HıV-1 çoğaltma sırasında devir Immünoplikasyon ve kütle spektrometresi yoluyla Nüklenolar faktörleri tanımlaması

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada, kütle spektrometresi için HIV-1 replikasyonu varlığında Rev immünopresipitasyon açıklanmaktadır. Açıklanan yöntemler, HıV-1 enfeksiyonlu döngüsünde yer alan nüksolar faktörlerinin tanımlanması için kullanılabilir ve az çalışılan yolların karakterizasyonu için diğer hastalık modelleri için geçerlidir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Arizala, J. A., Chomchan, P., Li, H., Moore, R., Ge, H., Ouellet, D. L., Rossi, J. J. Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59329, doi:10.3791/59329 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

HıV-1 enfeksiyöz döngüsü viral çoğaltma kolaylaştırmak için ana faktörler ile viral protein etkileşimleri gerektirir, paketleme, ve serbest. Enfeksiyöz döngü daha da infeksiyon düzenleyen ve nükresitoplazmik taşıma etkinleştirmek için HıV-1 RNA ile viral/konak protein kompleksler oluşumu gerektirir. HıV-1 Rev proteini, HıV-1 mRNAs 'ın nükleer ihracatını, intronik CiS-hareket hedefleri ile multimerizasyon yoluyla-Rev yanıtı elemanı (RRE) gerçekleştirir. Rev arginin zengin motif (ARM) COOH-Terminus içinde bir nükle lokalizasyonu sinyali (NoLS) var, nükreolus Rev/RRE kompleksleri birikimi sağlar. Nükleolar faktörleri, mRNA bağımsız nükleer ihracat ve birleştirme aracılık ek olarak çeşitli fonksiyonlar aracılığıyla HıV-1 bulaşıcı döngüsü desteklemek için spekülasyonlar vardır. Kitle spektrometresi için HIV-1 çoğaltmasının bulunması halinde, Rev nüklenolar mutasyonları (silme ve tek noktalı Rev-nols mutasyonları) ile karşılaştırıldığında, vahşi tip (WT) Rev 'in immünopresipitasyon yöntemini tarif ediyoruz. Nüklerokositasmik taşımacılığında (nucleophosmin B23 ve nükcolin C23), hücresel yapıştırma faktörlerinin yanı sıra, Rev-NoLS mutasyonlarının varlığında Rev ile etkileşimi kaybetmek. SnoRNA C/D kutusu 58 gibi çeşitli nükseolar faktörleri, Rev mutasyonları ile etkileşimi kaybetmek için tanımlanır, ancak HıV-1 çoğaltma döngüsünde fonksiyonları bilinmeyen kalır. Burada sunulan sonuçlar, HıV-1 enfeksiyonlu döngüsünü korumak için viral/konak nüksolar faktörlerinin tanımlanması için bu yaklaşımın kullanımını göstermektedir. Bu yaklaşımda kullanılan kavramlar, az çalışılan yolların karakterizasyonu gerektiren diğer viral ve hastalık modelleri için geçerlidir.

Introduction

Nükl, viral replikasyon için gerekli çeşitli hücresel ev sahibi ve viral faktörlerin etkileşim zemin olarak öne olduğunu. Nükleyer, üç farklı bölmeye bölünmüş kompleks bir yapıdadır: fibriler bölmesi, yoğun fibriler bölmesi ve granüler bölme. HıV-1 Rev proteini özellikle granüler bölmeler içinde lokalleştirir; Ancak, bu yerelleştirme deseni nedeni bilinmiyor. Nols dizisi içinde tek noktalı mutasyonların varlığını (Rev mutasyonlar 4, 5, ve 6), Rev bir nükle desen korur ve daha önce HIV-1HXB2 çoğaltma kurtarmak için gösterilmiştir, ancak, daha düşük verimlilik ile karşılaştırıldığında WT Rev1 . Tüm tek nokta mutasyonlar HıV-1NL4-3 bulaşıcı döngüsü sürdürmek mümkün değildir. NoLS dizisi içinde birden çok tek noktalı mutasyonlar varlığında (Rev-NoLS mutasyonları 2 ve 9), Rev çekirdek ve sitoplazması boyunca dağıtmak için gözlenen ve HıV-1HXB2 çoğaltma1kurtarmak mümkün olmamıştır. Bu proteomik çalışmanın amacı, nükselolar yanı sıra, Rev-aracılı HıV-1 bulaşıcı yolunda yer alan nonnüktrinolar hücresel faktörleri deşifre etmektir. Rev immünopyemek koşulları, nüklenolar B23 phosphoprotein ile etkileşimi ile optimize edilmiştir, daha önce nükloon mutasyonların varlığında Rev ile etkileşimi kaybetmek gösterilmiştir.

Rev hücresel faktörler yoğun geçmişte incelenmiştir; Ancak, bu viral patogenezi yokluğunda yapıldı. Bir protein, özellikle, bu çalışmada HIV-1 çoğaltma sırasında Rev etkileşimi ile karakterize nükvolar fosfoprotein B23-aynı zamanda nucleophosmin (NPM), numatrin veya NO38 amfitolit2,3 olarak adlandırılır 4. B23 üç isoformlar olarak ifade edilir (NPM1, NPM2, ve NPM3)-tüm üyeleri nucleophosmin/nükleoplazmin nükleer refakatçi aile5,6. NPM1 moleküler refakatçi, nüklozomların uygun montajında, kromatin yüksek sıralı yapılarında yer alan protein/nüklik asit kompleksleri oluşumunda,7,8ve toplama önlenmesi ve hedef proteinlerin N-terminal çekirdek etki alanı (kalıntıları 1-120)9ile yanlış katlanması. NPM1 işlevselliği çekirdek ve sitoplazması arasında preribosomal partiküllerin taşınması ile ribozom Genesis uzanır10,11, dahili transkripsiyonu spacer serisindeki preribosomal RNA işlenmesi 12,13, ve ribozomal montaj sırasında proteinlerin nüklolar toplama tutuklama14,15. NPM1 apoptozis inhibisyonu içinde bulaşmış16 ve tümör bastırıcı arf stabilizasyonu17,18 ve p5319, bir Onkojenik faktör ve tümör bastırıcı olarak ikili rolünü açığa. NPM1 genom stabilitesi, centrosome çoğaltma ve transkripsiyon hücresel faaliyetlerine katılır. NPM1, hücre döngüsü interfaz sırasında nükleollerde, mitozis sırasında kromozomal çevre boyunca ve mitozun sonucu olarak prenüsolar gövdelere (PNB) bulunur. NPM2 ve NPM3 malignite sırasında değiştirilmiş ifade seviyeleri uğrar NPM1 olarak iyi çalışılmıştır değildir20.

NPM1, iç NES ve NLS9,21 ve daha önce HIV-1 tat ve Rev proteinleri nükleer ithalatı sürücü bildirilmiştir çeşitli nükleer/nükleolar proteinlerin nükleoplazmik mekik belgelenmiş. B23-bağlayıcı-Domain-β-galactosidase Fusion proteinlerin varlığında, tat Sitoplazmanın içinde mislocalizes ve Transaktivasyon etkinliğini kaybeder; Bu B232için tat güçlü bir benzeşimi gösterir. Başka bir çalışmada RRE içeren mRNAs yokluğunda bir Rev/B23 istikrarlı kompleks kuruldu. RRE mRNA huzurunda, Rev B23 dan ayrışıp ve tercihen HIV RRE bağlar, B2322deplasmanında lider. Nerede, subnuclear düzeyinde, tat transaktivasyonu ve B23 HIV mRNA için Rev değişim süreci gerçekleşir bilinmiyor. Her iki protein B23 etkileşimi ile aynı anda nükolus girmek için öne vardır. Diğer ev sahibi hücresel proteinlerin HıV nükselolar yolu içinde katılımı bekleniyor. Bu proteomik soruşturmada açıklanan yöntemler, HıV-1 patogenezi sırasında yer alan hücre faktörleri ile nükselolus 'un etkileşimlerine yardımcı olacaktır.

Proteomik soruşturma, HıV-1HXB2 üretimi Için Rev nols tek noktalı mutasyonlar (M4, M5 ve M6) ve birden fazla arginin değiştirme (m2 ve M9) ifadesi ile başlatıldı. Bu modelde, bir hela hücre hattı stabil Rev eksikliği HIV-1HXB2 (hlfb) WT Rev ve Rev nüklemler mutasyonlar 3 ' End bir bayrak etiketi içeren transfekte olduğunu ifade ediyor. WT Rev varlığı HLfB kültüründe, Rev eksikliği (m2 ve M9) kurtarmak değil Rev-NoLS mutasyonlar ile karşılaştırıldığında, viral replikasyon gerçekleşmesi için izin verecektir veya viral çoğaltmanın gerçekleşmesi için izin verir, ancak gibi verimli WT Rev (M4, M5, ve M6)1. Cell lysate, Rev ifadesinin varlığında viral proliferasyon sonrası ve Rev/B23 etkileşimi için optimize edilmiş bir liziz tamponu ile immünopresipitasyon 'a maruz kaldıktan sonra 48 h alınır. Değişken tuz konsantrasyonlarını kullanarak lizis tampon optimizasyonu açıklanmıştır ve HıV-1 Rev için protein elüsyon yöntemleri gümüş lekeli veya Coomassie-vitray-sayfa jeller içinde karşılaştırılır ve analiz edilir. İlk proteomik yaklaşımı, tandem kütle spektrometresi tarafından ifade edilen WT Rev, m2, M6 ve M9 tarafından el ile oluşturulan bir numunenin doğrudan analizini içerir. WT Rev, M4, M5 ve M6 'ın atlatılacağı ikinci bir yaklaşım, ilk yaklaşımla karşılaştırıldığında bir jel ekstraksiyon işlemi uygulandı. WT Rev ile karşılaştırıldığında Rev-NoLS mutasyonları peptid yakınlık analiz edilir ve protein tanımlama olasılığı görüntülenir. Bu yaklaşımlar, HIV-1 mRNA taşımacılığında ve Rev ile HıV-1replikasyon sırasında birleştirme sürecinde bulunan olası faktörleri (nüklerolar ve nonnüklerolar) ortaya çıkarır. Genel olarak, hücre lizis, IP, açıklanan ve elüsyon koşulları, enfeksiyon yollarını etkinleştirmek ve düzenleyen ana hücresel faktörlerin anlaşılması için ilgi viral proteinlere uygulanabilir. Bu da çeşitli hastalık modellerinin Kalıcılık için gerekli hücresel ana faktör çalışması için geçerlidir. Bu proteomik modelde, HıV-1 Rev IP, nükle sitoplazmik mekik aktivitesi ve HıV-1 mRNA bağlayıcılığı ile ilgili olarak B23 etkileşim için optimize edilmiştir. Ayrıca, hücre hatları stabil ilgi anahtar proteinlerin eksiktir bulaşıcı hastalık modelleri ifade, HLfB hücre hattına benzer, ilgi bulaşıcı yollar çalışmak için geliştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hücre kültürü

