利用 PiggyBac 载体将人诱导的多能干细胞 (Ipsc) 转化为功能性脊柱和颅内运动神经元

Neuroscience

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Summary

该协议允许诱导多能干细胞快速有效地转换为具有脊柱或颅内身份的运动神经元, 通过从诱导的 piggyBac 载体的转录因子的异位表达。

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Garone, M. G., de Turris, V., Soloperto, A., Brighi, C., De Santis, R., Pagani, F., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors. J. Vis. Exp. (147), e59321, doi:10.3791/59321 (2019).

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Abstract

我们这里描述了一种方法来获得功能性脊椎和颅内运动神经元从人类诱导的多能干细胞 (Ipsc)。直接转化为运动神经元是通过转录因子的替代模块, 即 Ngn2、Isl1 和 Lhx3 (NIL) 或 Ngn2、Isl1 和 Phox2a (NIP) 的异位表达而获得的。NIL 和 NIP 分别指定脊柱和颅内运动神经元的身份。我们的协议从生成修改后的 iPSC 线开始, 在这些线路中, NIL 或 NIP 通过 piggyBac 转座子载体稳定地集成到基因组中。然后由多西环素诱导转基因基因的表达, 并在5天内导致 Ipsc 转化为 MN 祖细胞。随后的成熟, 7天, 导致脊柱或颅内 Mna 的同质种群。与以前的协议相比, 我们的方法有几个优点: 它非常快速和简化;它不需要病毒感染或进一步 MN 分离;它允许产生不同的 MN 亚群 (脊椎和颅骨) 与显著的成熟程度, 这证明了火训练的动作电位。此外, 大量的运动神经元可以获得没有纯化从混合人群。ipsc 衍生的脊髓和颅内运动神经元可用于肌萎缩侧索硬化症和运动神经神经元的其他神经退行性疾病的体外建模。均匀运动神经元群可能是细胞类型特异性药物筛选的重要资源。

Introduction

运动神经元 (MN) 变性在肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 和脊髓肌萎缩 (SMA) 等人类疾病中起着致病作用。建立合适的体外细胞模型系统, 总结人类 MN 的复杂性, 是朝着发展新的治疗方法迈出的重要一步。诱导多能干细胞 (ipsc) 具有显著的多系分化特性, 目前已从一些受运动神经元疾病 1,2 的患者中提取。从控制 "健康" 多能干细胞3开始, 基因编辑产生了更多携带与 MN 疾病相关的致病突变的 iPSC 系.这些生产线是体外疾病建模和药物筛选的有用工具, 前提是有适当的 iPSC 分为 Mn 的方法。这种方法发展的基本原理是为对 MN 疾病感兴趣的科学界提供快速有效的分化协议, 从而产生成熟的功能 Mn。此方法的第一个优点是其执行时间范围。另一个相关的强项来自于任何净化步骤的消除。最后, 该协议可用于生成两个不同的运动神经元群。

生成不同子类型的 mn 的可能性与 MN 疾病的建模特别相关。并非所有的 MN 亚型在 ALS 和 SMA 中都同样脆弱, 不同运动单位的症状出现对预后有很大影响。在 ALS 中, 脊柱出现症状开始于上肢和下肢, 导致死亡约 3-5年 4.相反, 球囊发作, 从颅骨 MNs 的退化开始, 有一个最坏的预后。此外, rna 结合蛋白 FUS 和 TDP-43 突变患者的球状发病百分比明显高于 SOD1 突变5患者。几乎所有的替代 mn 分化协议依赖于维甲酸 (ra) 的活性, 这赋予了脊椎字符分化 ipsc6,7,8。这限制了研究内在因素的可能性, 而内在因素可能对特定的 mn 亚型9、10 具有保护作用。

与以前在小鼠胚胎干细胞11中的研究一致, 我们最近已经表明, 在人类 Ipsc 中, Ngn2、isl1 和 Lhx3 (nil) 的异位表达诱导了脊柱 mn 的身份, 而 Ngn2 和 isl1 加 phox2a (nip) 则指定了颅内 mn12。因此, 我们开发了一个高效的协议, 导致在12天的周转时间内生产具有功能特性的人类 MNs。这种方法的目的是在很短的时间内, 在不需要纯化的情况下 (例如, 通过流式细胞仪), 获得具有脊柱或颅内身份的 MNs 高度丰富的细胞群。

