Vivo模型中的小鸡胆膜模型,用于评估头颈部癌症的围神经入侵

Medicine
 

Summary

前神经入侵是头颈部鳞状细胞癌和其他肿瘤的侵略性表型。小鸡胆膜模型已用于研究血管生成、癌症入侵和转移。在这里,我们演示了如何使用该模型来评估体内的围神经入侵。

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Schmitd, L. B., Liu, M., Scanlon, C. S., Banerjee, R., D’Silva, N. J. The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. J. Vis. Exp. (148), e59296, doi:10.3791/59296 (2019).

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Abstract

神经入侵是癌症包围或侵入神经的表型。它与头颈部鳞状细胞癌和其他癌症的临床效果不佳有关。力学研究表明,神经和肿瘤细胞之间的分子串扰发生在物理相互作用之前。在物理神经-肿瘤相互作用发生之前,只有少数在体内的模型来研究神经外入侵,特别是研究早期进展。小鸡胆膜模型已用于研究癌症入侵,因为胆囊上皮的基底膜模仿了人类上皮组织的膜。在这里,我们重新利用小鸡胆膜模型来研究近神经入侵,将大鼠背根神经结节和人类头颈部鳞状细胞癌细胞移植到胆囊上皮上。我们已经演示了该模型如何可用于评估癌细胞侵入体内神经组织的能力。

Introduction

前神经入侵(PNI)是癌症中一种研究不足的表型,它与高疾病复发和头部和颈部鳞状细胞癌(HNC)1患者的存活率差有关。PNI在微观上被定义为神经或周围的肿瘤细胞2,3。当检测到PNI时,患者可能接受辅助疗法,如选择性颈部解剖和/或放射治疗4,5。然而,这些疗法是积极的,而不是PNI特定的。事实上,没有治疗来阻止PNI,主要是因为神经-肿瘤相互作用背后的机制仍然缺乏理解。

不同的分子机制与神经肿瘤的吸引有关;肿瘤和基质细胞释放神经肽和生长因子,促进神经发生6,7。在体外培养时,HNC细胞和背根神经结膜(DRG)都有强大的反应;在6、8、9的培养中几天后,可以看到对肿瘤细胞入侵和神经发生的影响。然而,在入侵之前,缺乏适当的体内模型来重述肿瘤-神经相互作用。在这里,我们提出了一个体内PNI模型,以研究HNC细胞和神经6的早期相互作用。我们调整了小鸡胆膜(CAM)模型,包括神经组分,在CAM中嫁接DRG,然后移植癌细胞来模拟内膜肿瘤微环境。

CAM模型已经成功地用于评估细胞通过基底膜的入侵,模仿癌瘤和黑色素瘤10,11,12的早期侵入性阶段。CAM 由上胆上皮上皮、间痛和下全食上皮组成。胆小节上皮在结构上类似于人类上皮10,13,因为胶原蛋白-IV丰富的基底膜模拟了将口腔上皮与底层结缔组织分离的基底膜。自1913年CAM进行第一次肿瘤移植以来,许多方法的适应被开发,以便评估血管生成15,16,17,肿瘤进展,和转移18.重要的是,将肿瘤移植到CAM上的技术变化很小,但应用在不断发展。报告的复杂性已经公布,包括药物筛选19个,骨组织工程20个,和纳米粒子抗癌药物21个。

我们的实验室使用 CAM-DRG 模型,其中哺乳动物 DRG 被分离并移植到上部 CAM 表面。在DRG被纳入CAM后,HNC细胞在DRG附近移植,并允许在整个体内系统采集和分析之前与DRG相互作用。重要的是,该系统允许通过DRG和肿瘤细胞的荧光标记对DRG和肿瘤进行活体目视观察。该协议包括多个步骤,在17天内执行不同级别的复杂性,从孵化卵子到收获CAM(图1)。表达不同感兴趣的蛋白质的细胞可以在此模型中进行测试,以阐明导致癌症神经入侵的分子通路,以及筛选直接针对神经入侵的药物。用候选药物预处理的细胞可以在CAM上嫁接,与未经治疗的对照组相比,PNI的发生被调查。事实上,CAM模型已经用于药物筛选,作为体外研究和啮齿动物临床前试验之间的中间步骤。

