Идентификация нуклеолярных факторов во время репликации ВИЧ-1 через Rev Immunoprecipitation и масс-спектрометрию

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Здесь мы описываем Rev иммунопрецитивность в присутствии ВИЧ-1 репликации для масс-спектрометрии. Описанные методы могут быть использованы для выявления нуклеолярных факторов, участвующих в инфекционном цикле ВИЧ-1, и применимы к другим моделям заболеваний для характеристики недостаточно изученных путей.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Arizala, J. A., Chomchan, P., Li, H., Moore, R., Ge, H., Ouellet, D. L., Rossi, J. J. Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59329, doi:10.3791/59329 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Инфекционный цикл ВИЧ-1 требует взаимодействия вирусного белка с принимающими факторами для облегчения репликации вируса, упаковки и высвобождения. Инфекционный цикл далее требует формирования вирусных/хостовых белковых комплексов с РНК ВИЧ-1 для регулирования сращивания и обеспечения нуклеоцитоплазмического переноса. Белок ВИЧ-1 Rev выполняет ядерный экспорт ВИЧ-1 мРНК за счет мультимеризации с интроническими целями cis- элементом rev response (RRE). Сигнал локализации ядра (NoLS) существует в пределах COOH-термина мотива Rev аргинина (ARM), что позволяет накапливать комплексы Rev/RRE в ядре. Нуклеолярные факторы предполагают, чтобы поддержать ВИЧ-1 инфекционный цикл через различные другие функции в дополнение к посредничеству мРНК-независимых ядерных экспорта и сплайсинга. Мы описываем метод иммунопреципиции дикого типа (WT) Rev по сравнению с ревнулопатическими мутациями (удаление и одноточечные мутации Rev-NoLS) при наличии репликации ВИЧ-1 для массовой спектрометрии. Нуклеолярные факторы, замешанные в нуклеотипласмичном переносе (нуклеофосмимин B23 и нуклеолин C23), а также клеточные факторы сплайсинга, теряют взаимодействие с Rev в присутствии мутаций Rev-NoLS. Различные другие нуклеолярные факторы, такие как snoRNA C/D box 58, идентифицируются, чтобы потерять взаимодействие с мутациями Rev, но их функция в цикле репликации ВИЧ-1 остается неизвестной. Представленные здесь результаты свидетельствуют об использовании этого подхода для выявления вирусных/хост-нуклеолярных факторов, поддерживающих инфекционный цикл ВИЧ-1. Концепции, используемые в этом подходе, применимы к другим вирусным моделям и моделям заболеваний, требующим характеристики недостаточно изученных путей.

Introduction

Ядро постулируется как место взаимодействия различных клеточных хостов и вирусных факторов, необходимых для репликации вируса. Ядро представляет собой сложную структуру, разделенную на три различных отсека: фибриллярный отсек, плотный фибриллярный отсек и гранулированный отсек. Белок ВИЧ-1 Rev локализуется специально в гранулированных отсеках; однако причина такой схемы локализации неизвестна. При наличии одноточечных мутаций в последовательности NoLS (Rev мутации 4, 5 и 6), Rev поддерживает нуклеолярную модель и ранее было показано, чтобы спасти ВИЧ-1HXB2 репликации, однако, с пониженной эффективностью по сравнению с WT Rev1 . Все одноточечные мутации не в состоянии поддерживать инфекционный цикл ВИЧ-1NL4-3. При наличии нескольких одноточечных мутаций в последовательности NoLS (Rev-NoLS мутации 2 и 9), Rev наблюдается разойтись по всему ядру и цитоплазмы и не смог спасти ВИЧ-1HXB2 репликации1. Цель этого исследования протеомики заключается в расшифровке нуклеолярных, а также ненуклеолярных клеточных факторов, участвующих в инфекционном пути, опосредоваваемом ВИЧ-1. Условия иммунопреципатации оптимизированы при взаимодействии с нуклеолярным фосфопротеим B23, который ранее был показан, чтобы потерять взаимодействие с Rev в присутствии нуклеолярных мутаций.

Rev клеточных факторов были широко изучены в прошлом; однако это было сделано при отсутствии вирусного патогенеза. Один белок, в частности, что характеризуется в этом исследовании через Rev взаимодействия во время репликации ВИЧ-1 является нуклеолярный фосфопротеин B23 - также называемый нуклеофосмиин (NPM), numatrin, или NO38 в амфибий2,3, 4. B23 выражается как три изоформы (NPM1, NPM2, и NPM3) - все члены нуклеофосмина / нуклеоплазмина ядерного сопровождающего семейства5,6. Молекулярный сопровождающий NPM1 функционирует при надлежащей сборке нуклеосом, в формировании белково-нуклеиновых кислотных комплексов, участвующих в структурах высшего порядка хроматина7,8,и в профилактике агрегации и неправильное сворачивание целевых белков через n-терминальный ядерный домен (остатки 1-120)9. Функциональность NPM1 распространяется на рибосомный генезис через транспортировку прерибосомных частиц между ядром и цитоплазмой10,11, обработка прейбосомальной РНК во внутренней транскрибированной последовательности прокладки 12,13, и арест нуклеолярной агрегации белков во время рибосомной сборки14,15. NPM1 вовлечен в ингибирование апоптоза16 и в стабилизацию опухолевых супрессоров ARF17,18 и p5319,раскрывая свою двойную роль в качестве онкогенного фактора и супрессора опухоли. NPM1 участвует в клеточной деятельности стабильности генома, центросомного репликации и транскрипции. NPM1 содержится в нуклеоли во время межфазы клеточного цикла, вдоль хромосомной периферии во время митоза, и в пренуклеолярных телах (PNB) при заключении митоза. NPM2 и NPM3 не так хорошо изучены, как NPM1, который подвергается изменению уровня экспрессии при злокачественности20.

NPM1 документируется в нуклеоцитоплазматических челночных различных ядерных / нуклеолярных белков через внутренние РЭШ и NLS9,21 и ранее сообщалось, чтобы диск ядерного импорта ВИЧ-1 Тат и Rev белков. В присутствии B23-связывающего домена-я-галактосидазных термоядерных белков, Тат неправильно локализует в цитоплазме и теряет трансактивационную активность; это демонстрирует сильную близость Тат для B232. Другое исследование установило Rev/B23 стабильный комплекс в отсутствие RRE-содержащих мРНК. В присутствии RRE mRNA, Rev отделяется от B23 и связывает предпочтительно к ВИЧ RRE, что приводит к смещению B2322. Неизвестно, где на субядерном уровне происходит Таттрансактивация и процесс обмена В23 на ВИЧ-мРНК. Оба белка постулируются для ввода ядра одновременно через Взаимодействие B23. Ожидается вовлечение других клеточных белков хозяина в нуклеолярный путь ВИЧ. Методы, описанные в этом исследовании протеомики, помогут выяснить взаимодействие ядра с клеточными факторами хозяина, участвующими во время патогенеза ВИЧ-1.

Исследование протеомики было начато с помощью выражения одноточественных мутаций Rev NoLS (M4, M5 и M6) и нескольких замен аргинина (M2 и M9) для производства ВИЧ-1HXB2. В этой модели, HeLa клеточной линии устойчиво выражая Rev-дефицитНЫХ ВИЧ-1HXB2 (HLfB) трансфицируется WT Rev и Rev нуклеолярных мутаций, содержащих тег флага в 3'end. Присутствие WT Rev позволит вирусной репликации происходит в культуре HLfB, по сравнению с Rev-NoLS мутаций, которые не спасти Rev дефицита (M2 и M9), или позволяют вирусной репликации происходит, но не так эффективно, как WT Rev (M4, M5, и M6)1. Лизат клетки собран 48 h более поздно после вирусного пролиферации в присутствии выражения Rev и подвергся к immunoprecipitation с буфером lysis оптимизированным для взаимодействия Rev/B23. Описывается оптимизация буфера лизиса с использованием различных концентраций соли, а методы элюционизации белка для ВИЧ-1 Rev сравниваются и анализируются в окрашенных серебром или комасси-окрашенных гелях SDS-PAGE. Первый подход протеомики включает в себя прямой анализ элетативной выборки из выраженных WT Rev, M2, M6 и M9 тандемной масс-спектрометрией. Второй подход, при котором улеты WT Rev, M4, M5 и M6 прошли процесс извлечения геля, сравнивается с первым подходом. Пептид сродство к Rev-NoLS мутаций по сравнению с WT Rev анализируется и вероятность идентификации белка отображается. Эти подходы выявляют потенциальные факторы (нуклеолярные и ненуклеолярные), которые участвуют в транспортировке ВИЧ-1 мРНК и сращивания с Rev во время репликации ВИЧ-1. В целом, описанные условия клеточного лиза, ИС и элуции применимы к вирусным белкам, представляющим интерес для понимания клеточных факторов хозяина, которые активируют и регулируют инфекционные пути. Это также применимо к изучению клеточных факторов хозяина, необходимых для сохранения различных моделей заболеваний. В этой модели протеомики, ВИЧ-1 Rev IP оптимизирован для взаимодействия B23 для выяснения нуклеолярных факторов, участвующих в нуклеотипитопасмической челночной деятельности и связывания ВИЧ-1 мРНК. Кроме того, можно разработать клеточные линии, четко выражающие модели инфекционных заболеваний, которые не достаточны для ключевых белков, представляющих интерес, подобно линии клеток HLfB, для изучения инфекционных путей, представляющих интерес.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Культура клеток

  1. Поддерживать HLfB в модифицированной среде Орла Dulbecco (DMEM) дополнен10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 2 мМ L-глутамина, и 1 мМ натрия пируват в ткани культуры обработанных 100 мм пластин. Держите клеточные культуры на уровне 37 градусов по Цельсию в увлажненный инкубатор поставляется с 5% CO2. Проход ные клетки к плотности клеток 1 х 106 ячеек/мл.
  2. Откажитесь от носителей культуры клеток. Аккуратно промыть клетки 10 мл 1x фосфат-буфера сольников (PBS). Удалите и отбросьте 1x PBS, не нарушая клеточного слоя.
  3. Добавьте в клетки 2 мл раствора трипсин-ЭДТА. Рок блюдо, чтобы покрыть монослой и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в увлажненной камере в течение 5 минут.
  4. Твердо коснитесь стороны блюда ладонью, чтобы отсоединить клетки. Отстойные отдельные ячейки в 8 мл свежих культурных носителей. Спин клетки на 400 х г в течение 5 мин.
  5. Откажитесь от культурных носителей, не нарушая клеточные гранулы. Отрежь клеточные гранулы в 10 мл свежих носителей культуры. Субкультура 1 мл концентрированных клеток с 9 мл свежих культурных носителей в тканях-культуры обработанных 100 мм пластин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой мутации Rev-NoLS, 3x 100 мм HLfB или HeLa культурные пластины даст достаточно белка lysate для западного анализа помок и масс-спектрометрии. Добавьте дополнительные пластины для положительного контроля WT Rev и отрицательного контроля. Объем клеток субкультуры потребует оптимизации с использованием различных типов клеток.