  1. Dulbecco 'nun değiştirilmiş Eagle 'ın Orta (dmem) ' inde hlfb 'ı koruyun% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mm L-glutamin ve 1 mm sodyum piruvat doku kültürü ile tedavi edilen 100 mm plakalı. Hücre kültürlerini 37 °C ' de% 5 CO2ile birlikte verilen bir nemlendirici kuluçte tutun. 1 x 106 hücreli/ml hücre yoğunluğuna Passage confluent hücreleri.
  2. Hücre kültürü ortamını atın. 10 mL 1x fosfat-tamponlu tuz (PBS) ile hücreleri yavaşça durulayın. Hücre katmanını bozmadan 1x PBS 'i çıkartın ve atın.
  3. Hücrelere 2 mL 1x Trypsin-EDTA çözümü ekleyin. Tek tabakalı kat ve 5 dk için bir nemlendirici oda içinde 37 °c ' de inküyme çanak kaya.
  4. Sıkıca hücreleri ayırmak için el avuç ile çanak tarafına dokunun. 8 mL taze kültür medyasında ayrılmış hücreleri yeniden resuspend. 400 x g 'de hücreleri 5 dakika boyunca döndürün.
  5. Hücre Pellet bozmadan Kültür medya atın. Taze Kültür medya 10 ml hücre Pelet resuspend. Subculture 1 mL konsantre hücreler ile 9 mL taze Kültür medya içinde doku-kültür-tedavi 100 mm plakalar.
    Not: her Rev-nols mutasyonu için, 3x 100 mm hlfb veya hela kültür plakaları Batı leke Analizi ve kütle spektrometresi için yeterli protein lysate verecektir. WT Rev pozitif kontrol ve negatif kontrol için ekstra plakalar ekleyin. Alt kültür hücresi birimi, farklı hücre türlerinin kullanımı ile en iyileştirme gerektirir.

2. HIV-1 çoğaltma sırasında Rev-nols-3' Flag mutasyonlar ifadesi

  1. HLfB hücre kültürünü 2 x 106 hücreli/ml 'lik bir hücre yoğunluğuna büyütün. Her 100 mm plaka için 4 mL kalsiyum fosfat-DNA süspansiyonu hazırlayın.
    1. Etiket 2 15 mL Tüpler 1 ve 2 olarak. 2 mL 2x HBS ekleyin (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl, ve 1,5 mM na2HPO4 [pH 7,12]) tüp 1. TE 79/10 (1 mM Tris-HCl ve 0,1 mM EDTA [pH 7,9]) tüp 2 ' ye ekleyin. TE 79/10 hacmi 1,760 mL-DNA hacmi.
    2. 20 μg Plasmid, Rev-NoLs-3' Flag mutasyon tüp 2 ' ye ilgi içeren ve içeriğini Resuspension aracılığıyla karıştırın ekleyin. 240 μL 2 M CaCl2 ' den tüp 2 ' ye ekleyin ve yeniden Resuspension ile karıştırın.
    3. Tüp 2 karışımı transfer tüp 1 dropwise, yavaşça karıştırma. Süspansiyonun oda sıcaklığında 30 dakika oturmasına izin verin. yağış Vortex.
  2. 3 hücreli kültürün her biri için 1 ml Süspansiyon dropwise ekleyin, 100 mm plakalar yavaşça medya dönen iken. Plakalarını inkükule geri dönün ve transfeksiyon karışımını 6 saat boyunca bırakın. 10 mL taze kültür medyası ile transfeksiyon karışımını değiştirin ve 42 h için hücreleri kuluçsa.

3. viral protein lysate koleksiyonu

  1. 48 h posttransfection hücre medyasını atın. Her 100 mm plaka buzun bir yatağa yerleştirin. Her Rev-NoLS mutasyon örneği için etiket 15 mL tüpler ve buz üzerinde tüpler yerleştirin.
  2. Hücreleri, hücre katmanını bozmadan 10 mL ön soğutulmuş 1x PBS ile yavaşça durulayın. 1x PBS 'i atın. 3 mL liziz tamponu ekleyin (50 mM Tris-HCl [pH 8,0], 137 mM NaCl ve 1% X-100 deterjan [ malzeme tablosunabakın]), tüm 100 mm tabakaların her biri için proteaz inhibitörü kokteyli ile tedavi edilir.
  3. Hücre katmanını bozmak için bir hücre sıyırıcı kullanın. Plaka eğim ve hafifçe kazımak ve bir havuza hücreleri toplamak. Bir 1.000 μL mikropipet kullanarak hücre lysate toplayın ve prelabeled içinde 3 100 mm plakaları her biri hücre endoglikozidazları karıştırın 15 ml tüp.
  4. 15 dakika boyunca buz üzerinde hücre lysate inküye, her 5 dk vorherser. hücre lysate 15.000 x g , 5 dakika Santrifüjü.
  5. Hücre enkaz Pelet bozmadan protein süpernatant toplayın ve başka bir steril 15 ml tüp aktarmak. Bradford yöntemini kullanarak viral protein lysate konsantrasyonu elde (bkz. Bölüm 4).
  6. Batı immünoblot analizi için giriş numunesi (20 μg) bir kısım kaydedin. Son hacmine 2x örnek tampon (% 20 gliserol, 0,02% bromophenol mavi, 125 mM Tris-CL [pH 6,8],% 5 SDS ve% 10 2-mercaptoetanol) ekleyin. 95 °C ' de 10 dakika boyunca kaynatın ve giriş örneğini-20 °C ' de saklayın.

4. Bradford tahlil

Not: proteinli standart eğrileri oluşturmadan önce 100x BSA stokundan 10X Sığır serum albümin (BSA) hazırlayın.

  1. Aşağıdaki boş ve standartlar için mikrosantrifüj tüplere su aliquot: boş = 800 μL; Standart 1 = 2 mg/mL, 798 μL; Standart 2 = 4 mg/mL, 796 μL; Standart 3 = 6 mg/mL, 794 μL; Standart 4 = 8 mg/mL, 792 μL; Standart 5 = 10 mg/mL, 790 μL. aliquot 10X BSA aşağıdaki belirlenen standartlara göre: Standart 1 = 2 μL; Standart 2 = 4 μL; Standart 3 = 6 μL; Standart 4 = 8 μL; Standart 5 = 10 μL.
  2. 5 μL protein numunesi ile 795 μL su karıştırarak protein örneklerinin bir karışımını hazırlayın. Ekleme 200 μL protein assay boya reakajı ( malzeme tablosunabakın) her boş, standart, ve protein örneği. Numuneleri çift karışım için kısa bir süre Vortex ve oda sıcaklığında (18-20 °C) 5 dakika boyunca inküye yapın.
  3. Boş, standartları ve protein örneklerini cuvettes 'e aktarın. 595 nm dozunda protein konsantrasyonlarını ölçün.

5. Rev-NoLS ' ı n coimmünoprecipitation-3 ' Flag

  1. Proteaz inhibitörü kokteyli ile tedavi edilen 500 μL liziz tamponu ile 25 μL m2 yakınlık jeli boncuk ( malzeme tablosunabakın) durulayın. Her mutasyon örneği ve kontrolleri için daha fazla yakınlık jel boncuk durulayın.
    Not: iki jeller (50 μL) için yeterli m2 benzeşme jeli boncuk hazırlayın-bir Batı immünoblot Analizi ve diğer protein boyama ve kütle spektrometresi için.
  2. 4 °C ' de 2 dakika için 820 x g 'de spin. Süpernatant çıkarın. 2 kat daha fazla durulayın.
  3. Viral protein lysate ekleyin (1 mg/mL 5 toplam hacmi mL) prerinsed m2 benzeşme boncuklar. Lizis arabelleği kullanarak toplam hacmi ayarlayın.
  4. Reaksiyonu 4 °C ' de dönen 3 saat için inkük. M2 benzeşme boncukları/viral protein lysate 820 x g 'de 1 dakika santrifüjler.
  5. Süpernatant toplayın ve Batı immünoblot analizi için (20 μg) Post-IP örnek bir kısım kaydedin. Post-IP lysate protein konsantrasyonu ölçmek. Batı İmmünoblotting için 20 μg toplayın.
  6. Son birime 2x örnek arabellek ekleyin. 95 °C ' de 10 dakika boyunca kaynatın ve IP sonrası örneğini-20 °C ' de saklayın.
  7. M2 boncuk 750 μL lizis tampon ile durulayın ve 5 dakika için 4 °c ' de bir rotator üzerinde boncuklar yıkayın. m2 boncuk 820 x g Santrifüjü ve supernatant atın.
  8. 5 dakika boyunca 4 °C ' de Rotator üzerinde iki daha fazla yıkama için 5,7 adımlarını tekrarlayın. Üçüncü yıkamadan sonra, uzun bir jel yükleme ucu kullanarak m2lik boncuk/Co-IP kompleksinden liziz tamponunun herhangi bir izlerini çıkarın.
    Not: lizis tamponunun herhangi bir iz miktarını çıkarmadan önce, jel yükleme ucunun ucunu düz cımbız ile çimdik. Bu m2 boncuk kesintileri ve alımı önleyecek.
  9. M2 boncuk 55 μL 2x yükleme tampon resuspend. Numuneyi 95 °C ' de 10 dakika kaynatın.
  10. 25 μL 'yi iki ayrı SDS-PAGE jeline (Batı İmmünoblotting için bir jel ve Coomassie boyama için diğer) yükleyin.