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Protocol

1. 人类 Ipsc 的维护

  1. 基质涂层板的制备
    1. 在4°C 下连夜解冻一个5毫升的基质 (见材料表)。原始的基质库存在不同的库存浓度下, 并根据数据表上显示的稀释系数进行。重要的是要保持小瓶和管冰凉, 以防止过早的胶凝矩阵。在冰上预先冷却的低温管中, 将基质分配到等价物中。在-20°c 时冻结未使用的脂肪。
    2. 将一个放在冰上大约2小时才能解冻。
    3. 用20毫升的冷 dmmmm·f12 将基体的脂肪体稀释在一个50毫升的锥形管中。
    4. 混合好, 将稀释后的基质1毫升放入35毫米盘子 (其他菜品表面面积相当的量)。
    5. 将含有稀释基质的盘子在室温下保存 1小时, 以便涂布。
      请注意:用副封闭密封的菜肴可在4°c 下存放长达2周。
  2. 温和细胞离解试剂的库存溶液 (20 毫升) 和1x 工作量的制备(请参见材料表)。
    1. 在 PBS (Ca2 +mgg2 +游离) 中溶解粉末至 10 mgml。
    2. 滤清器通过0.22μm 滤膜进行灭菌。
    3. 准备20个等价物 (每种1毫升), 并储存在-20°c。
    4. 使用前, 在 PBS (Ca2 +mg2 +免费) 中稀释一个 aliquot 至 1 mg/ml (1x 工作的 aliquot)。
      注: 1x 工作的等价物可在4°c 下存放长达2周。
  3. 通过人的 Ipsc。
    1. 开始前: 如果在4°c 下储存, 在37°c 的孵化器中预热基质涂层板 20-30, 在室温下预热所需的人体 iPSC 介质 (见材料表)。预热 DMMM/F12。
    2. 吸种培养基。
    3. 用 PBS 冲洗 Ipsc (Ca2 +/mg2 +免费)。
    4. 加入1x 温和离解溶液 (35 毫米盘子 0.5 mL)。在37°c 时孵化, 直到菌落边缘开始从板上分离, 通常为3-5分钟。
    5. 渴望温和的离解解决方案, 注意不要分离 iPSC 菌落。
    6. 用 DMEMM/F12 (35 毫米盘子为2毫升) 清洗细胞, 并小心不分离细胞。重复此步骤一次。
    7. 加入人工 iPSC 介质 (35 毫米盘子为1毫升)。
    8. 用细胞提升器轻轻分离菌落, 转移到15毫升管中。
    9. 用 P1000 移液器向上和向下移液3-4 次, 轻轻打破细胞团块。
    10. 从基质涂层板中吸收上清液。
    11. 将细胞播种在人体 iPSC 培养基的适当培养量中。分割率可以因线而异, 大约为 1:4-1: 8。每天更换介质。

2. NIL 和 NIP 工业 iPSC 线路的生成

  1. 细胞转染。
    1. 用 PBS 冲洗细胞 (Ca2 +mg2 +免费)。
    2. 加入细胞离解试剂 (见材料表)(35 毫米盘0.35 毫升), 在37°c 孵育, 直到单个细胞分离 (5-10)。
    3. 使用 P1000 移液器向上和向下移液3-4 次, 轻轻完成细胞分离。
    4. 收集在一个15毫升管, 并添加 PBS (Ca2 +/mL2 +免费) 到10毫升。数一数单元格。
    5. 颗粒 106 个细胞, 并在100Μl 的缓冲区 r 中重新悬浮 (包括在细胞电穿孔试剂盒中, 请参见材料表)。
    6. 为转染添加质粒 DNA: 4.5 微克的转座子载体 (epB-Bsd-TT-NIL 或 EpB-Bsd-TT-NIL12) 和0.5 微克的 piggybac 转座子质13。
    7. 根据制造商的说明和前面描述的3进行电池电穿孔系统的转染 (见材料表), 其参数如下: 1, 200 v 电压、30毫秒宽、1个脉冲。在一个6毫米的基质涂层盘中播种人的 ipsc 介质中的细胞, 并辅以 10μm y-27道理 (rock 抑制剂, 见材料表)。
  2. 用抗生素进行选择。
    1. 转染两天后, 在培养基中加入5μgml。
    2. 大多数未转染的细胞将在选择杀菌素48小时内死亡。将细胞保持在闪电分裂中至少 7-10, 以反选择尚未整合基因组中转基因的细胞。
    3. 将稳定转染的细胞作为混合群体, 由具有不同转基因数量和不同整合位点的细胞组成, 或分离单个克隆。
    4. 用 RT-PCR 与 ngn2 的转基因特异性引物 (前进: tatgccccccccccccccccccccaccaccactag) 制备一个额外的盘子, 以检查转质的有效表达, 在诱导后;相反: GAGGGGGGGCTCACT), 如上文所述.
    5. 在这一阶段, 将新型 NIL-IP-IP-IPSC 生产线的库存冻结在人类 Ipsc 的冷冻介质中 (见材料表)。

