확산의 분석 및 형광 현미경 검사 법에 의해 수용 체 막의 클러스터 크기에 대 한 프로토콜을 처리 하는 이미지

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Immunology and Infection

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Summary

여기, 우리는 확산 계수, 형광 현미경 검사 법에 의해 감지 하는 단일 입자의 모션 및 클러스터 크기의 종류의 정량적 인 평가 허용 하는 이미지 분석을 추적 하는 단일 입자에 대 한 프로토콜을 제시.

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Sorzano, C. O., Martínez-Muñoz, L., Cascio, G., García-Cuesta, E. M., Vargas, J., Mellado, M., Rodriguez Frade, J. M. Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (146), e59314, doi:10.3791/59314 (2019).

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Abstract

비디오 시퀀스에 그들의 궤도의 후부 분석 추적 입자 요즘 많은 생물학 연구에서 일반적인 작업입니다. 모델 클러스터 세포 막 수용 체의 분석을 사용 하 여, 피지 (ImageJ) 및 Matlab 루틴을 사용 하 여이 이미지 분석 작업에 대 한 자세한 프로토콜 소개: 1) 관심 영역을 정의 하 고 마스크;이 지역에 맞게 디자인 2) 형광 현미경 동영상; 입자 추적 3) 선택 된 트랙의 확산 및 강도 특성 분석. 확산 계수의 정량 분석, 모션, 및 클러스터 크기의 유형 형광 현미경으로 얻은 이미지 처리 하며 객관적으로 입자 역학과 수정 결과 확인 하는 유용한 도구 환경 조건입니다. 이 문서에서는 이러한 기능 분석에 대 한 상세한 프로토콜 선물이. 설명 하는 방법을 여기 뿐만 아니라 단일 분자 추적 탐지를 허용 하지만 측면 확산 세포 막에서 매개 변수 추정 자동화, 궤적의 유형을 분류 하 고 따라서 극복 하는 완전 한 분석을 수는 세포 막에서 그것의 전체 궤도에 자리 크기 측정에 어려움

Introduction

막 단백질 지질 bilayer에 포함 된 열 확산으로 지속적인 운동에 있습니다. Intermolecular 상호 작용 올리고 단위체에서 크기에서 변화 하 고 신호 복합물의 안정성에 영향을 단지의 형성으로 그들의 역학 세포 응답 통제에 필수적입니다. 단백질 역학을 제어 하는 메커니즘을 elucidating 따라서 세포 생물학, 신호 전달 경로 이해 하 고 예기치 않은 셀 기능을 식별 하는 데 필요한 새로운 도전 이다.

일부 광 방법은 개발 되었다1셀 생활에 이러한 상호 작용을 공부 하. 이러한 가운데, 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 검사 법, 1980 년대 초에 개발 또는 세포 막2근처 매우 분자 상호 작용의 연구를 수 있습니다. 공부 하 고 살아있는 세포에 TIRF 데이터에서 가져온 막 단백질 궤적의 동적 매개 변수, 단일 입자 추적 방법 (SPT)가 필요 합니다. 여러 알고리즘이 사용할 수 있습니다, 있지만 우리 현재 Jaqaman 외.3 는 입자 결과 트랙을 연결 하려면 연속 프레임 사이 연결 하 여 입자 모션이 조밀한 입자 필드에 의해 그 사용 완전 한 궤도 (임시 입자 실종)에 세그먼트. 소프트웨어를 병합 하 고 그 결과 집계 및 분리 이벤트3에서 분할 입자를 캡처합니다. 이 소프트웨어의 출력 데이터 중 하나는 각 프레임에서 그들의 X 및 Y 위치를 정의 하 여 전체 궤적에 따라 입자의 탐지 이다.

일단 입자 감지, 우리 짧은 timelag 확산 계수 (D1-4),45를 확인 하려면 다른 알고리즘을 적용 합니다. 순간 확장 스펙트럼 (MSS)6,,78 분석을 적용 하거나 조정 곡선9제곱 변위 (MSD)의 '알파' 값을 피팅, 우리도에 따라 입자 분류 궤도의 유형입니다.

형광 이미지 자리 강도 분석 필드10,11에 과학자에 대 한 공유 목표 이다. 사용 되는 가장 일반적인 알고리즘은 소위 수와 밝기. 이 메서드는 그럼에도 불구 하 고 모바일 분수에서 입자에 올바른 프레임으로 프레임 강도 감지를 허용 하지 않습니다. 따라서, 이러한 입자 농도-의해-프레임을 평가 하 고 그들의 집계 상태를 결정 하는 새로운 알고리즘을 생성, 되었습니다. 각 입자의 좌표 U-Track2 소프트웨어3를 사용 하 여 감지, 일단 정의 강도 각 프레임에 완전 한 궤도 통해 각 프레임에서 셀 배경은 고려도 합니다. 이 소프트웨어 자리 강도 및 셀 배경 결정 하는 다른 가능성을 제공 하 고, 입자 감지 (클러스터 크기)에 있는 단백질의 대략적인 수를 계산 합니다 참조로 알려진된 단위체와 dimeric 단백질을 사용 하 여.

이 문서에서는 이러한 세 단계를 수행 하는 주의 가이드 설명: 1) 검색 및 U-트랙;를 사용 하 여 형광 현미경의 비디오에 따라 단일 입자 추적 2) MSS; 여 긴 궤적을 가진 입자의 움직임 (밀폐, 무료, 또는 감독)의 유형과 그 입자의 즉석 확산 계수 (D1-4) 분석 3) 각 장소에 대 한 예상된 배경 형광에 의해 수정 비디오 따라 자리 강도 측정 하는. 클러스터 크기 추정 및 photobleaching 단계 식별 수 있습니다.

이 프로토콜을 사용 하는 전문된 기술을 요구 하지 않는다 세포 배양으로 어떤 실험실에서 수행할 수 있습니다, 그리고 flow cytometry 및 현미경 검사 법. 프로토콜은 ImageJ 또는 피지 (ImageJ12배포), U-트랙3및 일부 ad hoc 만든 루틴 (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip)를 사용합니다. U-트랙 및 ad hoc 루틴 모든 호환 컴퓨터에 설치할 수 있는 Matlab을 통해 실행 합니다.