实验设计将随假设而变化。例如,如果测试特定蛋白质在PNI中的作用,实验组将包括移植的DRG与肿瘤细胞过度表达蛋白质,而对照组应包括DRG与细胞稳稳地转染空载体。几个不同的实验设计可用于解决具体问题。

Protocol

伦理声明:本协议中所有使用大鼠的实验均按照我们机构的IACUC(机构动物护理和使用委员会)规则进行。在这项研究中,对卵子的实验不受IACUC监管。

1. 卵孵育(估计时间:5分钟,零天)

  1. 获得无病原体受精的商业罗曼白勒霍恩卵,最好在受精后的第一天。每个实验组在38°C和54%湿度的卵子加湿培养箱中孵育6个卵子,每小时旋转8天。使用定期旋转卵子,以防止胚胎粘在蛋膜上。
    注:在孵育前,将卵子保存在18°C的冰箱中,以阻止胚胎发育最多1周。

2. 收集并制备DRG(估计时间:2小时,第8天)

注:小鼠和大鼠的实验需要获得(IACUC)的批准。在一些国家,使用鸡蛋也需要批准。

  1. 获得六到七周大的斯普拉格道利大鼠(约200克的重量)来提取DRG。
    注:一只大鼠应产生+40个宫颈和胸腔DRG。小鼠DRG也集成在CAM中,但是这个物种的条件需要独立优化。
  2. 在层流柜中,根据在其他地方发布的小鼠DRG提取协议,从宫颈和胸腔区域收获DRG。按照图 2了解如何获取 DRG。
    1. 在注射氯胺酮/西拉辛后,通过心脏穿刺使大鼠安乐死。用70%乙醇清洁大鼠皮肤,并用剪刀去除大鼠脊柱。不要进行宫颈脱位,因为这会损害宫颈 DRG。
    2. 按照图2A-D中提供的原理图解剖表示和毛图像,用同一剪刀分离宫颈、胸腔和腰部区域。将脊柱部分放入 10 厘米培养皿中,带 1x PBS,以保持组织湿润。
    3. 用细腻的骨剪刀,打开背和腹的椎骨,将脊柱分成两个侧半部分(图2E-F)。 将组织部分放在一个干净的10厘米的菜与新鲜的1xPBS。
    4. 使用钳子,轻轻地从椎骨分离脊髓,以可视化DRG (图2G)。
    5. 在每个 DRG 下方保持细钳,抓住它,并将其从骨腔中取出。不要直接握住 DRG,因为这会导致组织损伤。不要从DRG修剪斧头束(图2H)。
      注:避免使用腰椎DRG,因为这些降低了CAM中的集成。对于 DRG 区域位置,请按照图 2A-D上的原理图插图和总解剖图像进行操作。
  3. 收获后立即将每个DRG放入DMEM培养基,辅以2%青霉素/链霉素(Pen/链球菌)和10%热灭活胎儿牛血清(FBS),以帮助防止DRG的细菌污染。培养皿,培养介质4mL。
  4. 收获所有DRG后,将它们转移到新的培养皿与DMEM培养基补充2%笔/链条加10%FBS和含有1.25微克/mL的红色荧光染料。在细胞培养箱中孵育1小时。在此期间,准备鸡蛋以接收 DRG,如下所述(步骤 3)。
    注:收获DRG和完成荧光标记之间的间隔应足以准备卵子;DRG 可在培养箱中保存几个小时。

3. 制备用于DRG嫁接的鸡蛋(估计时间:1打鸡蛋1小时,第8天)