3. 电机神经元分化

  1. 如所述 (步骤 2.1.1 2.1.3), 将细胞与细胞离解试剂分离。收集离解细胞在一个15毫升管和稀释与5卷 DMM/F12。将细胞颗粒状, 并在人的 iPSC 介质中重新悬浮, 辅以 10μm ROCK 抑制剂。以62,500 细胞的密度计算细胞和种子在基质涂层的菜肴上.
  2. 第二天, 用 dmm函数 f12 取代培养基, 辅以1x 稳定的 l-谷氨酰胺类似物、1x 非必需氨基酸 (NEAA) 细胞培养补充剂和0.5倍青霉素-链霉素, 并含有1μgml 多西环素。这被考虑作为区别的第0天。在第1天, 刷新培养基和多西环素。
  3. 第2天, 将培养基改为神经碱/b27 培养基 (神经基底培养基, 补充 1x B27, 1x 稳定的 l-谷氨酰胺类似物、1x NEAA 和 0.5倍 penicillin/streptomycin), 含有 5μm DAPT、4μm 0.5X 和 1μgml dox十胺 (见材料表).每天刷新培养基和多西环素, 直到第5天。
  4. 第5天: 细胞离解试剂与细胞离解(请参见材料表)。
    1. 用 PBS 冲洗细胞 (Ca2 +mg2 +免费)。
    2. 加入细胞离解试剂 (35 毫米盘0.35 毫升), 在37°c 孵育, 直到整个细胞单层与盘分离。请注意, 单个细胞在孵育过程中不会被分离。
    3. 加入1毫升的 dmemmsf12, 并将细胞收集在一个15毫升的管中。
    4. 使用 P1000 移液器进行10-15 次移液, 向上和向下移液, 轻轻完成细胞分离。
    5. 加入4毫升的 dmmmsf12, 并对细胞进行计数。
    6. 在此阶段, 根据制造商的说明, 将运动神经元祖细胞冻结在细胞冷冻介质中 (见材料表)。
    7. 将细胞颗粒并重新悬浮在神经中 (Neurobasal/B27 培养基, 辅以 20 ng/mL bdnf, 10 ng/mL GDNF 和 200 ngml l-抗坏血酸, 见材料表) 补充 10μm rock 抑制剂。
    8. 在 100, 000 细胞的密度下, 在多鸟-层压膜上或在基质涂层支撑上播种细胞.使用Μ-滑动塑料支架与聚合物盖板 (见材料表) 进行免疫染色分析。
  5. 第6天, 用不含 ROCK 抑制剂的新鲜神经元培养基改变培养基。在接下来的几天里, 每3天刷新一次一半的培养基。培养介质必须非常小心地改变, 以防止从表面脱落。

4. 免疫染色分析

  1. 细胞固定。用 PBS 冲洗细胞 (用 Ca2 +mg2 +), 在室温下在 pbs 中培养4% 的甲醛 15分钟 (用 ca2 +/mg2 +)。
    注意事项:对苯二甲醛有毒, 怀疑会致癌。避免接触皮肤和眼睛, 并处理下的化学烟雾罩。
  2. 在室温下使用 PBS (ca2 +mg2 +), 含有 0.1% triton x-100 5分钟。
  3. 在室温下在抗体阻断溶液中培养 30分钟 (ABS: 3% BSA 在 PBS 中加 CA2 +/mg2 +)。
  4. 在室温下与 abs 的原生抗体培养 1小时: 抗 TUJ1 (1xy1000; 兔子) 和抗八角 4 (1x:200; 鼠标) 或抗 chat (抗胆碱乙酰基转移酶; 1: 150; 山羊)。请参阅材料表
  5. 在室温下用适当的驴二级抗体对在 abs 中培养 45分钟: 抗鼠亚历克莎 Flor 647 (1:250)、抗兔子亚历克莎福陆 594 (1:250) 和抗山羊亚历克莎福陆 488 (1:250)。请参阅材料表
  6. 在室温下在 0.4Μgml DAPI 中培养 5分钟, 以标记细胞核。
  7. 用安装介质 (见材料表) 安装电池, 以便在荧光显微镜下进行成像。