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Protocol

1입니다. 생물 샘플의 준비

  1. 10 %fcs 보충 RPMI 1640 매체에 Jurkat 세포 성장 NaPyr 및 L-글루타민 (완전 한 RPMI). Electroporate Jurkat 세포 (20 x 106 셀/400 µ L 10% fcs RPMI 1640의) 단위체 GFP 표시 chemokine 수용 체 벡터 (CXCR4-AcGFP, 20 μ g) 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 그것의 탐지를 허용 하도록.
    참고: 그것은 mCherry, mScarlet, 등 등과 같은 다른 단위체 형광 단백질을 사용 하 여 수 있습니다.
  2. transfection 후 24 h 셀 교류 cytometer 세포 생존 능력 및 CXCR4 AcGFP 식 결정을 분석.
  3. 같이 transfected 수용 체의 낮은 식 TIRFM 실험에 개별 추적에 대 한 단일 입자 추적을 보장 하는 데 필요한 세포 GFP낮은 긍정적인 세포 (그림 1)의 분류에 의해 CXCR4 AcGFP 저급을 표현 하는 셀을 선택 궤적9.
  4. 세포 표면에 있는 수용 체의 수를 수량화 합니다.
    참고: 예제13셀/8500 ~ 22000 AcGFP 표시 된 수용 체로 2 ~ 4.5 입자/μ m2에 해당 합니다.
  5. Resuspend 완전 한 RPMI 셀을 정렬 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 적어도 2 시간에 대 한 품 어. 셀 (300 x g, 5 분), 원심 및 TIRF 버퍼 (HBSS, 25mm HEPES, 2 %FCS, pH 7.3)에 그들을 resuspended.
    1. 플레이트 35 m m 유리 바닥 microwell 요리 (2-3 105 셀/접시 배)에 적절 한 리간드 (즉, CXCL12, 100 nM, 1 h, 37 ° C)의 유무에서 fibronectin (20 μ g/mL, 1 h, 37 ° C)와 코팅. 이미지 수집 전에 셀 (37 ° C, 5% CO2에서 20 분)를 품 어.
  6. EM-CCD 카메라, 기름 침수 목표 x 100 갖춘 TIRF 현미경을 사용 하 여 실험을 수행 (HCX PL apo는 100 x 1.46 / 없음) 및 488 nm 다이오드 레이저. 현미경에는 온도 제어 및 CO2보육 수 있습니다. 찾아서 초점을 조 악 하 고 정밀한 초점 손잡이, photobleaching 효과 최소화 하기 위해 밝은 필드를 사용 하 여 셀. TIRF 모드에서 미세 초점 조정에 대 한 낮은 레이저 강도, 단일 입자 탐지 또는 photobleaching 효과 (5% 레이저 전원, 28 μW) 유도에 부족을 사용 합니다.
  7. 약 50의 영화 (이미지 시퀀스) 취득 프레임 사이의 시간 간격을 최소화 하는 s. 사라져 필드의 침투 깊이의 70-90 nm 이어야 한다. ".Lif" (video.lif)로 각 실험 조건에 대 한 인수 영화를 저장 합니다.
    참고: 영화 설명된 예제에서 레이저 전력에서 49% 인수 했다 (2 mW) 90 ms의 노출 시간과 49 98 ms의 시간 간격 s (500 프레임). 선택한 사라져 웨이브의 보급률은 90 nm.

2. 다양 한 이미지와 마스크의 창조

  1. 각 실험 조건 (video.lif)에 대 한 모든 시리즈에 대 한 다른 폴더를 포함 해야 하는 새 폴더 (VideoName)를 만듭니다. 각 폴더는 비디오 이미지에 대 한 "videoSeq" 폴더와 분석의 결과 대 한 "결과" 폴더에 포함 됩니다. 이 순간 파일 구조는 다음 있는지 확인 합니다.
    VideoName/video.lif
    VideoName/계열1/videoSeq
    VideoName/계열1/결과
    참고: 현미경에서 다른.lif 파일 (FN, FN + 자위대) 모든 치료 상태에 대 한 몇 가지 동영상을 얻을 수 있습니다. "video.lif" input.lif 비디오 파일을 모든 TIRF 영화 취득 (시리즈) 현미경에서 수행에 해당 합니다. "videoSeq" 폴더는 우리가 분석 하는 영화의 500 프레임 포함 됩니다. "결과" 폴더 분석 수행에서 발생 하는 모든 파일이 포함 됩니다. 정확한 명칭 및 다른 폴더의 지역화는 알고리즘의 올바른 기능을 위해 필수적입니다. 대담한에 있는 이름은 위의 목록에 고정 됩니다 (즉, 그들은 스크립트에 의해 자행 하는 이름은 때문에이 방법으로 호출할 수 있다). 이름에 대담한 실험 수행에 맞게 변경할 수 있습니다.
  2. 끌어서 피지 메뉴 모음 및 클릭 확인 lif 파일을 BioFormats (보충 그림 1)를 사용 하 여 파일을 삭제 하 여 피지와 ImageJ TIRFM 비디오 (.lif 파일)를 엽니다.
  3. 처리 하 고 클릭 확인 (추가 그림 2A) 시리즈를 선택 합니다. 이 비디오의 분석에 대 한 마스크를 디자인 하려면 가져오기 또한 다른 chromophores와 멀티 채널 이미지 (예제에서는 시리즈 1은 다중 채널 이미지와 해당 비디오 시리즈 2). ImageJ 스택으로 비디오 (및 멀티 채널 이미지)를 열어야 합니다. (보충 그림 2B) 예제, 이미지는 왼쪽에 고 동영상은 오른쪽에.
    참고: 비디오에 대 한 마스크의 창조, 필요 하지 않은 경우 단계 2.5로 이동 합니다.
  4. 마스크를 만듭니다. 마스크의 디자인에 대 한 유용한 채널 단일 이미지를 만듭니다. 이 경우에, 재미 있는 채널 들에서 빨강, 녹색 및 회색.
    1. (보충 그림 3A) 다중 채널 이미지에서 채널 분할: 막대에서 이미지 를 선택 메뉴 및 클릭 색상 | 채널 분할. 다른 채널은 별도 이미지 (보충 그림 3B)으로 표시 됩니다.
    2. 병합 단일 이미지 (보충 그림 4A)에서 다시 3 채널: 막대에서 이미지 를 선택 메뉴 및 선택 색상 | 채널 병합. 적절 한 채널을 선택 하 고 확인 (추가 그림 4B)를 누릅니다. 새로운 비 스택 이미지를 있을 것입니다 (추가 그림 4C) 생성.
    3. 동기화 윈도우 도구 (보충 그림 5A)를 사용 하 여 두 개의 창을 동기화: 막대에서 분석 을 선택 메뉴 | 도구 | Windows 동기화. 동기화 이미지 가능성과 새로운 창 (보충 그림 5B) 표시 됩니다.
    4. 두 개의 창으로 동기화 (만 비디오 멀티 채널 이미지가 관련 된 경우), 두 창에 동일한 지역이 잘립니다 수 있습니다. ImageJ 부동 메뉴의 사각형 선택 도구와 관심 영역을 그립니다. 막대에서 이미지 를 선택 메뉴 및 선택 자르기 (보충 그림 6A). 2 자른된 이미지를 개별적으로 표시 됩니다 (보충 그림 6B).
    5. Windows 동기화 관리자에서 모든 Unsynchronize 버튼을 누르면 두 창 (보충 그림 6B) unsynchronize.
  5. 마스크 단계 2.4에서 만들지 않은, ImageJ 부동 메뉴의 사각형 선택 도구와 관심 영역을 그립니다.
  6. 이미지 시퀀스 해당 비디오 디렉토리 (보충 그림 7A) 디렉터리 videoSeq 에 비디오를 저장: 막대에서 파일 선택 메뉴 및 클릭 로 저장 | 이미지 시퀀스... video0000.tif, video0001.tif,..., video0499.tif (보충 그림 7B)으로 비디오 시퀀스에 대 한 레이블 이름을: 이름 상자에 비디오 로 이름을 변경 하 고 확인을 클릭 합니다. 시퀀스는 성공적으로 U-트랙에 의해 사용 되는 디렉터리에 혼자 있어야 합니다.
    참고: 그렇지 않으면 단계 2.8로 이동 비디오에 대 한 마스크를 설계.
  7. 마스크 디자인. 다중 채널 이미지를 선택 하 고 엽니다 세분화 편집기 플러그인 (추가 그림 8A): 바에서 플러그인을 선택 메뉴 및 선택 세분화 | 세그먼트화 편집기입니다. 추가 하 고 세그먼트화 편집기 (보충 그림 8B, C)의 레이블을 마우스 오른쪽 클릭 하 여 필요에 따라 세분화의 레이블 이름을 바꿉니다.
    1. ImageJ 부동 메뉴에서 적절 한 선택 도구를 선택 (여기에서는 자유형) 레이블 (녹색)을 선택 하 고 디자인 먼저 바깥쪽 마스크 (보충 그림 9A). 일단 설계, 복합 창의 선택 옵션에 선택한 마스크 버튼을 누르면 + 뷰어 (보충 그림 9A)에 표시 됩니다. 다음 레이블 (인테리어, 빨간색에서)이이 단계를 반복 (보충 그림 9B).
      참고: 녹색 및 인테리어 레이블에 대 한 마스크를 설계, 후 외관 마스크는 이미지의 나머지 부분을 차지할 것입니다.
    2. 마스크 영역 0, 1, 2,으로 이미지에서 코딩... RGB에서 레이블 순서에 따라 창을 레이블합니다. 모든 마스크 대 한 다른 레이블 설계는 저장할 때 마스크 비디오, 이름 mask.tif (보충 그림 9C)와 같은 파일 이름으로: 바에서 파일 선택 메뉴 및 선택 로 저장 | Tiff....
      참고: 선택한 마스크의 확산 계수 계산 및 궤적 (단계 4.2 참조)의 분류에 채택 될 것입니다.
  8. 이 순간 파일 구조는 다음을 확인 하십시오.
    VideoName/video.lif
    VideoName/계열 1/mask.tif
    VideoName/계열 1/ videoSeq / video0000.tif
    VideoName/계열 1/ videoSeq / video0001.tif
    ...
    VideoName/계열 1/ videoSeq / video0499.tif
    VideoName/계열 1/결과
    참고: 단계 2.4와 2.7 설계는 mask.tif 마스크 이미지입니다. video*.tiff 단계 2.6에서 저장 비디오입니다. 위와 같이,에서 이름에 굵게 위의 목록, 즉 고정, 그들은 스크립트에 의해 자행 하는 이름은 때문에이 방법으로 호출할 수 있다. 이름에 대담한 실험 수행에 맞게 변경할 수 있습니다.

