l'exclure de la zone d'opération. Marquez le milieu du sac d'air avec une croix.
  3. À l'aide d'un outil rotatif et d'une perceuse de gravure de 3 mm de diamètre, percer la coquille d'œuf dans le carré marqué (figure3C). Utilisez des forceps émoussés pour enlever la coquille d'œuf sans enlever la membrane externe de la coquille d'œuf (la membrane blanche juste sous la coquille) (Figure 3D). Travaillez soigneusement pour éviter la perforation accidentelle de cette membrane.
  4. En utilisant la même perceuse que dans l'étape 3.3, faire une perforation précise dans la croix marquée dans la zone de sac d'air pour permettre l'écoulement de l'air dans l'œuf (Figure 3E). Veillez à ne pas appliquer trop de pression sur l'œuf, pour éviter de le casser ou de l'endommager.
  5. Placer 30 l de HBSS dans l'ouverture carrée, au-dessus de la membrane extérieure intacte de coquille d'oeuf (figure 3E). À l'effile d'une seringue de 30 G, faites une perforation précise dans la membrane externe de cette zone carrée (figure3F).
  6. Placez l'œuf dans la source lumineuse pour visualiser le sac d'air. Appliquer la pression sur une ampoule en caoutchouc eyedropper et la placer dans la petite perforation faite dans la zone sac d'air (étape 3.4). Relâchez la pression dans l'ampoule jusqu'à ce que vous voyiez la séparation des deux membranes dans la zone de la fenêtre d'exploitation (figure 3G); répéter cette étape autant de fois que vous avez besoin pour atteindre la séparation complète des membranes dans la zone de la fenêtre d'exploitation.
  7. Répétez les étapes 3.1-3.6 pour tous les œufs.
  8. En utilisant la même perceuse que dans l'étape 3.3, percer la fenêtre de fonctionnement circulaire en prenant soin de ne pas rompre la membrane externe de la coquille d'œuf (Figure 3H). Nettoyez la surface de l'œuf en collant doucement un ruban adhésif pour enlever toutes les particules en vrac.
  9. À l'écrepresse, retirer la coquille d'œuf de la zone forée (figure3I-J). Ensuite, avec les mêmes forceps, enlever la membrane externe de coquille d'oeuf (Figure 3K), en prenant soin de ne pas introduire de petites particules de coquille à l'intérieur de l'oeuf pour minimiser la contamination.
  10. Identifiez le CAM à environ 1 cm de profondeur de la surface de l'œuf. Couvrir chaque œuf ouvert temporairement avec la membrane de cire de paraffine pour éviter la contamination (Figure 3L).
  11. Répétez les étapes 3.8-3.10 pour tous les œufs. Remettre les œufs dans l'incubateur d'œufs sans rotation jusqu'à ce que les DRG soient prêts à être greffés.

4. Grafting DRG sur le CAM (temps estimé: 40 min, jour 8)

  1. Préparer un plat de culture de 6 cm avec le milieu HBSS, pour laver les DRG avant l'implantation. Apportez les œufs préparés à l'armoire à débit laminaire de culture cellulaire. Retirer la membrane de paraffine de l'œuf (Figure 4A).
  2. Avec de fines forceps stériles, saisissez délicatement un DRG de l'intérieur du milieu de culture. Trempez-le dans le milieu HBSS pour enlever l'excès de milieu qui contient le colorant fluorescent. Tenez le DRG très doucement; sinon, il s'en tiendra aux forceps.
  3. Placez le DRG sur le CAM, en prenant soin de ne pas perforer la membrane (Figure 4B-C). Si nécessaire, utilisez une autre paire de forceps pour aider à détacher le DRG de la pointe des forceps lors de son placement sur le CAM.
    REMARQUE : Garder le DRG humide avec le milieu HBSS facilitera également le détachement des forceps.
  4. Couvrir l'œuf d'une vinaigrette stérile et transparente. Couvrez toutes les fenêtres et les perforations faites dans la coquille d'œuf pour éviter la contamination bactérienne (figure 4D).
  5. Après avoir greffé les DRG dans tous les œufs, incuber les œufs dans un incubateur humidifiant à 38 oC et 54 % d'humidité pendant 2 jours, sans rotation.