5. 通过补丁夹具记录的功能表征

  1. 准备 Hepes-平衡的外部溶液 (NES) 如下: 140 mM ncl、2.8 mM kcl、2 mM ccl 2、2 mm MGCL 2、10 Mm hepes 和 10 mm 葡萄糖.将渗透度设置在 290-300 mΩ之间。使用 1N NaOH 将 pH 值调整为 7.3, 并将溶液存放在4°c。
  2. 准备内部溶液: 140 mM K-glucoinate, 2 mM 氯化钠, 5 mm Bapta, 2 mM MgCl 2, 10 mMmm hepes, 2 mm mg-atp, 0.3 mm Na-GTP。使用 1M KOH 将 pH 值调整为 7.3, 并检查渗透度是否设置在 290 mΩ左右。将溶液冻结在-20°c 的小等价物中。
  3. 在进行实验之前, 将水浴中的 NES 溶液预热至28-30 左右。
  4. 拉一些硼硅酸盐微移液器 (ID 0.86 毫米;OD 1.5 mm) 轴承尖端电阻: 5-6 MΩ, 并在安装到移液器支架之前用细胞内溶液填充。
    请注意:记住用共用的银丝记录电极和参考电极在漂白剂中至少 30分钟, 以便在金属丝表面形成均匀的 AgCl 层。
  5. 将培养皿转移到记录室, 并让室与 NES 溶液在 1-2 mL/min。让流经在30°c 温度下设置的内联加热器的流量, 以保持溶液的温度。
  6. 将电生理记录室置于直立显微镜下。使用膜片钳放大器记录膜电流, 并使用适当的软件获取数据。
  7. 打开放大器控制软件, 将信号增益设置为值 1, 将贝塞尔滤波器设置为10千赫。确保贝塞尔滤波器比采样频率低2.5倍。
  8. 在记录软件中设置电压夹和电流夹实验的实验协议。
  9. 在协议设置中, 勾选插曲式刺激模式, 并将采样频率设置为25千赫。然后, 移动到波形选项卡, 并键入电压或电流步长振幅和长度, 如下所示。
  10. 对于电压门控钠电流, 使用15个电压步骤 (每个50毫秒的持续时间)-100 mV 到 + 40 mV (10 mV 增量)。在通过放大器向补丁细胞施加-60 mV 的保持电位后, 运行协议。同样, 电压门控钾电流通过电压步长 (每个250毫秒) 从-30 mV 到 + 50 mV (10 mV 增量), 将记录的电池保持在-40 mV。
  11. 为了研究 ipsc 衍生的颅骨和脊柱 MV 的燃烧特性, 在-70 mV 的膜电位下, 在电流夹紧模式下, 夹紧细胞的膜电位为-70 mV, 并使用4个增加振幅的电流脉冲 (每个频率) (从 + 20 pA 到 + 80 pA; 20 p a 增量)。
  12. 获取每个电池电压激活电流、诱发燃烧活动和三种无源特性, 如全细胞膜电容 (Cm)、细胞膜电阻 (Rm) 和休息膜电位 (RMP)。

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Representative Results

图 1显示了微分方法的示意图描述。人体 Ipsc (WT I线 3) 通过 epB-Bsd-TT-NIL 或 EpB-Bsd-TT-NIL 进行转染, 在选择无菌性细胞线12后生成稳定和诱导细胞系, 以下分别称为 Ipsc-nil 和 ipsc-nip。对分化细胞的多能性标记 OCT4 和泛神经元标记 TUJ1 的表达进行了表征。免疫染色分析显示, 在没有 TUJ1 阳性的情况下, 在第0天, OCT4 在所有细胞中的表达均匀 (图 2a)。在第3天, 我们观察到 OCT4 阳性细胞的数量大幅减少, 这反映在分化 Ipsc 的子集中的 TUJ1 表达 (图 2b)。第5天, 在人群中没有观察到 OCT4 的表达, 显示 TUJ1 的表达一致, 并获得了神经元形态 (图 2c)。然后将运动神经元祖细胞分离并重新镀膜, 以便进一步成熟。7天后 (从0天起 12天), 细胞均匀表达 TUJ1 和成熟运动神经元标记聊天 (图 3)。使用相同的培养和差异化条件 (补充图 s1补充图s2), 另外两条商业 Ipsc 线路 (见材料表)也取得了类似的结果。与来自小鼠 Esc 11 的 nil 诱导的运动神经元类似, nil 和 nip 诱导的人 Ipsc 表达的 hox 转录因子水平较低, 可以沿着星形星尾轴与雷甲酸 (补充图 s3)).

在分化初期播种62,500 细胞, 在第0天用1μm 多西环素诱导, 得到了这些结果。这导致了多西环素的最佳浓度, 以实现对转基因的最大诱导, 而不会对细胞产生明显的毒性 (补充图 s4a)。在第5天切除多西环素后, 转基因基因的表达被沉默 (补充图 S4B)。我们还进行了试点实验, 以确定在协议的这一点上细胞的最佳密度。我们注意到, 在平行微分实验中改变这个参数提供了不同的结果。经细胞形态观察, 初始密度降低至 31, 250细胞 2, 分化明显正常。然而, 我们注意到在第5天 (第3.4 节) 对离解的阻力, 并在随后的成熟阶段降低了生存能力。相反, 当细胞的初始密度提高到 125, 000 细胞2时, 我们观察到低效率的分化, 评估为缺乏获取典型的神经元样形态。这导致混合人口中只有少量的 Mn, 这将需要进一步净化 (例如, 由外地资产管制系统)。因此, 我们已经确定, 获得纯神经元细胞群的最佳密度, 能够在培养中存活两个月以上, 是62,500 细胞/厘米2