  1. 在层流柜中,调暗光线并照射卵子,以检查其活力和胚胎阶段。排除血管不良的卵子、未受精的卵子或与受精后第8天不一致的卵子。用自然产生的气囊轻轻地握住鸡蛋,朝向光源(图3A)。
  2. 用铅笔,标记蛋壳以接收开口 (图 3A-B)。
    1. 首先,将发育中的胚胎附着在CAM上,作为附着在蛋膜上的黑暗移动容器,并标记此区域以避免在此区域进行干预。
    2. 其次,选择操作窗口区域作为距胚胎附件至少2厘米的血管化区域,并绘制一个直径为1.5厘米的圆。距离操作窗口约 1 厘米,在血管化程度较低的区域绘制一个 0.5 厘米的正方形。
    3. 第三,绘制气囊区域,将其排除在操作区域之外。用十字架标记气囊的中间。
  3. 使用直径为 3 mm 的旋转工具和雕刻钻,在标记的正方形中钻蛋壳(图 3C)。使用钝钳去除蛋壳,而不去除外壳膜(壳底下的白膜)(图3D)。请小心工作,避免意外穿孔此膜。
  4. 使用与步骤 3.3 相同的钻头,在气囊区域标记的十字中精确穿孔,以允许空气流入鸡蛋(图 3E)。小心不要对鸡蛋施加太大的压力,以免破坏或损坏鸡蛋。
  5. 将 30 μL 的 HBSS 置于方形开口处,在完好的外壳膜上(图 3E)。使用30G注射器针,在此方形区域的外表膜中精确穿孔(图3F)。
  6. 将鸡蛋放入光源以可视化气囊。对滴珠橡胶灯泡施加压力,并将其置于气囊区域的小穿孔中(步骤 3.4)。释放灯泡中的压力,直到看到操作窗口区域中的两个膜分离(图 3G);重复此步骤的次数,以达到操作窗口区域膜的完全分离。
  7. 对所有鸡蛋重复步骤 3.1-3.6。
  8. 使用与步骤 3.3 相同的钻头,钻取圆形操作窗口时小心不要破裂外壳膜(图 3H)。通过轻轻粘上胶带来清除所有松散的颗粒,清洁鸡蛋表面。
  9. 用钝钳,从钻孔区域取出蛋壳(图3I-J)。其次,用同样的钳子,去除外蛋壳膜(图3K),小心不要在鸡蛋内引入小壳颗粒,以尽量减少污染。
  10. 在距蛋表面约 1 厘米深处识别 CAM。用石蜡蜡膜暂时覆盖每个打开的鸡蛋,以避免污染(图3L)。
  11. 对所有鸡蛋重复步骤 3.8-3.10。将卵子放回卵培养箱中,不旋转,直到 DRG 准备好进行移植。

4. 在 CAM 上移植 DRG(估计时间:40 分钟,第 8 天)

  1. 用HBSS培养基准备6厘米培养皿,在植入前清洗DRG。将准备好的鸡蛋带到细胞培养层流柜中。从鸡蛋中取出石蜡膜 (图4A)。
  2. 用精细无菌钳子,从培养基内轻轻抓住一个DRG。将其浸入 HBSS 培养基,以去除含有荧光染料的多余介质。非常轻柔地握住 DRG;否则,它会坚持在钳子上。
  3. 将 DRG 放在 CAM 上,小心不要刺穿膜 (图 4B-C)。如有必要,在将 DRG 放在 CAM 上时,使用另一对钳子帮助将 DRG 从钳尖上分离。
    注意:使用 HBSS 介质保持 DRG 湿润也有助于脱离钳子。
  4. 用无菌透明薄膜敷料盖住鸡蛋。盖住所有窗户和蛋壳中制成的穿刺,以避免细菌污染(图4D)。
  5. 在所有鸡蛋中嫁接DRG后,在38°C和54%湿度的加湿培养箱中孵育卵子2天,无需旋转。

5. 在 CAM 上移植肿瘤细胞(估计时间:1 小时 30 分钟,第 10 天)

  1. 在移植细胞前48小时,将培养板中所需的细胞板板。计算 UM-SCC-1 细胞每个卵子的 0.5 到 1 x 106细胞,以便在 CAM 中生成三维肿瘤。请注意,细胞数可能因细胞线而异。
  2. 吸气介质和添加 DMEM 培养基,辅以 1% 笔/链环加 10% FBS 和 2.5 μg/mL 的绿色荧光染料。在细胞培养箱中孵育1小时,在37°C下孵育。然后,检查显微镜上的荧光强度,吸气介质,用1x PBS洗涤一次,并加入0.25%胰蛋白酶长达10分钟。
  3. 在250 x g下离心4分钟,形成细胞颗粒。吸气DMEM培养基,在HBSS中重新悬浮,以洗涤多余的荧光染料。使用血细胞计对细胞进行计数。
  4. 将卵子带到细胞培养层流柜。用剪刀和钳子,打开覆盖鸡蛋的透明薄膜敷料(图4E-F)。
  5. 再次对计算出的细胞数进行离心,吸出HBSS培养基,以相同介质的5μL每5μL的6个细胞的最终浓度重新悬浮(图4G)。准备卵子总数所需的量(每个鸡蛋5 μL细胞悬浮液)。
  6. 将 5 μL 的电池溶液放入 CAM 上,距离 DRG 约 2 mm(图 4H)。在DRG和细胞之间保持均匀的距离。小心不要打扰卵子,以尽量减少细胞的扩散。
    注:要开始细胞植入,请选择 CAM 表面视觉干燥的卵子。如果表面太湿,细胞会扩散,不会形成常规肿瘤。
  7. 按照步骤 4.4 中的步骤,用新的薄膜敷料盖住鸡蛋。移植所有卵子中的细胞。在38°C和54%湿度下在加湿培养箱中孵育卵子7天,无需旋转。