5. Greffe des cellules tumorales sur le CAM (temps estimé: 1 h 30 min, jour 10)

  1. À 48 h avant de greffer les cellules, plaquer les cellules nécessaires dans les plaques de culture. Calculer 0,5 à 1 x 106 cellules par œuf pour les cellules UM-SCC-1 afin de générer des tumeurs tridimensionnelles dans le CAM. Sachez que le numéro de cellule peut varier selon la lignée cellulaire.
  2. Aspirez le milieu et ajoutez le milieu de culture de DMEM complété avec le stylo/Strep de 1% plus 10% FBS et 2.5 'g/mL de colorant fluorescent vert. Incuber pendant 1 h à 37 oC dans l'incubateur de culture cellulaire. Ensuite, vérifiez l'intensité de fluorescence sur le microscope, aspirez le milieu, lavez une fois avec 1x PBS, et ajoutez 0.25% trypsin e pendant jusqu'à 10 min. Neutraliser la trypsine avec le milieu complété par DMEM.
  3. Centrifugeuse à 250 x g pendant 4 min pour former une pastille cellulaire. Aspirez le milieu DMEM et suspendez-le dans LE HBSS pour laver l'excès de colorant fluorescent. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre.
  4. Apportez les œufs à l'armoire à débit laminaire de culture cellulaire. Avec des ciseaux et des forceps, ouvrez la vinaigrette transparente qui recouvre l'œuf (Figure 4E-F).
  5. Centrifuger le nombre calculé de cellules à nouveau, aspirer le milieu HBSS et re-suspendre à une concentration finale de 0,5 à 1x106 cellules par 5 'L du même milieu (Figure 4G). Préparer la quantité nécessaire pour le nombre total d'œufs (5 l de suspension cellulaire par œuf).
  6. Placez 5 ll de solution cellulaire sur le CAM, à environ 2 mm du DRG (figure 4H). Gardez des distances uniformes entre le DRG et les cellules. Veillez à ne pas déranger l'œuf pour minimiser la propagation des cellules.
    REMARQUE : Pour commencer l'implantation cellulaire, choisissez les œufs sur lesquels la surface du CAM est visuellement sèche. Si la surface est trop humide, les cellules peuvent se propager et ne pas former de tumeurs régulières.
  7. Couvrir l'œuf d'une nouvelle vinaigrette de film comme à l'étape 4.4. Greffer les cellules dans tous les œufs. Incuber les œufs dans un incubateur humidifiant à 38 oC et 54 % d'humidité pendant 7 jours, sans rotation.

