使用多光谱成像流细胞测定法执行体外微核测定的自动化方法

Bioengineering
 

Summary

体外微核测定是评估基因毒性和细胞毒性的成熟方法,但使用人工显微镜对测定进行评分是费力的,具有主观性和分时变异性。本文介绍了为使用多光谱成像流细胞测定执行全自动测试而开发的协议。

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Rodrigues, M. A. An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59324, doi:10.3791/59324 (2019).

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Abstract

体外微核 (MN) 测定通常用于评估细胞毒性和基因毒性,但通过手动显微镜对测定进行评分是费力的,并且由于评分员之间的变异性,结果存在不确定性。为了解决这个问题,引入了自动滑动扫描显微镜以及传统的流式细胞测量方法,试图消除评分员偏差并提高吞吐量。然而,这些方法有其自身固有的局限性,如无法可视化细胞的细胞质,以及缺乏视觉MN验证或图像数据存储与流细胞测定。多光谱成像流细胞仪(MIFC)有可能克服这些限制。MIFC 将显微镜的高分辨率荧光图像与传统流式细胞仪的统计鲁棒性和速度相结合。此外,所有收集的影像都可以存储在剂量特定的文件中。本文介绍了为在MIFC上执行MN测定的全自动版本而开发的协议。人类淋巴细胞TK6细胞使用低通液(75 mM KCl)扩大,用4%的形式素固定,核含量被Hoechst 33342染色。所有样品在MIFC上均暂停运行,允许采集测定所需的所有关键事件的高分辨率图像(例如,带和不含MN的二核化细胞以及单核细胞和多核细胞)。图像在MIFC数据分析软件中自动识别、分类和枚举,允许自动评分细胞毒性和基因毒性。结果表明,使用MIFC进行体外MN测定,与TK6细胞接触TK6细胞后的溶剂对照组相比,在几种不同细胞毒性水平上检测MN频率的统计显著增长。Mitomycin C 和科尔奇辛,在接触曼尼托后,MN 频率没有明显增加。

Introduction

体外微核(MN)测定是一种常用的测试,用于评估细胞毒性和基因毒性,作为化学和药物开发以及接触各种个体的人体生物监测等多个研究领域的筛选工具。环境、职业或生活方式因素1、23。MN由染色体片段或细胞分裂过程中产生的整个染色体组成,这些片段或染色体未合并到两个主要子核之一中。继端相之后,这种染色体物质在细胞质内部形成一个个体的圆形体,与主核之一的2分离。因此,MN是DNA损伤的代表,多年来一直被用作基因毒性试验终点4。测量MN的最适当方法是细胞因子块微核(CBMN)测定。使用煤层气测定,通过将细胞沙沙沙辛B(Cyt-B)纳入样品,可以评分二核细胞(BNCs)中的MN频率。Cyt-B允许核分裂,但防止细胞分裂,因此,限制MN的得分到只有分裂次的BNCs。

使用显微镜和流式细胞测量的协议已经开发和验证,并经常用于执行体外MN测定6,7,8,9,10, 11,12,13,14.显微镜的好处是能够直观地确认MN是合法的,但很耗时,并且容易在评分者15之间发生变异。为了解决这个问题,开发了自动显微镜方法来扫描幻灯片并捕获核16、17、18、19的图像,但细胞质无法可视化,这使得它难以确定 MN 是否与特定单元格实际关联。此外,这些方法难以识别使用Cyt-B9计算细胞毒性所需的多核(POLY)细胞(包括三基和四元细胞)。为执行MN测定而开发的流式细胞测定方法采用荧光以及正向和侧散射强度来识别在20、21次变流后从细胞中释放的细胞和MN的种群 ,22.这允许在几分钟内从几千个单元获取数据,并允许自动分析23;然而,由于无法可视化细胞,因此无法确认评分事件是否真实。此外,溶化细胞膜抑制Cyt-B的使用,并产生一个悬浮液,包含其他碎片,如染色体聚集体或凋亡体,没有办法区分这些与MN24。

鉴于这些限制,多光谱成像流细胞测定 (MIFC) 是执行 MN 测定的理想系统,因为它将显微镜的高分辨率荧光图像与传统流式细胞仪的统计鲁棒性和速度相结合。在MIFC中,所有细胞被引入流体系统,然后以流体动力学聚焦到流细胞比色皿的中心。通过使用光场 (BF) 发光二极管 (LED)、侧散射激光和(至少) 一个荧光激光,可以完成所有单元的正交照明。荧光子由三个(20x、40x或60x)高数值光圈物透镜之一捕获,然后通过光谱分解元件。然后,光子聚焦到电荷耦合器件(CCD)相机上,以获得流单元中所有细胞的高分辨率图像。为了避免模糊或条纹,CCD 以时间延迟集成 (TDI) 模式运行,该模式通过将像素内容从一行向下传输到 CCD 与流中单元的速度同步来跟踪对象。然后从最后一行像素收集像素信息。TDI 成像与光谱分解相结合,允许从流细胞中同时捕获多达 12 个图像(2 BF、10 荧光)。所有捕获的影像都存储在特定于样本的数据文件中,允许使用 MIFC 数据分析软件随时执行分析。最后,数据文件保留了所有双变量图上的蜂窝图像和点之间的链接。这意味着传统双变量图上的任何点都可以突出显示,其相应的 BF 和荧光图像将显示25

最近,基于MIFC的方法被开发用于对分诊辐射生物剂量测定26、27、28、29、30、31和遗传进行MN测定。毒理学32,33测试.这项工作已经证明,主要核、MN和细胞质的细胞图像成像的通量比其他方法高26。分析所需的所有细胞类型,包括MONO细胞、BNCs(带和不含MN)和POLY细胞,都可以在MIFC数据分析软件中自动识别,并且Feech等人开发的评分标准的实现是通过使用各种数学算法6,34。生物剂量测定结果表明,在量化每BNC29MN速率时,剂量反应校准曲线的量级与文献中其他自动方法的曲线相似。此外,毒理学的最新研究表明,使用MIFC可以自动捕获、识别、分类和枚举MONO细胞、BNC(带和不含MN)和POLY细胞的图像。该协议和数据分析使在将TK6细胞暴露于几个克氏体和aneugen32后,能够计算细胞毒性和基因毒性。