然后, 我们评估了 iPSC nil 衍生的脊髓运动神经元的功能成熟, 通过表征它们的电生理特性 (图 4), 如先前为 ipsc nip 衍生的颅运动神经元12所报告的那样.在协议的 Ms 成熟步骤第7天进行了膜片夹片记录, 采用电压和电流夹的方式 (见图 1; 总分化时间: 12天) (图 4a)。此时, 与先前报道的 iPSC Nip-mns 相比, iPSC nil 衍生的运动神经元显示出稍低的静止膜电位 (-30±2 Mv; n = 24) 和类似的电池电容值 (+ 25±2 pf; n = 25)。然后, 为了更深入地描述分化细胞的成熟程度, 我们研究了它们在受到一系列电压脉冲刺激时唤起钠和钾电流的能力。在这些实验中, ipsc nil 衍生神经元成功地显示了电压依赖性钠电流 (图 4b) 和电压依赖性钾电流 (图 4c), 在夹紧时达到峰值振幅。膜电位接近-20 mV 和 + 50 mV。Na+和 K+的平衡电位, 使用 nernst 方程 (www.physiologyweb.com/calculators/nernst_potential_calculator.html) 与先前报告的细胞外和细胞内溶液计算,分别为 + 110 mV 和-102 mV。此外, 80% 的 iPSC nil 派生的 Ms 在电流夹紧模式下夹紧, 当注入电流脉冲 + 60 pA 或更多时, 能够触发尖峰列车 (图 4d)。在50% 以上的记录细胞中, 引起重复发射所需的最低电流为 + 40 pA (18个细胞中的 15个;图 4门限为-37.6±0.8 mv, + 40 pa 的平均射击频率约为 7.9±2.2 hz (n = 18;图 4F)。

总体而言, 这些数据表明, 与先前报道的 iPSC nip 衍生的颅 Ms12 类似, Ipssc-nil 衍生的脊髓 mns 具有成熟神经元的典型功能特性。

Figure 1
图 1: 运动神经元分化协议.该图显示了微分协议的示意图, 从生成带有 piggyBac 向量的稳定 iPSC 线, 到文本中报告的功能分析的时间点。显示了在协议不同步骤中细胞的代表性相位对比图像。刻度柱 = 50μm。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 有代表性的分化细胞免疫染色分析.通过免疫染色方法对 IPSC-NIL 和 iPSC-NIP 细胞在第0天 (a)、第3天 (b) 和第5天 (c) 进行了多能性标记 oct4 (紫色) 和泛神经元标记 TUJ1 (红色) 的表达分析.核子被 DAPI 作了反染色。在激光扫描共聚焦显微镜 (见材料表) 中获得了共聚焦图像, 使用的是具有变焦2x、1024 x 1024 像素的 20x na 0.75 目标, 配备了405纳米、405纳米、559纳米和635纳米激光。使用了 DAPI、亚历克莎 Fluor 594 和亚历克莎 Fluor 647 的过滤器设置。刻度柱 = 50μm。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 对 ipsc 衍生运动神经元进行有代表性的免疫染色分析.第12天, 通过免疫染色方法对 ipsc-nil 和 iPSC-NIP 细胞的表达进行了免疫染色分析, 以观察泛神经元标记 TUJ1 (红色) 和运动神经元标记 CHAT (胆碱乙酰基转移酶; 绿色)。核子被 DAPI 作了反染色。如图 2图例所述, 获取了共聚焦图像。刻度柱 = 50μm。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 脊柱和颅内运动神经元的功能分析.(A) ipsc nil 衍生脊髓运动神经元上全细胞贴片夹具的明亮场图像。(B) 在 ipsc nil 衍生的 mV 中记录的 na+电流的 "要多少" 的 "i v 曲线", 以响应一系列不断增加的电压步长 (n = 26; 保持电位等于-60 mv)。(C) 代表 i变 v 曲线的 k+记录在 ipsc nil 衍生的 mV 响应一系列增加的电压步长 (n = 23; 保持电位等于-40 mv)。(D) 代表的动作电位序列的反应, 响应1的持久电流注入 + 60 pa。(E) 直方图表示 ipsc nil 衍生的 ms 在每个电流脉冲 (n = 18) 上产生动作电位的百分比。(F) 直方图, 显示每个电流脉冲的诱发发射频率 (n = 18)。在直立显微镜下进行电生理记录。材料表中显示了膜电流记录系统。请点击这里查看此图的较大版本.