3. 추적 입자

  1. U-트랙을 사용 하 여 선택한 비디오에서 본 모든 입자를 추적 합니다.
  2. Matlab을 열고 설정 경로 사용 하 여 U-트랙 디렉터리 경로를 추가 | 추가 하위 폴더 옵션 메뉴에서. 미래에 실행 Matlab U-트랙의 경로에 경로 저장 합니다. 이 경로 설정을 한 번만 수행 해야 합니다.
  3. 분석 하는 시리즈를 포함 하는 디렉터리를 작업 디렉터리를 변경 합니다. 콘솔 (보충 그림 10) movieSelectorGUI 에 입력 하 여 U-트랙을 호출 하 고 enter 키를 누릅니다. 영화 선택 창이 있을 것입니다 열 (보충 그림 11A).
  4. 영화 버튼 누르고 영화 판 창 (보충 그림 11B) 나타납니다.
  5. 추가 채널 (VideoName/계열 1/비디오) 비디오 디렉토리를 선택 하 고 영화 정보 매개 변수를 입력을 누릅니다. 결과 (videoName/계열 1/결과)를 U-트랙의 결과 대 한 출력 디렉터리를 설정 합니다.
    참고: 현미경 및 인수 조건에서 영화 정보 매개 변수를 얻을 수 있습니다.
  6. 고급 채널 설정 을 누르고 인수에 관련 된 매개 변수를 입력 합니다. 예제 (보충 그림 11C)에서 매개 변수 값을 찾습니다.
  7. 고급 채널 설정 창에 저장 하 고 영화 판 창에서 저장 을 누릅니다. 프로그램 결과 디렉터리에 movieData.mat 라는 파일을 쓰기의 확인에 대 한 물어볼 것입니다. 확인 합니다.
  8. 영화를 만든 후 영화 선택 창에서 계속을 누릅니다. U-트랙 분석할 개체의 형식에 대 한 물어볼 것입니다. 단일 입자 (보충 그림 12)를 선택 합니다. 컨트롤 패널 창 (보충 그림 13A) 나타납니다.
    1. 첫 번째 단계를 선택 1 단계: 검색 설정에 키를 누릅니다. 설정 가우스 혼합 모델 피팅 창 (보충 그림 13B) 표시 됩니다. 예제에서는 "지역 배경 가진 비교에 대 한 알파 값" 3 (보충 그림 13B) 0.001과 "롤링 창 시간 평균"로 설정 됩니다.
    2. 설정 가우스 혼합 모델 피팅 창에 적용제어판에서 실행 을 누릅니다. 보충 그림 13에서 구성 검색 단계에만 실행 됩니다. 이 단계는 몇 가지 (2-5) 분을 걸립니다. 1 단계 (감지, 보충 그림 14)의 결과 버튼을 눌러 결과 확인 합니다.
      참고: 위와 같이, 영화 검색 된 입자에 빨간색 동그라미를 보여줍니다. 없는 빨간색 원이 표시 되 면 다음이 단계는 일 하지 제대로.
  9. 즉, 여러 프레임에 걸쳐 있는 트랙으로 이전 단계에서 발견 하는 입자를 병합 트랙의 식별을 수행 합니다. 이 2 단계: 추적 U-트랙 설정을 추가 그림 15A-C와 같이 정의할 수 있다. 예제에서 2 단계 비용 함수 설정 프레임 연결간격 닫기, 병합 및 분할 에 대 한 보충 그림 15B와 C, 각각 표시 됩니다.
  10. 2 단계에 대 한 매개 변수를 설정한 후 실행 제어판 에서 누르고만 2 단계 실행 (보충 그림 16).
  11. 트랙 분석, 3 단계를 수행 합니다. 추가 그림 17 (오른쪽 창)에 표시 된 대로 설정을 정의 합니다. 그런 다음, 설정-모션 분석 및 실행 에서 컨트롤 패널-U-트랙의 패널에 적용 을 누릅니다. 이 단계는 몇 초 걸립니다.
  12. 프로세스는 올바르게 모든 트랙 확인 단계 3의 결과 버튼으로 확인 합니다. 이렇게, 쇼 트랙 번호 동영상 옵션 창에 클릭 하 고 각 트랙 되었습니다 프레임별으로 올바르게 식별 (보충 그림 18) 확인. 수동으로 그 입자는 진정한 입자를 주석을.
    참고: 이 수동 선택 되지 않았다면 약한 자동 선택 수행할 수 있습니다 나중 확산 계수 (4 단계 참조)을 계산할 때.