6. 收获CAM(估计时间:1小时打鸡蛋,第17天)

  1. 用4%PFA(甲醛)pH7.0,每只鸡蛋一口,每孔2mL,制备6孔板。
  2. 把鸡蛋带到实验室的长凳上。使用连接到注射器的针头穿孔薄膜敷料,在 CAM 上滴约 300 μL 的 PFA,使 CAM 稍微变硬,从而促进收获过程。对所有鸡蛋重复此操作。
  3. 使用剪刀,取出蛋壳的上半部分(操作窗口所在的位置),并连接凸轮(图 4I)。将此半厘米的直径减小到大约 3 厘米,保持 CAM 中 DRG 和肿瘤细胞在中心进行移植的部分(图 4J)。用细钳抓住 CAM 并将其从蛋壳中分离,同时将其放入 PFA 中。朝上定向DRG和癌细胞(图4K-L)。
    注:3厘米区域应包括DRG和细胞。DRG 很容易被视为固定在 CAM 上的一个小肿块,但是肿瘤细胞有时在总检查时难以识别。
  4. 或者,使用剪刀,加宽操作窗口,从鸡蛋顶部取出蛋壳,同时保持 CAM 到位;移开操作窗口外约 1 厘米(图 4M),并识别 CAM 上的 DRG 和细胞(图 4N-O)。用细腻的钳子,将 CAM 放在其中一个边缘,然后轻轻抬起。用锋利细腻的剪刀,轻轻切割CAM以去除直径约3厘米的圆形区域(图4P),并将CAM置于PFA中,DRG和癌细胞朝上。
    注:避免在多个位置用钳子拉伸或保持 CAM,以尽量减少可能产生显微镜伪影的组织损伤。
  5. 将每个 CAM 膜放入一个井中 (图 4L)。轻轻抓住 CAM 的边缘,将组织展开在 PFA 中,或轻轻摇动板,直到 CAM 展开,以避免折叠伪影。
  6. 通过快速斩首使胚胎安乐死(第17天)。在室温下将PFA中收获的组织固定4小时。固定后,用1x PBS替换PFA,并将组织储存在4°C的PBS中,直到嵌入石蜡中进行切片。避免过度固定,以免损坏 CAM 的细腻血管。
  7. 使用荧光立体显微镜,在收获后2天内拍摄膜,以避免失去荧光信号。

Representative Results

经过优化,该方法在 CAM 中具有接近 100% 的 DRG 集成度。DRG集成的代表性结果如图5A-B所示。 DRG 在 CAM 中的集成非常重要,因为它在实验期间为 DRG 组织提供了可行性。在微观上,DRG在CAM(H&E染色)的结缔组织内可见。血管经常在DRG组织内出现,这表明CAM血液供应正在培育移植的组织。植入的肿瘤也由H&E在CAM上识别;根据入侵的多少,肿瘤可能不存在与无数肿瘤岛屿入侵结缔组织(图5C-D)。代表性图 5E-F显示了在明场成像和合并荧光方面收获的 CAM。UM-SCC-1细胞过度表达Galanin受体2,与对照细胞相比,DRG的入侵增加(图5G-H)。癌症-DRG相互作用被观察为癌细胞呈现对DRG的方向入侵(图5H)。

以不同方式执行数据分析。癌细胞对DRG的定向入侵被观察为二分变量,并且呈现这种入侵模式的卵子数量在每个组中被计算在内。使用比例的二项检验计算组之间的统计差异。使用ImageJ6测量癌细胞和DRG和肿瘤区域之间的接近度,并使用学生不测试评估组之间的差异。为了确保 ImageJ 分析的准确性,同一实验中的所有图像都应在同等的光线和曝光设置下拍摄。使用相同的标准调整所有图像的图像阈值和亮度后,使用分析粒子工具测量肿瘤面积,线性测量工具测量肿瘤-DRG距离。对于不同组的所有图像,使用分析的所有图像的粒子大小的恒定非常重要。在某些情况下,肿瘤变厚,可以用数字卡钳手动测量,从而进行体积测量。