Supplementary Figure 1
补充图 s1: 使用集层高 Psc 的 MN 分化.(A) 在指定时间点区分集 hipsc-nil (左) 和 hipc-nip (右) 的明菲尔德图像。刻度柱 = 50μm。(B) 通过实时 qRT-PCR 分析标记在鉴别事件 hipsc-nil (上) 和圣例 hipsc-nip (底部) 细胞中的表达。对于每个标记, 具有最高表达式的时间点都被用作校准器样本。用于 ISL1 的引物是内源性基因所特有的。(C) 泛神经元标记 tuj1 (红色) 和颅内 mn 标记 PHOX2B (绿色) 在分化 (第6天) 例 hiPSC-NIL (左) 和圣安高 Psc-nip (右) 细胞的免疫染色。核子被 DAPI 作反染色。所有面板的刻度杆: 50μm。(D) 通过实时 qRT-PCR 分析 HB9 和 PHOX2B 在区分集层 hipsc-nil (上) 和类细胞 hipsc-nip (底部) 中的表达。第0天已用作校准器示例。PCR 引物和方法载于 De S疯子等人, 2018年12请点击这里查看此图的较大版本.

Supplementary Figure 2
补充图 s2: 使用 DS2U Ipsc 的 MN 区别化.(A) 在指定时间点区分 ds2u-nil (左) 和 ds2u-nip (右) 的明菲尔德图像。刻度柱 = 50μm。(B) 实时 qRT-PCR 分析指示标记在鉴别 d2u-nil (上) 和 ds2u-nip (底部) 细胞中的表达。对于每个标记, 具有最高表达式的时间点都被用作校准器样本。用于 ISL1 的引物是内源性基因所特有的。(C) 泛神经元标记 tuj1 (红色) 和颅内 mn 标记 PHOX2B (绿色) 在分化 (第6天) ds2u-nil (左) 和 DS2U-NIP (右) 细胞中的免疫染色。核子被 DAPI 作反染色。刻度柱 = 50μm。(D) 通过实时 qRT-PCR 分析 hb9 和 phox2b 在鉴别 ds2u/nil (上图) 和 ds2u-nip (底部) 细胞方面的表达。第0天已用作校准器示例。PCR 引物和方法载于 De S疯子等人, 2018年12请点击这里查看此图的较大版本.

Supplementary Figure 3
补充图 s3: hox 基因表达.(A) 分析四种不同的 hox 基因 (hox A2、Hox b1、Hox A4、Hox b5) 在通过实时 qRT-PCR 分化 iPSC-NIL 和 IPSC-NIL + ra 细胞5天后的表达。在第0天的 IPSC-NIL 已被用作校准器样品。(B) 通过实时 qrtpcr 对 Ipssc-nip 和 ipsc-nip + ra 细胞进行5天分化后, 分析四种不同的 hox 基因 (hox A2、Hox b1、hox A4、hox b5) 的表达。IPSC-NIP 在第0天已被用作校准器样品。(C) pcr 引物对。请点击这里查看此图的较大版本.

Supplementary Figure 4
补充图 s4: 多西环素诱导分析.(A) 通过 qRT-PCR 实时分析外源性 ngn2 在 iPSC-NIL (顶部) 和 iPSC-NIP (底部) 细胞中的表达, 在不同浓度 (0.5μm、1.0 微米、2.0μm) 的情况下未经处理或培养24小时。用外源小鼠基因特异性引物对 ngn2 进行分析。家长 iPSC 线路, 没有 NIL 和 NIP 结构, 已被纳入分析作为一个控制。在没有多西环素的情况下, 可忽略转基因在 iPSC-NIL 和 iPSC-NIP 中的表达。在第0天的 iPSC-NIL 和 iPSC-NIP 已被用作校准器样品。(B) 通过实时 qRT-PCR 分析外源 ngn2 在协议指示时间点分化 iPSC-NIL (左) 和 ipsc-nip (右) 细胞的表达。用外源小鼠基因特异性引物对 ngn2 进行分析。在第0天的 iPSC-NIL 和 iPSC-NIP 已被用作校准器样品。PCR 引物和方法载于 De S疯子等人, 2018年12请点击这里查看此图的较大版本.

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Discussion

由于谱系特异性转录因子的异位表达, 该协议可以有效地将人的 Ipsc 转化为脊柱和颅内运动神经元。这些转基因是由多西环素诱导和稳定地集成在基因组中感谢一个 piggyBac 转座子基载体。在混合人群中, 一个或多个携带 Bac 载体的副本将随机整合到单个细胞的基因组中, 从而增加基因组完整性改变的风险。此外, 随着时间的推移, 可能会逐步选择 iPSC 亚克隆, 可能会对分化以及疾病和控制细胞系的比较分析产生影响。总之, 使用该协议获得的 ipsc 派生的 Ms 将不适合再生医学。然而, 我们的方法可能是特别有用的体外运动神经元疾病的建模。主要的强项表现为极简单的培养条件、MN 转换的速度、ipsc 衍生 Mn 的高度成熟以及获得脊椎和颅骨 Mn 的可能性, 如先前所示:分析特定标记基因的表达12。该协议的鲁棒性表现在其重现性上。到目前为止, 我们已经成功地应用该协议超过30倍的脊柱和颅 MN 生成, 评估的结果, 通过标记和/或功能分析。我们已经成功地保持了长达两个月的运动神经元培养, 没有明显的可行性下降。此外, 一旦获得稳定转染 iPSC 线路, 每个实验都可以通过多西环素诱导开始, 而不需要新的转染。病毒向量也不是必需的。本文用材料表中所示的细胞电穿孔系统对 Ipsc 进行电控, 得到了具有代表性的结果。然而, 其他电穿孔方法可能是其他选择。相反, 根据我们的经验, 基于脂联的转染系统并不是多能干细胞12 的好选择。在工艺结束时获得的细胞群几乎完全由 MNs 组成, 避免了进一步纯化的需要 (例如, 通过流式细胞仪)。正如我们之前所显示的12, 该协议允许获得90% 的 tuj1 阳性细胞, 其中95% 也是 PHOX2B 在 nip 衍生培养中的阳性细胞。

我们可以设想一些必须得到准确考虑的关键点。首先, Ipsc 初始种群的质量对于确保均匀和一致地转换为 MNs 至关重要。必须避免。我们使用材料表中描述的人工 iPSC 介质建立了该协议, 作为未区分 Isc 的维护介质。其他商业上可获得的定义媒体可能代表有效的替代选择, 尽管我们在本工作中没有通过实验解决这一点。由于培养基成分可能会影响起始细胞群的增殖率, 因此将协议适应其他维护介质可能需要优化第0天的初始密度。转染后, 重要的是将细胞置于抗生素选择之下至少 2周, 以获得稳定的细胞系。它可能是适当的一些应用, 以获得一个更均匀的群体在转基因表达水平和更好地控制整合位点后, 得到克隆线。在第0天, 即在培养基中添加多西环素的时间, 细胞的密度是一个关键的参数。正如在 "代表性结果" 部分中提到的, 我们估计了最佳的细胞密度, 以确保重现性。我们不能排除其他多能干细胞系可能需要不同的初始密度, 这应该在试点实验中根据经验确定, 因为不同系之间的复制率可能会有很大差异。中位切换到神经碱/b27 必须发生在48小时后, 因为多西环素诱导 (第3.3 节): 分化可能会导致缓慢和效率较低, 如果细胞不保持在两个完整的时间在 Neurobasal/B27 介质。在第5天进行分离, 必须在不强调分化细胞的情况下进行。与细胞离解试剂 (步骤 3.4) 的培养时间可能因批次而异, 应在试点实验中仔细估计。在与细胞离解试剂孵育后, 整个细胞单层分离。然后, 如第3.4 节所述, 必须通过移液仔细分离, 以保持细胞完整性, 避免机械应力, 因为机械应力可能对 D5 之后的细胞培养的维持产生负面影响。最后, 我们注意到, 在重新电镀 MNs 粘附更好的组织培养塑料比玻璃。聚合物盖板可确保最佳的细胞粘附性和合适的光学性能是基于显微镜的应用的一个不错的选择。

我们的方法代表了多能细胞的直接 "编程" 转化为 MN 命运, 并不重述胚胎细胞在体内发育过程中获得 MN 身份的中间步骤, 例如神经外皮和沿着腹侧和足侧的轴的图案。因此, 在体外模拟人的 MN 规范是不合适的, 例如, 研究分化的分子机制。另一方面, 我们的协议允许产生相当数量的脊椎或颅内 Mp, 而不需要进一步的净化。考虑到成熟程度, 这也是研究运动神经退行性疾病分子基础的有用工具。在过去的几年里, 科学界产生了一系列具有运动神经元病相关基因致病突变的 iPSC 系。因此, 通过在这些突变的 iPSC 线路中稳定集成 NIL 和 NIP 模块, 可以很容易地生成 MN "可编程" iPSC 线路的集合。作为该方法今后可能的应用, 我们可以设想对细胞自主决定因素的表征, 这些决定因素对单个 MN 亚型具有不同的易感性, 方法是通过比较从 Ipsc 中获得的并排颅和脊椎 Mni。相同的遗传背景。此外, 在简化的培养条件下, 有效地将 Ipsc 转化为 MNs, 这种条件需要最少的操作 (即不需要通过胚胎体进行过渡), 并且可以很容易地扩展, 这可能会极大地促进自动化的高通量药物对运动神经元疾病的筛查方法。由于 ipsc 衍生神经元14的胎儿样性质, 成人引起的神经退行性疾病的体外建模可能具有挑战性.以前为加速 Ipsc 常规分化得出的 Mna 老化而设计的策略, 如前列腺素过度表达 15,可以与我们的方法相结合, 以获得更好的疾病模型。

本文所描述的方法, 基于由 piggyBac 载体介导的转录因子的诱导表达, 可应用于其他诱导细胞类型。我们以前已经证明, 骨骼肌细胞可以通过 BAF60c 和 Myod16的表达从人类 ipsc 中获得。同样, 我们可以设想的可能性, 扩大该方法的其他细胞类型的兴趣, 包括其他神经元亚型和星形胶质细胞, 通过 piggyb 介导的表达适当的编程因子17,18, 19,20,21

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Disclosures

作者们没有什么可以透露的

Acknowledgments

作者希望感谢意大利纳米科学研究所生命纳米科学中心的成像设施提供的支持和技术咨询。我们感谢生命纳米科学中心的成员进行了有益的讨论。这项工作得到了 AriSLA (2016年 "StressFUS" 试点赠款) 向 AR 提供的赠款的部分支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-Bapta Sigma-Aldrich A4926-1G chemicals for electrophysiological solutions
Accutase Sigma-Aldrich A6964-100ML  Cell dissociation reagent
anti-CHAT EMD Millipore  AB144P Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003
anti-goat Alexa Fluor 488  Thermo Fisher Scientific  A11055 Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848
anti-mouse Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific  A31571 Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130
anti-Oct4  BD Biosciences 611202 Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722
anti-Phox2b Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-376997 Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117
anti-rabbit Alexa Fluor 594  Immunological Sciences IS-20152-1 Secondary antibody used for immonofluorescence assays
anti-TUJ1  Sigma-Aldrich  T2200 Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133
B27 Miltenyi Biotec 130-093-566 Serum free supplement for neuronal cell maintenance
Bambanker Nippon Genetics NGE-BB02 Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors
BDNF PreproTech 450-02 Brain-Derived Neurotrophic Factor
Blasticidin Sigma-Aldrich 203350 Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes
BSA Sigma-Aldrich A2153 Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881 chemicals for electrophysiological solutions
Clampex 10 software Molecular Devices Clampex 10 Membrane currents recording system
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix Corning 354277 Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA Biological Industries 05-710-1E Freezing medium for human iPSCs
D-Glucose Sigma-Aldrich G5146 chemicals for electrophysiological solutions
DAPI powder Roche 10236276001 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays
DAPT AdipoGen AG-CR1-0016-M005 Gamma secretase inhibitor
Dispase Gibco 17105-041 Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12 Sigma-Aldrich D6421-500ML Basal medium for cell culture
Doxycycline Sigma-Aldrich D9891-1G  Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2U  WiCell UWWC1-DS2U Commercial human iPSC line
E.Z.N.A Total RNA Kit  Omega bio-tek R6834-02 Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells
GDNF PreproTech 450-10 Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC Line Thermo Fisher Scientific A18945 Commercial human iPSC line
Glutamax Thermo Fisher Scientific 35050038 An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health.
Hepes Sigma-Aldrich H4034 chemicals for electrophysiological solutions
iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR  Bio-Rad 1708841 Kit for gene expression analysis using real-time qPCR
iTaqTM Universal SYBR Green Supermix  Bio-Rad 172-5121  Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument
K-Gluconate Sigma-Aldrich G4500 chemicals for electrophysiological solutions
KCl Sigma-Aldrich P9333 chemicals for electrophysiological solutions
L-ascorbic acid LKT Laboratories A7210 Used in cell culture as an antioxidant
Laminin Sigma-Aldrich 11243217001 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Laser scanning confocal microscope  Olympus  iX83 FluoView1200 Confocal microscope for acquisition of immunostaining images
Mg-ATP Sigma-Aldrich A9187 chemicals for electrophysiological solutions
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 chemicals for electrophysiological solutions
Mounting Medium  Ibidi 50001 Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays
Multiclamp patch-clamp amplifier Molecular Devices 700B Membrane currents recording system
Na-GTP Sigma-Aldrich G8877 chemicals for electrophysiological solutions
NaCl Sigma-Aldrich 71376 chemicals for electrophysiological solutions
NEAA Thermo Fisher Scientific 11140035 Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 μL Kit Thermo Fisher Scientific MPK10096 Cell electroporation kit
Neon Transfection System Thermo Fisher Scientific MPK5000 Cell electroporation system
Neurobasal Medium Thermo Fisher Scientific 21103049 Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FF  Biological Industries 05-100-1A Human iPSC culture medium
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 157-8 Used for cell fixation in immunostaining assays
PBS Sigma-Aldrich D8662-500ML Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, with Calcium, with Magnesium
PBS Ca2+/Mg2+ free Sigma-Aldrich D8537-500ML Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium
Penicillin/Streptomycin  Sigma-Aldrich P4333-100ML Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
poly-ornithine Sigma-Aldrich P4957 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
SU5402 Sigma-Aldrich SML0443-5MG Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2)
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays
Upright microscope Olympus BX51VI Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera 
Y-27632  (ROCK inhibitor) Enzo Life Sciences ALX-270-333-M005  Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival
μ-Slide 8 Well  Ibidi 80826 Support for high–end microscopic analysis of fixed cells

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References

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