6. Récolte de la CAM (temps estimé : 1 h pour une douzaine d'œufs, jour 17)

  1. Préparer 6 assiettes de puits avec 4% de PFA (paraformaldéhyde) pH7.0, un puits par oeuf, 2 ml par puits.
  2. Amener les œufs sur un banc de laboratoire. À l'aide d'une aiguille fixée à une seringue pour perforer le pansement du film, déposer environ 300 l de PFA sur le CAM pour raidir légèrement le CAM, facilitant ainsi le processus de récolte. Répétez cette opération pour tous les œufs.
  3. À l'aide d'un ciseau, retirez la moitié supérieure de la coquille d'œuf (où se trouve la fenêtre d'opération) avec le CAM qui lui est attaché (Figure 4I). Réduire la taille de cette moitié à environ 3 cm de diamètre, en gardant la partie de la CAM où dRG et les cellules tumorales ont été greffés au centre (Figure 4J). Saisissez le CAM avec des forceps fines et détachez-le de la coquille d'œuf tout en le plaçant dans le PFA. Orientez le DRG et les cellules cancéreuses vers le haut (Figure 4K-L).
    REMARQUE : La zone de 3 cm devrait inclure à la fois le DRG et les cellules. Le DRG est facilement considéré comme une petite bosse attachée sur le CAM, cependant les cellules de tumeur sont parfois difficiles à identifier à l'examen brut.
  4. Alternativement, à l'aide d'un ciseau, élargir la fenêtre de fonctionnement en enlevant la coquille d'œuf du haut de l'œuf tout en gardant le CAM en place; enlever environ 1 cm au-delà de la fenêtre d'opération (figure 4M) et identifier le DRG et les cellules sur le CAM (Figure 4N-O). Avec des forceps fins délicats, tenez le CAM sur l'un des bords et soulevez-le doucement. À l'aide de ciseaux délicats tranchants, coupez délicatement le CAM pour enlever une zone circulaire d'environ 3 cm de diamètre (figure4P)et placez le CAM en PFA avec dRG et cellules cancéreuses orientées vers le haut.
    REMARQUE : Évitez d'étirer ou de tenir le CAM avec des forceps à plusieurs endroits pour minimiser les dommages aux tissus qui peuvent générer des artefacts de microscopie.
  5. Placez chaque membrane CAM dans un puits (Figure 4L). Saisissez délicatement les bords du CAM pour étendre le tissu ouvert dans le PFA ou secouez doucement la plaque jusqu'à ce que le CAM soit déplié, pour éviter les artefacts de pliage.
  6. Euthanasier l'embryon (jour 17) par décapitation rapide. Fixer les tissus récoltés en PFA pendant 4 h à température ambiante. Après fixation, remplacer la PFA par 1x PBS et stocker les tissus dans le PBS à 4 oC jusqu'à ce qu'ils intègrent de la paraffine pour la section. Évitez la surfixation qui endommagera la vascularisation délicate du CAM.
  7. À l'aide d'un stéréomicroscope à fluorescence, photographier les membranes dans les 2 jours suivant la récolte afin d'éviter de perdre les signaux fluorescents.

Representative Results

Lorsqu'elle est optimisée, cette méthode est aetoyée à près de 100 % d'intégration dRG dans le CAM. Les résultats représentatifs de l'intégration DRG sont présentés à la figure 5A-B. L'intégration de DRG dans le CAM est importante car elle assure la viabilité du tissu DRG pendant l'expérience. Microscopiquement, le DRG est vu dans le tissu conjonctif de la MAA (tache H et E). Les vaisseaux sanguins sont souvent vus à l'intérieur du tissu DRG, ce qui suggère que l'approvisionnement en sang CAM est nourrir le tissu greffé. Les tumeurs implantées sont également identifiées sur le CAM par H et E ; selon la quantité d'invasion est présente, les tumeurs pourraient présenter avec aucun à de nombreuses îles de tumeur envahissant le tissu conjonctif (Figure 5C-D). La figure 5E-F représentative montre le CAM récolté sur l'imagerie brightfield et la fluorescence fusionnée. Les cellules UM-SCC-1 surexprimant le récepteur Galanin 2 ont présenté une invasion accrue du DRG par rapport aux cellules témoins (Figure5G-H). L'interaction cancer-DRG est observée pendant que les cellules cancéreuses présentant l'invasion directionnelle vers le DRG (figure 5H).

L'analyse des données est effectuée de différentes manières. L'invasion directionnelle des cellules cancéreuses vers le DRG est observée comme variable dichotomique et le nombre d'œufs présentant ce modèle d'invasion est compté dans chaque groupe. Les différences statistiques entre les groupes sont calculées à l'aide d'un test binomial des proportions. La proximité entre les cellules cancéreuses et DRG, et la zone tumorale sont mesurées à l'aide de ImageJ6 et les différences entre les groupes sont évaluées à l'aide du test t de l'étudiant. Pour assurer la précision avec l'analyse ImageJ, toutes les images de la même expérience doivent être prises sur des paramètres de lumière et d'exposition égaux. Après ajustement du seuil d'image et de la luminosité de toutes les images en utilisant les mêmes critères, l'outil d'analyse des particules est utilisé pour mesurer la zone tumorale et l'outil de mesure linéaire mesure les distances tumorales-DRG. Il est important d'utiliser la configuration constante de la taille des particules analysées pour toutes les images à travers différents groupes. Dans certains cas, les tumeurs s'épaississent et peuvent être mesurées manuellement à l'aide d'un étrier numérique, ce qui permet une mesure du volume.