6. SDS-PAGE jeller hazırlanması

  1. Cast 2 15% SDS-akrilamid bir 50 ml tüpte aşağıdaki reaktifler karıştırarak jeller çözme (40 ml son hacimde, dört jeller için yeterli): 4,16 ml Ultra saf su, 15 ml% 40 akrilamid: bisacrylamid (29:1), 10 ml 1,5 M Tris-HCL (pH 8,8) , 400% 10 SDS, 400 μL% 10 amonyum Persülfat, ve 40 μL TEMED.
  2. 50 ml tüpünü birkaç kez ters çevirme ile çözme jeli karıştırın. Çözümlenen jel karışımının önlenmemiş bir Batı jel aparatı (Batı İmmünoblotting için üç ve bir Coomassie/gümüş boyama için dört jelleri) içine pipet.
  3. Jel karışımının üst katmanını kapsayacak kadar suyu nazikçe pipet. Çözme jel polimerize izin verin.
  4. Herhangi bir fazla suyu absorbe etmek için hassas bir görev silecek ( malzeme tablosunabakın) kullanarak, çözme jeli su tabakası dökün.
  5. 50 ml 'lik bir tüpte aşağıdaki reaktifleri karıştırarak iki 5% SDS-Acrylamid istifleme jeller (20 ml son hacimde, dört jeller için yeterli): 11,88 ml Ultra saf su, 2,5 ml% 40 akrilamid: bisacrylamid (29:1), 5,2 M Tris-HCL (pH 1,5) , 200% 10 SDS, 200 μL% 10 amonyum Persülfat ve 20 μL TEMED.
  6. 50 mL tüpünü birkaç kez ters çevirerek istifleme jeli karıştırın. İstifleme jeli karışımından, çözme jeli üzerindeki cihazın üst kısmına pipet atın.
  7. İstifleme jeli içine uygun sayıda şerit içeren bir jel kaset tarak yerleştirin. Hassas bir görev silecek kullanarak jel karışımı herhangi bir taşma absorbe ( malzeme tablosunabakın). İstifleme jeli tamamen polimerize izin verin.
  8. Batı jel aparatını 1x Batı çalışan tampon ile Flood (5x konsantrasyon: 250 mM Tris-CL [pH 8,3], 1,92 M gcine,% 0,5 SDS ve 10 mM EDTA).
  9. Jel kaset tarağını istifleme jelinden nazikçe çekin. 1x Batı çalışan tamponun yükleme kuyularını doldurmasına izin verin. Örnekleri yüklemeden önce bir şırınga kullanarak 1x Batı çalışan tampon ile her iyi Flush.
  10. Batı immünoblot örneklerini ilgili her bir jel içine yükleyin (giriş örnekleri, koimmunoprecip, numune ve post-IP örnekleri). Batı jel protein belirteçleri yükleyin.
  11. Başka bir jel içine Coomassie/gümüş boyama için coimmunoprecip, örnekleri yükleyin. Batı jel protein belirteçleri yükleyin.
  12. Çalışan jel aparatını bir güç kaynağına bağlayın ve yükleme boyası çözme jeline ulaşıncaya kadar 100 V 'de jeller çalıştırın. Yükleme boyası çözme jeli altına ulaşıncaya kadar 140 V gerilimini artırın.

7. Batı leke transferi

  1. Batı jel aparatı sökün. Çözme jel bozulmamış bırakarak, dilim ve istifleme jel atın.
  2. Çözme jelleri Batı transfer tamponunun (25 mM Tris, 194 mM gcine, 0,005% SDS,% 20 metanol) dolu temiz bir tepsisine yavaşça aktarın ve 15 dakika boyunca ıslatın.
  3. Jel transfer tertibatını aşağıdaki şekilde birleştirin.
    1. Kesme üç PVDF transfer membranları ve filtre kağıdı altı adet ( malzeme tablosunabakın) çözme jel boyutuna.
    2. PVDF membranı 5 dakika boyunca metanol içinde ıslatın. 5 dakika su içinde hidrat. PVDF membranı Batı transfer tamponunu kullanıma hazır olana kadar yerleştirin.
    3. Jel tutucu kasetini, kısmi olarak Batı transfer tamponu ile doldurulmuş cam bir pişirme tepsisine yerleştirin ve altta siyah tarafı vardır.
    4. Jel tutucu kasetinin siyah tarafına karşı Batı transfer tampon ile ıslatılmış bir köpük Pad yerleştirin.
    5. Batı transfer tampon filtre kağıdı bir parça ıslak ve köpük Pad üstüne yerleştirin. Çözümleme jeli filtre kağıdın üstüne yerleştirin.
      Not: çözme jelini PVDF membranına aktarılacak doğru yükleme yönüne yerleştirin.
    6. Çözme jeli üzerine bir PVDF transfer membran yerleştirin. Batı transfer tampon ile filtre kağıdı bir parça ıslak ve PVDF transfer membran üstüne yerleştirin.
    7. Filtre kağıdın üstüne Batı transfer tampon ile ıslatılmış başka bir köpük Pad yerleştirin. Jel tutucu kasetinin beyaz tarafını dikkatle batırılmış köpük balatasının üstüne katlayın. Kaseti sıkıca kilitle.
    8. Jel tutucu kaseti transfer aparatı elektrot montajında yerleştirin. Kalan her çözümleme jeli için 7.3.4-7.3.8 adımlarını yineleyin.
    9. Transfer aparatı deposunun Batı transfer tamponunu doldurun. Cihaz tankına bir karıştırma çubuğu yerleştirin.
    10. Cihaz tankını bir tabak üstüne yerleştirin. 5-6 için heyecan ayarı ayarlamak, karıştırın çubuk sıkışmış veya jel tutucu kasetleri vurmak olmadığından emin olun.
    11. Jel transfer aparatını bir güç kaynağına bağlayın ve 100 V 'de jeli 4 °C ' de 1 h 'ye aktarın.

8. İmmünoblotting

  1. Jel tutucu kaseti çıkarın ve siyah tarafı temiz bir cam pişirme tepsisine doğru yerleştirin. Kaseti açın ve köpük yastığı ve filtre kağıdını dikkatle atın. Doğru yükleme yönünü belirlemek için PVDF membranın bir köşesini işaretleyin. Membran ıslak tutun.
    Not: PVDF membran hava kurutulur ve temiz, mühürlü bir konteynır içinde depolanabilir. 7.3.2 adımları tekrarlayarak membranı rehidrat.
  2. Membranı 100 mL engelleme çözeltisi (% 5 süt, 1x TBS ve 0,1% Tween 20) olarak yerleştirin. 1 saat için oda sıcaklığında (18-20 °C) nazik sallanan ile membranı engelleyin.
  3. 25 kDa protein işaretleyicisinin üstündeki membranın üzerinden keser. B23 fare monoklonal IgG1 (1:500 seyreltme) içeren engelleme çözeltisi, 25 kDa daha büyük protein bantları içeren membranın üst kısmını yerleştirin. Bir gecede blok, 4 °C ' de sallanan.
  4. Membran alt kısmını yerleştirin, 25 kDa 'den küçük protein bantları içeren, m2 fare monoklonal IgG1 içeren engelleme çözeltisi (1:1000 seyreltme, malzeme tablosunabakın). Bir gecede blok, 4 °C ' de sallanan.
  5. Sallanan bir platformda 25 mL Batı yıkama çözeltisi (1x TBS, 0,1% ara 20) olarak 10 dakika membran 3x yıkayın.
  6. , Oda sıcaklığında 1 saat için engelleme solüsyonu seyreltilmiş keçi-Anti-fare IgG1-HRP (1:5000 seyreltme) içinde membranların kulbin. Sallanan bir platformda 25 mL Batı yıkama çözeltisi içinde 10 dakika membran 3x yıkayın.
  7. Kemilüminesans Batı Blot substrat hazırlayın. Membran için substrat eklemek için bir P1000 mikropipet kullanın.
  8. Her membran için kemiluminesans Batı lekeleme substrat geliştirin 5 dakika. substrat membran çıkarın. Hassas bir görev silecek kullanarak aşırı substrat absorbe ( malzeme tablosunabakın).
  9. Bir kasetin içine bantlanmış temiz bir levha koruyucusu içine membran yerleştirin. Kasedi karanlık bir odaya götürün ve kasete bir sayfa film yerleştirin. Kaseti yerine kilitleyin ve 5 – 15 dakika boyunca inküye yapın. filmi kasetten çıkarın ve geliştirin.

9. Coomassie boyama

  1. Batı jel aparatı sökün. Çözme jel bozulmamış bırakarak, dilim ve istifleme jel atın. Çözme jeli 25 ml Ultra Saf suyla dolu temiz bir tepsiye yavaşça aktarın.
  2. Jeli 15 dakika boyunca sallanan bir platformda kulkayın. çözme jel kırma önlemek için nazik sallanan kullanın. Ultra saf su atın ve yıkama adım 2x daha tekrarlayın.
    Not: yıkama adımlarının ardından SDS kabarcıkları kalırsa, jel bir gecede ultra saf suda yıkanabilir. Kalan SDS jel yüksek arka plan boyama neden olabilir.
  3. Şişenin tersine çevirme ile Coomassie leke reakajının karıştırın ( malzeme tablosunabakın). 100 mL Coomassie leke reakajının çözme jeli kapsayacak ve 1 h için sallanan bir platformda jel inkük koyun. Coomassie leke reakajının atılması ve 15 dakika boyunca sallanan bir platformda deiyonize suda jel yıkayın.
  4. Deiyonize suyu atın. Yıkama adımını 2x daha tekrarlayın. Protein bandlarının istenilen çözünürlüğü gözleninceye kadar jeli yıkamak için devam edin.

10. gümüş boyama

  1. Batı jel aparatı sökün. Çözme jel bozulmamış bırakarak, dilim ve istifleme jel atın. Çözme jeli 25 ml Ultra Saf suyla dolu temiz bir tepsiye yavaşça aktarın.
  2. Jeli 15 dakika boyunca sallanan bir platformda kulkayın. çözme jel kırma önlemek için nazik sallanan kullanın. Ultra saf su atın ve yıkama adım 2x daha tekrarlayın.
    Not: yıkama adımlarının ardından SDS kabarcıkları kalırsa, jel bir gecede ultra saf suda yıkanabilir. Kalan SDS jel yüksek arka plan boyama neden olabilir.
  3. % 30 etanol içinde jel Fix:% 10 asetik asit çözeltisi (6:3:1 su: etanol: asetik asit) gecelik oda sıcaklığında. Jeli oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 10 etanol çözeltisi içinde yıkayın. Etanol solüsyonu değiştirin ve 5 dakika daha yıkayın.
  4. Tek parçalı gümüş leke duyarlılığını 500 parça ultra saf su ile (50 μL 25 ml Ultra saf su ile) karıştırarak, Pierce Silver stain Kit 'ten hassaslaştırıcı çalışma çözümünü hazırlayın. 1 dakika boyunca hassaslaştırıcı çalışma çözeltisi içinde çözelti jel inküye. 1 dakika için ultra saf suda jel yıkayın, su yerine, ve 1 dakika için tekrar jel yıkayın.
  5. 50 parça gümüş leke (500 μL 25 mL gümüş leke ile arttırıcı) ile tek parçalı gümüş leke arttırıcı karıştırma tarafından leke çalışma çözümünü hazırlayın. Jel, 30 dakika boyunca leke çalışma çözeltisi içinde inküye.
  6. 50 parçaları gümüş leke geliştirici ile 1 parça gümüş leke arttırıcı karıştırma tarafından geliştirici çalışma çözümü hazırlayın (500 μL arttırıcı ile 25 mL Geliştirici). % 5 asetik asit çözümünü stop solüsyonu olarak hazırlayın. 1 dakika boyunca ultra saf su ile jeli yıkayın, suyu değiştirin ve ek 1 dakika boyunca jeli yıkayın.
  7. Suyu geliştirici çalışma çözümüyle değiştirin ve istenilen protein bandı yoğunluğu çözülene kadar inküye yapın (5 dakika). Geliştirici çalışma çözümünü stop çözümüyle değiştirin ve 10 dakika boyunca inküye yapın.