4. 확산 계수 및 궤도의 분류의 계산

  1. 모든 스크립트 (예, VideoName/Serie1)에서 분석 되는 비디오의 디렉터리에서 호출 해야 합니다.
  2. 확산 계수는 Matlab에서 실행 하 여 명령 콘솔을 계산 하기 위해 모든 궤도 읽기: trajectories=readTrajectories(0.1), 0.1 초 두 연속 프레임 패널 영화 에서처럼 (시간 간격 사이에서 시간을 이다 정보, 보충 그림 11B).
  3. 잘못 식별 된 관광 명소/궤도에 대응 하는 궤도 제외 합니다. 제외에 관광 명소의 목록을 줄. 관광 명소 4, 5, 28를 제외 하려면 예를 들어, 입력: 궤도 = readTrajectories (0.1 [4, 5, 28]).
  4. 이 셀의 트랙 중 하나에 대 한 즉각적인 확산 계수를 계산 합니다. 이 경우에, 시간 지연에 대 한 확산 계수를 계산 = 4, D1-4라는. 이렇게, Matlab 콘솔에서 명령을 실행 합니다: D calculateDiffusion = (궤도, 113.88e-3, 0.0015, '알파') 궤도 단계 3, 113.88e에서에서 얻은 궤도 있는-3 미크론에서 획득된 한 이미지의 픽셀 크기는, 0.0015는 아래 설명 된 대로 µ m2/s, 및 '알파'에서 측정 하는 움직이기 힘 드는 입자의 확산 계수에 대 한 상한 장착된 모델입니다.
    참고: 빠른 카메라와 필요를 사용 하는 경우 확산 매개 변수를 계산 하는 더 많은 프레임 증가, 예를 들어 20, 여 D = calculateDiffusion (궤도, 113.88e-3, 0.0015, '알파', ', 20). 20 위, 예에서 전에 문자열 매개 변수 ', 출력 파일에 추가 하는 접미사입니다. 이 접미사는 다른 분석을 차별화 하는 데 사용할 수 있습니다.
  5. 다시 다른 피팅 모드 ('수감', '자유', 또는 '감독')와 함께 calculateDiffusion 함수를 호출 하 여 다른 기능을 가진 MSD를 맞습니다. 이 예제에서 '수감': D = calculateDiffusion (궤도, 113.88e-3, '감 금' 0.0015).
  6. 추가 그림 20과 같이 지시 모델 피팅 결과 얻을.
  7. 짧고 긴 궤적에는 궤적을 분해. 명령을 사용 하 여: [shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) 50은 오래 (예제)에서 고려해 야 할 궤적의 프레임에 최소 길이.
  8. 4.3 단계에에서 설명 된 동일한 피팅 절차를 사용 하 여 짧은 궤도 연구: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, '지시', '짧은'). 명령으로 짧고 변칙 궤적 분석: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, '알파', '짧은').
  9. 그들의 순간 확장 스펙트럼 (MSS)7운동의 유형 분류 하 긴 궤적을 분석 합니다. 명령: trajectoriesClassification = classifyLongTrajectories (longTrajectories, 113.88e-3,0.0015, '긴') 화면에 분석을 표시 하 고 trajectoryClassification < 접미사 >.txt 라는 파일을 생성 합니다 디렉터리 results\TrackingPackage\tracks

5. 입자 밀도 통해 클러스터 Ssize의 계산

참고: 모든 스크립트 (예, VideoName/Serie1)에서 분석 되는 비디오의 디렉터리에서 호출 해야 합니다.

  1. 그들의 궤적을 따라 각 입자의 농도 분석 합니다. 이렇게, Matlab 콘솔에 입력 하 여 스크립트를 호출: analyzeSpotIntensities로 입력 U-트랙 첫 번째 섹션에 의해 계산 하는 궤도. 가장 기본적인 형태로, 단순히 되 고 분석 (예, VideoName/계열 1) 비디오의 디렉터리에서 모든 인수 없이 스크립트를 호출 analyzeSpotIntensities(). 와 같이 스크립트에 인수를 제공 하 여 여러 가지 방법으로이 기본 동작을 구성: analyzeSpotIntensities ('Arg1´, Value1, ' Arg2´, Value2,...). 해당 변수 값으로 유효한 인수 ('ArgN´, ValueN) 나열 됩니다.
    1. ('spotRadius´, 1)
      크기 3 x 3 자리 ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)) 중심으로의 패치에 해당 하는 (기본적으로) 1 픽셀의 spotRadius를 사용 하 여 형광 강도 분석.
      참고: 가운데 자리에 5 x 5의 패치는 spotRadius 선택 2, 등등.
    2. ('onlyInitialTrajectories´, 1)
      이 인수 (true, 1의 값)을 지정 하는 경우 비디오의 첫 번째 프레임에서 시작 하는 궤도을 분석 합니다. (기본적으로 0, false) 제어 이미지 분석에 유용 합니다.
    3. ('trackTrajectory´, 0)
      이 인수는 0 (false)으로 설정 되어, 경우 (유용 움직이지 관광 명소에 대 한) 모든 프레임에 대 한 첫 번째 프레임에 자리의 좌표를 계속 다음. (기본적으로 1, true) 인수는 1로 설정 하는 경우 다음 자리는 추적 비디오 다음 좌표 계산 따라 U-트랙으로.
    4. ('excludeTrajectories´, [4,5,28])
      (예제에서 4, 5, 28) 단계 4.3에서 제외 하는 그 궤도의 궤도 수를 포함 합니다.
    5. ('extendTrajectory ´, 1)
      이 인수를 1 (true)로 설정 하는 경우 다음 (궤적 중지 하더라도 이전) 비디오의 끝에 패치에서 강도 분석. 좌표는 궤적 (경우 trackTrajectory)에서 마지막 좌표 또는 궤적에 처음 좌표 (해당 되는 경우 trackTrajectory은 false)입니다. 이 인수는 false (0) 기본적으로.
    6. ('subtractBackground´, 1)
      이 매개 변수를 설정 하는 경우 다음 정확한 원시 형광 측정 각 자리에 그 자리 (아래 참조)에 대 한 배경 형광의 견적. 이 인수는 기본적으로 true (1).
    7. ('meanLength´, 프레임 번호)
      이 매개 변수를 설정 하는 경우 평균 강도 자리 표시 된 길이에서 측정 됩니다. 'MeanLength', 20 20 프레임에서 평균 자리 강도 측정을 설정 합니다. 인수가 설정 되어 있지 않으면 다음 자리 강도 계산 됩니다 전체 궤적 (기본적으로 전체 길이).
    8. ('showIntensityProfiles´, 1)
      그들의 배경 뿐 아니라 서로 다른 프레임에 따라 강도 프로필을 (기본적으로 0, false), 1이 매개 변수 설정.
      참고: 이 플롯은 보충 그림 21에서 같이 photobleaching를 식별 하기 위해 매우 유용 합니다. 모든 경로 대 한 루틴을 photobleaching 되었습니다 가능한 경우 자동으로 분석 합니다. 이 경로 따라 첫 번째 및 마지막 N 프레임에서 학생의 t와 함께 강도 값을 비교 하 여 이루어집니다. 기본적으로 N은 10, 하지만 인수를 통해이 값을 수정할 수 있는 ' Nbleach´.
    9. ('backgroundMethod´, 값)
      각 명소의 배경을 확인 하려면이 매개 변수를 설정 합니다. 이 여러 가지 방법으로 수행할 수 있습니다 및 사용 하 여 어느 선택된 변경 "값" 수 있습니다:
      1. ('backgroundMethod´, 0)
        이 값을 사용 하 여 수동으로 식별 전체 비디오에 대 한 배경. 비디오의 첫 번째 프레임에 있는 8 포인트를 선택할 수 있습니다. 이러한 점 주위 패치 전체 비디오 따라 분석 하 고 이러한 모든 농도의 95% 논집 모든 관광 명소에 대 한 배경 강도로 선택 된다.
      2. ('backgroundMethod´, 1)
        이 값을 사용 하 여 수동으로 식별 각 프레임에 대 한 배경. 모든 장소와 모든 프레임에 대 한 8 포인트를 선택 합니다. 이것은 시간이 걸리는 작업을 하지만 그것은 사용자에 게 컨트롤을 많이 준다. 이러한 패치 농도의 95% 논집이이 프레임에이 자리에 대 한 배경 강도로 선택 된다.
      3. ('backgroundMethod´, 2)
        이 값을 계산 하는 각 명소의 배경 8 포인트 인수에 의해 제어 되는 반경 원 자리 주위에 위치에서 추정 하는 사용 ' backgroundRadius´ (기본적으로, 4 * spotRadius).
      4. ('backgroundMethod´, 3)
        먼저 셀 비디오에 찾아서 다음 각 프레임 (보충 그림 22)에 셀의 농도 분석 하 여 각 프레임에 대 한 백그라운드를 계산 하기 위해이 값을 사용 합니다.
        참고: 배경이이 배포판의 주어진된 논집에 회색 값으로 선택 됩니다 (기본적으로 0.5 (= 50%),이 매개 변수는 인수를 통해 제어할 수 있지만 ' backgroundPercentile´,이 값을 설정할 수 있습니다, 예를 들어, 0.9 (= 90%) 경우 원하는 배경으로 고려 될 셀의 대부분. 셀의 식별에 도움이 인수를 사용 하 여 프레임을 따라 예상 최대 배경 값 표시 ' (예를 들어, 모든에서 분석 된 비디오, 배경 값 보통 6000를 넘어) maxBackground´13. 기본적으로이 옵션은이 도움말 기본적으로 사용 되지 않습니다 의미 하는 0으로 설정 됩니다. 셀 검출 및 인수를 설정 하 여 배경 추정을 위한 선택 영역 참조 ' showImages´ (언제 든 지 CTRL-C를 눌러 실행 중지) 1.
  2. 모든 궤도 각각, 단계 4에 5.1, gatherDiffusion.AndIntensity ()를 사용 하 여 계산에 대 한 확산 및 강도 정보를 수집 합니다. 만 짧은 궤도 대 한 확산 및 강도 정보를 수집 합니다. 이렇게, 단계 4.7 및 형식에서 사용 하는 접미사를 사용 하 여: gatherDiffusionAndIntensity ('Short´) 어디 ' Short´ 단계 4.7에서 사용 하는 접미사입니다.
  3. 수집 하는 순간 스펙트럼 확장 및 강도 informationby 입력: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') 어디 '긴'은 접미사 사용 단계 4.7에서. 이 프로토콜을 사용 하 여 생성 하는 모든 파일의 요약 그림 2에 표시 됩니다.