使用石蜡嵌入CAM组织部分,H&E染色或免疫组织化学上皮细胞(抗细胞角蛋白抗体反应对人类物种)可以进行,允许评估结缔组织内的入侵。入侵被量化为每个卵子结缔组织中的肿瘤岛数。胶原蛋白IV的免疫荧光可用于突出基底膜。此外,如果使用带有GFP标记的癌细胞,则无需细胞角蛋白的免疫组织化学,即可在组织部分识别这些细胞。CAM实验中的转移和血管生成分析在10、17别的地方进行了讨论。

Figure 1
图 1:实验时间线,包括第 0、8、10 和 17 天的主要步骤。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:第8天的DRG提取.A.大鼠示意图,说明脊柱的解剖位置.B.显示不同身体区域的鼠椎结构图;绿色表示颈椎,深蓝色表示胸腔,橙色表示腰部,浅蓝色表示骨椎。C-D.手术切除后大鼠脊柱的文心方面;区域的分离,如B所示。E.解剖椎骨以打开脊髓管,将椎体分离成两个侧段,包含DRG.部分应穿过中线每个椎骨的背和腹侧。F.开放胸椎的毛方面.G.脊髓置换后,在椎道中很容易看到 DRG(箭头指向 3 DRG)。H. 带有相应斧头束(箭头)的一个 DRG(箭头)的立体显微图像。刻度条:C、D、FG,1厘米; H,1毫米。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:第8天准备鸡蛋。A-B.在手术前识别鸡蛋血管和标记。A上的箭头指向自然产生的气囊。C-D.在方形开口标记上钻孔和打开蛋壳。D上的箭头指向在钝钳的帮助下取出壳体后,完整的外壳蛋壳膜。E.气囊上标记的十字架用钻头穿孔,使空气流入鸡蛋(箭头)。30 μL 的 HBSS 介质被放置在方形开口的外壳膜上。F.使用精细注射器针,将外卵壳膜穿孔到HBSS先前放置的位置。G.压力施加在橡胶滴珠灯泡上,同时将其连接到气囊上钻孔的穿孔。当手指压力释放时,空气被真空吸尘,产生一个人工气囊(白色箭头),应延伸到操作窗口。H.操作窗的边缘与蛋壳几乎平行,以避免意外穿孔.I-J.用钝钳去除蛋壳。K.用钝钳去除外蛋壳膜,小心不要在 CAM 上引入颗粒(在表面以下 1 厘米处观察)。L.鸡蛋暂时覆盖石蜡蜡膜,并放回孵化器.请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:DRG、细胞和CAM的收获:第8天:A。清除石蜡膜后,易于观察 CAM。B-C.使用精细钳子,DRG 被放置在 CAM 上。D.蛋被薄膜敷料覆盖,放入孵化器;箭头指向覆盖的开口。第10天:E-F.薄膜修整被移除,DRG 位于(F 上的箭头)。G-H.5 μL 的电池溶液与 DRG 相距约 2 mm 的距离,滴落到 CAM 上。第 17 天:I-LM-P演示了用于采集 CAM 的两种不同的方法。I.蛋壳用细剪刀打开,开始在空气囊上钻孔穿孔,直到鸡蛋的上半部分被移除。含有CAM的蛋壳尺寸缩小到约3厘米. K-L.使用精细的钳子,CAM 与蛋壳分离并放置在 PFA 中。M-O.操作窗口的加宽用于可视化 CAM 上的 DRG 和癌细胞。箭头指向肿瘤,箭头指向 DRG。P.CAM 用细钳子抓住,用锋利的剪刀切开,并放置在 PFA 中,如L所示。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图 5:代表性结果。A. H&E 部分显示 DRG 在 CAM 中的集成。B. A的放大倍率更高;箭头显示 DRG 中的 CAM 血管。C.UM-SCC-1细胞移植到CAM上,在移植四天后收获(H&E染色)。D. C的更高放大倍率,显示CAM结缔组织(箭头)中的侵入性肿瘤岛。E.与UM-SCC-1-GALR2细胞和大鼠DRG嫁接的CAM的毛立体显微镜图像,于第17天采集。F.合并的荧光和亮场图像突出显示以红色标记的 DRG 和标记为绿色的癌细胞。G-H.CAM的荧光立体显微镜与DRG和UM-SCC-1-GALR2对对照细胞进行移植,说明UM-SCC-1-GALR2细胞对DRG(H)的定向入侵。刻度条:A-D,500 μm;E-H,2 毫米.请点击这里查看此图的较大版本.

问题 原因 解决 方案
3.2.1 无法识别胚胎附件。 当鸡蛋静止时,附件位置很难看到。 快速侧向旋转卵子,以便看到附着在蛋膜上的长容器。
3.3 和 3.8 钻孔时对外蛋壳膜的穿孔。 钻头定位错误。 钻孔时,将钻头与蛋壳几乎平行放置。如果膜在步骤3.3中穿孔,则无需按照步骤3.5所述用针进行进一步穿孔。如果发生出血,丢弃卵子。
4.3 DRG 粘在钳子上。 DRG 干燥。 在 HBSS 中再次使用湿 DRG 和/或使用细针帮助从钳子中分离 DRG。
5.2 细胞没有完全标记荧光染料。 孵育时间。某些单元格需要更多时间进行标记。 用荧光染料将细胞在介质中多保存一小时。
5.6 细胞上的气泡掉落。 使用移液器尖端中的所有液体。 负载超过所需体积1μL,在植入细胞时不要使用移液器的最终μL。这将避免细胞混合中的气泡。
6.3 收获 CAM 时无法识别 DRG 或细胞。 小DRG,DRG被取代,癌细胞扩散。 如果未看到 DRG,则收获 CAM 的较大区域,并放入更大的容器进行固定。在立体显微镜中检查荧光下的DRG和细胞位置,然后将CAM修剪为更小的石蜡嵌入尺寸。

表 1:疑难解答表

Discussion

这里介绍的CAM-DRG体内模型通过在肿瘤细胞物理侵入神经之前演示神经-肿瘤相互作用,解决了以前模型的缺陷。大多数PNI体内研究侧重于肿瘤扩散和抑制运动功能,并依靠肿瘤细胞直接注射到坐骨神经23,24,25。坐骨神经注射是PNI的体内模型,癌细胞被注射到小鼠或大鼠坐骨神经中,肿瘤随后生长。注射模型可用于显示神经内肿瘤细胞引起的破坏性肿瘤进展和疼痛。坐骨神经模型也适合研究允许癌细胞在神经中茁壮成长,但缺乏评估PNI早期的能力,因为它将细胞直接引入神经,绕过神经护套。在不同的方法中,手术植入的正交肿瘤移植物用于描述肾上腺素和胆碱能神经纤维在促进前列腺癌进展中的重要性,从而表明神经在肿瘤进展中的突出作用26.这种模式包括化学消融的鼠感和寄生神经的化学消融。寄生纤维渗入肿瘤组织,这是一个与PNI相关的过程,但该模型没有专门用于评估神经和肿瘤之间的物理相互作用。CAM-DRG模型允许研究PNI期间神经和癌症之间的相互作用。此外,与 CAM 型号相比,鼠模型既昂贵又耗时。建议利用CAM-DRG模型对PNI进行力学研究。

CAM-DRG 方法的一些优点包括评估 PNI 和其他表型,如肿瘤生长、转移和血管生成。在较低的CAM和/或肝脏上鉴定人类DNA可用于检测人类癌细胞系10的转移,这是一种比组织切片和染色更敏感的实验方法,这可能不会揭示小转移。

CAM-DRG方法存在一定的局限性,包括观测时间框架短。胚胎的免疫系统在第1827天生理上活跃,届时可能会出现排斥和炎症过程,从而限制了实验时间。在移植接近DRG的肿瘤细胞时,考虑距离也很重要;较大的DRG-癌症距离可能会损害肿瘤细胞和神经之间的分子相互作用,或者可能延迟模型两个组分之间的物理接触。此外,如果胚胎的年长超过本协议的规定,胚胎运动可能会取代肿瘤细胞。因此,使用与受精后第10天一致的卵子进行细胞移植是很重要的。

由于免疫系统在1827日之前尚未完全发育,CAM中的肿瘤微环境与通常用于癌症研究的免疫抑制鼠模型相似。因此,该模型对评估免疫细胞在肿瘤进展中的作用没有用处。另一个限制是鸡种试剂的供应受限,如抗体、细胞因子和引物。

准确执行此协议需要实践;然而,它可以通过实验室成员完成,而无需专门的核心设施。钻蛋壳需要训练。建议在首次尝试此模型之前,先在杂货(非受精)鸡蛋上练习。如果遵循一些避免感染的关键步骤,可以实现高胚胎存活率和模型的成功:在2%Pen/Strep中适当预防DRG,在层流柜中工作,避免蛋壳颗粒分散到 CAM 上。在卵子孵育期间保持稳定的湿度也是至关重要的。我们建议增加每组鸡蛋的数量,直到掌握该技术。对于缺乏经验的实验室人员来说,最常见的问题是卵子污染和细胞移植技术不准确。

DRG收获也需要培训;建议在尝试体内模型之前,先在体外实验收获DRG。体外DRG培养是优化条件、改进技术以缩短DRG提取持续时间的机会。用钳子抓住DRG时,需要特别注意收获技术。DRG 不应直接举行;压力应施加在压力下方。我们建议使用放大镜在提取过程中更好地可视化 DRG。

重要的是,当首次执行此模型时,所有条件都应针对所需的细胞系进行优化。该模型针对大鼠DRG和HNC细胞系UM-SCC-1进行了优化。使用小鼠DRG和其他癌细胞类型可能需要优化。随着移植细胞浓度越高,肿瘤往往变厚变硬,从而有利于肿瘤的测量。考虑到每个组有多个卵子和每个卵子的细胞适当浓度,每个实验可能需要几百万个细胞。为了便于规划,应考虑对细胞翻倍时间的了解。对于此协议中的一些关键步骤,提供了故障排除表 (表1)。

Disclosures

作者声明没有相互竞争的利益。

Acknowledgments

这项工作得到了NIH/NIDCR授予DE027551和DE022567(NJD)的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco # 25200-056
ACE light source SCHOTT North America, Inc. Used to transilluminate the eggs
CellTracker Green CMFDA fluorescent dye Life Technologies # C7025 Reconstitute 50µg in 20µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium.
CellTracker Red CMTPX fluorescent dye Life Technologies # C34552 Reconstitute 50µg in 40µL of DMSO and stock at -20oC. Use 1µL of stock solution/mL of culture medium
Cordless rotary tool DREMEL # 866 Used to drill the egg shell
DMEM (1x) Gibco # 11965-092 Dulbeecco`s Modified Eagle Medium
DMSO Fisher Bioreagents # BP231-100 Dimethyl Sulfoxide
Dumont # 5 fine forceps Fine Science Tools (FST) # 11254-20 Used to harvest DRG
Egg incubator GQF  Digital Sportsman # 1502 Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls
Engraving cutter DREMEL # 108 Used to drill the egg shell
Extra fine Graefe forceps, curved Fine Science Tools (FST) # 11151-10 Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17
Extra fine Graefe forceps, straight Fine Science Tools (FST) # 11150-10 Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17
Fertilized Lohmann White Leghorn eggs Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm. 
Filter Forceps EMD Millipore # XX6200006P Blunt forceps used to remove the egg shell
Fine surgical straight sharp scissor Fine Science Tools (FST) #14060-09 Used to harvest the CAM tissue on day 17
HBSS (1x) Gibco # 14025-092 Hank`s Balanced Salt Solution
HI FBS Gibco # 10082-147 Heat-inactivated Fetal Bovine Serum
Paraffin wax membrane Parafilm laboratory film # PM-996 Used to  temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8
PBS (1x) pH 7.4 Gibco # 10010-023 Phosphate Buffered Saline
Pen/Strep Gibco # 15140-122 10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 µg/mL Streptomycin
PFA (paraformaldehyde solution) Sigma-Aldrich # P6148-1KG Dilute in water to make a 4% PFA solution
Sprague Dawley rats (females) Charles River laboratories Strain code: 001 6-7 weeks old (190-210g in weight)
Tegaderm Transparent Film Dressing 3M # 9505W Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation

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References

  1. Schmitd, L. B., Scanlon, C. S., D'Silva, N. J. Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. Journal of dental research. 97, (7), 742-750 (2018).
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