2. Выражение мутаций Rev-NoLS-3'flag во время репликации ВИЧ-1

  1. Выращивайте культуру клеток HLfB до плотности клеток 2 x 106 ячеек/мл. Приготовьте 4 мл суспензии фосфата-ДНК кальция для каждой 100-мм пластины следующим образом.
    1. Этикетка две 15 мл труб, как 1 и 2. Добавьте 2 мл 2x HBS (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl, и 1,5 мМ Na2HPO4 "pH 7,12") в трубку 1. Добавьте TE 79/10 (1 мМ Tris-HCl и 0,1 мМ EDTA (pH 7.9) в трубку 2. Объем TE 79/10 составляет 1,760 мл - объем ДНК.
    2. Добавьте 20 мкг плазмиды, содержащей мутацию Rev-NoLs-3'flag, интересную трубе 2, и смешайте ее содержимое через повторную подвеску. Добавьте 240 л 2 M CaCl2 в трубку 2 и снова перемешайте через повторную подвеску.
    3. Перенесите смесь трубки 2 в трубку 1 dropwise, аккуратно перемешивая. Разрешить подвески сидеть при комнатной температуре в течение 30 мин. Vortex осадков.
  2. Добавьте 1 мл подвески dropwise к каждому из 3-клеточной культуры, 100 мм пластин в то время как мягко закрученного средств массовой информации. Верните пластины в инкубатор и оставьте трансфекционную смесь на 6 ч. Замените трансфекционную смесь 10 мл свежих культурных носителей и инкубация клеток на 42 ч.

3. Сбор вирусного белка лизат

  1. Откажитесь от клеточного носителя 48 ч посттрансфекции. Поместите каждую 100-мм тарелку на ледяное ложе. Наклейте этикетку 15 мл труб окрева для каждого образца мутации Rev-NoLS и поместите трубки на лед.
  2. Аккуратно промыть клетки с 10 мл прехиллированных 1x PBS, не нарушая клеточного слоя. Откажитесь от 1x PBS. Добавьте 3 мл буфера лисиса (50 мм Tris-HCl (pH 8.0), 137 мМ NaCl, и 1% х-100 моющего средства (см. таблицуматериалов), обработанный коктейлем ингибитора протеазы, к каждой из 100 мм пластин.
  3. Используйте клеточный скребок, чтобы нарушить клеточный слой. Наклоните тарелку и аккуратно соскребите и соберите клетки в бассейн. Соберите клеточный лисат с помощью микропипетта мощностью 1000 л и смешайте клеточные лисаты с каждой из трех 100-мм пластин в предварительно маркированной трубке 15 мл.
  4. Инкубировать клеточный лисат на льду в течение 15 мин, вихрь каждые 5 мин. Центрифуге клетки lysate на 15000 х г в течение 5 мин.
  5. Соберите белок супернатант, не нарушая гранулы мусора клетки и перенесите его в другую стерильную трубку 15 мл. Получить концентрацию вирусного белка лизат с помощью метода Брэдфорд (см. раздел 4).
  6. Сохранить аликот входной образец (20 мкг) для западного иммуноблотного анализа. Добавьте 2x образец буфера (20% глицерола, 0,02% бромофенола синий, 125 мМ Tris-Cl "pH 6,8", 5% SDS, и 10% 2-меркаптоэтанол) в окончательный объем. Отварить его при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут, и хранить входный образец при -20 градусов по Цельсию.

4. Брэдфорд асссе

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка 10x бычьего сыворотки альбумина (BSA) из 100x BSA фонда до создания белка стандартных кривых.

  1. Аликвотная вода в микроцентрифуговых трубках для следующих пустых и стандартов: Пустой 800 л; Стандартный 1 х 2 мг/мл, 798 л; Стандартный 2 х 4 мг/мл, 796 л; Стандартный 3 й 6 мг/мл, 794 л; Стандартный 4 х 8 мг/мл, 792 л; Стандартный 5 - 10 мг/мл, 790 л. Аликот 10x BSA в следующие установленные стандарты: Стандарт 1 и 2 Лл; Стандарт 2 и 4 л; Стандарт 3 и 6 л; Стандартный 4 х 8 л; Стандартный 5 и 10 л.
  2. Подготовьте смесь образцов белка, смешав 795 л воды с 5 л образцов белка. Добавьте 200 зл и материалы протеинового реагента (см. таблицуматериалов) к каждому пустому, стандартному и протеинового образца. Vortex образцы кратко для равномерной смеси и инкубировать при комнатной температуре (18-20 градусов по Цельсию) в течение 5 мин.
  3. Перенесите пустые, стандартные и белковые образцы в кюветы. Измерьте концентрацию белка при оД 595 нм.

5. Киммунопресция Rev-NoLS-3'flag

  1. Промыть 25 зл и л из серепроцита M2 (см. ТаблицуМатериалов) с 500 зл искремирующим буфером, обработанным коктейлем ингибитора протеазы. Промыть больше сродства гель бусы для каждого образца мутации и контроля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте достаточное количество шариков геля сродства M2 для двух гелей (50 л) - один для западного иммуноблотного анализа, а другой для окрашивания белка и масс-спектрометрии.
  2. Спин при 820 х г в течение 2 мин при 4 градусах По цельсию. Удалите супернатант. Промыть еще 2 x.
  3. Добавьте вирусный лизат белка (1 мг/мл в 5 мл общего объема) к предризатому бисеру сродства M2. Отрегулируйте общий объем с помощью буфера lysis.
  4. Инкубировать реакцию в течение 3 ч, вращаясь при 4 градусах Цельсия. Centrifuge M2 сродство бисер / вирусный белок лисат на 820 х г в течение 1 мин.
  5. Соберите супернатант и сохраните аликвот пост-IP-образец (20 мкг) для западного иммуноблотного анализа. Измерьте концентрацию белка после IP-лисата. Соберите 20 мкг для западного иммуноблоттинга.
  6. Добавьте буфер 2x образца к окончательному тому. Отварить его при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут, и хранить образец после IP при -20 градусах По цельсию.
  7. Промыть бисер M2 с 750 л люсиса буфера и мыть бисер на ротаторе при 4 кв КС в течение 5 мин. Центрифуге M2 шарики на 820 х г и отбросить супернатанта.
  8. Повторите шаги 5.7 для еще двух смок на ротаторе при 4 градусах по Цельсию в течение 5 мин. После третьей стирки удалите следы буфера лизиса из комплекса M2-бис/ко-IP с помощью длинного гелевого наконечника.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Pinch конце гель-загрузки отзыв с плоскими пинцетом, прежде чем удалить любые следовые количества буфера лисиса. Это позволит предотвратить нарушение и поглощение m2 шариков.
  9. Отрежь бусы M2 в 55 л 2x погрузочного буфера. Отварить образец при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
  10. Нагрузка 25 злитый на два отдельных SDS-PAGE гели (один гель для западного иммуноблотинга, а другой для Coomassie окрашивания).

6. Приготовление гелей SDS-PAGE

  1. Бросьте два 15% SDS-акриламид решения гелей путем смешивания следующих реагентов в 50 мл трубки (при окончательном объеме 40 мл, достаточно для четырех гелей): 4,16 мл ультрачистой воды, 15 мл 40% акриламида: бисакриамид (29:1), 10 мл 1,5 М. , 400 л 10% SDS, 400 л из 10% аммония persulfate, и 40 зл TEMED.
  2. Смешайте разрешающий гель, несколько раз инвертируя трубку 50 мл. Pipette разрешающая смесь геля в precleaned западный прибор геля (четыре геля - 3 для западного immunoblotting и одного для Coomassie/серебряного окрашивания).
  3. Аккуратно пипетка достаточно воды, чтобы покрыть верхний слой геля смеси. Разрешить растворяющийся гель полимеризуется.
  4. Налейте слой воды из разрешителящего геля, используя тонкий стеклоочиститель задачи (см. таблицуматериалов) для того чтобы поглотить любое сверхнормальную воду.
  5. Бросьте два 5% SDS-акриламид укладки гелей путем смешивания следующих реагентов в 50 мл трубки (при окончательном объеме 20 мл, достаточно для четырех гелей): 11,88 мл ультрачистой воды, 2,5 мл 40% акриламида:bisacrylamide (29:1), 5,2 мл 1,5 Мл.HL (Три-HL , 200 л 10% SDS, 200 Л л из 10% аммония persulfate, и 20 Зл TEMED.
  6. Смешайте укладки гель, инвертируя 50 мл трубки несколько раз. Pipette укладки гель смесь выше решения гель в верхней части аппарата.
  7. Поместите гель кассеты гребень, содержащий соответствующее количество полос в укладке гель. Поглотить любой переполнение смеси геля с помощью деликатного стеклоочистителя задачи (см. Таблицу материалов). Разрешить укладки гель полимеризации полностью.
  8. Наводнение западного гелевого аппарата с 1x западный ходовой буфер (5x концентрация: 250 мм Tris-Cl (pH 8.3" , 1,92 М глицин, 0,5% SDS, и 10 мм EDTA).
  9. Аккуратно вытяните гель кассеты гребень из укладки гель. Разрешить 1x западный ходовой буфер для заполнения погрузочных скважин. Промыть каждый колодец с 1x западный беговой буфер с помощью шприца до загрузки образцов.
  10. Загрузите образцы западного иммуноблота в каждый соответствующий гель (входные образцы, коиммунопромипиированные образцы и образцы после ИС). Загрузите западные маркеры белка геля.
  11. Загрузите коиммунопромитатированные образцы для окрашивания Coomassie/серебра в другой гель. Загрузите западные маркеры белка геля.
  12. Подключите ходовой гель аппарат к источнику питания и запустите гели при 100 В до тех пор, пока погрузочный краситель не достигнет разрешителящего геля. Увеличьте напряжение до 140 В до тех пор, пока погрузочный краситель не достигнет дна разрешающиго геля.