本文提出的方案描述了一种使用MIFC进行体外MN测定的方法。这项工作中使用的样品处理技术处理单个样品需要不到 2 小时,与其他方法相比,执行起来相对容易。MIFC分析软件中的数据分析很复杂,但按照本文概述的步骤,可以在几个小时内完成分析模板的创建。此外,模板创建后,可以自动应用于所有收集的数据,而无需任何进一步的工作。该协议概述了将TK6细胞暴露给克氏体素和阿纽根所需的所有步骤,描述了如何培养、处理和染色细胞,并演示如何使用MIFC获取高分辨率图像。此外,本文还介绍了目前分析MIFC软件中的数据的最佳做法,以自动识别和评分MONO细胞、BNCs和POLY细胞,以便计算细胞毒性和基因毒性。

Protocol

1. 培养基的制备和TK6细胞的培养

注:本协议中使用的一些化学品是有毒的。吸入、吞咽或接触皮肤与细胞沙星B可能是致命的。穿戴适当的个人防护装备,包括实验室外套和两副手套。处理后彻底洗手。甲醛/甲醛是有毒的,如果吸入或吞咽;对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激性;并可能通过吸入或皮肤接触引起敏化。眼睛有严重受损的危险。它是一种潜在的致癌物质。

  1. 准备 565 mL 的 1x RPMI 培养基。将5 mL的MEM非必需氨基酸(100x)、5 mL的丙酸钠(100mM)、5 mL的青霉素-链霉素-谷氨酰胺(100x)和50 mL的胎儿牛血清(FBS)加入500 mL瓶1x RPMI 1640介质。将培养基在生物安全柜中制备,并储存在2-8°C下。在将介质加热到 37°C 之前,将其添加到 TK6 细胞中(参见材料表)。
  2. 在10 mL的介质中解冻1 mL的TK6细胞(在DMSO中储存在-80°C下)。在200 x g下将细胞离心8分钟,并吸出上清液。将细胞转移到50 mL的介质,并在37°C,5%CO2孵育。TK6细胞的倍增时间从+12-18小时不等,细胞达到最大增殖速率需要几个(3或4)通道(见材料表)。
  3. 培养100 mL的细胞,浓度为±7-8 x 105细胞/mL。

2. 制备克氏原和/或阿氏原和细胞沙拉素B

  1. 准备所需的克肌激素和阿豆原的适当库存浓度。例如,对于Mitomycin C,在10 mL的无菌水中溶解一个2mg的瓶子,最终库存浓度达到200微克/mL。Mitomycin C 可在 4°C 下储存三个月(参见材料表)。
  2. 在实验日,如果分别在无菌水中稀释或DMSO稀释,则准备稀释所需化学品,这些化学品比所需的暴露浓度高10倍或100倍。
  3. 对于Mitomycin C,在0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 μg/mL的无菌水中制备3 mL稀释剂。对于科尔奇金,在0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 μg/mL的无菌水中制备3 mL稀释剂。最后,对于Mannitol,在5、10、20、30、40和50mg/mL的无菌水中制备3mL稀释剂。
  4. 通过将5mg瓶溶解成25 mL的DMSO,制备200微克/mL的细胞沙沙沙辛B的库存浓度。细胞沙沙辛B可在-20°C下储存数月。

3. 细胞接触克氏原体和/或阿纽根

  1. 在T25烧瓶中,在+7-8x105细胞/mL的细胞中加入1mL所需化学物质(如米霉素C)。对于对照样品,加入1 mL的无菌水。将烧瓶置于 37°C、5% CO2培养箱中 3 小时。
    注:如果化学品在DMSO中稀释,则在每个烧瓶中仅添加100μL的化学物质,并在对照中添加100μL的DMSO。每个烧瓶应包含9.900 mL的细胞。
  2. 3小时后,从培养箱中取出烧瓶,并将细胞转移到15 mL聚丙烯管中。在200 x g下离心8分钟,吸出上清液并将细胞转移到含有10mL新鲜培养基的T25瓶内。在每个烧瓶中加入150 μL的细胞沙沙辛B的库存浓度(200微克/mL),最终浓度达到3微克/mL。
  3. 根据 OECD 指南9的建议,将烧瓶返回到 37°C、5% CO2培养箱,恢复时间等于 1.5-2.0 倍。对于本工作中使用的 TK6 细胞,恢复时间是 24 小时。
    注:此处使用的 TK6 细胞的倍增时间为 15 小时,恢复时间为 24 小时(1.6 倍倍)。回收时间小于1.5倍倍将减少暴露于影响BCs数量的更高剂量的样品的增殖。 相反,超过2.0的回收时间将在对照样品中产生不成比例的多聚核细胞,偏斜细胞毒性计算。

4. 制备缓冲液以固定和标记DNA内容(见材料表)

  1. 通过加入2.79克至500 mL的超纯水,制备75 mM氯化钾(KCl)。使用磁性搅拌器和无菌过滤器通过 200 μm 过滤器将溶液搅拌 5 分钟。75 mM KCl 溶液可在 4°C 下存储数月。
  2. 为实验准备足够量的4%的正数,预计每个样本中总共必须添加2.1 mL。例如,要制备 10 mL 的 4% 正式素,将 4 mL 的 10% 正式库存添加到 6 mL 的 1x Dulbeco 的磷酸盐缓冲盐碱溶液中,而不带 Ca2+或 Mg2+ (PBS)。这种4%的成金可以在室温下储存几个星期。
  3. 通过在 500 mL 瓶 1x PBS 中加入 10 mL 的 FBS,制备 510 mL 的洗涤缓冲液(1X PBS 中的 2% FBS)。
  4. 将100μg/mL浓度的Hoechst 33342浓度加入100μL(1mg/mL)至9,900μL的1X PBS, 制备10 mL。Hoechst 33342 溶液可在 4°C 下存储数月。