11. in-jel azaltma, alkilasyon, ve Coomassie sindirimi-lekeli jel bantları

  1. Jel bantları temiz bir jilet kullanarak jel kesip. Her jel bandını yaklaşık 5 mm küpler halinde kesip temiz 0,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
  2. 1:1 acetonitrile 100 mM amonyum bikarbonat ile kapsayan jel parçaları destain: 15 dakika oda sıcaklığında su, supernatant atın. Bu adımı yineleyin.
  3. Jel parçalarını 5 dakika boyunca bir vakum santrifüjte kurutun. 100 mm Amonyum Bikarbonat içinde 10 mm ditiyotreitol ile kurutulmuş jel parçaları kapsayan ve 56 °c ' de 1 h için inküyasyon proteinleri azaltın.
  4. Herhangi bir supernatant pipette. Su içinde 100 mM iodoacetamid ile jel parçaları kaplayan proteinleri alkylate ve karanlıkta oda sıcaklığında 1 h için onları inkükleştirici.
  5. Süpernatant kapalı pipette ve Asetonitril ile onları kaplayan ve yavaşça oda sıcaklığında onları sallayarak jel parçaları Shrink 15 dk. süpernatant kapalı pipet ve 100 mm amonyum bikarbonat ile kaplayan jel parçaları reswell ve onları sallayarak 15 dakika oda sıcaklığında yavaşça.
  6. 11,5 adımı yineleyin. Jel parçalarını 5 dakika boyunca bir vakum santrifüjte kurutun.
  7. 100 mM Amonyum Bikarbonat içinde 50 ng/μL sıralı dereceli modifiye tripsin ( malzeme tablosunabakın) ile jel parçaları kapak. Jelin 5 dakika boyunca şişmesine izin verin; sonra, kalan herhangi bir solüsyonu pipet. 100 mM amonyum bikarbonat ile jel parçaları kapak ve onları tamamen reswell izin, ek 100 mM Amonyum Bikarbonat ekleyerek jel parçaları tamamen kaplıdır böylece.
  8. Jel parçalarını 37 °C ' de bir gecede kulyın. Su% 10 formik asit hacminin 1/10 ekleyerek reaksiyon durdurun. Her tüpten süpernatant toplayın.
  9. % 60 Asetonitril% 1 formik asit ile onları kaplayan ve nazik sallayarak 15 dakika boyunca onları kulsolma ile jel parçaları ayıklamak.
  10. Süpernatanlarında tamamen kurutmayı önlemek için bakım yaparken, bir vakum santrifüjte 20 μl daha az kombine süpernatanlarında hacmini azaltın. Toplam hacmi 20 μL 'ye geri getirmek için% 1 formik asit ekleyin.

12. sıvı kromatografi/kütle spektrometresi

Not: örnekler Ultra HPLC, nano sprey kaynağı ve sütun ( malzeme tablosunabakın) ile donatılmış bir kütle spektrometresi kullanılarak incelenmiştir. Solvent A ve B, sırasıyla su ve Asetonitril% 0,1 formik asittir.

  1. Yüksek iyileşme Polipropilen Otomatik Örnekleyici şişeleri içine sindirilmiş proteinleri yükleyin. Şişeleri bir UPLC sisteminin örnek yöneticisine yükleyin.
  2. Her örnekteki 6 μL enjekte edilir. Her numuneyi,% 99 solvent A/1% solvent B kullanarak 8 μL/dak 'da 1,5 dk için nanotil bindirme sütununa yükleyin.
  3. % 3 ' ten% 35 ' e kadar doğrusal degradeyle kütle spektrometresi içinde peptidler 30 dakika içinde,% 35 ' den% 50% ' den 4 dakika ve% 50 ' den% 90 ' e kadar solvent b 'de 1 dk. koruyun 90% Asetonitril 3 dakika; % B 'yi 5 dk üzerinden% 3 ' e geri azaltın.
  4. Çözünürlük (20.000 çözünürlük) modunda pozitif iyon profili kütle spec veri kazanın. 100 dan 2.000 da her 0,6 s tarama hızında veri kazanın. MSE modunda veri edinme herhangi bir çarpışma enerjisi ile taramaları alternatif ve yüksek Çarpışma enerjisi ile tarar.
  5. Yüksek Çarpışma enerjisi için, Trap hücresindeki çarpışma enerjisini 15 V 'den 40 V 'ye yükseltir. kilit kütlesi olarak [Glu1]-fibrinopeptide B + 2 İyon kullanarak her 30 s kilit kitle taraması kazanın. Çözücü A boş bir enjeksiyon kullanarak bir veri dosyası edinme, her örnek çifti arasında aynı edinme yöntemi kullanarak kontrol etmek için kullanma.

13. kütle spektrometresi için veri analizi

  1. Kütle spektrometresi sonuçları dosyalarını bir nicel ve niteliksel proteomik araştırma platformu (örneğin, ProteinLynx Global Server) çalıştıran bilgisayara kopyalayın. Veri Analizi son derece CPU yoğundur ve ayrı, yüksek performanslı bir veri analiz bilgisayarında yapılmalıdır.
  2. Veri için yeni bir proje oluşturun. Otomatik ölçme plakasını temsil eden yeni bir mikrotiter plakası oluşturun. Numuneleri Mikrotitre plakasında aynı pozisyona otomatik amperte konumlarına atayın.
  3. Her örnek işleme parametrelerini atayın. Kullanılacak parametreler otomatik kromatografik tepe genişliği ve MSTIT çözünürlüğü; düşük enerji eşiği, 100 sayar; yüksek enerji eşiği, 5 sayar; Yoğunluk eşiği, 500 sayar.
  4. Her örnek iş akışı parametrelerini atayın. Kullanılacak parametreler veritabanı, birleştirilmiş insan SwissProt ve HıV, ters dizileri ile; Otomatik peptid ve parça toleransı; Min parça iyon peptid başına maçlar, 3; minimum parça iyon protein başına maçlar, 7; protein başına min peptid maçlar, 1; Primer Özet reaktif, tripsin; cevapsız yarık, 1; sabit değiştirici reaktifler, carbamidomethyl C; değişken değiştirici reaktifler, oksidasyon M; yanlış keşif oranı, 100.
  5. Örnekleri seçin ve son ham verileri işlemeseçin. Arama tamamlandığında, örnekleri seçin ve veri İskelesi 'Ne dışa aktar 'ı seçin (sürüm 3). İskeletleraçın, yeni bir dosya oluşturun ve proteomik platformundan ihraç edilen her dosyayı, habercisi iyon quantitation kullanarak yeni bir biosample olarak alın.
  6. Tüm dosyalar içe aktarıldığında, Yük ve analiz veri ekranına geçin. LFDR Puanlama ve standart deney çapında protein gruplandırma kullanarak arama ve alma verileri için kullanılan aynı veritabanını seçin. Protein tanımlama olasılığı,% 20 ' ye kadar protein eşiği, 1 ' e en az peptit sayısı ve analiz sırasında% 0 ' a kadar peptid eşiği için ekran seçeneklerini ayarlayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tek ve birden çok noktalı arginin mutasyonları olan Rev-NoLS, çeşitli hücre içi yerelleştirme desenlerine karşılık gelen WT Rev ile karşılaştırıldığında hücresel ana bilgisayar faktörleriyle etkileşimde bulunma yeteneğiyle incelendi. WT Rev-3' Flag ve pcDNA-bayrağı vector, HLfB kültüründe ifade edildi. Protein kompleksleri toplam hücre lysate işlenmiş ve gümüş leke reakajıyla lekelenmiş. Rev-NoLS-3' bayrağı, Şekil 1' de çeşitli NaCl konsantrasyonları (137 mm, 200 mm ve 300 mm) içeren üç farklı liziz tampon koşullarında algılanabilir (yaklaşık 18 kDa). B23 (37 kDa) daha düşük tuz konsantrasyonu (137 mm, şerit 2 – 4) içeren lizis tampon içinde, ancak 200 mm NaCl içeren lizis tampon algılanabilir ve yüksek bir tuz konsantrasyonu (300 mm NaCl) içeren liziz tampon içinde algılanamaz. Şekil 2' de, WT Rev-3' Flag, Rev-nols M1-3 ' bayrağı ve pcDNA-Flag vektörü hlfb kültüründe ifade edildi. Protein kompleksleri iki liziz tampon şartından (137 mM ve 200 mM NaCl) hazırlanan toplam hücre lysatlarından işlenir. M2 fare monoklonal IgG1 hücre Lysates Rev-3' Flag ifadesinin algılanması kullanılmıştır. B23 algılama WT Rev-3' Flag (giriş ve α-Flag-Rev IP) ile 137 mm NaCl içeren lizis tampon optimal oldu ama Rev-nols M1-3 ' bayrağı ile yakınlık kaybetti. WT Rev-3' Flag ile B23 benzeşimi, 200 mM NaCl içeren liziz tamponundaki daha yüksek bir tuz konsantrasyonu ile azaldı. pcDNA negatif kontrol, tüm liziz tampon koşullarında giriş ve α-Flag-Rev IP içinde nonspesifik immünonatifi algılama vermiyor.

Elüsyon koşulları, Şekil 3' te Rev-nols-3' Flag IP için optimize edilmiştir. WT Rev-3' Flag ve pcDNA-Flag vektörü hlfb kültüründe ifade edildi. Protein kompleksleri toplam hücre endoglikozidazları işlenmiş ve ışık ve ağır zincir arka plan ortadan kaldırmak için üç farklı koşullar kullanılarak elüe (25 ve 50 kDa)-2x örnek yükleme tampon 37 °c 15 dakika, 2x örnek yükleme tampon için 95 °c 3 dakika, ve 3x bayrak peptid e 4 °C ' de 30 dk. Rev NoLS-3' Flag (~ 18 kDa) en az 2x örnek yükleme tamponunun Kaynatıldıktan sonra algılanabilir. B23 (~ 37 kDa) iki koşul altında algılanabilir-37 °C inkübasyon için 2x örnek yükleme tamponu 15 dk ve 95 °C inkübasyon için 2x örnek yükleme tamponu 3 dakika.