7. Западная передача поблужей

  1. Разобрать западный гелевой аппарат. Нарежьте и отбросьте укладывая гель, оставляя разрешающий гель нетронутым.
  2. Аккуратно перенесите растворимые гели в чистый лоток, наполненный западным трансферным буфером (25 мм Трис, 194 мМ глицин, 0,005% SDS, 20% метанол) и замочите их в течение 15 минут.
  3. Соберите гель переносного аппарата следующим образом.
    1. Вырежьте три PVDF передачи мембран и шесть кусков фильтровальной бумаги (см. таблицу материалов) до размера разрешителяя геля.
    2. Замочите мембрану PVDF в метаноле в течение 5 мин. Гидрат его в воде в течение 5 мин. Поместите мембрану PVDF в западный буфер передачи до готовности к использованию.
    3. Поместите гель держатель кассеты в стеклянный противень выпечки заполнены частично с западным буфером передачи, с черной стороны в нижней части.
    4. Поместите пенную подушечку, пропитанную западным буфером передачи, против черной стороны кассеты держателя геля.
    5. Влажный кусок фильтровальной бумаги в западном буфере передачи и поместите его на верхней части пены площадку. Поместите разрешающий гель поверх фильтровальной бумаги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите разрешающий гель в правильной ориентации нагрузки, чтобы быть переданы в мембрану PVDF.
    6. Поместите одну мембрану переноса PVDF поверх разрешителяя геля. Влажный кусок фильтровальной бумаги с западным буфером передачи и поместите его на верхней части мембраны передачи PVDF.
    7. Поместите еще одну пенную площадку, пропитанную западным буфером передачи, поверх фильтровальной бумаги. Аккуратно сложите белую сторону кассеты держателя геля поверх пропитанной пенной прокладки. Запереть кассету плотно.
    8. Поместите гель держатель кассеты в передаче аппарата электрода сборки. Повторите шаги 7.3.4-7.3.8 для каждого оставшегося разрешающого геля.
    9. Заполните бак переносного аппарата западным буфером передачи. Поместите перемешивающий стержень в аппаратный бак.
    10. Поместите аппарат бак на верхней части перемешать пластины. Отрегулируйте настройки перемешать до 5-6, убедившись, что перемешать бар не застрял или удара гель держатель кассеты.
    11. Подключите аппарат передачи геля к источнику питания и перенесите гель при 100 В на 1 ч при 4 градусах Цельсия.

8. Иммуноблтинг

  1. Удалите гель держатель кассеты и поместите черную сторону вниз против чистого стекла выпечки лоток. Откройте кассету и осторожно отбросьте пенную площадку и фильтровальную бумагу. Отметьте угол мембраны PVDF, чтобы определить правильную ориентацию нагрузки. Держите мембрану влажной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мембрана PVDF может быть высушена воздухом и храниться в чистом, герметичном контейнере. Регидратация мембраны, повторяя шаги 7.3.2.
  2. Поместите мембрану в 100 мл блокирующего раствора (5% молока, 1x TBS и 0,1% Tween 20). Блокируйте мембрану нежным раскачиванием при комнатной температуре (18-20 градусов по Цельсию) на 1 ч.
  3. Вырезать через мембрану над 25 kDa маркер белка. Поместите верхнюю часть мембраны, содержащую белковые полосы больше 25 кДа, в блокирующий раствор, содержащий моноклональный IgG1 (1:500 разбавления). Блок на ночь, качания на 4 градуса по Цельсию.
  4. Поместите нижнюю часть мембраны, содержащую белковые полосы меньше 25 кДа, в блокирующий раствор, содержащий моноклональный IG1 мыши M2 (1:1,000 разбавления, см. Таблицуматериалов). Блок на ночь, качания на 4 градуса по Цельсию.
  5. Вымойте мембрану 3x на 10 минут в 25 мл западного раствора для мытья (1x TBS, 0.1% Tween 20) на качалке платформы.
  6. Инкубировать мембраны в козьей антимышке IgG1-HRP (1:5,000 разбавления) разбавленной в блокирующем растворе на 1 ч при комнатной температуре. Вымойте мембрану 3x в течение 10 минут в 25 мл западного раствора для мытья на качалке платформы.
  7. Подготовка chemiluminescence западного промокать субстрат. Используйте p1000 micropipette, чтобы добавить субстрат в мембрану.
  8. Развивайте каждую мембрану в chemiluminescence западный промокающий субстрат в течение 5 мин. Удалите мембрану из субстрата. Поглотить избыток субстрата с помощью деликатного стеклоочистителя задачи (см. Таблицу материалов).
  9. Поместите мембрану в чистый протектор листа, приклеенный к внутренней части кассеты. Возьмите кассету в темную комнату и поместите один лист пленки в кассету. Заблокируйте кассету на месте и инкубируйте в течение 5-15 мин. Снимите пленку с кассеты и развите ее.

9. Coomassie окрашивания

  1. Разобрать западный гелевой аппарат. Нарежьте и отбросьте укладывая гель, оставляя разрешающий гель нетронутым. Аккуратно перенесите разрешающий гель в чистый лоток, наполненный 25 мл ультрачистой воды.
  2. Инкубировать гель на качалке платформы в течение 15 минут Используйте нежные качалки, чтобы предотвратить разрешительное гель от разрушения. Откажитесь от ультрачистой воды и повторите шаг стирки в 2 раз больше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если пузыри SDS остаются после стирки, гель можно мыть в ультрачистой воде на ночь. Остаточные SDS может вызвать высокий фон окрашивания геля.
  3. Смешайте Coomassie пятно реагента путем инвертирования бутылки (см. таблицу материалов). Поместите 100 мл реагента пятна Coomassie для покрытия разрешительных гель и инкубировать гель на качалке платформы в течение 1 ч. Отбросьте Coomassie пятно реагента и мыть гель в деионизированной воде на качалке платформы в течение 15 минут.
  4. Откажитесь от деионизированной воды. Повторите шаг стирки в 2 x больше. Продолжайте мыть гель до тех пор, пока не будет соблюдаться желаемое разрешение белковых полос.

10. Серебряное окрашивание

  1. Разобрать западный гелевой аппарат. Нарежьте и отбросьте укладывая гель, оставляя разрешающий гель нетронутым. Аккуратно перенесите разрешающий гель в чистый лоток, наполненный 25 мл ультрачистой воды.
  2. Инкубировать гель на качалке платформы в течение 15 минут Используйте нежные качалки, чтобы предотвратить разрешительное гель от разрушения. Откажитесь от ультрачистой воды и повторите шаг стирки в 2 раз больше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если пузыри SDS остаются после стирки, гель можно мыть в ультрачистой воде на ночь. Остаточные SDS может вызвать высокий фон окрашивания геля.
  3. Исправить гель в 30% этанола:10% уксусной кислоты раствор (6:3:1 воды: этанол: уксусная кислота) на ночь при комнатной температуре. Вымойте гель в 10% растворе этанола в течение 5 мин при комнатной температуре. Замените раствор этанола и промойте еще 5 мин.
  4. Подготовка сенсибилизатора рабочего решения из Пирс Серебряный пятно Kit путем смешивания одной части серебра пятно сенсибизатор с 500 частей ультрачистой воды (50 л сенсибилизатора с 25 мл ультрачистой воды). Инкубировать растворительный гель в сенсибилизаторе рабочий раствор в течение 1 мин. Вымойте гель в ультрачистой воде в течение 1 мин, замените воду и снова промойте гель в течение 1 мин.
  5. Подготовка пятно рабочий раствор путем смешивания одной части серебра пятно усилитель с 50 частей серебра пятно (500 л усилителя с 25 мл серебра пятно). Инкубировать гель в пятно рабочего раствора в течение 30 минут.
  6. Подготовьте рабочее решение разработчика, смешивая 1 часть серебряного пятноусилителя с 50 частями серебряного пятна разработчика (500 л усилителя с 25 мл разработчика). Приготовьте 5% раствор уксусной кислоты в качестве стоп-решения. Вымойте гель с ультрачистой водой в течение 1 мин, заменить воду, и мыть гель еще 1 мин.
  7. Замените воду рабочим раствором разработчика и инкубация до желаемой интенсивности полосы белка не будет решена (5 мин). Замените рабочее решение разработчика стоп-решением и инкубация на 10 мин.

11. В гель сокращения, алкилирование, и пищеварение Coomassie окрашенных гель полос

  1. Вырежьте гелевые полосы из геля с помощью чистого лезвия бритвы. Разрежьте каждую гель-группу примерно на 5 мм кубов и поместите их в чистую микроцентрифугную трубку 0,5 мл.
  2. Destain геля куски, покрывая их 100 мМ аммония бикарбонат в 1:1 ацетонитрил: вода при комнатной температуре в течение 15 мин. Отбросьте супернатант. Повторите этот шаг.
  3. Высушите кусочки геля в течение 5 мин в вакуумной центрифуге. Уменьшите белки, покрыв высушенные кусочки геля дитиотрейтолом 10 мМ в бикарбонат аммония 100 мм и инкубируя их в течение 1 ч при 56 градусах Цельсия.
  4. Пипетка от любого супернатанта. Алкилат белки, покрывая кусочки геля с 100 мм йодоацетамида в воде и инкубации их в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
  5. Pipette от supernatant и уменьшить кусочки геля, покрывая их ацетонитрилом и встряхивая их мягко при комнатной температуре в течение 15 минут. Пипетта от супернатанта и reswell гель штук, покрывая их 100 мм аммония бикарбонат и встряхивая их нежно при комнатной температуре в течение 15 мин.
  6. Повторите шаг 11.5. Высушите кусочки геля в течение 5 мин в вакуумной центрифуге.
  7. Обложка геля штук с 50 нг / Л секвенирования класса модифицированных трипсин (см. Таблица материалов) в 100 мм аммония бикарбонат. Разрешить гель набухают в течение 5 мин; затем, pipette от любого оставшегося решения. Обложка геля кусочки с 100 мм бикарбонат аммония и позволяют им reswell полностью, добавив дополнительные 100 мм аммония бикарбонат, чтобы части геля полностью покрыты.
  8. Инкубировать кусочки геля на ночь при 37 градусах Цельсия. Остановите реакцию, добавив 1/10 объема 10% для модной кислоты в воде. Соберите супернатант из каждой трубки.
  9. Извлеките кусочки геля, покрыв их 1% формовой кислотой в 60% ацетонитрила и инкубируя их в течение 15 минут с нежной тряской.
  10. Уменьшите объем комбинированных супернатантов до менее чем 20 л в вакуумной центрифуге, заботясь, чтобы избежать полной высыхания супернатантов. Добавьте 1% для мультядной кислоты, чтобы вернуть общий объем к 20 Л.