5. 样品处理:低氧肿胀、固定、细胞计数和标记DNA含量

  1. 在回收期结束时,从培养箱中取出所有烧瓶,并将所有样品转移到 15 mL 聚丙烯管中。将所有样品在200 x g下离心8分钟。
  2. 吸出上清液,重新悬浮细胞,加入5 mL的75 mM KCl.通过倒置轻轻混合三次,并在4°C孵育7分钟。
  3. 在每个样品中加入2 mL 4%的正素,通过倒置轻轻混合三次,并在4°C孵育10分钟。此步骤充当"软固定"。
  4. 将所有样品在200 x g下离心8分钟。将上清液吸气,在100μL4%的形式素中重新悬浮20分钟。这一步起到"硬固定"的作用。
  5. 在200 x g下加入5 mL的洗涤缓冲液和离心机8分钟。吸出上清液,在100 μL洗涤缓冲液中重新悬浮。
  6. 将所有样品转移到1.5 mL微离心管中。
  7. 对每个样本执行单元格计数以确定每个样本的细胞数。样品将高度浓缩,因此可能需要在 1x PBS 中稀释 1:100(PBS 990 μL 中样品的 10 μL)才能获得准确的计数。
    注:此时最好使用血细胞计进行细胞计数。添加 KCl 使细胞质具有半透明的外观,使自动细胞计数器难以识别它们。此外,自动计数器由于多核细胞的大小而难以评分。
  8. 如果不立即在MIFC上运行样品,它们可以在4°C下储存数天。准备运行样品时,在每个样品中加入5 μL,每1x106个细胞/mL100μg/mL。每100μL样品中加入10μL500μg/mL的RNase,最终浓度为50微克/mL。在37°C、5%CO2孵育样品30分钟。
  9. 以200 x g的微离心机所有样品8分钟,并使用移液器去除上清液,留下±30 μL。在 MIFC 上运行之前,使用移液器重新悬浮所有样品,以确保管中没有气泡。不要涡旋。

6. 启动和校准 MIFC

  1. 确保护套、系统校准试剂、脱泡器、清洁剂和消毒器容器已满且废物箱已空。打开系统电源并双击 MIFC 软件图标。单击"启动"按钮,并确保选中"启动所有校准和测试"复选框。这将冲洗系统、负载护套和系统校准试剂,并校准系统(参见材料表)。

7. 在 MIFC 上运行样本

注: 本部分假定使用 2 摄像机 MIFC。如果使用 1 摄像机 MIFC,请参阅补充 1 - 完整协议,第 7 节,用于在采集过程中创建绘图

  1. 启动 MIFC 数据采集软件(参见材料表)。图 1显示了仪器设置。打开 405 nm 激光,将激光功率设置为 10 mW (A)。禁用所有其他激光器(包括 SSC),并将 BF 设置为通道 1 和 9 (B)。确认放大滑块设置为 60x (C),选择高灵敏度模式 (D),并且图像库中仅显示通道 1、7 和 9。
  2. 单击散点图图标。选择"所有总体",并在 Y 轴上的 X 轴和纵横比 M01上选择"面积 M01"。单击"方形区域"图标,并在单个单元格周围绘制区域。命名此区域单个单元格。右键单击绘图并选择"区域"。突出显示单个单元格区域并将 x 坐标更改为 100 和 900,并将 y 坐标更改为 0.75 和 1(图 1I)。
  3. 单击散点图图标。选择单个单元格作为父填充,选择 X 轴上的渐变 RMS M01,在 Y 轴上选择渐变 RMS M07。单击"方形区域"图标,并绘制大多数单元格周围的区域。命名此区域聚焦单元格。右键单击绘图并选择"区域"。突出显示聚焦单元格区域并将 x 坐标更改为 55 和 75,并将 y 坐标更改为 9.5 和 20(图 1J)。
  4. 单击直方图图标。选择聚焦单元格总体并选择强度 M07作为特征。单击"线性区域"图标,在直方图中绘制主峰值区域。命名这个区域DNA阳性。右键单击绘图并选择"区域"。突出显示DNA 阳性区域并将坐标更改为 2 x 105和 2 x 106。范围可能必须根据直方图上的强度峰值进行调整(图 1K)。
  5. 设置采集参数 (图 1E.指定文件名和目标文件夹,将事件数更改为 20,000,然后选择DNA 阳性总体。
  6. 单击加载(图 1F) 并将控制样本放入 MIFC 中。单击"获取"按钮收集数据 (图 1G)。采集完成后,单击"返回"按钮返回示例(图 1H)。从仪器上拆下样品管。对实验中的所有剩余样本重复此过程。

8. 在 IDEAS 中打开数据文件

  1. 启动 MIFC 分析软件包(参见材料表)。单击"开始分析"以启动打开的文件向导。通过浏览到所需的原始图像文件 (.rif) 选择数据文件。单击"打开"按钮,然后单击"下一步"。
  2. 由于这是单一颜色测定,因此不需要补偿,因此单击"下一步"以绕过补偿步骤。在此阶段,没有要应用的分析模板,因此请再次单击"下一步"。如果分析模板已从补充材料下载,请立即选择它。这些模板仅适用于 2 摄像机 MIFC,BF 设置为通道 1 和 9,在采集过程中通道 7 中处理核图像。
  3. 默认情况下,将自动生成 .cif 和 .daf 文件名以匹配 .rif。不建议更改 .cif 和 .daf的名称。单击"下一步"。通过选择0107来设置图像显示属性。单击"下一步"。此应用程序没有向导,因此单击"完成"。 在第 9-14 节中经常保存数据分析文件 (.daf) 和分析模板 (.ast) 非常重要,以避免进度丢失。

9. 创建蒙版和特征以识别 BNC

  1. 单击"图像库属性"图标(蓝色/白色图标)。在"显示属性"选项卡中,单击"将范围设置为像素数据",然后将颜色更改为黄色。单击"确定"。现在,在黑色背景下,Hoechst 图像更易于查看。
  2. 创建非凋亡细胞图。
    1. 单击"分析"选项卡,然后单击"蒙版"。单击"新建",然后单击"功能"。在"功能选择阈值"下,在"蒙版"下选择M07并将强度百分比设置为 50。单击"确定",然后再次单击"确定"。单击"关闭"。
    2. 单击"分析"选项卡,单击"要素",然后单击"新建"。对于要素类型,选择"区域"。对于掩码,选择阈值 (M07,Ch07,50)。单击"设置默认名称"并单击"确定"。单击"关闭"开始计算要素值。
    3. 单击"点图"图标。选择"全部填充"。对于X 轴特征,选择对比度_M01_Ch01特征,对于Y 轴特征选择"面积+阈值(M07,Ch07,50)"。单击"确定"。
    4. 单击"方形区域"按钮,并绘制大多数单元格周围的区域。称此区域为非凋亡。右键单击绘图并单击"区域"。突出显示非凋亡区域。将x 坐标设置为 0 和 15,并将y 坐标设置为 50 和 300。单击"关闭"。
  3. 创建 BNC 掩膜(步骤 9.3.1-9.3.5)以识别仅包含两个核的细胞。
    1. 在图片库中浏览 BNC 并单击它。这是可视化在 Hoechst 通道中创建蒙版。
    2. 单击"分析"选项卡,然后单击"蒙版"。单击"新建",然后单击"功能"。在"功能选择"级别设置"下,在"蒙版"下选择"M07",选择"中间水平蒙版"单选按钮,并将"轮廓细节比例"设置为 3.00。 单击"确定",然后再次单击"确定"。
    3. 单击"新建",然后单击"功能"。在"功能"下,选择"除草量",在"掩码"下选择"级别设置"(M07、Ch07、中、3)。图像设置为 Ch07,并将像素数设置为 2。单击"确定",然后再次单击"确定"。
    4. 单击"新建",然后单击"功能"。在"函数"下选择"分水岭",在"掩码"下选择"除草量(水平集(M07、Ch07、中、3)2"。 图像设置为 Ch07,并将线粗设置为1。单击"确定",然后再次单击"确定"。
    5. 单击"新建",然后单击"功能"。在"功能选择范围"下,在"蒙版"下选择"分水岭(色拉(水平集(M07、Ch07、中、3)2)"。图像设置为 Ch07。将最小和最大面积值分别设置为 115 和 5000。将最小和最大纵横比值分别设置为 0.4 和 1。单击"确定"。在"名称"字段中,将文本更改为读取BNC,然后单击"确定"。
  4. 创建要素和绘图以获取最终 BNC 人口
    1. 点计数 BNC 功能:单击"分析"选项卡,然后单击"要素",然后单击"新建"。 对于要素类型,选择"点计数"。对于蒙版,选择在 9.3.5 中创建的最终 BNC 掩码。将"连接性"设置为"四",并将名称更改为Spot 计数 BNC单击"确定",然后单击"关闭"以计算要素值。
    2. 点计数 BNC 直方图。单击直方图图标。选择非凋亡作为父填充。对于X 轴特征,请选择"点计数 BNC"特征。单击"确定"。单击"线性区域"图标。跨 bin 2绘制区域。调用此区域2N
      注: 请参阅补编 1 - 完整协议中的第 9 节,以创建剩余的蒙版、特征和绘图,以确定最终的 BNC 人口

10. 创建蒙版和特征,以识别 BNC 人口中的 MN

  1. 创建 MN 蒙版。浏览在图像库中包含 MN 的 BNC,然后单击它。这是可视化在 Hoechst 通道中创建 MN 掩码。单击"分析"选项卡,然后单击"蒙版"。
    1. 创建污点标识蒙版 1:
      1. 单击"新建",然后单击"功能"。在"功能"选择"点"并确保选择"亮"单选按钮。在蒙版下选择M07,将"点到单元格背景比率"设置为2.00。将最小半径设置为2,最大半径设置为6单击"确定",然后再次单击"确定"。
      2. 单击"新建",然后单击"功能"。在"功能选择范围"下,在"掩码"下选择"级别集"(M07、Ch07、中、3)。要显示的图像设置为Ch07。将最小面积和最大区域分别设置为 80 和 5000。将最小和最大纵横比分别设置为 0 和 1。单击"确定",然后再次单击"确定"。
      3. 单击"新建",然后单击"功能"。函数选择除草,在"掩码"下选择范围(级别设置(M07,Ch07,中间,3),80-5000,0-1。要显示的图像设置为Ch07。将像素数设置为2单击"确定",然后再次单击"确定"。
      4. 单击"新建"。双击Spot(M07、Ch07、明亮、2、6、2)掩码以将其添加到蒙版定义中。单击And运算符,然后单击"不"运算符。双击除草(范围(LevelSet(M07、Ch07、中间、3)、80-5000、0-1、2)掩码,将其添加到掩码定义中。单击"确定"。
      5. 单击"新建",然后单击"函数"。在"功能范围"下选择"范围"和"蒙版"下选择在 10.1.1.4 中创建的蒙版:
        1. 选择点(M07、Ch07、明亮、2、6、2)和未稀释(范围(范围(级别集(M07、Ch07、中、3)、80-5000、0-1、2)。
        2. 图像设置为显示Ch07。将最小面积和最大面积分别设置为 10 和 80。将最小和最大纵横比分别设置为 0.4 和 1。单击"确定",然后再次单击"确定"。点识别掩码 1 已完成。
          注:请参阅补编 1 - 完整协议中的第 10 节,以创建蒙版、特征和绘图,以确定最终的 MN 总体

11. 创建蒙版、特征和绘图,以识别单核化和多核化种群

  1. 创建 POLY 蒙版。单击"分析",然后"码",然后单击"新建"功能。在"功能选择范围"下,在"蒙版"下选择"分水岭(除集(水平集(M07、Ch07、中间、3)、2)。)。图像设置为 Ch07。将最小最大面积值分别设置为 135 和 5000。将最小和最大纵横比值分别设置为 0.4 和 1。单击"确定"。在"名称"字段中,将文本更改为"POLY",然后单击"确定",然后单击"关闭"。 多核细胞掩膜已完成。
  2. 创建 POLY 组件蒙版。
    1. POLY 组件掩码 1:单击"分析"选项卡,然后"蒙版",然后是"新建"函数。在"功能选择组件"下,在"蒙版"下选择POLY蒙版。对于排名功能,选择"区域"和"排序顺序",单击"降序"单选按钮。将排名设置为1单击"确定",然后再次单击"确定"。
    2. POLY 组件掩码 2、3 和 4:重复 11.2.1 中的所有步骤,但将Rank设置为 2、3 和4以创建单个组件掩码。
  3. 使用 POLY 蒙版点计数。
    1. 单击"分析"选项卡,然后单击"要素",然后单击"新建"。对于要素类型,选择"点计数"。对于蒙版,选择POLY蒙版并将连接度设置为4单击"设置默认名称",然后单击"确定",然后单击"关闭"以计算要素值。
    2. 单击直方图图标。选择非凋亡人群。对于X 轴特征,选择"点计数_POLY_4"特征。
    3. MONO 点计数区域。单击"线性区域"图标。在 11.3.2 中创建的直方图上跨 bin 1绘制区域。调用此区域1N
    4. TRI 点计数区域。单击"线性区域"图标。在 11.3.2 中创建的直方图上跨 bin 3绘制区域。调用此区域3N
    5. QUAD MONO 点计数区域。单击"线性区域"图标。在 11.3.2 中创建的直方图上跨 bin 4绘制区域。调用此区域4N
  4. 确定 MONO 总体。
    1. 创建 MONO 纵横比功能。单击"分析"选项卡,然后单击"要素",然后单击"新建"。在"要素类型"下,选择"纵横比"特征,在"蒙版"下选择"零金(1、面积、POLY、降序)"。单击"设置默认名称",然后单击"确定"。
    2. 创建 MONO 循环功能。在"功能管理器"窗口仍然打开时,单击"新建"。在"要素类型"下,选择"循环特征",在"蒙版"下选择"零部件(1、面积、POLY、降序)"。单击"设置默认名称",然后单击"确定",然后单击"关闭"以计算要素值。
    3. 对于圆形 MONO 单元格点图,请单击"点图"图标。选择1N作为父填充。对于X 轴特征,选择圆形组件(1、面积、POLY、降序),对于Y 轴特征选择纵横比+分量(1、面积、POLY、降序)。单击"确定"。单击"方形区域"按钮,在单元格总体周围向绘图的右上角绘制区域。命名此区域通告=1N。右键单击绘图并单击"区域"。突出显示圆形=1N区域。将X 坐标更改为 20 和 55,并将Y 坐标更改为 0.85 和 1.0。单击"关闭"。
    4. 创建区域 POLY/区域_M07 要素。单击"分析"选项卡,然后单击"要素",然后单击"新建"。在"要素类型"下,选择"区域要素",在"蒙版"下选择"零部件(1、面积、POLY、降序)"。单击"设置默认名称",然后单击"确定"。
    5. 在"功能管理器"窗口仍然打开的情况下,单击"新建",然后在"功能类型"下单击"组合单选单"按钮。从要素列表中,突出显示"区域+组件"(1、面积、POLY、降序),然后单击向下箭头将其添加到要素定义中。单击除法符号 (/)。选择"区域_M07"特征,然后单击向下箭头将其添加到要素定义中。单击"设置默认名称"并单击"确定"。单击"关闭"开始计算要素值。
    6. 对于最终的 MONO 填充点图,请单击点图图标。选择"循环=1N"作为父填充。对于X 轴特征,选择纵横比_M07,对于Y 轴特征选择"面积+零部件"(1、面积、POLY、降序)/面积=M07单击"确定"。单击"方形区域"按钮,并绘制大多数单元格周围的区域。命名此区域单核化。右键单击绘图并单击"区域"。突出显示单核化区域。将X 坐标更改为 0.85 和 1.0,并将Y 坐标更改为 0.55 和 1.0。单击"关闭"。
      注:请参阅补编1-《完整议定书》第11节,以创建面具、特征和绘图,以确定最终的三核和多核种群。

12. 创建自定义视图以检查 BNC 和 MN 掩码

  1. 单击"图像库属性"按钮,然后单击"查看"选项卡。单击"合成"选项卡,然后单击"新建"。名称类型Ch01/Ch07下。单击"添加图像"。在"图像"下选择Ch01并将百分比设置为 100。再次单击"添加图像",在"图像"下选择Ch07并将百分比设置为 100。
  2. 单击"新建"和"名称类型"BNC 和MN 掩码
  3. 单击"添加列"。在"图像类型"下选择"Ch01",在"蒙版"选择"无"
  4. 单击"添加列"。在"图像类型"下选择"Ch07",在"蒙版"选择"无"
  5. 单击"添加列"。在"图像类型"下选择"Ch07",在"蒙版"下选择"BNC"
  6. 单击"添加列"。在"图像类型"下选择Ch07,在"蒙版"下选择MN 蒙版
  7. 单击"添加列"。在"图像类型"下,单击"合成单选"按钮。Ch01/Ch07复合图像应自动添加到视图中。单击"确定"可关闭"图像库属性"窗口。

13. 创建自定义视图以检查 POLY 蒙版

  1. 请参阅补充 1 - 完整协议中的第 13 节,以创建自定义视图以检查 POLY 掩码

14. 创建统计表以枚举关键事件

  1. 单击"报表"选项卡,然后单击"定义统计信息报告"。在新窗口中,单击"添加列"。
  2. 添加 BNC 计数统计信息。在"统计"选择"计数"和"选定人口"下选择BNC人口。单击"添加统计信息"将统计信息添加到列表中。
  3. 重复步骤14.2,为MNBnCs、MONO、TRI和POLY种群创建单独的列。单击"关闭",然后单击"确定"。
  4. 数据分析模板已完成 (图2)。保存模板(文件,另存为模板)。完整的掩码列表可以在补充2 - 掩码列表中找到。

15. 使用数据分析模板批处理实验文件

  1. 在"工具"菜单下,单击"批处理数据文件",然后单击新窗口中的"添加批处理"。
  2. 在新窗口中,单击"添加文件"以选择要添加到批处理的实验文件 (.rif)。在"选择模板或数据分析文件 (.ast、.daf)"选项下,单击打开的文件夹图标以浏览并打开步骤 14.4 中保存的数据分析模板 (.ast 文件)。
  3. 单击"预览统计信息报告"按钮以预览统计信息表。此处不会显示任何值,因为它们尚未计算。但是,此步骤用作检查,以确保在运行批处理之前选择了正确的分析模板。
  4. 单击"确定"可关闭当前窗口。然后单击"提交批次"以开始对所有文件的批处理。
  5. 批处理完成后,包含所有 .rif 文件的文件夹中将有一个 .txt 文件可用。使用这些统计数据计算基因毒性和细胞毒性。

16. 计算基因毒性和细胞毒性参数

  1. 计算基因毒性:要计算基因毒性,请使用 15.5 中创建的统计表。将 MN BNCs 中的细胞数除以 BNC 总体中的细胞数,然后乘以 100:
    Equation 1
  2. 计算细胞毒性:通过求和TRI和QUAD细胞的数量求和,确定POLY细胞的总数。
    1. 使用MONO、BnCs和POLY中的细胞数量计算细胞因子-块增殖指数(CBPI),如下所示:
      Equation 2
    2. 最后,使用对照培养基 (C) 和化学暴露培养物 (T) 中的 CBPI 值计算每种培养物的细胞毒性,如下所示:
      Equation 3

Representative Results

本文概述的分析方法允许自动识别和评分BNCs,有MN和无MN,以计算基因毒性。此外,MONO和POLY细胞也自动被识别和评分,以计算细胞毒性。在 MIFC 数据分析软件中实现对这些事件进行评分时必须遵守的已发布的评分标准6、34。这里介绍的结果表明,在人类淋巴细胞TK6细胞暴露于著名的MN诱导化学品(米托霉素C和科尔奇辛)后,可检测到MN频率的统计显著增长,细胞毒性增加。测试的其他化学品的类似结果已在另一份出版物32中得到证明。此外,使用 Mannitol 的结果表明,使用此处概述的 MIFC 方法也可以正确识别非 MN 诱导化学品。如果使用不同的细胞类型(例如中国仓鼠细胞)执行测定,则协议中描述的用于创建所有掩膜、特征和区域边界的参数可能需要进行调整。

图 3显示了四个用于识别 BNC 的选定面板(图 3A-3D)。此处显示的是一个直方图,用于选择具有两个核(图 3A)和双变量图的细胞,从而能够选择具有相似循环性的 BNC(图 3B)、相似区域和强度(图 3C)和具有良好分离、非重叠核(图3D)的BNCs,根据评分克里蒂埃6,34。图 3E显示 BF 和 Hoechst 图像以及 BNC 和 MN 掩码,指示可以识别和枚举具有单个或多个 MN 的 BNC。这允许通过确定最终 BNC 人群中的微核化 BNC 速率来计算基因毒性。图 4显示了使用 POLY 掩码识别 MONO、TRI 和 QUAD 单元的点计数功能的应用。然后可以求和的TRI和QUAD细胞的数量,以获得POLY细胞的最终数量(表1)。这使得细胞毒性可以通过使用协议中所示的公式进行计算。因此,实验中的每个剂量点都可以通过基因毒性和细胞毒性参数进行评估。

图5显示了阿内根科尔奇辛、克拉斯托根米托霉素C和阴性对照Mannitol的基因毒性和细胞毒性值。对于Colchicine(图5A),0.02至0.05 μg/mL剂量在MN频率上产生统计显著性增加,在溶剂控制中分别从1.28%到2.44%不等(表1)。在Mitomycin C(图5B)的情况下,与溶剂对照组相比,两个最高剂量的0.4和0.5μg/mL产生具有统计学意义的MN频率。这些 MN 频率在 0.4 μg/mL 时为 0.93%,在 0.5 μg/mL 时为 1.02%(表 2)。最后,对于Mannitol(图5C),没有测试剂量导致细胞毒性超过30%,也没有产生显着增加的MN频率相比,溶剂控制,如预期(表3)。

Figure 1
图 1:MIFC 仪器设置。MIFC 设置的屏幕截图,如协议第 7 节所述。(A) 将 405 nm 激光功率设置为 10 mW.(B) 设置 BF 通道 1 和 9。(C) 选择 60 倍放大物镜。(D) 选择最慢的流速,以最高的分辨率生成影像。(E) 指定要收集的事件数至 20,000。(F) 单击加载按钮开始示例加载过程。(G)单击"获取"按钮开始获取影像。(H)单击"返回"按钮返回任何未使用的示例。(I) 用于选择单个单元格的 BF 纵横比与 BF 面积的散射图。(J) 霍赫斯特梯度 RMS 与 BF 梯度 RMS 的散点图用于选择聚焦的单元。(K) 用于选择DNA阳性细胞的Hoechst强度的直方图。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2:分析软件门控策略。协议第 9 节中描述的门控策略的屏幕截图。区域按顺序显示,用于识别双核细胞(红盒)、微核(黄色盒)和单核和多核细胞(蓝色框)。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3:识别和评分的BNC与没有MN。(A) 选择具有两个不同核的细胞.(B) 利用纵横比强度特征,识别具有两个高度圆形核的二核细胞(BNCs)。(C) 选择具有相似区域和强度的核的 BNC.这是通过计算两个原子核的面积和两个核的纵横比的比例来实现的。(D) 使用形状比和纵横比特征来识别具有两个分离良好的原子核的 BNCs。(E) 使用微核 (MN) 掩膜的点计数特征,表明具有单个或多个 MN 的 BNC 可以识别和枚举。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4:MONO和POLY细胞的识别和评分。使用点计数功能识别和枚举单体、三元和四元细胞。组件掩膜 1 允许识别单核细胞(上图)。组件掩膜 1 到 3 允许识别三核细胞(中间图像)。组件掩码 1 到 4 允许识别四元细胞(下图)。这个数字已被修改从罗德里格斯201832请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图 5:细胞毒性的定量。细胞毒性量化使用细胞因子块增殖指数(黑圈)和基因毒性量化使用MN(透明棒)的百分比后3小时暴露和24小时回收(A)科尔奇辛,(B)米托霉素C和(C) 曼尼托.与对照相比,MN 频率的统计显著增加以星形表示(奇平方测试;=p < 0.05, =p < 0.01, =p < 0.01)。所有数量是每个剂量点两个复制的平均值。这个数字已被修改从罗德里格斯201832请点击此处查看此图的较大版本。

Table 1
表 1:计算科尔奇辛细胞毒性(单核、双核和多核细胞的数量)和基因毒性(微细胞二核化细胞的数量和百分比)所需的参数。所有计算的数量是每个剂量点两个复制的平均值。

Table 2
表 2:计算Mitomycin C的细胞毒性(单核、双核和多核细胞的数量)和基因毒性(微细胞二核化细胞的数量和百分比)所需的参数。所有计算的数量是每个剂量点两个复制的平均值。

Table 3
表 3:计算 Mannitol 的细胞毒性(单核、双核和多核细胞的数量)和基因毒性(微细胞二核化细胞的数量和百分比)所需的参数。所有计算的数量是每个剂量点两个复制的平均值。

补充1:全面议定书。请点击此处下载此文件。

补充2:掩码列表。请点击此处下载此文件。

Discussion

在最近的一份出版物Verma等人强调开发一个系统的重要性,该系统结合了流式细胞学的高通量优势与图像分析的数据和图像存储优势35。本文中描述的MIFC体外MN测定符合这一引文,并有可能克服显微镜和流式细胞学方法中的许多上述挑战。此处描述的协议表明,细胞毒性和基因毒性都可以使用MIFC进行评估。样品制备、细胞染色和数据收集非常简单,但协议中应始终执行一些关键步骤。向细胞中添加氯化钾(KCl)对细胞膨胀至关重要,在主核之间产生分离。这可确保掩蔽算法能够识别 BNC 和 POLY 细胞 (POLY 细胞) 中的所有单个核,这是其枚举所必需的。此外,KCL提供核和MN之间的分离,这对于精确的MN掩蔽和定量至关重要。此外,在添加KCl后使用FORMALin可防止细胞在离心过程中发生哺乳。加入细胞沙沙沙辛B会导致经过多个核分裂的TK6细胞相当大。因此,细胞质变得脆弱,如果在加入KCl后立即进行离心,可以进行分莱。此外,根据样本中的细胞数量而不是最终浓度将Hoechst引入样本是非常重要的。例如,Hoechst 的最终浓度为 10 μg/mL 会均匀染色 1 x 106细胞的样本,但可能无法充分染色含有 5 x 106细胞的样本,并可能导致许多细胞核色暗,使分析变得困难。还必须注意,如果MIFC配备了405纳米激励激光器,如果MIFC配备了488nm和/或642nm激励激光器,那么Hoechst可以更换为DAPI等另一种DNA染料。如果修改核污渍,为了找到所需的/所需的激光功率的适当浓度,对污渍进行三井,这一点至关重要。

在 MIFC 上收集数据时,确定渐变 RMS 要素的最佳区域边界非常重要。由于MIFC仪器之间有些细微的变化,本议定书中提出的边界可能需要调整。在数据收集期间应用此功能对于确保捕获高度集中的影像至关重要。如果数据文件包含许多模糊或未聚焦的图像,则分析软件中的掩蔽算法可能会错误地突出显示模糊区域中的染色伪影,从而导致大量误报伪影制品被评分为 MN。尽管此处描述的图像处理技术可能比较困难,但一旦 MIFC 软件中开发了分析模板,批处理就可以自动分析数据文件,从而消除了用户干预,因此,获得评分器偏见。此外,如果使用 TK6 细胞以外的细胞线执行测定,则需要修改掩膜和区域边界,因为细胞的形态特性(例如大小)将与 TK6 细胞的形态属性不同。

此处显示的结果(图5)显示,当将TK6细胞暴露于不同剂量的米托霉素C和柯希辛时,MN诱导在统计学上显著增加。与溶剂对照相比,在两种化学品中观察到MN频率的统计显著增长。此外,没有剂量的Mannitol诱导细胞毒性超过30%,也没有统计上显著的增加的MN频率相比溶剂控制,如预期的那样。本文中描述的使用MIFC进行体外MN测定的协议给出了正对照和阴性对照化学品的预期结果。使用溶剂控制和负控制化学品进行一些实验,以开发MN频率和细胞因子块增殖指数(CBPI)的基线值非常重要。对于基因毒性,MN 频率的统计显著增加是通过与基线 MN 频率的比较来确定的,基线 MN 频率对于所使用的细胞类型必须广为人知。此外,所有细胞毒性计算均基于对照样本的CBPI,因此,在对照中必须很好地量化MONO、BNCs和POLY细胞的基线速率。

在MN测定中使用MIFC的一些限制和优点已在以前的工作29,32中进行了描述。与显微镜相比,主要限制涉及较低的 MN 频率,这可能是由于在分析软件中执行评分标准时缺乏灵活性以及 MIFC 的有限景深。可以创建良好的轮廓掩膜,以准确识别主核,但接触(或非常接近)主核的 MN 可能在 BNC 掩膜中捕获。此外,使用显微镜可以相当容易评分的非常小的 MN 在使用 MIFC 时可能未被错误地忽略,因为 MN 掩膜的区域参数的下限,以避免对小伪影进行评分。除了基于图像的数据分析存在困难外,MIFC还通过设计获得了三维细胞物体的二维投影图像。这可能导致一些 MN 在两个主 MN 的不同焦点深度捕获,使它们看起来非常暗淡,并且使用掩蔽进行无法处理。此外,MN的一小部分可能位于两个主要核之一的后面,使得它们无法可视化和评分。因此,考虑到这些困难,在解释低剂量MN频率显著增加时,应谨慎使用。

尽管存在这些缺点,此处介绍的 MIFC 方法比其他技术具有若干优势。Fenech等人提出了在开发MN检测的自动化系统和方法时应考虑的标准和准则。这些包括,但不限于,直接可视化的主要核和细胞质,确定从被测试的化学或制剂的各种剂量的MN频率,以及量化形态和确定所有位置的能力核和MN,以确保它们在细胞质内。本文表明,为执行体外MN测定而开发的MIFC方法满足(或具有满足)这些标准。具体来说,荧光激光可以捕获核和MN的图像,而使用BF LED可以获取细胞质图像。具有正常核形态的细胞图像可以使用高级掩膜和特征的组合自动与不规则形态的细胞区分开来。为科尔奇辛和米托霉素C(图5)提供的结果表明,与溶剂对照相比,基因毒性和细胞毒性可以评估不同剂量,并且观察到具有统计学意义的MN频率,预期。此外,OECD测试指南487建议对每次测试浓度进行2,000个BNCs评分,以评估MN的存在,以确定基因毒性以及每个测试浓度至少500个细胞,以确定细胞毒性9;使用手动显微镜可能需要超过 1 小时。本文的规程和结果显示,平均捕获约6,000个BNCs、16,000个MONO细胞和800个POLY细胞,并在20分钟内捕获每个测试浓度进行评分。数据采集速度之快和在如此短的时间内得分的候选细胞数量之多,凸显了利用MIFC进行体外MN测定的另一个重要优势。

虽然本文提出的结果令人鼓舞,但它们代表了早期概念验证方法。这项工作的后续工作应更彻底地调查一个更大、更多样化的化学装置,涵盖基因毒性和细胞毒性的多种类别和机制,如Kirkland等人建议的37进行此类研究然而,这些较大规模的研究将使人们对可靠识别弱基因毒性剂的能力有宝贵的了解。这里介绍的方法尚未小型化为微井格式,这将允许在更大的剂量范围内更快速和更有效地筛选。因此,以目前的形式,这里介绍的基于MIFC的体外MN测定可能最适合劳动密集型的后续研究或研究良好的实验室实践。然而,该方法将继续进行优化和验证,并有可能在检测与形态相关的化学特异性事件方面增加灵活性,例如增加细胞比例的阿纽根暴露。非圆形核,仍然是可腐蚀的38。最后,MIFC 方法为在 MN 测定中引入其他生物标记物(例如血吸管染色)提供了机会,从而更全面地了解 MN 诱导机制。

Disclosures

作者受雇于Luminex公司,该公司是图像流多光谱成像流细胞仪的制造商,用于这项工作。

Acknowledgments

作者感谢克里斯蒂娜·普罗布斯特(Luminex公司)在开发数据分析模板的先前形式方面所作的努力,并感谢Haley Pugsley博士(Luminex Corporation)和菲尔·莫里西博士(Luminex Corporation)对手稿。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tube Falcon 352096
Cleanser - Coulter Clenz  Beckman Coulter 8546931 Fill container with 200 mL of Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
Colchicine MilliporeSigma 64-86-8
Corning bottle-top vacuum filter  MilliporeSigma CLS430769 0.22 um filter, 500 mL bottle
Cytochalasin B MilliporeSigma 14930-96-2 5 mg bottle
Debubbler - 70% Isopropanol EMD Millipore 1.3704 Fill container with 200 mL of Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) MilliporeSigma 67-68-5
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X EMD Millipore BSS-1006-B PBS Ca++MG++ Free 
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences, Inc. 04018 This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.  Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.  May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.  Potential cancer hazard.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10 mg/mL solution
Mannitol MilliporeSigma 69-65-8
MEM Non-Essential Amino Acids 100X HyClone SH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark II EMD Millipore 100220 A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
MIFC analysis software - IDEAS EMD Millipore 100220 The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC software - INSPIRE EMD Millipore 100220 This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)
Mitomycin C MilliporeSigma 50-07-7
NEAA Mixture 100X Lonza BioWhittaker 13-114E
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X Gibco 15070063
Potassium Chloride (KCl) MilliporeSigma P9541
Rinse - Ultrapure water or deionized water NA NA You can use any ultrapure water or deionized water.  Fill container with 900 mL of Rinse.
RNase MilliporeSigma 9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1X HyClone SH30027.01
Sheath - PBS EMD Millipore BSS-1006-B This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X  Ca++MG++ free.  Fill container with 900mL of Sheath.
Sterile water HyClone SH30529.01
Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite VWR JT9416-1 This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.  Fill container with 200 mL of Sterilzer.
System Calibration Reagent - SpeedBead EMD Millipore 400041 Each tube holds ~10 mL.  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
T25 flask Falcon 353109
T75 flask Falcon 353136
TK6 cells MilliporeSigma 95111735

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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