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Representative Results

이 프로토콜을 사용 하는 형광 현미경 영화와 그들의 동적 특성의 분석에서 발견 하는 입자의 자동화 된 추적을 허용 한다. 처음, 셀 추적 붙일 결합 단백질으로 페는. SPT 셀 (그림 1)을 정렬 하 여 얻을 수 있는 세포 표면에 수용 체의 적절 한 수준을 제공 합니다. 선택한 셀이이 프로토콜 (보충 비디오 1)에 설명 된 도구로 공부 될 수 있는 형식에 비디오를 생성 하는 TIRF 현미경에 의해 분석 된다.

생성 하는 비디오를 직접 분석할 수 없습니다, 그리고 각 비디오의 독립적인 프레임 필요 합니다. ImageJ 사용 하 여 비디오 프레임.tiff 형식 또는 마스크 같은 Matlab 소프트웨어를 사용 하 여 해석 될 수 있는 파일을 생성 합니다. U-트랙 선택된 비디오에서 본 입자 추적 Matlab (.mat) 파일 (movieData.mat, Channel_1_detection_result.mat, channel_1.mat, Channel_1_tracking_result.mat)에 정보를 저장, 그림 2참조.

그림 2에서 같이, 확산 계수 계산 및 궤도 명령의 분류 생성 다른 파일 (diffusionCoefficients.txt, diffusionCoefficientsMobile.txt, diffusionCoefficientsShort.txt, trajectoryClassificationLong.txt, 등). 이러한 파일에 포함 된 정보 가장 뛰어나고 프리즘 소프트웨어를 사용 하 여 관리 됩니다. 이 분석에서 얻을 수 있는 정보 포함:

  1. 움직이기 힘 드는 명소의 비율입니다. 움직이기 힘 드는 입자의 참조로 사용할 수 있습니다: coverslips (그림 3A)에 연결 된 D1-4 가져온 값 (1) 고정된 셀에 단일 입자에서 그리고/또한 (2)에서 순화 된 형광 단백질의 95% 백분위 수.
  2. 긴 궤적의 비율 (> 50 프레임) (그림 3B).
  3. 긴 궤적의 움직임의 유형: 감독, 무료, 국한 (그림 3C).
  4. 셀에 모바일 입자의 확산 계수 (D1-4) 다른 자극 (그림 4A)으로 치료.

프로토콜의 5 단계는 궤적을 따라 각 입자의 농도 분석합니다. 스크립트 analyzeSpotIntensities 분석 하는 모든 정보 화면에 인쇄 됩니다. 각 명소에 대 한 프레임, 스크립트 픽셀 단위로, 배경 형광 (k0), 3 x 3 패치, 수정된 강도에서 원시 자리 강도 예상 그 프레임 (x, y)에서의 좌표를 보여줍니다 (마이너스 원시 강도 계산의 배경), 강도 어디이 자리는 패치와 마스크 내에서 지역 번호에서 관찰의 최대 값은이 프레임에 위치 해 있습니다. 생산 하는 출력의 종류의 예로

자리 43 프레임 = = 184
x = 78.0397
y = 72.5395
k0 = 1571
spotRawIntensity = 5550.1111
spotCorrectedIntensity = 3979.1111
maxCorrectedSpotIntensity = 6243
maskRegion = 2

이 모든 정보는 로그 파일 (results/TrackingPackage/tracks/log.txt)와 엑셀 (results/TrackingPackage/tracks/spotIntensitiesByFrame.txt)에서 읽을 수 있는 테이블에 저장 됩니다. 각 자리를 분석 후 스크립트 인쇄 궤도와 마스크 내의 majoritarian 영역 평균 강도

자리 = 43
프레임에 따라 meanCorrectedSpotIntensity = 4762.303
majoritarian 지역 = 3

이 정보는 위의 로그 파일 및 스프레드시트 (results/TrackingPackage/tracks/meanSpotIntensities.txt)에서 읽을 수 있는 테이블에 저장 됩니다. 예를 들어, 셀 다른 조건 자극된에 그들의 궤적을 따라 모든 입자에 대 한 평균 자리 농도 (msi) 그림 4B에 표시 됩니다. 우리가 지금 대략 형광 클러스터의 크기를 예측 하려면이 정보를 사용할 수 있습니다. 자리의 의미로 수정된 강도 형광 단백질이이 자리에 수와 관련 된 그리고 모노 머의 형광 비슷하지만 독립적인 실험을 통해 측정 될 수 있다, 직접 입자 당 수용 체의 수를 계산. 입자를 사용 하 여 같은 셀에 표시 하는 단위체 단백질의 강도 참고로 당 수용 체 수의 주파수 분포 그림 4C에 표시 됩니다.