L'utilisation de sections de tissu CAM incorporé à la paraffine, de la tache ou de l'immunohistochimie pour les cellules épithéliales (anticorps anticytokératine réactives pour l'espèce humaine) peut être effectuée, permettant l'évaluation de l'invasion dans le tissu conjonctif. L'invasion est quantifiée comme le nombre d'îles de tumeur dans le tissu conjonctif par oeuf. L'immunofluorescence pour le collagène IV peut être utilisée pour mettre en évidence la membrane du sous-sol. En outre, si l'utilisation des cellules cancéreuses GFP-étiquetées, l'identification de ces cellules dans les sections de tissu est facilitée sans immunohistochemistry pour la cytokératine. La métastasie et l'analyse d'angiogenèse dans les expériences de CAM sont discutées ailleurs10,17.

Figure 1
Figure 1 : Chronologie des expériences, y compris les principales étapes des jours 0, 8, 10 et 17. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Extraction d'Extraction dRG le jour 8 . Unschéma de rat illustrant l'emplacement anatomique de la colonne vertébrale. B. Diagramme de la configuration des vertèbres de rat montrant différentes régions du corps; vert pour le col de l'utérus, bleu foncé pour le thoracique, orange pour lombaire et bleu clair pour les vertèbres sacrées. C-D. Aspect ventral de la colonne vertébrale de rat après excision chirurgicale ; la séparation des régions comme l'illustre B. E. Dissection des vertèbres pour ouvrir le canal de la moelle épinière, séparant les corps vertébraux en deux sections latérales contenant les DRG. La section devrait couper à travers l'aspect dorsale et ventral de chaque os vertébral à la ligne médiane. F. Aspect brut de la colonne vertébrale thoracique ouverte. G. Une fois la moelle épinière déplacée, les DrG sont facilement visibles dans les canaux vertébraux (têtes de flèche pointant 3 DRG). H. Image stéréomicroscopique d'un DRG (flèche) avec les faisceaux d'axone correspondants (tête de flèche). Barres d'échelle: C, D, F, et G, 1 cm; H, 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Préparation des œufs le jour 8. A-B. Identification de la vascularisation et des marques d'oeufavant avant la procédure. Flèches sur Un point au sac d'air naturel. C-D. Forage et ouverture de la coquille d'œuf sur la marque d'ouverture carrée. La flèche sur D pointe vers la membrane extérieure intacte de coquille d'oeuf après avoir enlevé la coquille à l'aide des forceps émoussés. E. La croix marquée sur le sac d'air est perforée avec la perceuse pour permettre l'écoulement de l'air dans l'œuf (tête de flèche). 30 l de milieu HBSS est placé sur la membrane externe de coquille d'oeuf sur l'ouverture carrée. F. Avec une aiguille fine de seringue, la membrane externe de coquille d'oeuf est perforée où le HBSS a été précédemment placé. G. La pression est appliquée sur une ampoule en caoutchouc tout en l'attachant à la perforation forée sur le sac d'air. Lorsque la pression des doigts est libérée, l'air est aspiré, générant un sac d'air artificiel (flèches blanches) qui devrait s'étendre à la fenêtre de fonctionnement. H. Les bords de la fenêtre d'opération sont percés dans une position presque parallèle à la coquille d'œuf, afin d'éviter la perforation accidentelle. I-J. Enlèvement de la coquille d'œuf avec des forceps émoussés. K. Enlevez la membrane externe de la coquille d'œuf à l'égard des forceps émoussés, en prenant soin de ne pas introduire de particules sur le CAM (observé à 1 cm sous la surface). L. Les œufs sont recouverts temporairement d'une membrane de cire de paraffine et remis dans l'incubateur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Greffe de DRG, cellules et récolte de CAM : Au jour 8 : A. CAM facilement observé après l'enlèvement de membrane de cire de paraffine. B-C. Avec des forceps fins, DRG est placé sur le CAM. D. L'œuf est recouvert d'un pansement de film et mis dans l'incubateur; flèches pointent vers les ouvertures qui sont couvertes. Le jour 10: E-F. Le pansement de film est enlevé et DRG est situé (tête de flèche sur F). G-H. La solution cellulaire de 5 ll est larguée sur le CAM à une distance de 2 mm du DRG. Le jour 17 : I-L et M-P font la démonstration de deux approches différentes utilisées pour la récolte du CAM. I. Coquille d'oeuf est ouverte avec un ciseaux fin commençant sur la perforation forée de sac d'air jusqu'à ce que la moitié supérieure de l'oeuf soit enlevée. J. La coquille d'oeuf contenant le CAM est réduite dans la taille à approximativement 3 cm. K-L. Avec des forceps fins, CAM est détaché de la coquille d'oeuf et placé dans PFA. M-O. L'élargissement de la fenêtre d'opération est effectué pour visualiser le DRG et les cellules cancéreuses sur le CAM. Arrowhead pointe vers la tumeur et les pointes de flèche à la DRG. P. Le CAM est saisi avec des forceps fins, découpé avec un ciseaux pointus, et placé en PFA comme indiqué dans L. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Résultats représentatifs. A. La section H-E montrant l'intégration du DRG dans le CAM. B. Grossissement supérieur de A; flèches montrent les vaisseaux sanguins CAM dans le DRG. C. Um-SCC-1 cellules greffées sur le CAM et récoltées quatre jours après la greffe (tache h et E). D. Grossissement plus élevé de C montrant des îles de tumeur envahissantes dans le tissu conjonctif de CAM (flèches). E. Image stéréomicroscopique brute de la MCA greffée de cellules UM-SCC-1-GALR2 et de Rat DRG, récoltée le jour 17. F. Fluorescence fusionnée et images brightfield mettant en évidence le DRG étiqueté dans les cellules rouges et cancéreuses étiquetées en vert. G-H. Stéréomicroscopie de fluorescence du CAM greffé avec DRG et UM-SCC-1-GALR2 contre les cellules témoins, illustrant l'invasion directionnelle des cellules UM-SCC-1-GALR2 au DRG (H). Barres d'échelle : A-D, 500 m ; E-H, 2 mm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

pas problème raison solution
3.2.1 Impossible d'identifier l'attachement de l'embryon. La position d'attachement est difficile à voir pendant que l'œuf est immobile. Faites pivoter l'œuf rapidement latéralement pour pouvoir voir un long récipient attaché à la membrane de l'œuf.
3.3 et 3.8 Perforation de la membrane externe de coquille d'oeuf pendant le forage. Mauvais positionnement de la perceuse. Placez la perceuse presque parallèle à la coquille d'œuf pendant le forage. Si la membrane est perforée à l'étape 3.3 , il n'est pas nécessaire d'effectuer une perforation plus poussée avec l'aiguille comme indiqué à l'étape 3.5. En cas de saignement, jetez l'œuf.
4,3 DRG colle aux forceps. DRG est sec. Mouillez d'autres DRG dans HBSS et/ou utilisez une aiguille fine pour aider à détacher le DRG des forceps.
5,2 Annonces Les cellules ne sont pas parfaitement étiquetées avec du colorant fluorescent. Temps d'incubation. Certaines cellules ont besoin de plus de temps pour étiqueter. Gardez les cellules pendant une heure supplémentaire dans les médias avec du colorant fluorescent.
5,6 Annonces Bulle d'air sur la goutte de cellules. Utilisation de tout le liquide dans la pointe de la pipette. Chargez 1 L de plus que le volume désiré et n'utilisez pas la dernière L de la pipette lors de l'implantation des cellules. Cela permettra d'éviter les bulles d'air dans le mélange de cellules.
6,3 Annonces Impossible d'identifier dRG ou cellules lors de la récolte de la CAM. Petit DRG, DRG a été déplacé, les cellules cancéreuses se sont propagées. Si le DRG n'est pas vu, récoltez une plus grande surface de la CAM et placez-le dans un plus grand récipient pour la fixation. Vérifiez la position du DRG et de la cellule sous la fluorescence dans un microscope stéréo, puis coupez le CAM à une taille plus petite pour l'intégration de paraffine.