12. Ликвидная хроматография/масс-спектрометрия

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы были проанализированы с помощью масс-спектрометра, оснащенного ультра HPLC, источником наноспрей и колонкой (см. таблицуматериалов). Растворы A и B составляют 0,1% для модной кислоты в воде и ацетонитриле, соответственно.

  1. Загрузите переваренные белки в высоковосстановительные полипропиленовые аутоsampler флаконы. Загрузите флаконы в образец менеджера системы UPLC.
  2. Вводят по 6 л каждого образца. Загрузите каждый образец на улавливание колонки нанотиле в течение 1,5 мин при 8 л/мин, используя 99% растворителя A/1% растворителя B.
  3. Выделите пептиды в масс-спектрометр с линейным градиентом от 3% до 35% растворителя B в течение 30 мин, а затем градиент от 35% до 50% растворителя B в течение 4 мин и от 50% до 90% растворителя B более 1 мин. Поддерживать 90% ацетонитрила в течение 3 мин; затем уменьшить %B обратно до 3% в течение 5 мин.
  4. Приобрести положительные ионные данные профиля массы спецификации в режиме разрешения (20000 разрешение). Приобретайте данные от 100 до 2000 Da со скоростью одного сканирования каждые 0,6 с. Приобрести данные в режиме MSE путем чередования сканирования без энергии столкновения и сканирует с повышенной энергией столкновения.
  5. Для повышенной энергии столкновения, рампы столкновения энергии в клетке ловушки от 15 V до 40 V. Приобрестисканирование массы замка каждые 30 с, используя ион No 2 от "Glu 1"-Фибринопептид B в качестве замка массы. Приобретение файла данных с помощью пустой инъекции растворителя А, используя тот же метод приобретения между каждой парой образцов для управления переносом.

13. Анализ данных для масс-спектрометрии

  1. Копирование файлов результатов масс-спектрометрии на компьютер под управлением исследовательской платформы количественной и качественной протеомики (например, ProteinLynx Global Server). Анализ данных является высокоинтенсивным для процессора и должен выполняться на отдельном высокопроизводительном компьютере анализа данных.
  2. Создайте новый проект для данных. Создайте новую пластину микротитера, представляющую пластину автосэмпера. Назначайте образцы в том же положении в микротитерной пластине, что и их положение в автосэмпере.
  3. Назначайте параметры обработки каждого образца. Параметрами для использования являются автоматическая хроматографическая ширина пика и разрешение MSTOF; порог низкой энергии, 100 пунктов; повышенный порог энергии, 5 пунктов; порог интенсивности, 500 пунктов.
  4. Назначайте параметры каждого образца рабочего процесса. Параметры для использования базы данных, concatenated человека SwissProt и ВИЧ, с реверсными последовательностями; автоматический пептид и переносимости фрагментов; мин фрагмент ионных совпадений на пептид, 3; мин фрагмент ионных совпадений на белок, 7; мин пептид совпадает на белок, 1; первичный реагент дайджеста, трипсин; пропущенные расщепления, 1; реагенты фиксированного модификатора, карбамидоэтил С; реагенты переменного модификатора, окисление M; ложное открытие, 100.
  5. Выберите образцы и выберите процесс последних исходных данных. Когда поиск завершится, выберите образцы и выберите Экспортные данные в Scaffold (версия 3). Open Scaffold, создать новый файл, и импортировать каждый файл экспортируется с платформы протеомики в качестве нового биообразца с использованием прекурсора иона количественной оценки.
  6. При импорте всех файлов перейдите на экран нагрузки и анализируйте данные. Выберите ту же базу данных, которая используется для поиска и импорта данных, используя баллики LFDR и стандартную группу белков по всему эксперименту. Установите параметры отображения вероятности идентификации белка, порог белка до 20%, минимальное количество пептидов до 1, и пептидный порог до 0% во время анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rev-NoLS одно- и многоточечные аргининмутации, соответствующие различным моделей субклеточной локализации, были рассмотрены в их способности взаимодействовать склеточными факторами хозяина по сравнению с WT Rev-3'flag и p cDNA-флагом вектор были выражены в культуре HLfB. Белковые комплексы перерабатывались из полного клеточного лизата и окрашивались серебряным пятнистым реагентом. Rev-NoLS-3'flag обнаруживается (приблизительно 18 kDa) в трех различных условиях буфера лисиса, содержащих различные концентрации NaCl (137 мм, 200 мм и 300 мм) на рисунке 1. B23 был обнаружен (37 кДа) в буфере лисиса, содержащем более низкую концентрацию соли (137 мМ, полосы 2-4), едва обнаруживаемый в буфере излинеза, содержащий 200 мМ NaCl, и необнаруживаемый в буфере лисиса, содержащий высокую концентрацию соли (300 мм NaCl). На рисунке 2, WT Rev-3'flag, Rev-NoLS M1-3'flag, и pcDNA-флагвектор были выражены в культуре HLfB. Белковые комплексы перерабатывались из общих клеточных лисатов, подготовленных из двух условий буфера лисиса (137 мМ и 200 мм NaCl). M2 мышь моноклональной IgG1 был использован в обнаружении Rev-3'flag выражение от клеточных lysates. Обнаружение B23 было оптимальным в буфере lysis, содержащем 137 mM NaCl с флагом WT Rev-3'flag (ввод и q-flag-Rev IP), но потеряло сродство с Rev-NoLS M1-3'flag. Сродство B23 с флагом WT Rev-3'flag уменьшилось при более высокой концентрации соли в буфере лисиса, содержащем 200 мМ NaCl. pcDNA отрицательный контроль не дает неспецифического иммунообнаружения в ввода и q-flag-Rev IP всех условий буфера lysis.

Условия elution были оптимизированы для IP-адреса Rev-NoLS-3'flag на рисунке 3. WT Rev-3'flagи p cDNA-флаг вектор были выражены в культуре HLfB. Белковые комплексы были обработаны из общих клеточных лисатов и eluted с использованием трех различных условий для искоренения света и тяжелой цепи фон (25 и 50 kDa) - 2x образец погрузки буфера на 37 градусов по Цельсию на 15 мин, 2x образец погрузки буфера при 95 КК на 3 мины, и 3x флаг peptid e при температуре 4 кВ в течение 30 мин. Rev NoLS-3'flag (No18 kDa) был наиболее обнаруживаемым после elution через кипячение в 2x образец погрузки буфера. B23 (No37 kDa) был обнаружен при двух условиях - инкубация 37 градусов по Цельсию в 2x пробном погрузочном буфере в течение 15 мин и инкубации 95 градусов по Цельсию в 2x пробном погрузочном буфере в течение 3 мин.

M2 (ядерный/нуклеолярный в локализации, нефункциональный в производстве ВИЧ-1HXB2), M6 (нуклеоляр ный образец, функциональный в производстве ВИЧ-1HXB2) и M9 (рассеянвный в цитоплазме/ядре, нефункциональный в вирусном производстве) в культуре HLfB. Белковые комплексы были обработаны из общего клеточного лизата, eluted через 95 КС инкубации в 2x образец погрузки буфера в течение 3 мин, и решена в серебристый пятнистый реагент (Рисунок 4). WT Rev был обнаружен после реакции флага IP. Rev-NoLS M2, M6 и M9 также были обнаружены на 18 kDa. На маркере 37 kDa наблюдались полосы, соответствующие белку B23. Белковые комплексы были также замечены в каждой полосе, соответствующей реакции IP WT Rev, M2, M6, M9, и pcDNA отрицательного фонового контроля. Белковые лисаты были проанализированы иммунообнаруживанием для q-flag-Rev и B23. Обильные WT Rev и умеренные уровни M6 были выражены (ввод флага) и обнаруживаемый после флага IP (я флаг-Rev IP, рисунок 5). M2 и M9 не были высоко выражены от 20 мкг ввода белка лизата, но обнаруживались при низкой интенсивности после флага IP от 5 мг белка лизата. pcDNA отрицательный контроль не дает неспецифического иммунообнаружения в ввода и Q-флаг-Rev IP. Сродство B23 с WT Rev наблюдалось после реакции флага IP (B23 co-IP). Сродство B23 было слегка отмечено с M2 (две одноточечные мутации R48,50G) и M6 (одноточечная мутация R50G). Сродство B23 было потеряно в присутствии трех одноточекных мутаций M9 (R46,48,50G) в Rev-NoLS.

Всего были обработаны лизаты от иммунопромизированных мутаций WT Rev и Rev-NoLS-3'flag (4, 5, 6 и 8) были обработаны, окрашены реагентом Coomassie и визуализированы по сравнению с серийными разбавлениями BSA (правая панель). Rev-NoLS-3'flag обнаруживается (12,5-25 мкг) при наличии и отсутствии мутаций при 18 кДа(рисунок6). Белковые комплексы, обработанные из IP-реакций WT Rev-3'flag, нуклеолярно-локализованных мутаций Rev-NoLS-3'flag(M4, M5 и M6), а также отрицательный контроль p cDNA-flag были визуализированы в гелях SDS-PAGE, окрашенных реагентом Coomassie (рисунок7). WT Rev (WT1 и WT2) был обнаружен после реакции флага IP на 18 kDa. Мутации Rev-NoLS были слегка обнаруживаемы после выражения в реакции HLfB и IP-флага. pcDNA отрицательный контроль не дает неспецифического фона на 18 kDa.