수집 보급 및 강도 명령 두 파일을 만들: 1 이라고 diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txt및 다른 전화 log_diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txt 디렉터리에 결과 / TrackingPackage/트랙. 두 파일 1) 자리, 2)는 확산 계수, 3) 강도, 색인과 마스크 내의 4) 지역 번호를 포함 되어 있습니다. 이러한 파일은 스프레드시트에서 읽을 수 있습니다.

마찬가지로, 수집 궤적 분류 및 강도 명령을 두 파일 하나 라는 trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt 및 다른 log_trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt 에서 만들어집니다는 디렉터리 결과/TrackingPackage/트랙합니다. 첫 번째 자리 1) 색인, 2) 운동 유형, 3) 자리는 순간, 4) 강도, 5) D1-4 및 6) 마스크 내에서 지역 번호 포함합니다. Excel에서이 파일을 읽을 수 있습니다.

이 프로토콜을 사용 하 여 생성 하는 모든 파일의 요약 그림 2에 표시 됩니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 수행할 수 있는 기타 분석 포함 작은 대 큰 명소, 즉 단위체 대 올리고, ligands, 억제제, 막 구성에 의해 유도 된 이러한 동적 매개 변수에 유사의 동적 매개 변수 비교 신호 경로, 등 변경 다른 실험 조건 하에서 그것의 ligand CXCL12 응답에서 CXCR4 행동의 완전 한 분석13이 프로토콜 사용 하 여 수행 되었습니다.

Figure 1
그림 1 : 셀 정렬. 셀 정렬 전후 Jurkat 세포에 GFP의 표현 CXCR4 AcGFP와 페. GFP (GFP낮은)의 저급을 표현 하는 셀 선택 하 고 TIRF 실험에 대 한 고용 됩니다.

Figure 2
그림 2 : 생성 된 파일의 요약. 그림 설명 Matlab 루틴을 사용 하 여 생성 된 모든 파일입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 궤도의 분류. 해당 셀을 다른 자극으로 치료 하는 궤도의 다른 종류의 수입니다. 움직이기 힘 드는 명소, 긴 궤도 및 (C) 유형의 긴 궤적의 움직임의 (B) 비율 (A) 비율.

Figure 4
그림 4 : 확산 계수, 평균 자리 농도 및 입자 당 수용 체의 수. (A) (I, II, II와 IV) 다른 자극에 응답에서 각 명소에 대 한 짧은 확산 계수 (D1-4) 값의 분포. 레드 라인 D1-4에 대 한 평균 값을 나타냅니다. (B) 그것의 처음 20 프레임 (I, II, II와 IV) 다른 자극에 응답에 따라 각 장소에 대 한 평균 자리 농도 (msi) 값입니다. 레드 라인 평균 강도 값을 (SD)을 나타냅니다. (C) 빈 폭으로 복용 단위체 단백질 강도 값과 개별 입자의 강도 분포에서 추출 된으로 수용 체/입자의 비율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 1: 피지 또는 ImageJ TIRFM 파일 열기. .Lif 비디오를 드래그 앤 시 바이오 형식 창에 표시 되는 옵션. 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오. 

보충 그림 2: 시리즈를 선택합니다. 이미지는.lif 비디오에 존재합니다. 다중 채널 이미지를 포함 한 분석, 일련의 선택을 허용 하는 (A) 창. (B) 시리즈 선택, 포함 한 멀티 채널 이미지 (왼쪽)와 해당 비디오 (오른쪽)의 결과 예. 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오. 

보충 그림 3: 채널을 분할. (A) 창 ImageJ 명령의 캡처 필요한 멀티 채널 이미지와 (B) 결과 예제는 채널의 채널 분할을 위한 분할. 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 4: 병합 채널입니다. (A) 단일 이미지에 서로 다른 채널을 병합. (B) 채널 병합에 대 한 선택. (C) 채널 병합의 결과 예. 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 5: Windows 동기화 합니다. ImageJ 메뉴에서 (A) 지역화 이미지 동기화 및 (B)의 결과 창에 필요한 명령 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 6: 관심 영역을 선택 합니다. 사각형 선택 도구는 이미지의 (B) 결과 사용 하 여 관심의 창 (A) 선택. 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 7: 비디오를 저장 합니다. 이미지 시퀀스 창으로 파일에 대 한 매개 변수 및 이미지 시퀀스로 관심 영역을 저장 합니다. 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 8: 분할입니다. (A) 오픈 ImageJ의 플러그인 메뉴에서 분할 편집기 플러그인. (B)는 세분화에 대 한 레이블/자료 추가. 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 9: 마스크 디자인입니다. (A) 적절 한 라벨 및 녹색 마스크의 정의의 선택. 빨간 마스크의 (B) 선택. 두 레이블에 해당 하는 두 개의 마스크의 예입니다. (C) 마스크를.tiff 파일로 저장. 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 10: Matlab 작업 디렉터리입니다. 분석 시리즈를 포함 하는 올바른 디렉터리의 선택. 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 11: U-트랙 메인 메뉴입니다. (A) 영화 선택, (B) 영화 판 및 (C) 채널 설정 메뉴. 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 12: 추적 하는 개체의 유형을 선택 합니다. 단일 입자의 추적을 선택 합니다. 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 13: 입자의 탐지입니다. (A) U-트랙, 제어 패널. (B) 입자의 검출에 대 한 설정의 예입니다. 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 14: 입자 탐지에 대 한 결과의 예입니다. 뷰어 메뉴, 동영상 옵션 메뉴 및 영화를 포함 하는 창에 대 한 다른. 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 15: 추적 메뉴입니다. 설정의 예입니다. (A) 추적, (B) 설정-프레임 프레임 연결 및 (C) 차이 폐쇄 하 고, 병합 하 고 분할 메뉴. 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 16: 입자 추적에 대 한 결과의 예입니다. 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 17: 트랙 분석 메뉴입니다. 설정의 예입니다. 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 18: 트랙 분석의 확인입니다. 트랙 분석, 감지 하는 입자를 보여주는 비디오 창 및 그들의 해당 트랙을 포함 하 여 후 표시 하는 화면. 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 19: 확산 계수 계산 합니다. 히스토그램의 확산 계수의 계산 (왼쪽)과 평균 제곱 변위 (MSD, 오른쪽). 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 20: 확산 계수는 다른 피팅 모드를 포함 하 여 계산 합니다. 히스토그램의 확산 계수 계산 (왼쪽)과 평균 제곱 한정 된 모델에 대 한 변위 (MSD, 오른쪽). 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 21: 강도 프로필입니다. 궤적 (파란 선) 및 배경 (빨간 선)을 따라 자리 강도의 예입니다. 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 22: 각 프레임에 대 한 배경입니다. 왼쪽: 샘플 셀 이미지입니다. 중간: 자동으로 셀을 검색. 오른쪽: 지역 자동으로 배경으로 선택. 는 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 비디오 1: 다른 농도 움직임의 종류와 입자의 존재를 보여주는 전형적인 TIRF 비디오 현미경의 예입니다. 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 자료 1: 임시 루틴 궤도의 분류 및 클러스터 크기의 분석에 대 한 고용에 있는 모든 프로토콜 스크립트를 포함 하는 파일. 자료를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

설명된 방법을 Matlab 함께 어떤 이전 경험을 필요 없이 수행 하기 쉽습니다. 그러나, Matlab 루틴 매우 다른 명령의 명칭 및 프로그램에 의해 고용 된 다른 폴더의 지역화와 정확성이 필요 합니다. 추적에서 분석 루틴 (3 단계), 여러 개의 매개 변수를 수정할 수 있습니다. "설정 가우스 혼합 모델 피팅" 창 (단계 3.8) U-트랙 비디오에 단일 입자 감지 방법을 제어 합니다. 이 피팅 가우스 혼합 모델3에 설명 된 대로 하면 됩니다. 이이 음 쇠에 대 한 주요 매개 변수 중 하나는 로컬 맥시 마를 식별 수 있도록 필터를 정의 합니다. 이 작업의 성공 이미지 대비와 소음 이미지에 의존합니다. 첫 번째 매개 변수 (로컬 백그라운드와 비교에 대 한 알파 값) 제어 소음을 줄이기 위해 관광 명소의 식별 하는 동안 두 번째 도움이 동안 진짜 자리 되는 맥시 마의 자신감. "추적" 단계 (3.9)에 중요 한 매개 변수는 (즉, 트랙 프레임 있는 입자는 실제로 본, 하지만 이러한 프레임 전에 이러한 프레임 후; 0 예에서 볼 수 있다 동안 스팬 수 있습니다) 프레임 간격을 수 그리고 트랙 성공적인 트랙으로 간주 하기 위해 확장 해야 하는 프레임의 수 (우리의 예제에서는, 20;이 매개 변수는 카메라 수집 속도 관련 트랙에서 번호 프레임 보급 공동 계산 허용 되도록 해야 합니다. 효율적인). 그것은 또한 병합 하 고 분할 (이 예제에서는 이러한 두 가지 가능성 선정 됐다)에 세그먼트를 결정 하는 것이 중요입니다. 다음, 단계 1 비용 기능 (프레임으로 프레임 연결)에 대 한 매개 변수를 설정 해야 합니다. 이 함수는 프레임에 따라 입자는 추적 하는 방법을 제어 합니다. 이 시점에서 가장 중요 한 매개 변수는 얼마나 각 자리 다음 프레임에 있을 것으로 예상 된다 제어 Brownian 검색 반지름의 선택 이다. 우리의 예제에서 우리로 선택 했다 0과 5 상한이, 각각. 참고 이러한 매개 변수는 추적 되 고, 입자의 특성에 따라 달라질 및 그들은 각 특정 한 경우에 조정 해야 할 수 있습니다. 특히 중요 한는 브라운에 배율 파워와 선형 반지름을 검색합니다. 이러한 능력을 확장 (무료 또는 밀폐 된 확산) 입자의 운동의 종류에 따라 달라 집니다. 예제에서 값이 (0.5, 0.01) 보급을 무료로 선정 됐다. 이러한 매개 변수의 특정 문서에 대 한3을 참조 하십시오.

확산 계수 명령 (단계 4.4)의 계산에서 움직이지 입자의 확산 계수의 상한 알려질 수 있다 또는 움직이지는 별도 프로젝트에서 calculateDiffusion 함수를 실행 하 여 이전 실험에서 입자 (순화 된 단위체 형광 단백질)와 확산 계수를 보고 보고. 이 함수는 두 개의 추가 매개 변수를 사용: ' outputSuffix´, 출력 파일 이름에 추가 되 고 기본적으로 빈 값은, 그리고 ' plotLength´, 기본적으로는 13 고 확산 계산 수행 시간 지연 (초) 수입니다. 피팅 모드 '알파' 의미는 곡선에 MSD의 조정

Equation 1

즉, 오프셋 (MSD0)와의 시간 전력 기능 지연. 이 전원 기능의 지 수 Equation 2 , 움직임 제한 여부를 결정 합니다 (0 < α < 0.6), 변칙 (0.6 < α < 0.9), 무료 (0.9 < α < 1.1), 또는 (α > 1.1) 감독. 이러한 종류의 분석의 검토에 대 한 독자가 불린다 Manzo 외9

확산 계수4 의 계산 ( 보충 그림 19참조) 두 개의 출력 숫자를 생성 합니다. 첫 번째는 확산 계수 계산된 (참고는이 시점에서, 각 궤도 대 한 독립적인 확산 계수는)의 히스토그램을 보여 줍니다. 뜻과 이러한 계수의 95% 백분위 Matlab 콘솔에 표시 됩니다. 두 번째 음모는 MSD (빨간 곡선) (그 누구의 확산 계수는 커맨드 라인에서 주어진 임계값 이상) 모바일 간주 그 궤적에 대 한 시간 지연의 기능으로 계산 하는 것으로 간주 하는 단계 수를 보여 줍니다. 평균 및 표준 편차 모바일 궤도의 계산 됩니다 (이 단일 셀에 궤도 대 한 값). 예제에서는 지 수는 0.59 의미 움직임 한정 이다. 이 커브 피팅 프로그램 (완벽 하 게 맞지는 0를 도달할 것입니다) 매개 변수 (각각의 표준 편차로 표시 됨) 중 하나 및 적합의 미 덕에 관련 된 불확실성을 보고 합니다. 이 시점에서 하 고 알파 값을 확인 한 후 우리는 다른 기능을 가진 MSD에 맞게 결정할 수 있습니다.

Equation 3    0 이면 < α < 0.6 (국한)

Equation 40.9 경우 < α < 1.1 (무료)

Equation 5만약 α > 1.1 (감독)

비정상적인 궤도 다른 기능 장착 될 수 없습니다. 한정 된 입자의 경우 수 계산 감 크기 (미크론)에서 Destainville 그 외 여러분14

Equation 6

정확한 피팅의 좋은 지표는 맞춤 선 최종 피팅 피팅 알파에서 감소 한다 (예, 맞는 선 폭포 0.30474에서 0.15749, 보충 그림 19-20). calculateDiffusioncreates 두 파일 시리즈 디렉토리 안에 "results\TrackingPackage\tracks"에서 "diffusionCoefficients.txt" 및 "diffusionCoefficientsMobile.txt" 라고합니다. 이러한 파일 포함 3 열: 1) 각각의 인덱스 입력 궤적, 해당 2) 그들의 확산 계수, 3)이이 트랙에 속한다 마스크에서 majoritarian 지역 (지역에서에서 얻을 수 있습니다 파일 "mask.tif" 단계에서 생성 하는 2.7; 이 파일이 존재 하지 않는 경우 다음이 열 하지 않습니다). 비슷한 실험 조건에서 셀 집합에 대 한 확산 계수 분포를 분석 하이 파일을 다른 셀에 대 한 생성 된 유사한 파일을 사용할 수 있습니다.

짧은 궤도 (단계 4.7-4.8)에 대 한 확산 계수 계산에서 마지막 매개 변수 '짧은'은 접미사는 를 덮어쓰지 않고 궤도의 다른 하위 집합을 분석할 수 있도록 출력 파일에 추가 diffusionCoefficients.txt 파일. 출력 파일의 실제 이름은 "diffusionCoefficients < 접미사 >.txt"와 "diffusionCoefficientsMobile < 접미사 >.txt"입니다. 위에서 수행 하는 일반적인 분석에서 아무 접미사 주어진 빈 접미사 간주 됩니다. 모델 매개 변수 (D, v, 및 MSD0) 모든 궤도를 장착에서 달라질 수 있습니다. 가장 현저 하 게, 세상에 맞는 매개 변수의 표준 편차는 일반적으로 증가. 이유는 짧은 궤도 더 안정적 이며 신뢰할 수 있는 피팅 더 어렵습니다.

긴 궤적 (단계 4.9)의 분석 한정 된 (1)에 그들을 분류 무료 (2), 또는 감독된 (3) 그들의 첫 번째 순간 및 500 무작위 경로 순간의 2.5%, 97.5% 백분위 기준 위치 같은 브라운 모션 확산 계수 그리고 분석 하 고 몬테 카를로 궤적으로 길이. 경로 분석 되는 순간 시뮬레이션에서 관찰 하는 첫 번째 순간의 2.5%가 하 있는 경우에, 공부 되 고 경로 한정으로 분류 됩니다. 감독;로 분류 인 경우 시뮬레이션된 첫 순간의 97.5% 이상 그렇지 않으면, 경로 브라운으로 분류 됩니다. 명령에서 고용, 113.88e-3 µ m의 픽셀 크기, 0.0015 움직이지 명소 '긴'에 µ m2/s, 측정의 확산 계수의 상한 출력 파일 이름 접미사입니다. 이 파일 ("trajectoryClassificationLong.txt")의 첫 번째 열은 궤적 번호, 두 번째는 그것의 분류 (1 = 감 금, 2 = 무료, 3 = 감독), 그리고 세 번째는 궤적 순간.

각 입자 (단계 5.1)의 강도 계산에 대 한 스크립트는 매우 유연 하며 다양 한 방법으로 형광 강렬을 추적 하는 허용 한다 (각 추적 제어 실험의 움직이기 힘 드는 명소 같은 다른 상황에 대 한 적합 또는 추적 매우 움직이는 명소 가변 형광 배경 셀 위로). 스크립트는 모든 프레임을 따라 모든 궤적을 분석 합니다. 각 프레임에 각 자리 그것 것 이다 (크기 3 x 3 픽셀의 기본적으로 자리 주위 사각 패치 분석) 자리 주위 픽셀의 농도 측정, 추정 장소와 배경 형광 자리 차이 계산 하 고는 배경입니다. Photobleaching 입자와 단일 지점으로 단일 클러스터에서 형광 입자의 수의 비율이 방법으로 추정 될 수 있습니다.

여러 매개 변수 (자리 강도, 측면 확산, 모션의 유형), 점 크기와 기저 조건에서의 동적 사이의 관계를 공부 하는 데 도움이 수에 대 한 정보를 생산 하는이 자동화 된 방법 (gatherTrajectoryClassificationAndIntensity) 그리고 어떻게 다른 치료는 이러한 매개 변수를 수정할 수 있습니다.

방법의 주요 제한 그것은 추적할 수 형광 단백질으로 세포 transfection를 요구 한다 이다. 보통 transfection 단백질 overexpression, 단일 단백질 추적 방해 사실 이끌어 낸다. 정렬 단계 셀 셀 탐지를 허용 하는 수용 체의 수를 표현 및 SPT TIRF 현미경 단일 입자의 자간을 선택 포함 되어야 합니다. 이 방법은 또한 생체 양자 점으로 표시 추적에 대 한 고용 수 또는 놀라 우 파편. 설명된 프로토콜 분석에서 구동 결론 올바른지 확인 하기 위해 이전 분석 해야 하는 컨트롤의 수를 요구 한다. 우선, 그것은 검색 및 단일 입자의 추적을 허용 하는 적절 한 식 조건을 결정 하는 중요 한입니다. 밀도와 영화 ~ 4.5 입자 / µ m2, 8500-22000 수용 체/셀, 해당 세포 막 수용 체13spatio 시간적 조직 분석 하는 데 사용 했다.

그것은 순화 된 단위체 AcGFP 단백질 또는 고정된 셀을 사용 하 여 최소 감지 확산 계수를 설정 해야 합니다. 두 경우에서 아무 유포 이며 따라서 우리는 이러한 조건에서 분석 하는 입자의 확산 값 고정된 입자에 대응 하 고 모바일 및 부동 궤적13사이 감 별 하는 데 사용 예상 간주 됩니다.

우리가 여기서 제시 하는 분석은 적용 될 수 있는 해상도 의해 수용 체의 확산의 분석, 회절 제한 된 이미지의 분석 및 세포 운동의 분석 표준 현미경 검사 법에 의해 일반 궤적 분석 도구 . 앞서 설명한 번호와 밝기11, 분석 등 다른 사람으로이 방법의 주요 이점은 이다 그것은 계정에 복용의 시간, 그 궤적을 따라 각 개별 자리의 평균 강도 값의 평가 허용 한다 photobleaching 전에 AcGFP 단위체 단백질 생존 Photobleaching 전에 분자의 생존 시간 강력 하 게 구동 조건에 따라 달라 집니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는 카를로 Manzo와 마리아 가르시아 Parajo 확산 계수 분석의 그들의 도움과 소스 코드에 대 한 감사입니다. 이 작품은 과학 스페인 교육부, 혁신 및 대학 (SAF 2017-82940-R)에서 교부 금에 의해 부분적으로 지원 및 기관 드 건배 카를로스 3 세 (RD12/0009/009와 RD16/0012/0006;의 RETICS 프로그램 RIER)입니다. LMM 및 JV Fundación 일반 CSIC의 COMFUTURO 프로그램에 의해 지원 됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Jurkat cells ATCC CRL-10915 Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP Clontech 632469 Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine
Gene Pulse X Cell electroporator  BioRad  We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells.  Use the transfection method best working in your hands. 
Cytomics FC 500 flow cytometer  Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter  Beckman Coulter Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.  You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.
Dako Qifikit DakoCytomation K0078 Used for quantification the number of receptors in the cell surface.
Glass bottom microwell dishes MatTek corporation P35G-1.5-10-C
Human Fibronectin from plasma Sigma-Aldrich F0895
Recombinant human CXCL12 PeproTech 300928A
Inverted Leica AM TIRF Leica
EM-CCD camera Andor  DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 software Danuser Laboratory
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi FiJI https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software Matlab tool.  For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice
GraphPad Prism GraphPad software

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References

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  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, (Pt 21), 3621-3628 (2010).
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