Tableau 1 : Table de dépannage

Discussion

Le modèle in vivo de CAM-DRG présenté ici traite des déficits des modèles précédents en démontrant l'interaction nerf-tumeur avant l'invasion physique du nerf par des cellules de tumeur. La plupart des études in vivo de PNI se concentrer sur la propagation tumorale et l'inhibition de la fonction motrice, et dépendent de l'injection directe de cellules tumorales dans les nerfs sciatiques23,24,25. L'injection de nerf sciatique est un modèle in vivo de PNI où les cellules cancéreuses sont injectées dans une souris ou un nerf sciatique de rat où la tumeur se développe plus tard. Les modèles d'injection sont utiles pour montrer la progression destructrice de tumeur et la douleur résultant des cellules de tumeur dans des nerfs. Le modèle de nerf sciatique est également approprié pour l'étude des facteurs qui permettent aux cellules cancéreuses de prospérer dans le nerf mais n'a pas la capacité d'évaluer la phase tôt de PNI, parce qu'il introduit des cellules directement dans le nerf, contournant des gaines nerveuses. Dans une approche différente, les greffes orthotopic chirurgicalement implantées de tumeur ont été employées pour caractériser l'importance des fibres adrénergiques et cholinergiques de nerf en favorisant la progression de cancer de la prostate, suggérant ainsi un rôle en avant des nerfs dans la progression de tumeur 26. Ce modèle s'est composé de l'ablation chimique des nerfs sympathiques et parasympathiques murines. Les fibres parasympathiques ont infiltré les tissus tumoraux, un processus lié à PNI, mais le modèle n'a pas été spécifiquement utilisé pour évaluer les interactions physiques entre le nerf et la tumeur. Le modèle CAM-DRG permet d'enquêter sur les interactions entre le nerf et le cancer pendant le PNI. De plus, les modèles de murine sont coûteux et prennent beaucoup de temps par rapport au modèle CAM. Nous suggérons d'utiliser le modèle CAM-DRG pour des études mécanistes de PNI.

Quelques avantages à l'approche de CAM-DRG incluent l'évaluation du PNI et d'autres phénotypes, tels que la croissance de tumeur, la métastasie, et l'angiogenèse. L'identification de l'ADN humain sur le CAM inférieur et/ou dans le foie peut être employée pour la détection de métastases des lignées humaines de cellules cancéreuses10,une approche expérimentale plus sensible comparée à la section et à la coloration de tissu, qui peuvent ne pas indiquer de petites métastases.

La méthode CAM-DRG comporte certaines limites, y compris le court laps de temps d'observation. Le système immunitaire de l'embryon est physiologiquement actif au jour 1827, lorsque le rejet et un processus inflammatoire peuvent avoir lieu, limitant le temps expérimental. Il est également important de considérer la distance en greffant des cellules de tumeur près du DRG ; de plus grandes distances DRG-cancer pourraient altérer les interactions moléculaires entre les cellules tumorales et le nerf, ou pourraient retarder le contact physique entre les deux composants du modèle. En outre, si les embryons sont plus âgés que stipulé dans ce protocole, les mouvements d'embryon pourraient déplacer les cellules tumorales. Par conséquent, il est important d'utiliser des œufs compatibles avec le jour 10 post-fertilisation pour la greffe cellulaire.

Puisque le système immunitaire n'est pas entièrement développé avant le jour 1827,le microenvironnement de tumeur dans le CAM est semblable à celui des modèles murins immunosuppressed souvent employés pour des études de cancer. Par conséquent, ce modèle n'est pas utile pour évaluer le rôle des cellules immunitaires dans la progression tumorale. Une autre limite est la disponibilité restreinte de réactifs pour les espèces de poulet, comme les anticorps, les cytokines et les amorces.

L'exécution précise de ce protocole exige la pratique ; cependant, il peut être fait par un membre de laboratoire sans avoir besoin d'une installation de base spécialisée. Le forage de la coquille d'œuf nécessite une formation. Il est recommandé de pratiquer des œufs à l'épicerie (non fécondés) avant de tenter ce modèle pour la première fois. La survie embryonnaire élevée et le succès du modèle peuvent être atteints si certaines étapes critiques pour éviter l'infection sont suivies : prophylaxie antibiotique appropriée des DRG dans 2% Pen/Strep, travaillant dans une armoire à débit laminaire, et évitant la dispersion des particules de coquille d'oeuf sur le CAM. Il est également crucial de maintenir une humidité stable pendant le temps total d'incubation des œufs. Nous recommandons d'augmenter le nombre d'œufs par groupe jusqu'à ce que la technique soit maîtrisée. Les problèmes les plus fréquents pour le personnel de laboratoire inexpérimenté sont la contamination des œufs et la technique inexacte pour la greffe de cellules.

La récolte de DRG exige également la formation ; pratique dans la récolte des DrG pour les expériences in vitro8 avant de tenter le modèle in vivo est recommandée. La culture DRG in vitro est l'occasion d'optimiser les conditions et d'améliorer la technique pour raccourcir la durée de l'extraction DRG. Une attention particulière à la technique de récolte est nécessaire lors de la saisie du DRG avec des forceps. Le DRG ne doit pas être tenu directement; pression doit être appliquée en dessous. Nous recommandons l'utilisation de la lentille grossissante pour mieux visualiser le DRG pendant l'extraction.

Fait important, lors de l'exécution de ce modèle pour la première fois, toutes les conditions doivent être optimisées pour la ligne cellulaire désirée. Ce modèle a été optimisé pour le rat DRG et la lignée cellulaire HNC UM-SCC-1. L'utilisation de la souris DRG et d'autres types de cellules cancéreuses peut nécessiter une optimisation. Avec une concentration plus élevée de cellules greffées, les tumeurs ont tendance à devenir plus épaisses et plus rigides, ce qui facilite les mesures tumorales. Compte tenu des œufs multiples pour chaque groupe et d'une concentration appropriée de cellules pour chaque œuf, plusieurs millions de cellules peuvent être nécessaires pour chaque expérience. Pour faciliter la planification, la connaissance du temps de doublement des cellules doit être prise en considération. Pour certaines étapes critiques de ce protocole, une table de dépannage est fournie (tableau 1).

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les subventions DES NIH/NIDCR DE027551 et DE022567 (NJD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco # 25200-056
ACE light source SCHOTT North America, Inc. Used to transilluminate the eggs
CellTracker Green CMFDA fluorescent dye Life Technologies # C7025 Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium.
CellTracker Red CMTPX fluorescent dye Life Technologies # C34552 Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium
Cordless rotary tool DREMEL # 866 Used to drill the egg shell
DMEM (1x) Gibco # 11965-092 Dulbeecco`s Modified Eagle Medium
DMSO Fisher Bioreagents # BP231-100 Dimethyl Sulfoxide
Dumont # 5 fine forceps Fine Science Tools (FST) # 11254-20 Used to harvest DRG
Egg incubator GQF  Digital Sportsman # 1502 Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls
Engraving cutter DREMEL # 108 Used to drill the egg shell
Extra fine Graefe forceps, curved Fine Science Tools (FST) # 11151-10 Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17
Extra fine Graefe forceps, straight Fine Science Tools (FST) # 11150-10 Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17
Fertilized Lohmann White Leghorn eggs Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. 
Filter Forceps EMD Millipore # XX6200006P Blunt forceps used to remove the egg shell
Fine surgical straight sharp scissor Fine Science Tools (FST) #14060-09 Used to harvest the CAM tissue on day 17
HBSS (1x) Gibco # 14025-092 Hank`s Balanced Salt Solution
HI FBS Gibco # 10082-147 Heat-inactivated Fetal Bovine Serum
Paraffin wax membrane Parafilm laboratory film # PM-996 Used to  temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8
PBS (1x) pH 7.4 Gibco # 10010-023 Phosphate Buffered Saline
Pen/Strep Gibco # 15140-122 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin
PFA (paraformaldehyde solution) Sigma-Aldrich # P6148-1KG Dilute in water to make a 4% PFA solution
Sprague Dawley rats (females) Charles River laboratories Strain code: 001 6-7 weeks old (190-210g in weight)
Tegaderm Transparent Film Dressing 3M # 9505W Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation

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References

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