Иммунопромцицитированные лисаты, приготовленные из флага WT Rev-3'flag, M2, M6, M9, и отрицательного контроля pcDNA-flag(показано на рисунке 4),были проанализированы тандемной масс-спектрометрией. Вероятность идентификации белка (в процентах) отображается для сравнения белковых взаимодействий, происходящих с каждой нуклеолярной локализацией мутации Rev-NoLS по сравнению с WT Rev (таблица 1). Сотовые белки, некоторые из которых являются нуклеолярными в шаблоне локализации (рибосомные изоформы, эукариотический фактор инициации перевода 48, snoRNA C/D box 58B и нуклеофосмина B23), были определены как прямые/косвенные связуальные партнеры WT Rev. Эти нуклеолярные партнеры WT Rev. факторы потеряли связующее сродство к M2 (две одноточечные мутации R48,50G), M6 (одноточечная мутация R50G) и M9 (три одноточечные мутации R46,48,50G), похожие на отрицательный контроль pcDNA. Каждая полоса конясси-окрашенный гель на рисунке 6 была обработана для тандемной масс-спектрометрии (таблица2). Пептид сродство к rev-NoLS мутации был проанализирован и отображается с использованием вероятности идентификации белка (в процентах). Различные клеточные белки, некоторые из которых являются нуклеолярными в шаблоне локализации (нуклеолин C23, нуклеофосмин B23 и нуклеосомного тела), были определены как прямые/косвенные факторы связывания белка WT Rev. Эти нуклеолярные факторы не были идентифицированы, чтобы связать с M4, M5 и M6. Транспортные факторы ARHGEF1 (коэффициент нуклеотида роханина 1) и TBC1D24 (семейство доменов TCB1, член 24) были потеряны в сродстве в присутствии мутаций Rev-NoLS. Сражающие факторы hnRNPC (неоднородный рибонуклеарный белок C) и PNN (пинин, десмосомо-ассоциированный белок) были дополнительно замечены, чтобы связать сяр привязку к WT Rev, который потерял взаимодействие с одноточечными нуклеолярными мутациями Rev.

Figure 1
Рисунок 1 : Оптимизация условий лизиса клеточного ячеек для совместного IP Rev-3'flag во время производства ВИЧ-1. WT Rev-NoLS-3'flag иотрицательный контроль p cDNA-flag IP условия были оптимизированы в трех различных концентрациях NaCl (137 мМ, 200 мМ и 300 мМ) в буфере лисиса. Как наблюдается при окрашивании серебра, 137 мМ NaCl был оптимальной концентрацией соли для Rev иммунопреципиции и B23 связывания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 : Оптимизация условий лизиса для совместного IP-IP Rev-3'flag и иммунообнаружения B23 во время производства ВИЧ-1. WT Rev-NoLS-3'flag, M1-3'flag иотрицательный контроль p cDNA-flag IP условия были оптимизированы в двух различных концентрациях NaCl (137 мм и 200 мМ) в буфере лисиса. Как наблюдается через иммунообнаружение, 137 мМ NaCl был оптимальной концентрацией соли для Rev иммунопреципиции и B23 связывания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 : Оптимизация Rev-3'flag co-IP elution во время производства ВИЧ-1, визуализированная серебряным окрашиванием. Белковые комплексы обрабатывались из общих клеточных лисатов,подготовленных во время флага WT Rev-3'flag и p cDNA-flag IP. Были протестированы три различных условия elution : 2x образец погрузки буфера на 37 градусов по Цельсию в течение 15 мин, 2x образец погрузки буфера на 95 градусов по Цельсию в течение 3 мин, и 3x флаг пептид на 4 КК в течение 30 мин. Оптимальные условия elution WT Rev произошли после 15-минутного инкубационного периода в 2x образец погрузки буфера на 37 градусов по Цельсию и после 3-минутного инкубационного периода в 2x образец погрузки буфера на 95 градусов по Цельсию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4 : Иммунопрецистия мутаций Rev-3'flag 2, 6 и 9 во время производства ВИЧ-1. Белковые комплексы, которые прямо/косвенно связаны с WT Rev, M2 (R48,50G), M6 (R50G), M9(R46,48,50G), а также отрицательный контроль p cDNA-flag в присутствии репликации ВИЧ-1 показаны в серебристом sDS-PAGE гель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5 : Rev-3'flag совместное IP мутаций 2, 6 и 9 для Иммунообнаружения B23 во время производства ВИЧ-1. Белковые лисаты и реакции ИС, подготовленные из WT Rev, M2, M6, M9, и отрицательный контроль pcDNA-флагна рисунке 4 были дополнительно проанализированы иммунообнаруживацией для q-flag-Rev и B23. WT Rev и мутант выражение, а также взаимодействие с B23 нуклеоцитоплазмический белок, наблюдается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6 : Количественная оценка мутаций Rev-NoLS 4, 5, 6 и 8 после реакции IP флага . Реакции IP от HLfB, выражающие WT Rev и нуклеолярно-локализующие M4 (R46G), M5 (R48G),M6 (R50G), M8 (ЗРЗ), и отрицательный контроль p cDNA-флага были измерены для концентрации белка с помощью серийных разбавлений BSA. Для каждого образца наблюдалась концентрация белка в размере 12,5-25 мкг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7 : Иммунопрецистия нуклеолярных локализации мутаций Rev-NoLS 4, 5 и 6 во время производства ВИЧ-1. Показаны окрашенные ВС-ПАГгель, содержащие иммунопромизированные белковые комплексы WT Rev (1 и 2), M4, M5 и M6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Идентифицированные белки Молекулярный вес WT Rev M2 M6 M9
частица распознавания сигнала 14kDa (гомология связывающий белок Алу РНК) 15 кДа 95% 0.00 0.00 0.00
рибосомный белок S3A 30 kDa 95% 0.00 0.00 0.00
эукариотический коэффициент инициации перевода 4B 69 kDa 95% 0.00 0.00 0.00
рибосомный белок L31 14 кДа 91% 0.00 0.00 0.00
рибосомный белок L12 18 кДа 93% 0.00 0.00 0.00
рибосомный белок L22 15 кДа 91% 0.00 0.00 0.00
малая нуклеолярная РНК, C/D коробка 58B 15 кДа 87% 0.00 0.00 0.00
цинковый палец, cCHC домен, содержащий 11 185 кДа 87% 0.00 0.00 0.00
актин связывания LIM белок 1 79 kDa 79% 0.00 0.00 0.00
рибосомный белок S13 17 кДа 78% 0.00 0.00 0.00
нуклеофосмин (нуклеолярный фосфопротеин В23, нуматрин) 33 kDa 73% 0.00 0.00 0.00

Таблица 1: Определение клеточных факторов, взаимодействующих с WT Rev во время производства ВИЧ-1. Белковые элуаты, приготовленные из WT Rev, M2, M6 и M9, были непосредственно проанализированы тандемной масс-спектрометрией. Белковые взаимодействия, которые прямо/косвенно связаны с WT Rev против M2, M6 и M9, суммируются по вероятности идентификации белка (в процентах).

Идентифицированные белки Молекулярный вес M4 M5 M6 Wt pCDNA
поли(A) связывающий белок, цитоплазмический 1 61 kDa 98% 0.00 100% 100% 0.00
тепловой шок 70kDa белок 1B 70 kDa 100% 100% 100% 100% 0.00
рибосомный белок L7 29 kDa 91% 0.00 100% 100% 0.00
гисттон кластера 1, H1e 22 kDa 0.00 0.00 100% 100% 0.00
рибосомный белок L4 48 кДа 95% 0.00 100% 100% 0.00
рибосомный белок L13 24 кДА 99% 0.00 100% 100% 0.00
дополняют компонент 1, q субкомпонентный связывающий белок 31 кДа 100% 100% 100% 100% 0.00
Y коробка связывающий белок 1 36 kDa 0.00 0.00 100% 100% 0.00
нуклеосомного подсластить белок 1-как 1 45 кДа 0.00 0.00 0.00 100% 0.00
рибосомный белок L8 28 kDa 89% 36% 100% 100% 0.00
рибосомный белок L18 22 kDa 27% 0.00 100% 100% 0.00
тепловой шок 70kDa белок 8 71 kDa 5% 99% 100% 100% 0.00
рибосомный белок L19 23 kDa 10% 0.00 81% 100% 0.00
рибосомный белок L27 16 kDa 92% 0.00 100% 100% 0.00
рибосомный белок L7a 30 kDa 0.00 0.00 100% 100% 0.00
рибосомный белок L24 18 кДа 0.00 0.00 100% 99% 0.00
тубулин, бета-класс I 50 kDa 92% 69% 100% 100% 0.00
рибосомный белок L6 33 kDa 0.00 0.00 100% 100% 0.00
тепловой шок 70kDa белок 9 (смертный) 74 кДА 33% 99% 100% 100% 0.00
рибосомный белок S2 31 кДа 87% 0.00 100% 100% 0.00
казеиназа 2, альфа 1 полипептид 45 кДа 0.00 0.00 50% 100% 0.00
рибосомный белок L14 23 kDa 0.00 0.00 81% 100% 0.00
рибосомный белок, большой, P0 34 кДА 0.00 0.00 100% 100% 0.00
гисттон кластера 1, H1b 23 kDa 0.00 0.00 73% 100% 0.00
тепловой шок 70kDa белок 5 (глюкозно-регулируемый белок) 72 kDa 99% 0.00 100% 100% 0.00
рибосомный белок S4, X-связанный 30 kDa 0.00 0.00 100% 100% 0.00
рибосомный белок S20 13 kDa 98% 94% 99% 99% 0.00
рибосомный белок L28 16 kDa 0.00 0.00 100% 99% 0.00
рибосомный белок S14 16 kDa 0.00 0.00 100% 100% 0.00
рибосомный белок S3A 30 kDa 0.00 0.00 100% 100% 0.00
рибосомный белок L21 19 kDa 0.00 0.00 100% 100% 0.00
цинковый палец CCCH типа, противовирусные 1 101 kDa 0.00 0.00 97% 100% 0.00
гисттон кластера 1, H1c 21 kDa 0.00 0.00 0.00 98% 0.00
рибосомный белок L36 12 kDa 0.00 0.00 100% 100% 0.00
рибосомный белок S18 18 кДа 90% 0.00 100% 100% 0.00
модулятор апоптоза 1 40 kDa 42% 88% 34% 0.00 0.00
рибосомный белок L17 21 kDa 0.00 0.00 100% 100% 0.00
рибосомный белок S26 13 kDa 91% 0.00 99% 98% 0.00
рибосомный белок L32 18 кДа 0.00 0.00 48% 100% 0.00
рибосомный белок L35 15 кДа 0.00 0.00 97% 100% 0.00
рибосомный белок L29 18 кДа 0.00 0.00 57% 94% 0.00
рибосомный белок S9 23 kDa 0.00 0.00 100% 100% 0.00
неоднородный ядерный рибонуклеопротеин H1 (H) 51 кДа 98% 0.00 100% 100% 0.00
рибосомный белок S8 22 kDa 0.00 0.00 78% 100% 0.00
рибосомный белок L10 25 кДА 0.00 0.00 100% 100% 0.00
рибосомный белок L23a 18 кДа 0.00 0.00 68% 100% 0.00
рибосомный белок S6 29 kDa 0.00 0.00 100% 100% 0.00
рибосомный белок L31 14 кДа 0.00 0.00 95% 100% 0.00
рибосомный белок S13 17 кДа 0.00 0.00 100% 99% 0.00
рибосомный белок L10a 25 кДА 45% 0.00 81% 100% 0.00
поли(A) связывающий белок, цитоплазмический 4 (индуцируемая форма) 70 kDa 0.00 0.00 100% 100% 0.00
трансмембранный emp24 домен переноса белка, содержащий 1 25 кДА 0.00 0.00 0.00 100% 0.00
EBNA1 связывающий белок 2 35 кДА 0.00 0.00 69% 100% 0.00
сохраненная суеродная петля-сhelix вездесущая киназа 85 кДА 74% 92% 65% 83% 0.00
рибосомный белок L12 18 кДа 0.00 0.00 57% 100% 0.00
рибосомный белок S24 15 кДа 0.00 0.00 100% 100% 0.00
холодный шок домен белка А 40 kDa 0.00 0.00 0.00 100% 0.00
рибосомный белок L27a 17 кДа 0.00 0.00 89% 99% 0.00
неоднородный ядерный рибонуклеопротеин F 46 kDa 0.00 0.00 99% 99% 0.00
рибосомный белок L11 20 kDa 0.00 0.00 99% 100% 0.00
рибосомный белок L26-как 1 17 кДа 0.00 0.00 100% 100% 0.00
казеиназа 2, альфа-премьер-полипептид 41 kDa 0.00 0.00 0.00 100% 0.00
тубулин, альфа 1а 50 kDa 33% 0.00 100% 0.00 0.00
рибосомный белок L3 46 kDa 0.00 0.00 86% 94% 0.00
митохондриальный рибосомный белок L15 33 kDa 0.00 0.00 100% 99% 0.00
нуклеолин 77 кДА 0.00 0.00 25% 100% 0.00
митохондриальный рибосомный белок S21 11 kDa 0.00 0.00 93% 94% 0.00
KRR1, небольшой компонент процесса (SSU), гомолог (дрожжи) 44 кДА 89% 0.00 76% 99% 0.00
митохондриальный рибосомный белок S7 28 kDa 0.00 0.00 0.00 100% 0.00
хлоридный канал, нуклеотид-чувствительный, 1A 22 kDa 0.00 0.00 97% 86% 0.00
циклин B3 158 кДа 0.00 0.00 67% 49% 0.00
гуанин нуклеотид связывания белка, как 3 (нуклеоляр) 61 kDa 0.00 0.00 99% 98% 0.00
митохондриальный рибосомный белок S23 22 kDa 0.00 0.00 100% 50% 0.00
митохондриальный рибосомный белок S22 41 kDa 0.00 0.00 0.00 99% 0.00
нуклеофосмин (нуклеолярный фосфопротеин В23, нуматрин) 33 kDa 0.00 0.00 52% 97% 0.00
рибосомный белок S19 16 kDa 0.00 0.00 0.00 99% 0.00
глицецеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы 36 kDa 0.00 0.00 100% 0.00 0.00
гисттон кластера 1, H2bg 14 кДа 0.00 0.00 53% 72% 0.00
рибосомный белок S23 16 kDa 0.00 0.00 68% 0.00 0.00
Коэффициент нуклеотида ноуклеотида Rho guanine (GEF) 1 104 кДа 0.00 0.00 0.00 94% 0.00
смерть связанных белка 3 46 kDa 0.00 0.00 87% 87% 0.00
митохондриальный рибосомный белок S6 14 кДа 0.00 0.00 52% 84% 0.00
рибосомный белок L39 6 кДА 0.00 0.00 0.00 87% 0.00
митохондриальный рибосомный белок S28 21 kDa 0.00 0.00 85% 99% 0.00
гисттон кластера 1, H4h 11 kDa 0.00 0.00 0.00 93% 0.00
митохондриальный рибосомный белок L43 23 kDa 0.00 0.00 0.00 97% 0.00
рибосомный белок S15 17 кДа 0.00 0.00 0.00 85% 0.00
рибосомный белок S12 15 кДа 0.00 0.00 68% 39% 0.00
рибосомный белок L35a 13 kDa 0.00 0.00 0.00 96% 0.00
митохондриальный рибосомный белок L38 45 кДа 0.00 0.00 42% 98% 0.00
митохондриальный рибосомный белок S14 15 кДа 0.00 0.00 45% 76% 0.00
фосфодиэстеразы 5A, cGMP-специфический 95 кДА 14% 0.00 0.00 72% 0.00
рибосомный белок L15 24 кДА 0.00 0.00 0.00 56% 0.00
неоднородный ядерный рибонуклеопротеин C (C1/C2) 22 kDa 0.00 0.00 0.00 100% 0.00
митохондриальный рибосомный белок S16 11 kDa 0.00 0.00 0.00 92% 0.00
рибосомный белок S15a 15 кДа 0.00 0.00 0.00 91% 0.00
нейрексин 2 185 кДа 0.00 50% 0.00 0.00 0.00
аутизм восприимчивость кандидат 2 139 кДа 0.00 0.00 46% 0.00 0.00
митохондриальный рибосомный белок L17 20 kDa 0.00 0.00 0.00 92% 0.00
коэффициент сращивания 3a, субединица 1, 120kDa 89 kDa 0.00 0.00 56% 89% 0.00
Семейство доменов ла рибонуклеопротеин, член 1 116 кДа 0.00 0.00 65% 66% 0.00
лепрекан-как 2 62 kDa 0.00 0.00 0.00 68% 0.00
рибосомный белок L18a 21 kDa 0.00 0.00 0.00 86% 0.00
рибосомный белок L23 15 кДа 0.00 0.00 60% 47% 0.00
трансмембранный emp24 домен переноса белка, содержащий 9 27 kDa 0.00 0.00 0.00 78% 0.00
частица распознавания сигнала 72kDa 75 кДА 0.00 0.00 0.00 100% 0.00
лектин, галактозид-связывание, растворимый, 3 26 kDa 0.00 71% 28% 0.00 0.00
митохондриальный рибосомный белок L1 37 кДА 0.00 0.00 0.00 69% 0.00
Семья H1 histone, член X 22 kDa 0.00 0.00 0.00 96% 0.00
казеин киназа 2, бета-полипептид 25 кДА 0.00 0.00 0.00 89% 0.00
растворимый перевозчик семьи 4, бикарбонат натрия котранспортер, член 7 118 кДа 82% 0.00 0.00 0.00 0.00
WD повторный домен 13 54 кДА 0.00 81% 0.00 0.00 0.00
коэффициент удлинения транскрипции A (SII), 3 17 кДа 0.00 0.00 0.00 38% 0.00
рибосомный белок S16 16 kDa 0.00 0.00 75% 0.00 0.00
SP140 ядерного белка тела 92 kDa 0.00 0.00 0.00 64% 0.00
отоферлин 227 кДА 62% 0.00 0.00 0.00 0.00
голги транспорт 1B 15 кДа 0.00 0.00 0.00 33% 0.00
митохондриальный рибосомный белок S34 26 kDa 0.00 0.00 0.00 33% 0.00
рибосомный белок L30 13 kDa 0.00 0.00 0.00 49% 0.00
актин связывания LIM белок 1 96 кДА 0.00 0.00 0.00 43% 0.00
гуанин нуклеотид связывания белка, как 2 (нуклеоляр) 84 кДА 40% 0.00 0.00 0.00 0.00
липопротеиновый белок высокой плотности 141 кДа 0.00 0.00 34% 0.00 0.00
аденозин диаминаза, РНК-специфический, B2 81 kDa 0.00 0.00 28% 0.00 0.00
цистатин E/M 17 кДа 0.00 27% 0.00 0.00 0.00
Цинк палец белка 786 80 kDa 0.00 0.00 23% 0.00 0.00
pleckstrin гомологический домен, семья B, член 1 145 кДа 0.00 0.00 0.00 95% 0.00
белок фосфатазе метилэстераза 1 44 кДА 0.00 0.00 94% 0.00 0.00
janus киназа и микротрубублии взаимодействующий белок 2 95 кДА 0.00 0.00 0.00 94% 0.00
частица распознавания сигнала 68kDa 67 кДА 0.00 0.00 0.00 93% 0.00
Семейство доменов TBC1, член 24 63 kDa 0.00 0.00 0.00 89% 0.00
митохондриальный рибосомный белок L27 16 kDa 0.00 0.00 0.00 89% 0.00
митохондриальный рибосомный белок L2 24 кДА 0.00 0.00 0.00 88% 0.00
митохондриальный рибосомный белок S2 33 kDa 0.00 0.00 0.00 87% 0.00
Пентатрикопептид повторный домен 3 79 kDa 0.00 0.00 0.00 84% 0.00
рибосомный белок, большой, P2 12 kDa 0.00 0.00 0.00 76% 0.00
IMP (инозин 5'монофосфат) дегидрогеназы 2 56 kDa 0.00 0.00 76% 0.00 0.00
тубулин, бета 4B класс IVb 50 kDa 0.00 0.00 76% 0.00 0.00
митохондриальный рибосомный белок L23 19 kDa 0.00 0.00 0.00 74% 0.00
митохондриальный рибосомный белок S31 45 кДа 0.00 0.00 0.00 74% 0.00
галактоза-3-О-сульфотрансфераза 1 49 kDa 74% 0.00 0.00 0.00 0.00
супрессор разновидности 4-20 омолог 1 (Дрозофила) 99 кДА 0.00 72% 0.00 0.00 0.00
митохондриальный рибосомный белок S25 20 kDa 0.00 0.00 0.00 70% 0.00
рибосомный домен L1, содержащий 1 55 кДА 0.00 0.00 0.00 70% 0.00
семья с сходством последовательности 110, член D 29 kDa 69% 0.00 0.00 0.00 0.00
рибосомный белок L36a-как 12 kDa 0.00 0.00 0.00 66% 0.00
серебеллин 4 предшественник 22 kDa 0.00 0.00 0.00 64% 0.00
N-ацетилглукосамин-1-фосфатные передачи, альфа- и бета-подразделения 144 кДа 64% 0.00 0.00 0.00 0.00
RAD51 гомолог B (S. cerevisiae) 38 кДА 0.00 0.00 0.00 64% 0.00
регулятор транскрипции удлинения 1 124 кДа 63% 0.00 0.00 0.00 0.00
гомобокс A1 15 кДа 0.00 0.00 0.00 62% 0.00
фосфолипидный перенос белка 49 kDa 0.00 0.00 0.00 62% 0.00
Ро GTPase активации белка 33 137 кДа 0.00 0.00 54% 0.00 0.00
митохондриальный рибосомный белок S18B 29 kDa 0.00 0.00 0.00 52% 0.00
эндоплазмический ретикулум аминопептидаза заре 2 106 кДа 51% 0.00 0.00 0.00 0.00
трехсторонний мотив, содержащий 28 89 kDa 0.00 50% 0.00 0.00 0.00
незрелые рака толстой кишки стенограмма 1 24 кДА 0.00 0.00 0.00 50% 0.00
Насыщенный интерактивный домен 1A (SWI-как) 242 kDa 0.00 0.00 49% 0.00 0.00
митохондриальный рибосомный белок S17 15 кДа 0.00 0.00 0.00 48% 0.00
пинин, десмосомсвязанный белок 82 kDa 0.00 0.00 0.00 48% 0.00
белок фосфатаза, mg2'/Mn2 " зависимых, 1G 59 kDa 0.00 0.00 0.00 45% 0.00
G патч домена и анкирин повторяет 1 39 kDa 45% 0.00 0.00 0.00 0.00
митохондриальный рибосомный белок L3 39 kDa 0.00 0.00 0.00 44% 0.00
почки раскованный бензимидазолы 3 гомолог (дрожжи) 37 кДА 0.00 44% 0.00 0.00 0.00
WD и тетратрикопептид повторяет 1 76 kDa 0.00 0.00 0.00 44% 0.00
дисульфид белка иомеразы семьи А, член 2 58 кДА 0.00 0.00 0.00 42% 0.00
казрин, периплакин взаимодействующий белок 86 kDa 0.00 41% 0.00 0.00 0.00
сулит-катушки-сhelix-сулит-катушки-суликс домена, содержащего 2 16 kDa 0.00 0.00 40% 0.00 0.00
тепловой шок белка 90kDa альфа (цитосолик), класс член 1 85 кДА 0.00 0.00 40% 0.00 0.00
ретинит пигментный регулятор GTPase 83 kDa 0.00 0.00 40% 0.00 0.00
CTD (карбокс-терминальный домен, РНК-полимераза II, полипептид A)
фосфатаза, подразделение 1
104 кДа 0.00 39% 0.00 0.00 0.00
митохондриальный рибосомный белок L37 48 кДа 0.00 0.00 0.00 39% 0.00
C2CD2-как 76 kDa 0.00 38% 0.00 0.00 0.00
DnaJ (Hsp40) омолог, подсемейство C, член 6 106 кДа 0.00 0.00 38% 0.00 0.00
митохондриальный рибосомный белок L51 15 кДа 0.00 0.00 0.00 38% 0.00
bystin-как 50 kDa 0.00 0.00 0.00 38% 0.00
хантингтин-ассоциированный белок 1 76 kDa 0.00 0.00 0.00 37% 0.00
Цинк палец белка 263 77 кДА 0.00 36% 0.00 0.00 0.00
цикл деления клеток и регулятор апоптоза 1 133 kDa 0.00 0.00 34% 0.00 0.00
белок тирозин фосфатазы, нерецепторный тип 13
(АПО-1/CD95 (ФАС)-асфатаза)
256 кДА 0.00 0.00 34% 0.00 0.00
Домен KRAB-A, содержащий 2 56 kDa 0.00 0.00 0.00 31% 0.00
активация сигнального коинтегратора 1 комплексного подразделения 2 28 kDa 0.00 0.00 0.00 31% 0.00
центросомный белок 76kDa 74 кДА 0.00 30% 0.00 0.00 0.00
полимераза (РНК) III (ДНК направлена) полипептид C (62kD) 61 kDa 0.00 0.00 0.00 30% 0.00
5-гидрокситриптамин (серотонин) рецептор 6 47 кДА 0.00 0.00 0.00 29% 0.00
Т-клеточная рецептор альфа-альфа присоединения 56 2 kDa 0.00 26% 0.00 0.00 0.00
биориентация хромосом в клеточном делении 1-подобного 330 кДА 0.00 0.00 0.00 25% 0.00
Ras ассоциации и DIL доменов 114 кДа 0.00 0.00 25% 0.00 0.00
WD повторный домен 66 130 кДа 0.00 0.00 0.00 24% 0.00
хромосома 6 открытая рамка чтения 25 13 kDa 0.00 0.00 22% 0.00 0.00
трансмембранный белок 177 34 кДА 0.00 0.00 0.00 21% 0.00
нейронные клетки-предшественники выражены, отсежденные в развитии 4-подобные 101 kDa 0.00 20% 0.00 0.00 0.00

Таблица 2: Определение клеточных факторов хозяина, в комплексе с нуклеолярными локализацией Rev мутаций 4, 5 и 6 во время производства ВИЧ-1. Гель SDS-PAGE, окрашенный в Coomassie, был обработан для тандемной масс-спектрометрии. Результаты взаимодействия белков WT Rev против нуклеолярных мутаций M4, M5 и M6 суммируются по вероятности идентификации белка (в процентах).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Масс-спектрометрические анализы, сравнивающие мутации Rev-NoLS и WT Rev в присутствии ВИЧ-1, были оценены для понимания нуклеолярных факторов, участвующих в цикле репликации вирусов. Это позволит определить нуклеолярные компоненты, необходимые для вирусной инфекции. Нуклеоляр B23 имеет высокое сродство к Rev-NoLS и функции в нуклеолярной локализации Rev3 и нуклеоцитоплазматического переноса Rev-связанных ВИЧ мРНК22. Сродство B23 с мутациями Rev-NoLS, которые содержали одиночные или множественные замены аргинина, было оценено через immunoprecipitation Rev-3'flag во время вирусного производства (Рисунок 2; WT и мутации M2, M6 и M9). Сродство B23 с одноточечными мутациями Rev-NoLS M4, M5 и M6 ранее рассматривалось в присутствии репликации ВИЧ-1. В предыдущем исследовании, IP eluates M4, M5, и M6 были подвергнуты западной иммуноблоттинг с антитела, характерные для флага для Rev и B23 сродство1. На фоне репрельных одноточековых мутаций связывающаяся близость B23 была значительно снижена. B23 поддерживал близость с WT Rev во время репликации ВИЧ. Ожидается, что одноточечные мутации, индуцированные в Rev-NoLS, уменьшат связывающее сродство к другим клеточным принимающим факторам, облегчающим связывание и транспортировку ВИЧ-мРНК. Мутации одной и нескольких точек Rev-NoLS в этой модели отменили нуклеофосмину B23 сродство к Rev, что указывает на нарушение нуклеоцитоплазмического челнока и переноса мРНК ВИЧ. Вполне вероятно, что нуклеолярные факторы (нуклеолин C23 и нуклеозомный сборочный белок 1), транспортные факторы (ARHGEF1 и TCB1D24) и сплайсинг-факторы (hnRNPC и PNN) участвуют в инфекционном цикле ВИЧ-1 через взаимодействие с белковыми комплексами Rev. Таблица 1 и таблица 2 раскрывают различные другие клеточные факторы, как нуклеолярные, так и ненуклеолярные по шаблону, которые потенциально вовлечены в цикл репликации ВИЧ-1 через Преподобный Нуклеолярный фактор - snoRNA C/D box 58, замешанный в сноРНК обработка, перенос сноРНК в ядро, и 2'-O-метилирование рибосомальной РНК - была определена, но функция этого белка в цикле репликации ВИЧ-1 остается неизвестной. В настоящее время изучается конкретная роль этих клеточных факторов в инфекционном цикле ВИЧ-1.

Представленные здесь результаты свидетельствуют об использовании этого подхода для выявления вирусных/хост-нуклеолярных факторов, поддерживающих инфекционный цикл ВИЧ-1. С помощью этого подхода можно определить вирусные/хост-нуклеолярные факторы, участвующие в других моделях заболеваний. Кроме того, вполне вероятно, что один нуклеолярный фактор может включать в себя многофункциональные роли в различных моделях заболеваний. Например, B23 был вовлечен в транспортировку нуклеолярных вирусных белков, вирусную сборку, ободрение, репликацию и задержку в других вирусных инфекционных моделях. B23 характеризуется во взаимодействии с NoLS клеточных факторов для нуклеоцитоплазмического переноса - фактор роста p120 (аминокислоты 40-57)23 и C23 дорнна процессор (аминокислоты 540-628)24. B23 также документально взаимодействовать с человеческим Т-клеточным лимфотропным вирусом (HTLV-1) белка Rex (аминокислоты 1-22)25,ВИЧ-1 Тат (аминокислоты 49-57)2, и ВИЧ-1 Rev (аминокислоты 37-47)26. Японский вирус энцефалита (JEV) геном кодирует нуклеолярно-локализованный основной белок, через который аминокислоты Gly42 и Pro43 взаимодействуют с N-терминальной областью B23 во время инфекции JEV, в результате чего вирусная сердечная белка/B23 в ядро27. Одноцепочечный геном РНК вируса гепатита В (HBV) частично состоит из двухцепочечной ДНК, которая кодирует нуклеолярный основной белок. HBV основной белок ассоциируется с нуклеолином и B23 в ядре28; B23 был продемонстрирован в сборке HBV через взаимодействие с основным белком N-терминального домена. В частности, B23 аминокислоты 259-294 связываются с N-терминальной области нюба HBV белка, чтобы вирусное инкапсидации29. Отрицательное чувство, одноцепочечный рнконный вирус гепатита D (HDV) выражает антиген HDVAg в двух изоформах; малые средства изоформы в репликации RNA, и большая изоформа облегчает вирусную сборку. Репликация РНК происходит в ядре и требует взаимодействия B23 с HDVAg30,31. HDV инфекция вызывает upregulation B23, который взаимодействует главным образом с малым изоформом HDVAg и более менее с большим изоформом HDVAg. Взаимодействие происходит через небольшой домен HDVAg NLS, через который B23 связывает и достигает ядерного накопления. После удаления сайта привязки HDV к B23 репликация РНК была нарушена. Было показано, что HDVAg колокализируется с B23 и нуклеолином в ядре. Нуклеолин был обнаружен, чтобы обладать транскрипционными свойствами в качестве репрессора32, выявление ядра в качестве отсека для регулирования репликации HDV. B23 также участвует в задержке генома герпеса, связанного с саркомой Капози (KSHV). KSHV скрытый белок - V-циклин - с принимающей CDK6 киназы, фосфорилаты B23 на Thr199, облегчая B23 взаимодействия с задержкой связанных ядерного антигена33. Связанный с задержкой ядерный антиген действует для предотвращения вирусной репликации. Истощение B23 приводит к реактивации KSHV, выявление B23 в качестве регулятора задержки KSHV. Функция B23 в цикле репликации ВИЧ-1 характеризуется нуклеоцитоплазмической транспортной активностью Тата и Превиста, и неизвестно, может ли B23 вызвать задержку во время ВИЧ-инфекции. Участие B23 в репликации, ознакомления и сборке ВИЧ-1 в настоящее время неизвестно.

Адаптация этого метода к другим моделям заболеваний потребует больших усилий и времени для генерации белково-дефицитных инфекционных позвоночников, выраженных в соответствующих клеточных линиях. Преимуществом этого Rev-дефицитного ВИЧ-1HXB2 позвоночника является способность изучить Rev-NoLS мутации в присутствии полного вирусного позвоночника, вирусные инфекционные факторы, и принимающих факторов, участвующих в цикле репликации ВИЧ-1. Другие исследования изучали функцию преподобного нуклеоляра при отсутствии полной инфекционной системы ВИЧ-1. Тщательная характеристика инфекционных и болезнетворных путей должна включать репрезентативные среды, которые поддерживают естественное течение прогрессирования заболевания. Были проведены два различных типа анализов, которые сопожаты в способности выявлять нуклеолярные факторы. В таблице 1 перечислены факторы, которые остались привязаны к WT Rev в результате прямого анализа масс-спектрометрии белка eluate. Этот анализ дал несколько известных факторов ВИЧ-1 Rev. Этот прямой метод был сравнен с другим процессом, включающим экстракцию белка, разделенного в рамках гелей SDS-PAGE и масс-спектрометрии анализа таких белков. Этот второй метод дал множество известных и потенциальных факторов, которые связаны с белковым комплексом Rev, но не хватало следующих белков, ранее идентифицированных в таблице 1: частица распознавания сигналов 14 kDa, эукариотическое начало перевода фактор 4B, рибосомный белок L22, небольшая нуклеолярная РНК C/D коробка 58B и цинковый палец CCHC домен, содержащий 11. В конечном счете, превосходный метод, выбранный для анализа масс-спектрометрии в этом протоколе, предусматривал извлечения пептидов из гелей SDS-PAGE. Первый прямой метод включал 2x образец буфера в eluate без бромофенола синий; остальные компоненты буфера 2x образца могут мешать полной обработке трипсина и могут давать неполнообработанные пептиды для анализа масс-спектрометрии. Второй косвенный метод смог очистить обработанные трипсином пептиды от потенциальных загрязняющих веществ SDS-PAGE.

Методы подготовки масс-спектрометрии, описанные здесь, могут быть использованы для выявления терапевтических вмешательств для искоренения ВИЧ-1-инфекции путем ориентации на Rev. Все удаления и одноточечные мутации Rev-NoLS могут быть исследованы на доминирующей негативной активности и используется в аресте Rev функции. Доминирующие негативные характеристики интереса для Rev функционального ареста являются следующими: Rev / RRE связывания сродство; перелокализация нуклеолярного WT Rev через мультимеризацию с ревунтами; потеря сродства к ключевым клеточным факторам, связанным с транспортировкой и сплайсингом ВИЧ-1 мРНК. Ревмультиизация, связанная с коэкспрессией мутаций Rev-NoLS с WT Rev, может быть рассмотрена. Доминирующие негативные мутации в этой модели, как ожидается, мультимеризутся с WT Rev и сдвиг нуклеолярных моделей к ядру и цитоплазмы, что приводит к Rev функциональной остановки. Масс-спектрометрия может быть использована для выявления потери ключевых клеточных факторов, участвующих в сращивании и транспортировке ВИЧ-1 мРНК. Выявление отсутствующих взаимодействий с WT Rev в результате коэкспрессии с доминирующими-отрицательными мутациями Rev-NoLS позволит выявить участие нуклеолярных путей в патогенеза ВИЧ-1. Кроме того, вирусные частицы ВИЧ-1NL4-3, генерируемые на фоне мутаций Rev-NoLS, могут быть исследованы на всех упакованных клеточных факторах. Сотовые и вирусные факторы, упаковываемые в вирусные частицы, могут быть дополнительно идентифицированы с помощью масс-спектрометрии. Это позволит выявить наличие нуклеолярных факторов в вирусных частиц и роль выявленных нуклеолярных факторов в вирусной инфекции. Описанные методы применимы к другим вирусным и болезнетворным моделям для выявления и характеристики недостаточно изученных путей. Это позволило бы разработать терапевтические вмешательства против болезней, с помощью которых доступны ограниченные методы лечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы признают д-р Барбара К. Фелбер и д-р Джордж Н. Павлакис для HLfB приверженцев культуры, предоставляемые Национальными институтами здравоохранения (NIH) СПИД исследований и справочных реагентов программы, Отдел СПИДа, Национальный институт аллергии и инфекционных болезни (НИАИД), NIH. Авторы также признают финансовые источники, предоставленные NIH, Grants AI042552 и AI029329.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Fisher Chemical A38S-212
Acetonitrile Fisher Chemical A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide BioRad 1610158
Ammonium bicarbonate Fisher Chemical A643-500
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel Sigma-Aldrich A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG Sigma-Aldrich F3165
BioMax MS film Carestream 8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL Bio-Rad 5000006
B23 mouse monoclonal IgG Santa Cruz Biotechnologies sc-47725
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carnation non-fat powdered milk Nestle N/A
Cell scraper ThermoFisher Scientific 179693PK
C18IonKey nanoTile column Waters 186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes Fisher Scientific 08-772-22
Dithiothreitol Thermo Scientific J1539714
1 x DPBS Corning 21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate Pierce 32106
Ethanol, 200 proof Fisher Chemical A409-4
FBS Gibco 16000044
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GelCode blue stain reagent ThermoFisher 24590
Glycerol Fisher Chemical 56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnologies sc-2005
Iodoacetamide ACROS Organics 122270050
KimWipe delicate task wiper Kimberly Clark Professional 34120
L-glutamine Gibco 25030081
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
NanoAcuity UPLC Waters N/A
Pierce Silver Stain Kit Thermo Scientific 24600df
15-mL Polypropylene conical tube Falcon 352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo Scientific 26616
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001
Purified BSA New England Biolabs B9001
PVDF  Western blotting membrane Roche 3010040001
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
10 x TBS Fisher Bioreagents BP2471500
TEMED BioRad 1610880edu
Triton X-100 detergent solution BioRad 1610407
Trizaic source Waters N/A
trypsin-EDTA Corning 25-051-CIS
Tween 20 BioRad 1706531
Synapt G2 mass spectrometer Waters N/A
Whatman filter paper Tisch Scientific 10427813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. (2018).
  2. Li, Y. P. Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat. Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).
  3. Szebeni, A., et al. Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin. Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).
  4. Truant, R., Cullen, B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).
  5. Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Genetics. 173, 1835-1850 (2006).
  6. Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. BioEssays. 29, 49-59 (2007).
  7. Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).
  8. Szebeni, A., Olson, M. O. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Science. 8, 905-912 (1999).
  9. Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).
  10. Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 56, 379-390 (1989).
  11. Yun, J. P., et al. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).
  12. Savkur, R. S., Olson, M. O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).
  13. Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).
  14. Grisendi, S., et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437, 147-153 (2005).
  15. Itahana, K., et al. Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).
  16. Ye, K. Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).
  17. Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor. Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).
  18. Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3. Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).
  19. Horn, H. F., Vousden, K. H. Cancer: guarding the guardian. Nature. 427, 110-111 (2004).
  20. Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).
  21. Dingwall, C., et al. Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).
  22. Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element. Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).
  23. Valdez, B. C., et al. Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23. Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).
  24. Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).
  25. Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).
  26. Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals. Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).
  27. Tsuda, Y., et al. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).
  28. Ning, B., Shih, C. Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein. Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).
  29. Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1. Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).
  30. Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication. Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).
  31. Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies. Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).
  32. Yang, T. H., et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).
  33. Sarek, G., et al. Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency. PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics