Medir estabilidad enzimática por calorimetría isoterma de titulación

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Summary

La estabilidad térmica de la actividad enzimática se mide fácilmente por calorimetría isoterma de titulación (ITC). Ensayos de estabilidad de la proteína la mayoría actualmente utilizan medir proteína despliegue, pero no proporcionan información sobre la actividad enzimática. CCI permite la determinación directa del efecto de las modificaciones de la enzima sobre la estabilidad de la actividad enzimática.

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Chan, W. K., Mason, M., Hansen, L. D., Kenealey, J. D. Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry. J. Vis. Exp. (145), e59302, doi:10.3791/59302 (2019).

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Abstract

Este trabajo demuestra un nuevo método para medir la estabilidad de la actividad enzimática por calorimetría isoterma de titulación (ITC). La tasa pico de calor observada después de una sola inyección de la solución sustrato en una solución de enzima se correlaciona con la actividad enzimática. Múltiples inyecciones de sustrato en la misma solución de enzima con el tiempo muestran la pérdida de actividad enzimática. El ensayo tiene carácter autónomo, que requiere muy poco tiempo de personal y es aplicable a la mayoría de los medios de comunicación y las enzimas.

Introduction

Las enzimas son proteínas capaces de catalizar una amplia variedad de reacciones orgánicas. Función de más enzimas en solución acuosa a cerca de pH neutro, evitando el uso de solventes agresivos. Debido a su alta selectividad, enzima catalizado reacciones producen menos (en algunos casos ningunos subproductos) subproductos de catalizadores no selectivos tales como ácidos y bases1. Esto es especialmente relevante en la fabricación de alimentos en todas las reacciones químicas deben hacerse para que el producto final es seguro para el consumo humano. Actualmente, se utilizan enzimas para producir jarabe de maíz de alta fructosa2,3de queso, cerveza4, leche sin lactosa5y otros productos alimentarios importantes. Aunque este trabajo se centra en el uso de enzimas en la industria de alimentos, hay muchos otros usos para las enzimas incluidas en síntesis química y de la droga verde.

La utilidad de las enzimas es limitada por la estabilidad de la actividad enzimática, que depende del mantenimiento de la estructura tridimensional de la enzima. La estructura de la enzima puede ser estabilizada por modificaciones como pegilación6, inmovilización en un soporte sólido7modificaciones genéticas8y formulaciones. En la actualidad, estabilidad de la enzima por lo general se mide por calorimetría diferencial de barrido (DSC) y ensayos de actividad enzimática de extremo9. DSC mide la temperatura a la que se desarrolla una enzima; a mayor temperatura, más estable la estructura. Sin embargo, la pérdida de actividad ocurre a menudo en una temperatura más baja que se requiere para desplegar la enzima o dominios dentro de la enzima10. Por lo tanto, DSC no es suficiente para determinar si una modificación de la enzima aumenta la estabilidad de la actividad enzimática. Análisis de enzima de extremo son generalmente intensivos en el tiempo, requieren de múltiples muestras y suelen implican una reacción colorimétrica juntada que no es aplicable a soluciones muy coloreadas u opacas o suspensiones.

Este trabajo muestra un método para la medición directa de la estabilidad de la actividad enzimática por calorimetría isoterma de titulación (ITC). CCI mide la tasa de calor liberado o absorbido durante el curso de una reacción. Puesto que casi todas las reacciones producen o absorben calor, ITC puede utilizarse para la mayoría de las reacciones catalizadas por enzima, incluyen reacciones que no tienen una reacción acoplada o se producen en medios opacos como la leche. ITC se ha utilizado por muchas décadas para medir parámetros cinéticos químicos para muchos tipos de reacciones, pero el protocolo que presentamos se centra en el uso de TIC para medir la tasa máxima de calor de las reacciones enzima-catalizadas y demuestra que la actividad enzimática es linealmente correlacionada con la tasa máxima de calor. ITC las medidas de tasas de máximo calor en su mayoría son autónomas y requieren de muy poco tiempo personal para configurar y analizar.

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Protocol

1. preparación de muestras

  1. 1.000 mL de tampón de acetato de sodio de 0.1 M a pH 4.6
    1. Medir 800 mL de agua destilada en un matraz aforado de 1.000 mL.
    2. Peso 8,2 g de acetato de sodio anhidro y añadir en el vaso.
    3. Coloque el vaso en una placa de agitación, colocar una varilla de agitación en el vaso, encienda la placa de agitación y revuelva hasta que se disuelva completamente.
    4. Cuando se haya disuelto completamente el acetato de sodio anhidro, medir el pH de la solución con un medidor de pH calibrado.
    5. Añadir 1 M HCl o NaOH por lo tanto para obtener el pH deseado de 4.6.
    6. Añadir agua destilada hasta el volumen total es de 1.000 mL.
    7. Almacenar a temperatura ambiente hasta su uso.
  2. Solución de enzima
    1. Preparar 10 mL de la botella de solución dentro de la gama 10-30 mg/mL por primera medición 8 mL del 0,1 M sodio acetato buffer pH 4.6 de 15 mL graduado de enzima.
    2. Añadir la solución tampón en un tubo cónico de 15 mL con enzima y agite vigorosamente hasta que la enzima se haya disuelto.
    3. Agregue una solución búfer más hasta que el volumen total es de 10 mL.
    4. Almacenar la solución de enzima a 4 ° C hasta su uso.
  3. Solución de sustrato
    1. Para preparar una solución de sustrato dentro de la gama de 300-600 mM, calcular la cantidad de sustrato necesario en gramos para hacer la concentración deseada.
    2. Pesar el sustrato y colocar en un vaso de precipitados de 100 mL vidrio
    3. Medir 20 mL de la solución tampón utilizando un cilindro aforado de 25 mL y añada en el vaso de vidrio.
    4. Coloque el vaso en una placa de agitación y coloque una varilla de agitación magnética en el vaso. Encender la calefacción y ajustar en consecuencia la velocidad de agitación.
    5. Permiten revolviendo para continuar hasta que el sustrato se haya disuelto.
    6. Verter la solución de sustrato en un tubo cónico de 50 mL y agregar 0.1 M sodio tampón de acetato pH 4.6 hasta el volumen total es de 45 mL. Mezclar por agitación.
    7. Almacenar la solución de sustrato a temperatura ambiente hasta su uso.

2. realizar el experimento

  1. Preparando el instrumento ITC
    1. Asegúrese de que la celda de referencia está cargada con 350 μl de agua destilada. Antes de cargar la enzima en la célula de la muestra, verificar que la celda de la muestra se haya limpiado.
    2. Limpieza de protocolo-llene la jeringa de carga con 500 μl de solución de limpieza de 2% (Tabla de materiales), Inserte cuidadosamente la aguja en la celda de muestra, llene la celda y Extraiga lentamente el líquido usando la misma jeringa. Deseche el líquido en un vaso de precipitados. Repita este paso dos veces con solución de limpieza de 2% (Tabla de materiales), tres veces con etanol al 70% y luego lavar diez veces con agua destilada.
    3. Llene la jeringa de carga con 450 μl de solución enzimática, cuidadosamente Inserte la aguja hasta el fondo de la celda de muestra y presionar el émbolo hasta la línea μl 100 lentamente para evitar la formación de burbujas de aire.
    4. Lavar la jeringa de titulación de 50 μL con agua destilada tres veces por colocar la punta de la aguja en el agua poco a poco tomando el agua en la jeringa, luego distribuye el agua en un recipiente de desechos.
    5. Eliminar el agua residual mediante enjuague con solución de sustrato tres veces.
    6. Llene la jeringa de titulación con solución de sustrato mediante la elaboración de la solución hasta que la jeringa está llena sin burbujas de aire.
    7. Con la jeringa en la solución de substrato, saque el émbolo y aproximadamente 2 μl de aire para entrar en la parte superior de la jeringa y vuelva a insertar el émbolo.
    8. Retire la manija de la bureta de la ITC, colocar la jeringa dentro del mango de la bureta y atornille hasta que quede apretado.
    9. Limpie la punta del agitador con una pelusa, luego cuidadosamente coloque el mango de la bureta en el instrumento ITC y trabarlo en su lugar.

3. configuración del ITCrun

  1. En el equipo, Abra ITCrun y haga clic en configurar.
  2. Revolvimiento de velocidad , haga clic en y a 350 RPM. Compruebe el tamaño de la jeringa (μL) y asegurar que está en 50 μl.
  3. La temperatura y pulse Actualizar. Se recomienda que este paso sea realizado por lo menos 1 h antes de preparar la ITC. Esto permite suficiente tiempo para que el instrumento para calentar o enfriar según sea necesario.
  4. Para la configuración del experimento, seleccione valoración incremental.
  5. Haga clic en Insertar para las inyecciones. Ajustar el intervalo de inyección a 5.400 s, volumen de inyección (μL) 4 y el número de inyecciones a 4. Pulse OK para confirmar la configuración.
  6. En el cuadro equilibrado, seleccione Auto-equilibrar y grande espera que calienta. (Si los calores esperados son pequeños, uno puede seleccionar pequeños bajo calores esperados, sin embargo, esto aumentará el tiempo de equilibrado).
  7. Establezca la línea de base inicial a 300 s.
  8. Para iniciar la ejecución, haga clic en el iniciar símbolo junto a la velocidad de agitación y haga clic en iniciar que se encuentra al lado el símbolo de la llave.
  9. Guarde el archivo y que el instrumento a ejecutar.

4. Análisis de datos

  1. Abra el archivo en NanoAnalyze. Haga clic en datos y seleccionar columnas de datos.
  2. Seleccionar todos los datos, copiar y luego pegar los datos en Microsoft Excel.
  3. Ajuste cero basal añadiendo el valor deseado en el 300 s para que sea cero. Esta corrección se aplica a toda la columna de valores de índice de calor.
  4. Encontrar el valor mínimo o máximo de la tasa de calor para cada inyección mediante la ecuación: =MIN(cell:cell) o MAX(cell:cell). Cada punto de datos representa la actividad enzimática máxima de la enzima en cada inyección.
  5. Trazar gráficos de los valores de MIN o MAX contra el tiempo en que el valor se produjo durante la valoración.

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Representative Results

Los resultados representativos figura 1 y figura 5 muestran los datos de dos enzimas, lactasa e invertasa. Lactasa e invertasa catalizan la hidrólisis de un disacárido en dos monosacáridos, endothermically y exotérmico, respectivamente. Ambas reacciones enzimáticas fueron funcionadas en concentraciones que impiden la saturación de la enzima.

Los datos de lactasa demuestran cómo datos ITC pueden utilizarse para estimar la estabilidad de la enzima. Cuatro inyecciones secuenciales de 4 μL de la lactosa de 600 mM (figura 1) se titulan en lactasa de 20 mg/mL. Un intervalo de 5.400 s entre cada inyección se aplicó, y esto permite tiempo suficiente volver a la línea de base inicial antes de cada inyección. El protocolo descrito anteriormente se realizó en 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C y 55 ° C. Además, la lactosa de 600 mM se tituló en tampón de acetato de sodio 100 mM sólo a 55 ° C como control para el calor de la mezcla. Para cada inyección de enzima sustrato, hay un calor exotérmico inicial de la mezcla, y posteriormente la lactasa catalizada endotérmico hidrólisis de la lactosa se produce hasta que se complete la reacción y la tasa de calor vuelve a la línea de base. La inyección de la lactosa en la solución de lactasa se repite tres veces más con la altura máxima de la reacción endotérmica de cada inyección posterior un poco menos de la inyección anterior debido a la disminución de la actividad enzimática. Luego pueden convertir los datos en bruto para mostrar el calor pico en relación con el tiempo (figura 2A-D). La altura máxima para cada inyección puede montar a una regresión lineal y la pendiente indica la estabilidad de la enzima a la temperatura seleccionada. Más negativo de la pendiente, la menos estable la enzima. Como era de esperar, estabilidad de la enzima disminuye con el aumento de temperatura (Figura 2E).

Cada inyección de lactosa que se describe en la figura 1 resultados en la dilución de la lactasa. Para demostrar que esta dilución no es la causa de la disminución de actividad enzimática, también se realizó el ensayo de actividad de la lactasa ITC a 25 ° C, la concentración de lactasa en la primera inyección y en la última inyección (figura 3). Esta dilución resulta en una disminución de 8% en la actividad enzimática, mientras que la inyección IV en el ensayo muestra una disminución del 73% en actividad. La dilución de la lactasa durante el experimento de inyección de cuatro así tuvieron un efecto relativamente pequeño (es decir, 11%) en la actividad enzimática. La pérdida real de la actividad por lo tanto, 73-8 = 65%.

Como se mencionó en la introducción una de las ventajas del uso de TIC es que estas reacciones pueden hacerse en medios opacos, como la leche. Para demostrar esta capacidad del CCI, leche se inyectó directamente en lactasa (figura 4). Porque el pH de la leche no es adecuado para el tampón de acetato de sodio, hay un gran calor exotérmico de mezcla inmediatamente después de la inyección. El calor exotérmico de mezcla máxima se ve en el control que carece de lactasa (figura 4, línea gris) y en las dos inyecciones con leche (figura 4, negro y las líneas de puntos) tras el calor de la mezcla de pico. Se produce la reacción endotérmica que indica actividad de la lactasa. La leche contiene una mezcla compleja de proteínas, vitaminas, minerales y lactosa. Debido a la complejidad de la leche, es probable que otras reacciones ocurren durante el curso de la reacción. Para demostrar que el pico endotérmico es debido a la actividad de la lactasa, se añadió la leche lactosa 146 mM. En la reacción con la leche con la lactosa (figura 4, línea de puntos), el pico endotérmico y el área bajo la curva son mayores que en la leche sola (figura 4, negro línea), indicando que el pico endotérmico es debido a la actividad de la lactasa. El desplazamiento de la línea de fondo indica que una reacción lenta continúa después de que termine la reacción de la lactosa.

Para demostrar cómo se pueden utilizar este análisis para comparar la estabilidad de la actividad enzimática de dos preparaciones de enzimas diferentes, la estabilidad de la invertasa libre y la invertasa inmovilizada en una membrana de nylon-6 nanofibras se comparan en la figura 5 a 35 ° C11 . Como en el ensayo de lactasa, las inyecciones 4 μL de sacarosa se realizaron secuencialmente y el índice de calor máximo determinado de la altura del pico para cada inyección. Como se muestra en la figura 6, las alturas de pico disminuyen linealmente con el tiempo que indica la disminución de actividad enzimática.

Figure 1
Figura 1 : Rastros de datos ITC de la actividad lactasa. Cada traza muestra cuatro inyecciones secuenciales de 4 μL de 600 mM lactosa en una solución de lactasa en solución tampón pH 4,6. Los rastros se realizaron a 55 ° C (negro), 45 ° C (gris oscuro), 35 ° C (discontinua), 25 ° C (gris claro) y sin control de enzima (punteada) a 55 ° C. Las líneas rectas representan el ajuste al mínimo pico endotérmico después de cada inyección.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Estabilidad de la actividad enzimática se basa en la tasa de cambio en actividad máxima. La actividad enzimática de pico para cada uno de cuatro inyecciones en relación con el tiempo (s) a 25 ° C (A), (B) a 35 ° C, 45 ° C (C) y 55 ° C (D). El ajuste lineal de los datos está representado por la línea continua. Las pendientes de las líneas equipadas en partes A-d se trazan contra temperatura en EHaga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : El efecto de dilución de la enzima sobre la altura máxima a 25 ° C. Actividad de la lactasa se mide la concentración de enzima en las primeras y cuarta inyecciones de 20 mg/mL (negro) y 18,62 mg/mL (gris), respectivamente. El margen es un zoom a la vista de la actividad enzimática de pico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Medición de la actividad de la lactasa en la leche. Rastro ITC de una inyección de BYU creamery leche descremada en búfer (gris), leche en lactasa de 20 mg/mL (negro) y leche enriquecida con 5% lactosa adicionales en 20 mg/mL (punteado). El eje y es discontinuo para mostrar la reacción de la enzima endotérmica y el calor exotérmico de mezcla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Un ejemplo representativo de cómo podía utilizarse el análisis de estabilidad de enzima ITC a 35 ° C para comparar dos diferentes preparaciones de invertasa. Las actividades de la invertasa inmovilizada en una membrana de nanofibras y la enzima libre se muestran por las líneas grises punteadas y oscuras, respectivamente. La línea negra es el control con ningún invertasa mostrando sólo el calor de la mezcla en escalas apropiadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : La relación lineal entre concentración de tarifa y la invertasa de la calor exotérmico de pico después de una inyección de 4 μL de sacarosa de 600 mM. Esta curva estándar se puede utilizar para determinar la concentración de invertasa en una muestra desconocida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Una gran ventaja del análisis de estabilidad de enzima ITC descrito aquí es la automatización. Una vez todos los buffers adecuados y soluciones, el tiempo de cada ensayo es aproximadamente 15 minutos para la persona que realiza el ensayo. Por el contrario, los ensayos convencionales para la actividad de la invertasa y la lactasa requieren aproximadamente 2 horas con la participación continua de la persona que realiza el ensayo y muchos ensayos de actividad enzimática toman mucho más trabajo. En una publicación anterior, hemos demostrado cómo los datos desde el método ITC se comparan con un método más tradicional de spectrophotrometric para la actividad de invertasa11.

Otra de las ventajas del ensayo ITC es su aplicabilidad a cualquier enzima12. Así, la estabilidad de las diferentes enzimas bajo un conjunto particular de condiciones de prueba no requiere configurar varios ensayos diferentes. Además, el ensayo ITC es útil para determinar la estabilidad de la actividad de una enzima de novela o de una enzima que no tiene un adecuado ensayo colorimétrico.  El análisis de la CCI también puede hacerse en medio opaco que es una ventaja importante en ciencia de los alimentos. Ya que ensayos anteriores la mayoría de la actividad enzimática utilizan la espectrofotometría, fluorescencia o luminiscencia para medir la actividad enzimática, no son compatibles con medios opacos o altamente coloreados. Aunque este trabajo muestra sólo el efecto de la temperatura sobre la estabilidad de la actividad enzimática, el método ITC es aplicable a la mayoría de otras condiciones que afectan la estabilidad de la enzima (e.g., pH, sales, disolventes no acuosos y agentes de desnaturalización).

Como con todos los experimentos ITC, el tampón utilizado para la solución de enzima y sustrato debe coincidir lo más cerca posible. Desajuste de la concentración o el pH puede producir efectos de calor grande que exceden el rango dinámico del calorímetro. Uso del mismo buffer stock para preparar soluciones de la enzima y el sustrato es generalmente suficiente. Pero si no, las soluciones se pueden emparejar por diálisis ambas soluciones contra la misma solución tampón.

Otra condición es que la enzima no debe ser el sustrato saturado, en cuyo caso, la altura máxima llega a ser independiente de la concentración de sustrato. También, el tiempo de la reacción ir a la terminación o al equilibrio entre las inyecciones puede llegar a ser excesiva y la señal puede exceder el rango dinámico del calorímetro. Sin embargo, la concentración del substrato debe ser lo suficientemente grande como para suministrar una señal de fuerte calor. Si la enzima está saturada de sustrato, puede disminuir la concentración del substrato, o aumentó la concentración de enzima. Cuando se carga la jeringa y la célula calorimétrica, uno debe asegurarse de que las burbujas no están presentes. Si una burbuja se inyecta o liberada de la célula durante el curso de un experimento, hará un evento anómalo en la señal de frecuencia de calor.

El método ITC es depende el cambio de entalpía de la reacción catalizada y la tasa y la cantidad de reacción. Si el cambio de entalpía para la reacción es demasiado pequeño, el sustrato es muy insoluble, o la enzima no tiene actividad suficiente, la tasa de calor puede ser demasiado pequeña para obtener suficiente señal. Además, si la enzima es inhibida por concentraciones bajas de los productos, la disminución de actividad enzimática observada durante el curso del experimento va a originarse por inhibición del producto así como por pérdida de actividad en el tiempo. Por ejemplo, en la valoración de la lactasa, la concentración final de 54 mM de glucosa y galactosa provoca una disminución de 27% en la altura de la actividad enzimática a 55° C (datos no mostrados). Esto es significativamente menor que la disminución del 78% en la altura del pico de inyección 1 inyección 4 en la figura 1. Sin embargo, esto puede corregirse mediante la medición de la actividad enzimática en presencia de la concentración de producto alcanzada durante el curso del ensayo. Además, valorar la enzima con menos substrato puede reducir la cantidad de inhibición del producto.

Otras limitaciones pueden ocurrir debido a la enzima. Por ejemplo, con cada inyección de la enzima será el diluido. Porque este CCI utiliza un recipiente de la reacción de desbordamiento, durante el curso del experimento un volumen de solución equivalente al tamaño de la inyección se elimina con cada inyección. Así, se extrae una pequeña cantidad de enzima, y los productos de la reacción aumentan con cada inyección. Los efectos de dilución y la cantidad de enzima quitado se pueden mantener pequeños si el tamaño de la inyección se mantiene pequeño, y por lo tanto a menudo es necesaria una gran concentración de sustrato. Porque el cociente del volumen de inyección al volumen del recipiente de reacción es menor en TIC con recipientes de reacción más grandes el efecto de dilución es menor que en el bajo volumen ITC utilizado en este trabajo. Además, cada reacción muchas enzimas requieren microgramo a miligramo bajas cantidades, por lo que si tiene una enzima que es caro o difícil de purificar, esto podría prohibir el uso de este ensayo.

La mayoría de los problemas que pueden surgir durante este ensayo son relacionados con mantenimiento y limpieza del recipiente de reacción de ITC. Si la ITC no alcanza una línea de base estable, esto es a menudo debido al recipiente de la reacción no está lo suficientemente limpia. Recomendamos usar un detergente fuerte después de cada experimento utilizando proteínas en el ITC porque las proteínas pueden pegarse al recipiente de reacción e interferir con la medición del calor. Para una más limpia, una solución de ácido fórmico al 50% se incubó a 55 ° C por 12 h seguido por limpieza con solución de limpieza (Tabla de materiales), etanol y agua elimina contaminantes más.

Por último, ya que la ITC lleva unos 45 minutos se equilibren luego de cargar soluciones, la actividad de las enzimas relativamente inestables o en condiciones marginales no es posible. Si la enzima se inactiva durante este tiempo no hay señal, estará disponible o el decaimiento puede ser demasiado rápido después de la primera inyección para obtener datos de estabilidad.

Porque el ensayo de CCI mide directamente la actividad enzimática, puede ser extendido a un número de otros usos. Por ejemplo, este análisis podrían hacerse con el aumento de las concentraciones del inhibidor a determinar que la constante de inhibición, Ki, basado en la disminución de la actividad enzimática con el aumento de la concentración de inhibidor. Como se muestra en la figura 5, se puede adaptar este protocolo de enzimas inmovilizadas en un soporte sólido. Una membrana de nanofibras se utilizó en este trabajo, pero también se podrían utilizar otros soportes sólidos si puede desarrollar un método para insertar y retirar a través del tubo de acceso pequeña. El método ITC podría extenderse también a las enzimas que se alteran químicamente o genéticamente para mejorar la estabilidad térmica o para determinar la cantidad de enzima activa en una muestra desconocida (es decir, la figura 6 muestra la relación lineal entre el pico de la tasa de calor altura y enzimas la concentración).

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Disclosures

Ninguno

Acknowledgments

Ninguno

Materials

Name Company Catalog Number Comments
a-Lactose Fisher Scientific  unknown (too old) 500g
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min Alfa Aesar A13184-30 250g
Lactase  MP Bio 100780 5g
Hydrocholric Acid Solution, 1N  Fisher Scientific  SA48-500 500mL
Benchtop Meter- pH VWR 89231-622
Ethanol 70% Fisher Scientific  BP8231GAL 1gallon
Micro-90 Fisher Scientific  NC024628 1L (cleaning solution)

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