M2 (lokalizasyonda nükleer/nükleolar, HıV-1HXB2 üretiminde işlevsel olmayan), M6 (nükle, fonksiyonel HIV-1HXB2 üretim), ve M9 (sitoplazmada dağınık/çekirdekte, viral üretimde işlevsel olmayan) HLfB kültüründe ifade edildi. Protein kompleksler toplam hücre lysate tarafından işlenmiş, 95 ° c inkübasyon ile 3 dakika boyunca 2x örnek yükleme tamponunda ellenmiş ve gümüş leke reakajında çözüldü (Şekil 4). WT Rev IP bayrağı reaksiyonu sonrasında algılanabilir. 18k-NoLS m2, M6 ve M9 de 18 kDa algılanabilir. 37 kDa işaretinde B23 proteinine karşılık gelen bantlar gözlenmiştir. WT Rev, m2, M6, M9 ve pcDNA negatif arka plan kontrolünün IP reaksiyonlarına karşılık gelen her şeritte protein kompleksler daha da gözlenmiştir. Protein endoglikozidazları α-Flag-Rev ve B23 için immünitif algılama ile incelendi. Bol WT Rev ve orta düzeyde M6 ifade edildi (α-Flag girişi) ve bayrak IP sonra algılanabilir (α-Flag-Rev IP, Şekil 5). M2 ve M9, 20 μg protein lysate girişinden yüksek oranda ifade edilmiyor ancak 5 mg protein lizat gelen bayrak IP 'den sonra düşük yoğunlukta algılanabilir. pcDNA negatif kontrol, giriş ve α-Flag-Rev IP 'de nonspesifik immünatifi algılaması vermiyor. WT Rev ile B23 benzeşimi IP bayrağı reaksiyonu (B23 Co-IP) sonra gözlendi. B23 benzeşimi m2 (iki tek noktalı mutasyonlar R48, 50G) ve M6 (tek noktalı mutasyon R50G) ile biraz gözlenen. B23 benzeşimi M9 (R46, 48, 50G) üç tek noktalı mutasyonların varlığını Rev-NoLS içinde kayboldu.

İmmunoprecipalized WT Rev ve Rev-nols-3' Flag mutasyonlar (4, 5, 6 ve 8) gelen toplam endoglikozidazları, Coomassie reaktif ile lekelenmiş, işlenmiş ve BSA seri seyreltme (sağ panel) ile karşılaştırıldığında görselleştirildi. Rev-NoLS-3 ' i n bayrağı 18 kDa (Şekil 6) ' da mutasyonların bulunması ve yokluğunda algılanabilir (12.5-25 μg). WT Rev-3' bayrağı IP reaksiyonları, nükreolar-lokalleştirme Rev-nols-3' Flag mutasyonları (M4, M5 ve M6) ve negatif kontrol pcDNA-bayrak, Coomassie reaktif ile lekelenmiş SDS-sayfa jeller 'de görselleştirildi (Şekil 7). WT Rev (WT1 ve WT2), 18 kDa IP bayrağı reaksiyonu sonrasında algılanabilir. Rev-NoLS mutasyonlar biraz HLfB ve IP bayrağı reaksiyon ifadesi sonra algılanabilir. pcDNA negatif denetim 18 kDa nonspesifik arka plan vermiyor.

WT Rev-3 ' i n Flag, m2, M6, M9 ve negatif kontrol pcDNA-bayrağı ( Şekil 4' te gösterilen) hazırlanan immünopmanitaj endoglikozidazları tandem kütle spektrometresi tarafından incelenmiştir. Protein tanıma olasılığı (yüzdeler), her nükte-lokalleşme Rev-NoLS mutasyonu ile birlikte oluşan protein etkileşimlerinin WT Rev (Tablo 1) ile karşılaştırılması için görüntülenir. (Ribosomal isoformlar, ökaryotik çeviri başlatma faktörü 48, snoRNA C/D kutu 58B ve nucleophosmin B23) lokalizasyon deseninde nüklerolar olan hücresel proteinler, WT Rev 'in doğrudan/dolaylı bağlayıcı ortakları olarak tespit edilmiştir. bu nüklerolar faktörler m2 (iki tek noktalı mutasyonlar R48, 50G), M6 (tek nokta mutasyon R50G) ve M9 (üç tek nokta mutasyonu R46, 48, 50G), pcDNA negatif kontrol benzer bağlayıcı benzeşimi kaybetti. Şekil 6 ' da Coomassie-lekeli jel her şeritte tandem kütle spektrometresi için Işlenmiş (Tablo 2). Rev-NoLS mutasyonları peptid yakınlık analiz ve protein tanımlama olasılığı (yüzdeleri) kullanılarak görüntülenir. Bazı hücre proteinlerinin, bazıları lokalizasyon deseninde nüklerolar (nükselolin C23, nucleophosmin B23 ve nükle montaj proteini), WT Rev 'in doğrudan/dolaylı protein bağlama faktörleri olarak tespit edilmiştir. bu nükle faktörler M4, M5 ve M6 ile bağlamak için tanımlanır. Taşıma faktörleri ARHGEF1 (Rho guanin nüknikotid değişimi faktörü 1) ve TBC1D24 (TCB1 etki alanı ailesi, üye 24), Rev-nols mutasyonları varlığına yakınlık içinde kayboldu. Splicing faktörleri hnRNPC (heterojen ribonükleer protein C) ve PNN (Pinin, desmosome ilişkili protein) Ayrıca WT Rev bağlamak için gözlenen, hangi Rev tek noktalı nüklenolar mutasyonlar ile etkileşimi kaybetti.

Figure 1
Şekil 1 : HIV-1 üretimi sırasında Rev-3' Flag Co-IP için hücre liziz koşullarının optimizasyonu. WT Rev-nols-3flag ve negatif kontrol pcDNA-bayrak IP koşulları lizis tampon üç farklı NaCl konsantrasyonları (137 mm, 200 mm ve 300 mm) optimize edilmiştir. Gümüş boyama ile gözlenen, 137 mM NaCl Rev immünoprecipitation ve B23 bağlayıcı için optimum tuz konsantrasyonu oldu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2 :, HIV-1 üretimi sırasında Rev-3flag Co-IP ve B23 immünsiyon için liziz koşullarının optimizasyonu. WT Rev-nols-3' Flag, M1-3 ' bayrağı ve negatif kontrol pcDNA-Flag IP koşulları, lizis tamponunun iki farklı NaCl konsantrasyonunda (137 mm ve 200 mm) optimize edilmiştir. Bağışıklık algılama yoluyla gözlenen, 137 mM NaCl Rev immünoprecipitation ve B23 bağlayıcı için optimum tuz konsantrasyonu oldu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : HIV-1 üretimi sırasında Rev-3 ' i n Flag Co-IP elüsyonunun optimizasyonu, gümüş boyama ile görselleştirildi. Protein kompleksleri WT Rev-3 ' Flag ve pcDNA-Flag IP sırasında hazırlanan toplam hücre endoglikozidazları tarafından işlenmiş. Üç farklı elüsyon koşulları test edildi-37 °C ' de 15 dakika, 2x örnek yükleme tamponu, 95 °C ' de 3 dakika için 2x örnek yükleme tamponu ve 4 °C ' de 30 dakika için 3x bayrağı peptid. WT Rev 'in optimum elüsyon koşulları, 37 °C ' de 2x örnek yükleme tamponunda 15 dk. inkübasyon süresinden sonra ve 95 °C ' de 2x örnek yükleme tamponunda 3 dakikalık kuluçdak döneminden sonra meydana gelmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : HIV-1 üretimi sırasında Rev-3 ' i n bayrak mutasyonları 2, 6 ve 9 Immunoprecipitation. WT Rev, m2 (R48, 50G), M6 (R50G), M9 (R46, 48, 50G) ve negatif kontrol pcDNAile doğrudan/dolaylı olarak bağlanan protein KOMPLEKSLERI, HIV-1 çoğaltmanın varlığında gümüş LEKELI sds-page jeli ile gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Rev-3' Flag HIV-1 üretim sırasında B23 immünitasyon için 2, 6 ve 9 mutasyonların Co-IP. Şekil 4 ' te WT Rev, m2, M6, M9 ve negatif kontrol pcDNA-bayrağı ile hazırlanan protein endoglikozidazları ve IP reaksiyonları α-Flag-Rev ve B23 için immünitik algılayarak daha da incelenmiştir. WT Rev ve mutant ifadesinin yanı sıra B23 nüklenositoplazmik protein ile etkileşimi gözlenmektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : Bayrak IP reaksiyonunun ardından Rev-NoLS mutasyonları 4, 5, 6 ve 8 ' ın ölçülmesini . HLfB 'nin WT Rev 'den gelen IP reaksiyonları ve nükvolar-yerelleştirme M4 (R46G), M5 (R48G), M6 (R50G), M8 (ΔRQ) ve negatif kontrol pcDNA-bayrağı, BSA seri seyreltilmeleri kullanılarak protein konsantrasyonu için ölçülmüştür. Her numune için 12.5-25 μg protein konsantrasyonu gözlenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7 : HIV-1 üretimi sırasında nüklenlerin Lokalleştirilmesi Rev-NoLS mutasyonları 4, 5 ve 6 Immunooprecipitation. Coomassie-WT Rev (1 ve 2), M4, M5 ve M6 immunoprecip, protein kompleksleri içeren lekeli SDS-sayfa jel gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Tanımlanan proteinler Moleküler Ağırlık (WT) M2 M6 M9
sinyal tanıma parçacık 14kDa (Homologous Alu RNA bağlayıcı protein) 15 kDa için 95% 0 0 0
ribozomal protein S3A 30 kDa 95% 0 0 0
Ökaryotik tercüme başlatma faktörü 4B 69 kDa 95% 0 0 0
ribozomal protein L31 14 kDa için 91% 0 0 0
ribozomal protein L12 18 kDa için 93% 0 0 0
ribozomal protein L22 15 kDa için 91% 0 0 0
küçük nükcolar RNA, C/D kutusu 58B 15 kDa için 87% 0 0 0
Çinko parmak, CCHC etki alanı içeren 11 185 kDa 87% 0 0 0
aktin bağlayıcı LIM protein 1 79 kDa 79% 0 0 0
ribozomal protein S13 17 kDa 78% 0 0 0
nucleophosmin (nükrinolar fosfoprotein B23, numatrin) 33 kDa 73% 0 0 0

Tablo 1: HIV-1 üretimi SıRASıNDA WT Rev ile etkileşimde bulunan hücresel ana bilgisayar faktörlerinin tanımlaması. WT Rev, m2, M6 ve M9 'den hazırlanan protein, tandem kütle spektrometresi tarafından doğrudan incelenmiştir. WT Rev 'e karşı m2, M6 ve M9 'a doğrudan/dolaylı olarak bağlanan protein etkileşimleri protein tanımlama olasılığı (yüzdeler) ile özetlenmiştir.

Tanımlanan proteinler Moleküler Ağırlık M4 M5 M6 Wt pCDNA 'ler
Poly (A) bağlayıcı protein, sitoplazmik 1 61 kDa 98% 0 100% 100% 0
Isı şok 70kDa protein 1B 70 kDa 100% 100% 100% 100% 0
ribozomal protein L7 29 kDa için 91% 0 100% 100% 0
histon küme 1, H1e 22 kDa için 0 0 100% 100% 0
ribozomal protein L4 48 kDa 95% 0 100% 100% 0
ribozomal protein L13 24 kDa 99% 0 100% 100% 0
Bileşen 1, q alt bileşen bağlama proteini tamamlayıcı 31 kDa hakkında 100% 100% 100% 100% 0
Y kutusu bağlayıcı protein 1 36 kDa 0 0 100% 100% 0
nüktrinosome montaj proteini 1-benzeri 1 45 kDa 0 0 0 100% 0
ribozomal protein L8 28 kDa 89% 36% 100% 100% 0
ribozomal protein L18 22 kDa için 27 0 100% 100% 0
Isı şok 70kDa protein 8 71 kDa 5 99% 100% 100% 0
ribozomal protein L19 23 kDa için 10 0 81% 100% 0
ribozomal protein L27 16 kDa için 92% 0 100% 100% 0
ribozomal protein L7a 30 kDa 0 0 100% 100% 0
ribozomal protein L24 18 kDa için 0 0 100% 99% 0
tubulin, beta sınıfı ı 50 kDa 92% 69% 100% 100% 0
ribozomal protein L6 33 kDa 0 0 100% 100% 0
Isı şok 70kDa protein 9 (mortalin) 74 kDa 33% 99% 100% 100% 0
ribozomal protein S2 31 kDa hakkında 87% 0 100% 100% 0
kasein kinaz 2, Alfa 1 polipeptid 45 kDa 0 0 50% 100% 0
ribozomal protein L14 23 kDa için 0 0 81% 100% 0
ribozomal protein, büyük, P0 34 kDa 0 0 100% 100% 0
histon küme 1, H1B 23 kDa için 0 0 73% 100% 0
Isı şok 70kDa protein 5 (glikoz-düzenlenmiş protein) 72 kDa 99% 0 100% 100% 0
ribozomal protein S4, X-bağlantılı 30 kDa 0 0 100% 100% 0
ribozomal protein S20 13 kDa için 98% 94% 99% 99% 0
ribozomal protein L28 16 kDa için 0 0 100% 99% 0
ribozomal protein S14 16 kDa için 0 0 100% 100% 0
ribozomal protein S3A 30 kDa 0 0 100% 100% 0
ribozomal protein L21 19 kDa 0 0 100% 100% 0
Çinko parmak CCCH-tipi, antiviral 1 101 kDa 0 0 97% 100% 0
histon küme 1, H1c 21 kDa için 0 0 0 98% 0
ribozomal protein L36 12 kDa için 0 0 100% 100% 0
ribozomal protein S18 18 kDa için 90% 0 100% 100% 0
Apoptozis modülatör 1 40 kDa 42% 88% 34% 0 0
ribozomal protein L17 21 kDa için 0 0 100% 100% 0
ribozomal protein S26 13 kDa için 91% 0 99% 98% 0
ribozomal protein l32 18 kDa için 0 0 48% 100% 0
ribozomal protein L35 15 kDa için 0 0 97% 100% 0
ribozomal protein L29 18 kDa için 0 0 57% 94% 0
ribozomal protein S9 23 kDa için 0 0 100% 100% 0
heterojen nükleer Ribonükleoprotein H1 (H) 51 kDa 98% 0 100% 100% 0
ribozomal protein S8 22 kDa için 0 0 78% 100% 0
ribozomal protein L10 25 kDa hakkında 0 0 100% 100% 0
ribozomal protein L23a 18 kDa için 0 0 68% 100% 0
ribozomal protein S6 29 kDa için 0 0 100% 100% 0
ribozomal protein L31 14 kDa için 0 0 95% 100% 0
ribozomal protein S13 17 kDa 0 0 100% 99% 0
ribozomal protein L10a 25 kDa hakkında 45% 0 81% 100% 0
Poly (A) bağlayıcı protein, sitoplazmik 4 (indüklenebilir form) 70 kDa 0 0 100% 100% 0
transmembran emp24 protein taşıma alanı içeren 1 25 kDa hakkında 0 0 0 100% 0
EBNA1 bağlayıcı protein 2 35 kDa 0 0 69% 100% 0
helix-loop-helix her yerde kinaz 85 kDa 74% 92% 65% 83% 0
ribozomal protein L12 18 kDa için 0 0 57% 100% 0
ribozomal protein S24 15 kDa için 0 0 100% 100% 0
Soğuk şok Domain protein A 40 kDa 0 0 0 100% 0
ribozomal protein L27a 17 kDa 0 0 89% 99% 0
heterojen nükleer Ribonükleoprotein F 46 kDa 0 0 99% 99% 0
ribozomal protein L11 20 kDa için 0 0 99% 100% 0
ribozomal protein L26-Like 1 17 kDa 0 0 100% 100% 0
kasein kinaz 2, Alfa Prime polipeptide 41 kDa 0 0 0 100% 0
tubulin, Alfa 1a 50 kDa 33% 0 100% 0 0
ribozomal protein L3 46 kDa 0 0 86% 94% 0
mitokondriyal ribozomal protein L15 33 kDa 0 0 100% 99% 0
nüktrinolin 77 kDa 0 0 25 100% 0
mitokondriyal ribozomal protein S21 11 kDa için 0 0 93% 94% 0
KRR1, küçük alt birim (SSU) processome bileşeni, homolog (Maya) 44 kDa 89% 0 76% 99% 0
mitokondriyal ribozomal protein S7 28 kDa 0 0 0 100% 0
klorür kanalı, nüktiotid-duyarlı, 1A 22 kDa için 0 0 97% 86% 0
siklin B3 158 kDa 0 0 67% 49% 0
Guanin nüktrinotid bağlayıcı protein gibi 3 (nüktrinolar) 61 kDa 0 0 99% 98% 0
mitokondriyal ribozomal protein S23 22 kDa için 0 0 100% 50% 0
mitokondriyal ribozomal protein S22 41 kDa 0 0 0 99% 0
nucleophosmin (nükrinolar fosfoprotein B23, numatrin) 33 kDa 0 0 52% 97% 0
ribozomal protein S19 16 kDa için 0 0 0 99% 0
glisalaldehit-3-fosfat dehidrojenaz 36 kDa 0 0 100% 0 0
histon küme 1, H2bg 14 kDa için 0 0 53% 72% 0
ribozomal protein S23 16 kDa için 0 0 68% 0 0
Rho guanin nükotid değişim faktörü (GEF) 1 104 kDa 0 0 0 94% 0
Ölüm ilişkili protein 3 46 kDa 0 0 87% 87% 0
mitokondriyal ribozomal protein S6 14 kDa için 0 0 52% 84% 0
ribozomal protein L39 6 kDa 0 0 0 87% 0
mitokondriyal ribozomal protein S28 21 kDa için 0 0 85% 99% 0
histon küme 1, H4h 11 kDa için 0 0 0 93% 0
mitokondriyal ribozomal protein L43 23 kDa için 0 0 0 97% 0
ribozomal protein S15 17 kDa 0 0 0 85% 0
ribozomal protein S12 15 kDa için 0 0 68% 39% 0
ribozomal protein L35a 13 kDa için 0 0 0 96% 0
mitokondriyal ribozomal protein L38 45 kDa 0 0 42% 98% 0
mitokondriyal ribozomal protein S14 15 kDa için 0 0 45% 76% 0
fosfodiesteraz 5A, cGMP 'ye özel 95 kDa 14 0 0 72% 0
ribozomal protein L15 24 kDa 0 0 0 56% 0
heterojen nükleer Ribonükleoprotein C (C1/C2) 22 kDa için 0 0 0 100% 0
mitokondriyal ribozomal protein S16 11 kDa için 0 0 0 92% 0
ribozomal protein S15a 15 kDa için 0 0 0 91% 0
neurexin 2 185 kDa 0 50% 0 0 0
Otizm duyarlılık adayı 2 139 kDa 0 0 46% 0 0
mitokondriyal ribozomal protein L17 20 kDa için 0 0 0 92% 0
yapıştırma faktörü 3A, altbirim 1, 120kda 89 kDa 0 0 56% 89% 0
La ribonukleoprotein Domain ailesi, üye 1 116 kDa 0 0 65% 66% 0
leprecan-2 gibi 62 kDa 0 0 0 68% 0
ribozomal protein L18a 21 kDa için 0 0 0 86% 0
ribozomal protein L23 15 kDa için 0 0 60% 47% 0
transmembran emp24 protein taşıma alanı içeren 9 27 kDa 0 0 0 78% 0
sinyal tanıma parçacık 72kDa 75 kDa 0 0 0 100% 0
lectin, galaktoside-bağlayıcı, çözünür, 3 26 kDa 0 71% 28 0 0
mitokondriyal ribozomal protein L1 37 kDa 0 0 0 69% 0
H1 histon ailesi, üye X 22 kDa için 0 0 0 96% 0
kasein kinaz 2, Beta polipeptide 25 kDa hakkında 0 0 0 89% 0
çözünen taşıyıcı aile 4, sodyum bikarbonat cotransporter, üye 7 118 kDa 82% 0 0 0 0
WD tekrar etki alanı 13 54 kDa 0 81% 0 0 0
Transkripsiyon uzaması faktörü A (SII), 3 17 kDa 0 0 0 38% 0
ribozomal protein S16 16 kDa için 0 0 75% 0 0
SP140 nükleer vücut proteini 92 kDa 0 0 0 64% 0
otoferlin 227 kDa 62% 0 0 0 0
Golgi taşıma 1B 15 kDa için 0 0 0 33% 0
mitokondriyal ribozomal protein S34 26 kDa 0 0 0 33% 0
ribozomal protein L30 13 kDa için 0 0 0 49% 0
aktin bağlayıcı LIM protein 1 96 kDa 0 0 0 43% 0
Guanin nüktrinotid bağlayıcı protein gibi 2 (nüktrinolar) 84 kDa 40% 0 0 0 0
yüksek yoğunluklu lipoprotein bağlayıcı protein 141 kDa 0 0 34% 0 0
adenozin deaminaz, RNA 'ya özgü, B2 81 kDa 0 0 28 0 0
sistatin E/M 17 kDa 0 27 0 0 0
Çinko parmak protein 786 80 kDa 0 0 23 0 0
pleckstrin Homoloji benzeri etki alanı, Aile B, üye 1 145 kDa 0 0 0 95% 0
protein fosfataz methylesterase 1 44 kDa 0 0 94% 0 0
Janus kinaz ve Mikrotubul etkileşim protein 2 95 kDa 0 0 0 94% 0
sinyal tanıma parçacık 68kDa 67 kDa 0 0 0 93% 0
TBC1 etki alanı ailesi, üye 24 63 kDa 0 0 0 89% 0
mitokondriyal ribozomal protein L27 16 kDa için 0 0 0 89% 0
mitokondriyal ribozomal protein L2 24 kDa 0 0 0 88% 0
mitokondriyal ribozomal protein S2 33 kDa 0 0 0 87% 0
Pentatricopeptid tekrar etki alanı 3 79 kDa 0 0 0 84% 0
ribozomal protein, büyük, P2 12 kDa için 0 0 0 76% 0
IMP (inosine 5 '-monophosphate) dehidrojenaz 2 56 kDa 0 0 76% 0 0
tubulin, Beta 4B sınıfı IVB 50 kDa 0 0 76% 0 0
mitokondriyal ribozomal protein L23 19 kDa 0 0 0 74% 0
mitokondriyal ribozomal protein S31 45 kDa 0 0 0 74% 0
galaktoz-3-O-sulfotransferase 1 49 kDa 74% 0 0 0 0
renklilik 4-20 homolog 1 (Drosophila) bastırıcı 99 kDa 0 72% 0 0 0
mitokondriyal ribozomal protein S25 20 kDa için 0 0 0 70% 0
1 içeren ribozomal L1 etki alanı 55 kDa 0 0 0 70% 0
dizi benzerlik 110 ile Aile, üye D 29 kDa için 69% 0 0 0 0
ribozomal protein L36a-like 12 kDa için 0 0 0 66% 0
serebellin 4 öncüsü 22 kDa için 0 0 0 64% 0
N-asetilglukozamin-1-fosfat transferaz, Alfa ve beta alt paketleri 144 kDa 64% 0 0 0 0
RAD51 homolog B (S. cerevisiae) 38 kDa 0 0 0 64% 0
Transkripsiyon uzaması regülatörü 1 124 kDa 63% 0 0 0 0
Homeobox a1 15 kDa için 0 0 0 62% 0
fosfolipid transfer proteini 49 kDa 0 0 0 62% 0
Rho GTPase aktive protein 33 137 kDa 0 0 54% 0 0
mitokondriyal ribozomal protein S18B 29 kDa için 0 0 0 52% 0
endoplazmik retikulum aminopeptidaz 2 106 kDa 51% 0 0 0 0
Üçlü motif 28 içeren 89 kDa 0 50% 0 0 0
olgunlaşmamış kolon kanseri transkript 1 24 kDa 0 0 0 50% 0
Zengin interaktif Domain 1A (SWı benzeri) 242 kDa 0 0 49% 0 0
mitokondriyal ribozomal protein S17 15 kDa için 0 0 0 48% 0
Pinin, desmosome ilişkili protein 82 kDa 0 0 0 48% 0
protein fosfataz, Mg2 +/Mn2 + bağımlı, 1G 59 kDa 0 0 0 45% 0
G yama etki alanı ve ankirin tekrarlar 1 39 kDa 45% 0 0 0 0
mitokondriyal ribozomal protein L3 39 kDa 0 0 0 44% 0
benzimidazoller tarafından Unin, tomurcuklanan 3 homolog (Maya) 37 kDa 0 44% 0 0 0
WD ve tetratricopeptid tekrarlar 1 76 kDa 0 0 0 44% 0
protein disülfit izomeraz aile A, üye 2 58 kDa 0 0 0 42% 0
Kazrin, periplakin etkileşim proteini 86 kDa 0 41% 0 0 0
Helezon-Coil-Helix-spiral-Coil-Helix etki alanı içeren 2 16 kDa için 0 0 40% 0 0
Isı şok protein 90kDa Alfa (sitosolik), sınıf üyesi 1 85 kDa 0 0 40% 0 0
Retinitis Pigmentosa GTPase regülatörü 83 kDa 0 0 40% 0 0
CTD (karboxy-Terminal Domain, RNA polimeraz II, polipeptid A)
fosfataz, alt birim 1
104 kDa 0 39% 0 0 0
mitokondriyal ribozomal protein L37 48 kDa 0 0 0 39% 0
C2CD2-like 76 kDa 0 38% 0 0 0
DnaJ (Hsp40) homolog, alt aile C, üye 6 106 kDa 0 0 38% 0 0
mitokondriyal ribozomal protein L51 15 kDa için 0 0 0 38% 0
bystin-gibi 50 kDa 0 0 0 38% 0
huntingtin-ilişkili protein 1 76 kDa 0 0 0 37% 0
Çinko parmak protein 263 77 kDa 0 36% 0 0 0
hücre bölme döngüsü ve Apoptozis regülatörü 1 133 kDa 0 0 34% 0 0
protein Tirozin fosfataz, reseptör olmayan tip 13
(APO-1/CD95 (Fas)-ilişkili fosfataz)
256 kDa 0 0 34% 0 0
KRAB-A etki alanı içeren 2 56 kDa 0 0 0 31 0
sinyal coıntegrator 1 karmaşık altbirim 2 aktive 28 kDa 0 0 0 31 0
centrosomal protein 76kDa 74 kDa 0 30 0 0 0
polimeraz (RNA) III (DNA yönlendirilmiş) polipeptid C (62kD) 61 kDa 0 0 0 30 0
5-hidroxytryptamine (serotonin) reseptör 6 47 kDa 0 0 0 29 0
T hücre reseptörü Alfa katılma 56 2 kDa için 0 26 0 0 0
Hücre bölünme 1 gibi kromozomların biorientation 330 kDa 0 0 0 25 0
RAS Birliği ve DIL etki alanları 114 kDa 0 0 25 0 0
WD tekrar etki alanı 66 130 kDa 0 0 0 24 0
Kromozom 6 açık okuma çerçevesi 25 13 kDa için 0 0 22 0 0
transmembran protein 177 34 kDa 0 0 0 21 0
Neural habercisi hücre ifade, gelişimsel aşağı-4 benzeri düzenlenmiş 101 kDa 0 20 0 0 0

Tablo 2: HIV-1 üretimi sırasında nükrenolar-lokalileştirme Rev mutasyonları 4, 5 ve 6 ile kompleks hücresel konak faktörlerinin tanımlanması. Şekil 6 ' da Coomassie-LEKELENMIŞ SDS-sayfa jel tandem kütle spektrometresi için işlenmiş. WT Rev 'in, M4, M5 ve M6 nüklemlerine karşı protein etkileşimi sonuçları protein tanımlama olasılığı (yüzdeler) ile özetlenmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HıV-1 varlığında Rev-NoLS mutasyonları ve WT Rev karşılaştırması kitle spektrometrik analizleri viral çoğaltma döngüsünde yer alan nüklesolar faktörleri anlamak için değerlendirildi. Bu viral infeksiyonun için gerekli nükviolar bileşenlerini belirleyecekti. Nüknikolar B23, Rev-NoLS ' a yüksek benzeşme ve devir3 ' ün nüklevin lokalizasyonunda ve Rev-Bound HIV mrnas22' nin nüklusitoplazmik taşınması işlevlerine sahiptir. Tek veya birden fazla arginin değiştirmeleri içeren Rev-NoLS mutasyonları ile B23 yakınlık, viral üretim sırasında Rev-3' Flag immünoprecipitation ile değerlendirildi (Şekil 2; WT ve mutasyonlar m2, M6 ve M9). B23 tek noktalı Rev-NoLS mutasyonları M4, M5 ve M6 için benzeşimi daha önce HıV-1 çoğaltma varlığı incelenmiştir. Önceki çalışmada, IP, M4, M5 ve M6, Rev ve B23 benzeşimi1için α-bayrağı spesifik bir antikor ile Batı İmmünoblotting maruz kalmıştır. Rev tek noktalı mutations arka planında, B23 bağlama benzeşimi önemli ölçüde azaltıldı. B23 HıV çoğaltma sırasında WT Rev ile yakınlık korunur. Rev-NoLS içinde indüklenen tek nokta mutasyonlar HıV mRNA bağlama ve taşıma kolaylaştırarak diğer hücresel ana faktörler bağlama benzeşimi azaltmak için bekleniyor. Bu modelde Rev-NoLS tek ve birden fazla nokta mutasyonları, nüklositoplazmik mekik ve HıV mRNA taşımacılığında bir bozulma gösteren, B23 benzeşimini Rev 'e kaldırıldı. Büyük olasılıkla nükjolar faktörleri (nükcolin C23 ve nükcosome montaj proteini 1), taşıma faktörleri (ARHGEF1 ve TCB1D24), ve birleştirme faktörleri (hnRNPC ve PNN) HıV-1 bulaşıcı döngüsünde Rev protein kompleksleri ile etkileşim yoluyla yer almaktadır. Tablo 1 ve Tablo 2 ortaya çeşitli diğer hücresel faktörler, hem nükle ve nonnükseolar desen, bu potansiyel olarak dahil HIV-1 çoğaltma döngüsü Rev ile. Nükle faktörü-snoRNA C/D kutusu 58, snoRNA 'da bulaşmış işleme, nükribozomal RNA 'nın 2 '-O-metilasyonu ve steroid-1 çoğaltma döngüsünde bu proteinin işlevi bilinmemektedir. HıV-1 enfeksiyonlu döngüsünde bu hücresel faktörlerin belirli rolleri Şu anda incelenmektedir.

Burada sunulan sonuçlar, HıV-1 enfeksiyonlu döngüsünü korumak için viral/konak nüksolar faktörlerinin tanımlanması için bu yaklaşımın kullanımını göstermektedir. Diğer hastalık modellerine katılan viral/ev sahibi nüklikolar faktörleri bu yaklaşım kullanılarak tespit edilebilir. Bir nükperolar faktörünün çeşitli hastalık modellerinde çok fonksiyonlu roller içerme olasılığı daha yüksektir. Örneğin, B23 nükl viral proteinler, viral montaj, encapsidation, çoğaltma ve diğer viral enfeksiyöz modellerde gecikme taşımacılığında karışmıştır. B23 nükxositoplazmik taşıma için hücresel faktörlerin NoLS ile etkileşimleri karakterize-P120 büyüme faktörü (amino asitler 40-57)23 ve C23 pre-rRNA işlemci (amino asitler 540 – 628)24. B23 aynı zamanda insan T-hücreli lenffotropik virüs (HTLV-1) protein Rex (amino asitler 1-22)25, HİV-1 tat (amino asitler 49 – 57)2ve hiv-1 Rev (amino asitler 37-47)26ile etkileşim için belgelenmiştir. Japon ensefalit virüsü (JEV) genomu, JEV enfeksiyonu sırasında B23 N-terminal bölgesi ile etkileşen amino asitler Gly42 ve Pro43 ile nükle lokalize çekirdek proteini kodlar, viral çekirdek protein/B23 taşınması ile sonuçlanan çekirdeği27. Hepatit B virüsünün (HBV) tek telli RNA genomu, kısmen çift telli DNA 'dan oluşur ve bu da nükle çekirdeğin proteini kodlıyor. Nükroolus28' de nüktrinolin ve B23 ile HBV çekirdek proteini ilişkilendirir; B23, çekirdek protein N-terminal etki alanı ile etkileşim yoluyla HBV montajında gösterilmiştir. Özellikle, B23 amino 259-294 asitler HBV çekirdek proteininin N-terminal etki alanına bağlamak viral encapsidation izin29. Negatif anlamda, tek telli RNA Hepatit D virüsü (HDV) iki isoform içinde HDVAg antijeni ifade eder; RNA çoğaltmasında küçük izoformu yardımcıları ve büyük izoformu viral montaj kolaylaştırır. RNA çoğaltması nüklenolus içinde gerçekleşir ve hdvag30,31ile B23 etkileşimi gerektirir. HDV enfeksiyonu, büyük hdvag izoformu ile çoğunlukla küçük hdvag izoformu ve daha az etkileşim B23 bir upregülasyonu neden olur. Etkileşimler, hangi B23 bağlar ve nükleer birikimi elde küçük HDVAg NLS etki alanı aracılığıyla gerçekleşir. HDV bağlayıcı site B23 için silindikten sonra, RNA çoğaltma bozulmuş. HDVAg, nükle ile B23 ve nüklenolin ile colocalize edildi. Nükreolin bir baskıcı32olarak transkripsiyon özelliklerine sahip olduğu tespit edildi, HDV çoğaltma düzenlenmesi için bir bölme olarak nükreolus açığa. B23 de Kaposi sarkomu ilişkili herpesvirüs (KSHV) genomu gecikme yer almaktadır. KSHV gizli protein-v-cyclin-ev sahibi CDK6 kinaz ile, fosforlar B23 Thr199, gecikme ile ilişkili nükleer antijen33ile B23 etkileşimi kolaylaştırıyor. Gecikme ilişkili nükleer antijen viral litik çoğaltma önlemek için davranır. B23 tükenmesi KSHV yeniden aktivasyonuna yol açar, KSHV gecikme bir düzenleyici olarak B23 açığa. HıV-1 çoğaltma döngüsünde B23 fonksiyonu tat ve Rev nüksokositasmik taşıma aktivitesi ile karakterize, ve B23 HıV enfeksiyonu sırasında gecikme neden olabilir bilinmiyor. B23's bir çoğaltma, encapsidation ve derleme HıV-1 katılımı Şu anda bilinmiyor.

Bu yöntemin diğer hastalık modellerine adaptasyonu, uygun hücre hatlarında ifade edilen protein eksikliği olan bulaşıcı kemiklerin üretilmesi için çok çaba ve zaman gerektirir. Bu Rev eksikliği HıV-1HXB2 omurgası avantajı tam viral omurgası, viral bulaşıcı faktörler ve ev sahıbı faktörler HIV-1 çoğaltma döngüsü içinde varlığında Rev-nols mutasyonları incelemek için yeteneğidir. Diğer çalışmalar tam HıV-1 bulaşıcı sistem yokluğunda Rev nükle fonksiyonunun incelenmiştir. Bulaşıcı ve hastalık yollarının kapsamlı karakterizasyonu, hastalığın ilerlemesinin doğal seyrini destekleyen temsili ortamlar içermelidir. İki farklı analiz türü yapılmıştır ve nüklemolar faktörleri tespit etme yeteneğinde karşılaştırılmıştır. Tablo 1 , proteinin doğrudan Kütle Spektrometrisi ANALIZININ sonucunda WT Rev 'e bağlı kalan faktörleri listeler. Bu analiz HıV-1 Rev birkaç bilinen faktörleri vermiştir. bu doğrudan yöntem, bu tür proteinlerin SDS-PAGE jeller ve Kütle Spektrometrisi Analizi içinde ayrılmış protein ekstraksiyonu içeren başka bir işlem ile karşılaştırıldı. Bu ikinci yöntem, Rev protein kompleksine bağlı ancak daha önce Tablo 1' de tanımlanan aşağıdaki proteinlerin yoksun olduğu bilinen ve olası faktörlerin çeşitli vermiştir: sinyal tanıma parçacık 14 kDa, ökaryotik çeviri başlatma faktör 4B, ribozomal protein L22, küçük nükseolar RNA C/D kutu 58B, ve çinko parmak CCHC etki alanı içeren 11. Sonuçta, bu protokolde kütle spektrometresi analizleri için seçilen üstün Yöntem SDS-PAGE jeller peptidler ekstraksiyon dahil. İlk doğrudan yöntem bromophenol mavi olmadan yıkantıdaki 2x örnek tampon dahil; 2x numune tamponunun kalan bileşenleri tam tripsin tedavisine müdahale edebilir ve kütle spektrometresi analizi için tamamen işlenmiş peptidler verebilir. İkinci dolaylı Yöntem, Trypsin tedavi edilen peptidler SDS-PAGE ' i olası kirleticileri arındırabiliyordu.

Burada açıklanan kütle spektrometresi hazırlama yöntemleri, Rev 'i hedefleme yoluyla HıV-1 enfeksiyonu ortadan kaldırmak için terapötik müdahalelerin tanımlanması için kullanılabilir. tüm silme ve tek noktalı Rev-NoLS mutasyonları için incelenebilir baskın-negatif aktivite ve Rev fonksiyonunun tutuklanması kullanılır. Rev fonksiyonel tutuklama için faiz dominant olumsuz özellikleri şunlardır: Rev/RRE bağlama benzeşimi; Devir mutantları ile multimerizasyon yoluyla nükselolar WT Rev yeniden konumlandırılması; HıV-1 mRNA taşıma ve yapıştırma dahil anahtar hücresel faktörlere yakınlık kaybı. WT Rev ile Rev-nols mutasyonlarının ekspresyonları içeren Rev multimerizasyon incelenebilir. Bu modelde dominant negatif mutasyonlar WT Rev ile multimerize ve çekirdek ve sitoplazmaya doğru nükleolar kalıpları kayması bekleniyor, bir Rev fonksiyonel tutuklama yol. Kütle spektrometresi, HıV-1 mRNA birleştirme ve taşımacılığında yer alan anahtar hücresel faktörlerin kaybını belirlemek için kullanılabilir. Baskın negatif Rev-NoLS mutasyonları ile koifade sonucunda WT Rev ile eksik etkileşimlerin tanımlanması, HıV-1 patogenezinde nüklümi spesifik yolların tutulumu ortaya koyacaktır. Alternatif olarak, tüm paketlenmiş hücresel faktörler için Rev-NoLS mutasyonlarının arka planında oluşturulan viral HıV-1NL4-3 parçacıklar araştırılabilir. Viral parçacıklar içinde paketlenmiş hücresel ve viral faktörler daha fazla kitle spektrometresi ile tanımlanabilir. Bu viral parçacıklar içinde nükle faktörlerin varlığını ve viral enfeksiyonda tanımlanan nükle faktörlerin rolünü ortaya koyacaktır. Açıklanan yöntemler, az çalışılan yolların tanımlanması ve karakterize edilmesi için diğer viral ve hastalık modelleri için geçerlidir. Bu, sınırlı tedavilerin mevcut olduğu hastalıklara karşı terapötik müdahalelerin gelişmesine izin verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Yazarlar Dr. Barbara K. Felber ve Dr George N. Pavlakis HLfB bağlılık kültürü Ulusal Sağlık Enstitüleri (NıH) AıDS araştırma ve referans reaktif programı, Bölüm AıDS, Ulusal alerji ve bulaşıcı Enstitüsü tarafından sağlanan kabul Hastalıklar (NıAıD), NıH. Yazarlar ayrıca NıH, hibe AI042552 ve AI029329 tarafından sağlanan finansal kaynakları kabul.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Fisher Chemical A38S-212
Acetonitrile Fisher Chemical A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide BioRad 1610158
Ammonium bicarbonate Fisher Chemical A643-500
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel Sigma-Aldrich A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG Sigma-Aldrich F3165
BioMax MS film Carestream 8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL Bio-Rad 5000006
B23 mouse monoclonal IgG Santa Cruz Biotechnologies sc-47725
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carnation non-fat powdered milk Nestle N/A
Cell scraper ThermoFisher Scientific 179693PK
C18IonKey nanoTile column Waters 186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes Fisher Scientific 08-772-22
Dithiothreitol Thermo Scientific J1539714
1 x DPBS Corning 21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate Pierce 32106
Ethanol, 200 proof Fisher Chemical A409-4
FBS Gibco 16000044
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GelCode blue stain reagent ThermoFisher 24590
Glycerol Fisher Chemical 56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnologies sc-2005
Iodoacetamide ACROS Organics 122270050
KimWipe delicate task wiper Kimberly Clark Professional 34120
L-glutamine Gibco 25030081
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
NanoAcuity UPLC Waters N/A
Pierce Silver Stain Kit Thermo Scientific 24600df
15-mL Polypropylene conical tube Falcon 352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo Scientific 26616
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001
Purified BSA New England Biolabs B9001
PVDF  Western blotting membrane Roche 3010040001
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
10 x TBS Fisher Bioreagents BP2471500
TEMED BioRad 1610880edu
Triton X-100 detergent solution BioRad 1610407
Trizaic source Waters N/A
trypsin-EDTA Corning 25-051-CIS
Tween 20 BioRad 1706531
Synapt G2 mass spectrometer Waters N/A
Whatman filter paper Tisch Scientific 10427813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. (2018).
  2. Li, Y. P. Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat. Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).
  3. Szebeni, A., et al. Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin. Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).
  4. Truant, R., Cullen, B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).
  5. Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Genetics. 173, 1835-1850 (2006).
  6. Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. BioEssays. 29, 49-59 (2007).
  7. Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).
  8. Szebeni, A., Olson, M. O. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Science. 8, 905-912 (1999).
  9. Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).
  10. Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 56, 379-390 (1989).
  11. Yun, J. P., et al. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).
  12. Savkur, R. S., Olson, M. O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).
  13. Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).
  14. Grisendi, S., et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437, 147-153 (2005).
  15. Itahana, K., et al. Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).
  16. Ye, K. Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).
  17. Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor. Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).
  18. Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3. Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).
  19. Horn, H. F., Vousden, K. H. Cancer: guarding the guardian. Nature. 427, 110-111 (2004).
  20. Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).
  21. Dingwall, C., et al. Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).
  22. Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element. Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).
  23. Valdez, B. C., et al. Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23. Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).
  24. Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).
  25. Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).
  26. Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals. Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).
  27. Tsuda, Y., et al. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).
  28. Ning, B., Shih, C. Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein. Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).
  29. Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1. Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).
  30. Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication. Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).
  31. Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies. Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).
  32. Yang, T. H., et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).
  33. Sarek, G., et al. Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency. PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics