מדידת אנזימטי יציבות על ידי טיטור איזותרמי Calorimetry

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

יציבות תרמית של פעילות אנזים נמדד בקלות על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC). כיום, רוב מבחני יציבות חלבון המשמש מדד חלבון התגלגלות, אבל אינם מספקים מידע אודות פעילות אנזימטיות. המרכז לטניס בישראל מאפשר קביעה ישירה ההשפעה של שינויים האנזים על היציבות של פעילות אנזים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chan, W. K., Mason, M., Hansen, L. D., Kenealey, J. D. Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry. J. Vis. Exp. (145), e59302, doi:10.3791/59302 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

עבודה זו מדגימה שיטה חדשה למדידת את היציבות של פעילות אנזים על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC). קצב חום שיא נצפתה לאחר זריקה אחת של הפתרון המצע לתוך פתרון אנזים הוא מתואם עם פעילות אנזים. זריקות מרובות של המצע לתוך אותו אנזים פתרון לאורך זמן להראות את אובדן פעילות אנזים. וזמינותו הוא אוטונומי, הדורשות כוח אדם מעט מאוד זמן, והוא החלים על מרבית התקשורת ואנזימים.

Introduction

אנזימים הם חלבונים מסוגל ותזרז מגוון רחב של תגובות אורגני. הפונקציה אנזימים רוב ב תמיסה מימית-ליד ה-pH נייטרלי וכך למנוע את השימוש בממיסים קשים. בגלל סלקטיביות גבוהה שלהם, אנזים מזורז ותגובות לייצר פחות (בחלק מהמקרים אין תוצרי לוואי) תוצרי לוואי מאשר זרזים לא בררניים כגון חומצות ובסיסים1. זה רלוונטי בעיקר בייצור מזון שבו כל תגובות כימיות חייב להיעשות כך המוצר הסופי הוא בטוח לצריכה אנושית. כיום, אנזימים משמשים להפקת פרוקטוז גבוהה סירופ תירס2, גבינה3, בירה4, לקטוז חלב5ומוצרי מזון חשוב. בעוד מאמר זה מתמקד אנזים לשימוש בתעשיית המזון, ישנם שימושים רבים ומגוונים עבור אנזימים כולל סינתזה התרופות, כימיה ירוקה.

השירות של אנזימים הוא מוגבל על ידי היציבות של פעילות אנזים, אשר תלויה שמירה על מבנה תלת-ממדי של האנזים. מבנה האנזים יכול התייצב על-ידי שינויים כגון PEGylation6, קיבעון על תמיכה מלאה7, שינויים גנטיים8ו פורמולציות. כיום, אנזים יציבות נמדד בדרך כלל על ידי calorimetry סריקה דיפרנציאלית (DSC), פעילות אנזים הקצה של מבחני9. DSC מודד את הטמפרטורה שבה מתגלה אנזים; גבוה יותר הטמפרטורה, המבנה יציבים יותר. עם זאת, אובדן של פעילות מתרחשת לעיתים קרובות בטמפרטורה נמוכה יותר מהנדרש כדי לגולל את אנזים או תחומים בתוך ה אנזים10. לכן, DSC אינה מספיקה לקבוע אם השינוי האנזים מגדילה את היציבות של פעילות אנזים. הקצה של אנזים מבחני הן בדרך כלל זמן אינטנסיבי, דורשים דוגמאות מרובות, לעתים קרובות כרוך תגובה ערכי צבע מוחלטים בשילוב אינה ישימה פתרונות מאוד צבעוניים או אטום או המתלים.

עבודה זו מדגימה שיטה למדידה ישירה היציבות של פעילות אנזים על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC). המרכז לטניס בישראל מודד את הקצב של חום שוחררו או נספג במהלך תגובה. מאז כמעט כל התגובות לייצר או קולטים חום, ITC יכול לשמש עבור רוב התגובות מזורז-אנזים, לרבות תגובות לא תגובה בשילוב או להופיע בתקשורת אטומים כגון חלב. ITC שימש במשך עשורים רבים כדי למדוד פרמטרים כימיים קינטי עבור סוגים רבים של תגובות, אבל פרוטוקול המובאת כאן מתמקד בשימוש ITC כדי למדוד את קצב חום שיא של תגובות מזורז-אנזים ומדגים כי פעילות אנזים הוא באופן ליניארי בקורלציה עם שיעור שיא החום. ITC מדידות של שיא החום המחירים בעיקר אוטונומי, דורשים מעט מאוד זמן צוות ההתקנה ולנתח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת דוגמאות

  1. 1,000 מ ל 0.1 M סודיום אצטט מאגר ב- pH 4.6
    1. למדוד 800 מ ל מים מזוקקים בתוך 1,000 מ ל סיים את לימודיו.
    2. שוקל 8.2 גר' נטול מים סודיום אצטט ולהוסיף אותו הספל.
    3. מניחים את הספל על צלחת stir, למקם את מוט מערבבים הספל, להפעיל את הצלחת מערבבים ומביאים לרתיחה עד התפרקה לחלוטין.
    4. כאשר נטול מים סודיום אצטט התפרקה לחלוטין, למדוד את ה-pH של התמיסה עם מד pH מכוילת.
    5. להוסיף 1 M HCl או NaOH בהתאם להשגת רמת ה-pH 4.6 הרצוי.
    6. להוסיף מים מזוקקים עד שאמצעי האחסון סך 1,000 מ.
    7. לאחסן בטמפרטורת החדר עד השימוש.
  2. אנזים פתרון
    1. הכינו 10 מ"ל של הגליל פתרון בטווח 10-30 מ"ג/מ"ל על ידי הראשון מ 8 מדידה ל 0.1 M סודיום אצטט מאגר pH 4.6 ב 15 מ"ל סיים את האנזים.
    2. הוסף את בופר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל עם אנזים ומנערים נמרצות עד האנזים יש התפרקה.
    3. מוסיפים עוד בופר עד שאמצעי האחסון הכולל 10 מ"ל.
    4. לאחסן את הפתרון אנזים ב 4 ° C עד השימוש.
  3. פתרון המצע
    1. כדי להכין פתרון המצע בטווח 300-600 מ מ, לחשב את כמות המצע הדרושים גרמים. כדי לעשות את הריכוז הרצויה.
    2. שוקל את המצע ומניחים לתוך גביע זכוכית 100 מ
    3. למדוד 20 מיליליטר בופר באמצעות צילינדר 25 מ ל סיים את לימודיו ולאחר מכן להוסיף זה כוס זכוכית.
    4. מניחים את הספל על צלחת מערבבים ומניחים מוט מגנטי מערבבים לתוך הספל. להדליק את החימום ולהתאים את המהירות מלהיב בהתאם.
    5. אפשר לערבב להמשיך עד המצע יש התפרקה.
    6. שופכים את הפתרון המצע לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ולהוסיף 0.1 M סודיום אצטט מאגר pH 4.6 עד שאמצעי האחסון הכוללת 45 מ. מערבבים ע י ניעור.
    7. לאחסן את הפתרון המצע בטמפרטורת החדר עד השימוש.

2. ביצוע הניסוי

  1. הכנת הכלי ITC
    1. ודא כי התא הפניה נטען עם 350 µL של מים מזוקקים. לפני טעינת האנזים לתוך התא לדוגמה, ודא כי התא מדגם נוקה.
    2. ניקוי פרוטוקול-מילוי המזרק טעינה עם 500 µL של 2% לניקוי (טבלה של חומרים), בזהירות את המחט לתוך התא מדגם, למלא את התא, הסר את הנוזל בעזרת המזרק באותו. השלך את הנוזל לתוך גביע. חזור על שלב זה פעמיים עם 2% לניקוי (טבלה של חומרים), שלוש פעמים עם אתנול 70% ולאחר מכן לשטוף 10 פעמים עם מים מזוקקים.
    3. למלא את המזרק טעינה עם 450 µL של אנזים פתרון, בזהירות את המחט כל הדרך עד לתחתית התא מדגם והקש על הבוכנה עד לקו µL 100 באיטיות כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.
    4. לשטוף את המזרק טיטור 50 µL עם מים מזוקקים שלוש פעמים על-ידי הצבת את מחט לתוך מים לאט תופס את המים לתוך המזרק, ואז מחלק את המים לתוך מיכל פסולת.
    5. להסיר שאריות מים על ידי שטיפה עם המצע פתרון שלוש פעמים.
    6. למלא את המזרק טיטור המצע פתרון על ידי ציור הפתרון עד המזרק מלא ללא כל בועות אוויר.
    7. עם המזרק עדיין בפתרון המצע, להסיר את הבוכנה ולאפשר כ 2 µL של אוויר כדי להזין העליון של המזרק והכנס הבוכנה.
    8. הסר את ידית buret המרכז לטניס בישראל, למקם את המזרק בתוך הידית buret ולהתעסק עד חזק.
    9. לנגב את קצה בחישה עם טישו נטולת מוך, ואז בזהירות למקם את ידית buret לתוך המכשיר ITC ונעל אותה במקום.

3. הגדרת ITCrun

  1. במחשב, לפתוח ITCrun ולחץ על ' הגדר'.
  2. לחץ על ערבוב קצב והגדר 350 סל"ד. בדוק את גודל מזרק (µL) ולהבטיח שזה ב- 50 µL.
  3. הגדר את הטמפרטורה ולחץ על ' עדכון'. מומלץ כי שלב זה ניתן לבצע לפחות שעה לפני הכנת את המרכז לטניס בישראל. דבר זה מאפשר מספיק זמן עבור כלי לחמם או לקרר כנדרש.
  4. עבור הגדרת הניסוי, בחר טיטור מצטבר.
  5. לחץ על הוסף כדי להתקין את הזריקות. להתאים את מרווח הזמן של הזרקת כדי 5,400 s, נפח הזרקה (µL) ועד 4 מספר זריקות ל- 4. לחץ על אישור כדי לאשר את הגדרות.
  6. תיבת Equilibration, בחר equilibrate אוטומטי גדול צפוי מחממת. (אם מחממת הצפוי הם קטנים, אחד באפשרותך לבחור קטן תחת מחממת הצפוי; עם זאת, זה יגביר את הזמן equilibration).
  7. להגדיר את התוכנית הבסיסית הראשונית ל-300 s.
  8. להתחיל לרוץ, לחץ על להתחיל סמל ליד קצב ערבוב ולאחר מכן לחץ על התחל אשר נמצא ליד סמל מפתח הברגים.
  9. שמור את הקובץ ולאפשר את המכשיר להפעיל.

4. ניתוח נתונים

  1. פתח את הקובץ ב- NanoAnalyze. לחץ על נתונים ובחר עמודות נתונים.
  2. בחר את כל הנתונים, העתק ולאחר מכן הדבק את הנתונים ל- Microsoft Excel.
  3. להתאים אפס בסיסית על-ידי הוספת הערך הנדרש 300 s כדי שזה אפס. להחיל את התיקון על העמודה כולה מערכי שיעור חום.
  4. למצוא את הערך המינימלי או המקסימלי של שער חום עבור כל זריקה באמצעות המשוואה: =MIN(cell:cell) או MAX(cell:cell). כל נקודת נתונים מייצג הפעילות האנזימטית מתרחשת שיא של האנזים אצל כל זריקה.
  5. מגרש גרפים של ערכי מינימום או מקסימום נגד הזמן שבו הערך אירעה בעת טיטור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות נציג איור 1 , איור 5 הצג נתונים שני אנזימים, לקטאז, אינוורטאז. לקטאז, אינוורטאז לעודד את הידרוליזה של דו-סוכר לתוך שני monosaccharides, endothermically, exothermically, בהתאמה. שתי תגובות אנזימטיות נוהלו בריכוזים אשר מנעה הרוויה של האנזים.

הנתונים לקטאז להדגים כיצד ניתן להשתמש ITC נתונים להערכת יציבות אנזים. ארבעה רציפים 4 µL זריקות של 600 מ מ לקטוז (איור 1), היו טיטרציה לתוך 20 מ"ג/מ"ל לקטאז. מרווח של 5,400 s בין כל זריקה היה מוחל, ומאפשר זה מספיק זמן לחזור לקו הבסיס הראשוני לפני כל זריקה. הפרוטוקול המתואר לעיל בוצעה ב 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 מעלות צלזיוס. בנוסף, לקטוז 600 מ מ היה טיטרציה לתוך 100 מ מ סודיום אצטט מאגר רק ב 55 ° C כפקד לחום של ערבוב. עבור כל זריקה של האנזים לתוך המצע, יש חום אקסותרמית הראשונית של ערבוב, לאחר מכן הידרוליזה תגובה אנדותרמית לקטאז מזורז של לקטוז מתרחשת עד השלמת התגובה ומחזירה קצב חום לקו הבסיס. ההזרקה של לקטוז בתוך תמיסת לקטאז ואז חוזר על עצמו שלוש פעמים נוספות עם שיא הגובה של תגובה תגובה אנדותרמית כל זריקה עוקבות קצת פחות מאשר הזריקה הקודמת בשל הירידה של פעילות אנזימטי. ניתן להמיר את הנתונים הגולמיים ואז להראות את שיא החום ביחס לזמן (איור 2 א). אז, להיות בכושר שיא גובה עבור כל זריקה רגרסיה ליניארית ומציין השיפוע אנזים יציבות בטמפרטורה שבחרת. יותר שליליות המדרון, האורווה פחות את האנזים. כצפוי, אנזים יציבות פוחתת עם העליה בטמפרטורה (2E איור).

כל זריקה של לקטוז המתואר באיור 1 גורמת לדילול לקטאז. כדי להדגים כי זה דילול אינה סיבת הירידה בפעילות אנזימטיות, ITC לקטאז פעילות וזמינותו נעשתה גם 25 ° c, ריכוז לקטאז הזריקה הראשונה וכן ב הזריקה האחרונה (איור 3). דילול זו התוצאה 8% ירידה בפעילות האנזים, ואילו הזריקה הרביעית ב וזמינותו מראה ירידה 73% בהיקף הפעילות. דילול לקטאז במהלך הניסוי ארבע-הזרקת ובכך הייתה השפעה קטנה יחסית (קרי, 11%) על פעילות האנזים. ההפסד בפועל של פעילות היה לכן 73-8 = 65%.

כפי שצוין לעיל, המבוא אחד היתרונות של שימוש המרכז לטניס בישראל היא כי תגובות אלו יכול להיעשות בתקשורת אטומים, כגון חלב. להפגין יכולת זו של המרכז לטניס בישראל, חלב היה מוזרק ישירות לתוך לקטאז (איור 4). מכיוון ה-pH של החלב אינו מותאם למאגר סודיום אצטט, יש חום אקסותרמית גדול של ערבוב מיד לאחר ההזרקה. החום אקסותרמית של שיא ערבוב נתפסת בפקד חסר לקטאז (איור 4, קו אפור) ובשנת זריקות שני עם חלב (איור 4, שחור, קווים מנוקדים) מיד לאחר החימום של ערבוב שיא. התגובה תגובה אנדותרמית המציין לקטאז הפעילות מתרחשת. החלב מכיל תערובת מורכבת של חלבונים, ויטמינים, מינרלים, לקטוז. בגלל המורכבות של חלב, סביר כי תגובות אחרות להתרחש במהלך התגובה שלנו. כדי להדגים כי הפסגה תגובה אנדותרמית היא בשל פעילות לקטאז, החלב היה מתובל 146 מ מ לקטוז. התגובה עם החלב לקטוז עלה (איור 4, קו מנוקד), שיא תגובה אנדותרמית ואת השטח מתחת לעקומה הם גדולים יותר מאשר חלב לבד (איור 4, שחור קו), המציין כי הפסגה תגובה אנדותרמית הוא אכן בשל הפעילות לקטאז. להסטת קו הבסיס מציין כי תגובה איטית ממשיכה בסיום התגובה לקטוז.

כדי להדגים כיצד assay זה ניתן להשתמש כדי להשוות את היציבות של פעילות אנזימטי של תכשירי אנזים אחר שני, יציבות אינוורטאז חינם ו אינוורטאז ותשמרו על קרום nanofiber ניילון-6 מושווים באיור 5-35 ° C11 . כמו וזמינותו לקטאז, µL 4 4 זריקות של סוכרוז נעשו ברצף, שער חום המרבי נקבע שיא הגובה עבור כל זריקה. כפי שמוצג באיור 6, הגולן שיא להקטין באופן ליניארי עם הזמן המציין הפחתת פעילות אנזים.

Figure 1
איור 1 : המרכז לטניס בישראל נתונים עקבות של פעילות לקטאז. כל מעקב מציג ארבעה רציפים 4 µL זריקות של 600 מ מ לקטוז לתוך פתרון לקטאז במאגר pH 4.6. העקבות נעשו ב 55 מעלות צלזיוס (שחור), 45 ° צלזיוס (אפור כהה), 35 ° C (מקווקו), 25 ° C (אפור בהיר) ושליטה אין אנזים (מנוקד)-55 מעלות צלזיוס. הקווים הישרים מייצגים את התאמת למינימום שיא תגובה אנדותרמית בעקבות כל זריקה.  אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : יציבות הפעילות אנזים בהתבסס על שיעור השינוי בפעילות שיא. הפעילות האנזימטית מתרחשת שיא עבור כל אחד ארבע זריקות ביחס לזמן (s) ב- 25 ° C (A), 35 ° C (B), 45 ° צלזיוס (C), 55 ° צלזיוס (D). התאם ליניארי של הנתונים מיוצגת על ידי הקו המלא. המדרונות של הקווים מצויד בחלקים A-D מותוות נגד הטמפרטורה ב- Eאנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : השפעת האנזים דילול על שיא הגובה בגיל 25 ° C. פעילות לקטאז נמדד בריכוז האנזים על זריקות הראשון והרביעי של 20 מ"ג/מ"ל (שחור), 18.62 מ"ג/מ"ל (אפור), בהתאמה. שיבוץ היא התמקדה הפעילות אנזים שיא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : מדידת פעילות לקטאז בחלב. ITC זכר זריקה של BYU creamery שומן חלב חינם לתוך מאגר (אפור), חלב לתוך לקטאז 20 מ"ג/מ"ל (שחור) וחלב מתובל 5% נוספים לקטוז לתוך 20 מ"ג/מ"ל (מנוקד). ציר y הוא מקוטע כדי להציג את התגובה תגובה אנדותרמית אנזים והחום אקסותרמית של ערבוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : דוגמה מייצגת של איך אנזים ITC יציבות וזמינותו ב 35 ° C יכול לשמש כדי להשוות בין שני תכשירים שונים של אינוורטאז. הפעילות של אינוורטאז מתאושש on a nanofiber ממברנה אנזים חינם מוצגים על ידי קווים אפור מנוקד וחשוך, בהתאמה. הקו השחור הוא הפקד עם אין אינוורטאז מציג רק את החום של ערבוב על סולמות מתאימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : הקשר הליניארי בין חום אקסותרמית אינוורטאז וקצב ריכוז שיא בעקבות זריקת 4 µL של סוכרוז 600 מ מ. עקום תקן זה יכול לשמש כדי לקבוע ריכוז אינוורטאז ב דוגמה לא ידוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היתרון העיקרי של ITC אנזים יציבות וזמינותו המתוארים כאן הוא אוטומציה. לאחר כל מאגרי המתאים ואת פתרונות נעשים, הגדרת זמן עבור כל assay הוא כ 15 דקות עבור האדם עושה את הבדיקה. לעומת זאת, מבחני קונבנציונליים עבור אינוורטאז ופעילות לקטאז דורשים בערך 2 h עם מעורבות מתמדת של האדם עושה את הבדיקה ולקחת הרבה פעילות אנזימטי מבחני הוקטנה באופן משמעותי יותר. בפרסום הקודם, הראו כיצד הנתונים מן השיטה ITC משתווה שיטה spectrophotrometric מסורתיות יותר של פעילות אינוורטאז11.

יתרון נוסף של ITC וזמינותו הוא את תחולתן כמעט כל אנזים12. לפיכך, בדיקת היציבות של אנזימים שונים תחת מסוים התנאים אינו מחייב הגדרת מספר מבחני שונות. בנוסף, וזמינותו ITC שימושי לקביעת היציבות של הפעילות של אנזים הרומן או של אנזים שאין וזמינותו של ערכי צבע מוחלטים מתאימים.  וזמינותו המרכז לטניס בישראל יכול להיעשות גם בתקשורת אטום וזה יתרון גדול במדעי המזון. מאחר רוב מבחני הקודם של פעילות אנזים משתמשות ספקטרופוטומטר, זריחה או הפריה חוץ גופית כדי למדוד פעילות אנזים, הם אינם תואמים מדיה אטום או מאוד צבעוניים. למרות עבודה זו ממחישה רק את השפעת הטמפרטורה על יציבותו של פעילות אנזים, השיטה ITC ישימה על רוב תנאים אחרים המשפיעים על יציבות אנזים (למשל, pH, מלחים, ממיסים מימית, וסוכנים denaturing).

כמו עם כל הניסויים ITC, המאגר המשמש עבור הפתרון אנזים, המצע צריך להתאים כמו באופן מדויק ככל האפשר. אי-התאמה של ריכוז או pH יכול לגרום לתופעות חום גדול עולה על הטווח הדינמי של קלורימטר. שימוש באותו מאגר מניות להכין פתרונות האנזים והן המצע מספיקה בדרך כלל. אבל אם לא, ניתן להתאים את הפתרונות על ידי dialyzing שני פתרונות נגד הפתרון אותו מאגר.

תנאי נוסף הוא כי האנזים לא צריך להיות המצע רווי, בכל מקרה, שיא הגובה הופך עצמאי של ריכוז המצע. כמו כן, זמן התגובה ללכת עד לסיומו או שיווי משקל בין זריקות יכול להיות מופרז ו/או האות עולה על הטווח הדינמי של קלורימטר. עם זאת, ריכוז המצע חייב להיות גדול מספיק כדי לספק אות חום חזק. אם האנזים המצע רווי, ריכוז המצע הניתנות להפחתה, או ריכוז האנזים גדל. בעת טעינת קלורימטר תא של מזרק, אחד עליך לוודא כי אין בועות נוכחים. אם בועה מוזרק או שוחרר מן התא במהלך ניסוי, זה יגרום אירוע חריג בתוך האות קצב חום.

השיטה ITC היא תלויה על השינוי אנתלפיה התגובה catalyzed ועל את קצב וכמות של התגובה. אם השינוי אנתלפיה עבור התגובה הוא קטן מדי, המצע מסיס יותר מדי, או האנזים אין מספיק פעילות, שער חום עשוי להיות קטן מדי כדי לקבל אות מספיק. בנוסף, אם האנזים מעוכב ריכוזים נמוכים של המוצרים, הירידה בפעילות אנזימטי נצפתה במהלך הניסוי שנגרם על ידי עיכוב מוצר, כמו גם על ידי אובדן של פעילות לאורך זמן. לדוגמה, ב טיטור לקטאז, הריכוז הסופי של 54 מ מ גלוקוז, גלקטוז גורם לירידה 27% הגובה שיא של פעילות האנזים 55° צלזיוס (נתונים לא מוצג). זה משמעותי פחות 78% לירידה לגובה שיא של הזרקת 1 כדי הזרקת 4 באיור1. עם זאת, ניתן לתקן על ידי מדידת הפעילות אנזים בנוכחות ריכוז המוצר הגיע במהלך וזמינותו. עוד יותר, titrating את האנזים עם סובסטרט פחות יכול להפחית את כמות המוצר עיכוב.

מגבלות אחרות עלולה להתרחש עקב האנזים. לדוגמה, עם כל זריקה האנזים יהיה מדולל. מכיוון ITC זו משתמשת מיכל התגובה של גלישה, במהלך הניסוי של אמצעי אחסון של פתרון המקבילה לגודל הזרקת מוסר עם כל זריקה. לכן, כמות קטנה של אנזים יוסר, ולהגדיל המוצרים של התגובה עם כל זריקה. ההשפעות של דילול ואת כמות האנזים הוסר יכול להישמר קטן אם גודל הזרקת נשמרת קטן, ולכן ריכוז גדול של המצע הוא לעתים קרובות הכרחי. בגלל היחס של הזרקת נפח אחסון כלי התגובה הוא קטן יותר ב ITCs עם כלי גדול התגובה ההשפעה דילול הוא קטן יותר באמצעי האחסון נמוך ITC להשתמש בעבודה זו. בנוסף, כל התגובה של אנזימים רבים ידרשו מיקרוגרם ל כמויות מיליגרם נמוך, אז אם יש לך אנזים זה יקר או קשה לטהר, זה יכול לאסור את השימוש של זה וזמינותו.

רוב הבעיות שעשויות להתרחש במהלך הזה assay הינם הקשורים תחזוקה הולמת ניקוי של כלי השיט התגובה ITC. אם המרכז לטניס בישראל לא מגיעים בסיס יציב, זה נובע לעיתים קרובות מיכל התגובה שאני לא מספיק נקיים. אנו ממליצים להשתמש חומר ניקוי חזק לאחר ניסוי בעת שימוש חלבונים ב- ITC כיוון חלבונים יכול לדבוק מיכל התגובה ומשבשים המדידה קצב חום. עבור יותר עמוק נקי, פתרון חומצה פורמית 50% מודגרות ב 55 ° C עבור עד 12 שעות ולאחריו ניקוי עם פתרון הניקוי (טבלה של חומרים), אתנול ומים יסיר רוב מזהמים.

בסופו של דבר, כי המרכז לטניס בישראל לוקח בערך 45 דקות ל- equilibrate לאחר טעינת פתרונות, הפעילות של אנזימים יציב יחסית או בתנאים שוליים לא ייתכן. אם האנזים הוא מומת במהלך זה זמן אין קליטה, יהיה זמין או הריקבון עשוי להיות מהיר מדי לאחר הזריקה הראשונה כדי לקבל נתוני היציבות.

כי וזמינותו ITC מודד ישירות פעילות אנזים, אותו ניתן להרחיב את מספר שימושים אחרים. לדוגמה, וזמינותו זו יכולה להתבצע עם ריכוז המעכב כדי לקבוע שהקבוע עיכוב, קי, בהתבסס על הירידה בפעילות האנזים עם הגדלת ריכוז המעכב. כמוצג באיור5, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם קיבוע אנזימים על תמיכה מלאה. קרום nanofiber נעשה שימוש בעבודה זו, אך אחרים תומך מוצק יכול לשמש גם אם ניתן לפתח שיטה כדי להוסיף ולהסיר אותו דרך הצינורית גישה קטן. השיטה ITC יכול ניתן להרחיב גם אנזימים שמשתנים באופן כימי או גנטית כדי לשפר את יציבות תרמית או כדי לקבוע את כמות האנזים פעיל בדוגמה לא ידוע (קרי, איור 6 מראה את הקשר הליניארי בין חום קצב שיא גובה אנזים ריכוז).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אף אחד

Acknowledgments

אף אחד

Materials

Name Company Catalog Number Comments
a-Lactose Fisher Scientific  unknown (too old) 500g
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min Alfa Aesar A13184-30 250g
Lactase  MP Bio 100780 5g
Hydrocholric Acid Solution, 1N  Fisher Scientific  SA48-500 500mL
Benchtop Meter- pH VWR 89231-622
Ethanol 70% Fisher Scientific  BP8231GAL 1gallon
Micro-90 Fisher Scientific  NC024628 1L (cleaning solution)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39, (1), 301-312 (2010).
  2. Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup. Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183, (1), 293-306 (2017).
  3. Budak, ŞÖ, Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology. 182-203 (2018).
  4. van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use. Energy. 115, 519-527 (2016).
  5. Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk. Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).
  6. Lawrence, P. B., Price, J. L. How PEGylation influences protein conformational stability. Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).
  7. Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts. Biotechnology Advances. 36, (5), 1470-1480 (2018).
  8. Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications. Applied Bioengeneering. 2, (1), 011501 (2018).
  9. Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Archives of Biochemistry and Biophysics. 531, (1), 100-109 (2013).
  10. Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. Transient model of thermal deactivation of enzymes. Biochimica et biophysica acta. 1814, (10), 1318-1324 (2011).
  11. Mason, M., et al. Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes. Jounal of Food Science. (2017).
  12. Leksmono, C. S., et al. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics