自动 3D 光学相干断层扫描,以在大型空间尺度上阐明生物膜变形

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Summary

微生物生物膜在相间形成复杂的结构,并发展成高度依赖于尺度的空间模式。在这里,我们介绍了一个实验系统(硬和软件),用于自动采集3D光学相干断层扫描(OCT)数据集。此工具集允许在空间和时间中对生物膜形态发生进行非侵入性和多尺度表征。

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Depetris, A., Wiedmer, A., Wagner, M., Schäfer, S., Battin, T. J., Peter, H. Automated 3D Optical Coherence Tomography to Elucidate Biofilm Morphogenesis Over Large Spatial Scales. J. Vis. Exp. (150), e59356, doi:10.3791/59356 (2019).

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Abstract

生物膜是一种最成功的微生物生活方式,在众多环境和工程环境中盛行。理解生物膜形态,即社区组装期间生物膜的结构多样化,是空间和时间尺度上的一个显著挑战。在这里,我们提出了一个基于光学相干断层扫描(OCT)的自动化生物膜成像系统。OCT是生物膜研究中新兴的成像技术。然而,目前可以获取和处理的数据量妨碍了生物膜形态中大规模模式的统计推论。自动化的OCT成像系统可以覆盖生物膜生长的大空间和扩展时间尺度。它将市售的OCT系统与机器人定位平台和一套软件解决方案相结合,用于控制OCT扫描探头的定位,以及3D生物膜成像数据集的采集和处理。此设置允许对生物膜开发进行原位和非侵入性的自动监测,并可能进一步开发,将 OCT 成像与宏观摄影和微传感器分析结合。

Introduction

生物膜是一种非常成功的微生物生活方式适应,这些相间相关和基质封闭的微生物群落在自然和工业环境中主导微生物生命1、2。在那里,生物膜形成复杂的结构,如长流器3,波纹4或蘑菇状帽5,对生物膜生长、结构稳定性和抗应力性有重要影响。虽然从微型流动室中生长的单一物种培养物的工作中学到了很多关于生物膜结构分化的知识,但大多数生物膜都是高度复杂的群落,通常包括生命所有领域的成员。因此,将这些复杂的生物膜理解为微生物景观7,并了解生物膜结构和功能在复杂社区中如何相互作用,是生物膜研究的前沿。

要根据环境线索对复杂生物膜的形态形成进行机械性理解,就必须结合空间和时间解决的对相关生物膜物理结构的观测进行精心设计的实验比例8.然而,对实验系统中生物膜生长的非破坏性观察受到后勤限制的严重限制,例如需要将样品(例如,转移到显微镜上)经常破坏脆弱的生物膜结构。

此处提出的协议引入了基于光学相干断层扫描 (OCT) 的全自动系统,允许在中尺度(mm 范围)对生物膜形态发生进行原位、非侵入性监测。OCT是生物膜研究的新兴成像技术,在水处理和生物污染研究、医学9和河流生态学10中的应用。在OCT中,低相干光源被分割成样品和参考臂;分析了生物膜(样品臂)和参考臂光反射和散射的光的干扰。获取一系列轴向强度轮廓(A 扫描),其中包含深度解析的结构信息,并合并到 B 扫描(横截面)。一系列相邻的B扫描组成最后的3D卷扫描10。OCT提供约10μm范围内的横向光学分辨率,因此非常适合研究生物膜10、12的中观结构分化。有关OCT的更详细描述,请参阅德雷克斯勒和藤本13和费彻及其同事14。尽管单个 OCT xy 扫描的视场面积达数百平方千米,但大型模式无法通过单次扫描的 OCT 进行量化。关于溪流和河流等自然生境的生物膜,这限制了我们评估生物膜形态形成的能力,其规模与生境的物理和水力模板相匹配。

为了超越这些空间极限并自动获取OCT扫描,在3轴定位系统上安装了光谱域OCT成像探头。该安装允许以重叠的马赛克图案(切片扫描)获取多个 OCT 扫描,从而有效地实现高达 100 cm2的表面区域的断层成像。此外,该系统的高定位精度能够在长期实验中可靠地监测特定部位的生物膜特征的生长和发育。该系统为模块化,安装的各个组件(即定位装置和OCT)可用作独立解决方案或灵活组合。图 1概述了安装的硬组件和软件组件。

该系统使用市售GRBL控制的CNC定位装置(材料表)进行测试。该特定定位平台的工作距离为 600*840*140 mm,制造商指示的精度为 +/- 0.05 mm,可编程分辨率为 0.005 mm。 GRBL 是开源(GPLv3 许可证),用于 CNC 的高性能运动控制设备。因此,每个基于 GRBL 的定位设备(版本 > 1.1)都应与此处提供的指南和软件包兼容。此外,该软件可以适应其他步进电机控制器STEP-DIR输入类型,很少修改。

用于评估系统性能的 OCT 设备(材料表)具有低相干性光源,中心波长为 930 nm(带宽 = 160 nm),可调节参考臂长度和强度。在此处介绍的示例中,还使用了用于将 OCT 探头浸入流水中的浸入式适配器(材料表)。此处为自动 OCT 扫描采集开发的软件包主要取决于与特定 OCT 系统一起提供的 SDK,但是,来自不同扫描镜头和中央波长的同一制造商的 OCT 系统应易于兼容。

GRBL 设备由安装在单板计算机上的 Web 服务器控制(图 1)。这授予从任何具有本地网络或 Internet 访问权限的计算机对设备的远程控制。OCT 设备由单独的计算机控制,允许 OCT 系统在自动实验设置之外运行。最后,软件包包括用于同步 OCT 探头定位和 OCT 扫描采集的库(即,以镶嵌模式或一组定义位置自动获取 3D 成像数据集)。在 3D 中有效地定义 OCT 探头的位置,可以针对(区域)扫描集调整焦平面。具体而言,在不平坦的表面上,可以为每个 OCT 扫描指定不同的焦平面(即 z 方向的不同位置)。

开发了一组软件包来处理原始的OCT扫描(表1)。定位设备的导航、OCT 扫描采集和数据集处理均使用 Python 编码的 Jupyter 笔记本电脑执行,从而在软件开发和优化方面具有显著的灵活性。此类笔记本的两个工作示例和批注示例(分别用于图像采集和处理)可从https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git 它们旨在作为自定义的起点方法。Jupyter 笔记本是基于 Web 浏览器的应用程序,其中包含带有带条形码的 Python 代码的单元格。每个步骤都包含在笔记本的单元格中,可以单独执行。由于穿过扫描透镜的光路长度不同(球面像差)15,原始OCT扫描出现失真(图2A)。我们开发了一种算法来自动纠正在获取的OCT扫描(包含在图像处理.ipynb,补充文件1)中的这种失真。此外,生物膜形态可以可视化为二维高程图,如之前在膜系统16中使用的,我们说明了如何缝合从切片阵列中采集的扫描获得的高程图。

最后,通过烟流实验说明了所述实验室装置的功能,其中光营养流生物膜暴露于流速梯度。

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Protocol

1. 定位设备的设置

  1. 按照https://github.com/grbl/grbl/wiki/Connecting-Grbl中的说明,将定位装置连接到微控制器板。
  2. 通过 USB 电缆将微控制器连接到具有互联网连接的单板计算机,并安装 HTTPS://GITLAB.COM/FLUMEAUTOMATION/GRBL_SERVER.GIT 中所述的 GRBL 服务器。现在,定位设备应从http://IP:5020/托管的网页进行导航。或者,可以使用 Python 脚本导航定位设备,如工作示例Images 收购.ipynb(补充文件 2)的第一部分所示。

2. OCT 设置

  1. 使用兼容的鸽子尾架将 OCT 探头安装到定位装置上。如果需要,请在物镜上安装浸入式适配器。
  2. 将计算机和 OCT 基单元放置在实验旁边的工作台上(例如,微流体设备、流动室、烟道、过滤系统)。确保光缆(最大长度约 1.8 m)自由移动,足够长的时间到达所有预定位置,且不干扰实验设置。
  3. 按照制造商的描述,将 OCT 系统与可用软件一起安装。
  4. 安装软件包,以便自动获取 OCT 扫描,如https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git所述。

3. 图像采集

  1. 打开 OCT 系统和定位装置的电源。确保设备可以自由移动。
  2. 在文本编辑器中打开文件配置.json。编辑config.json文件以调整默认图像采集参数(表 2),例如折射率(20°C 时水为 1.33,空气为 1.00),以及获取数据和元数据的目标文件夹。
  3. 定义视图字段 (FOV) 的大小和配置.json中每个 B 扫描的 A 扫描数。
    注: 这两个参数确定最终数据集的体素大小和输出文件的大小,并且应与探头的光学分辨率匹配(x-y 体素大小不应小于光学分辨率的一半)。A 扫描和 B 扫描的数量会影响要覆盖的空间范围,这些空间范围与可用磁盘空间和处理能力进行权衡。
  4. 配置.json中定义输出 OCT 扫描的信号边界。这取决于样本的类型。因此,建议根据一组初步扫描的强度直方图确定这些参数。在配置.json中保存更改。
  5. 将 OCT 探测器导航到感兴趣的站点。聚焦样品并调整参考臂和光源强度,以实现最佳图像质量。对多个位置重复此过程并记下坐标。
    注: 这将允许在这些参考点周围进行后续的 OCT 扫描采集。请注意,在自动图像采集期间,无法更改参考臂的长度和强度。
  6. 在 Juypter 笔记本中打开Image 获取.ipynb文件 (补充文件 2).每个单元格包含执行特定任务的代码,可通过按单元格 |运行Ctrl = 输入移位 + 输入
    1. 将路径设置为所需的库和默认配置参数。或者,定义一组新的临时参数。
    2. 连接到定位设备并初始化 OCT。
    3. 校准定位装置(执行"定位")。
    4. 获取涵盖单扫描或镶嵌模式中兴趣位置的数据集,指定数量和重叠(例如,30%)相邻磁贴。
      注: 内存在扫描之前分配,从而优化计算机资源使用。数据以 8 位 =.raw格式保存,以节省存储空间,使用时间戳和位置作为命名约定(即 %Y%%d_%%%%%%%%%%%%S_lt;位置>;)中定义的目标文件夹。元数据(包括 OCT 设置和坐标)将保存在具有相同命名约定的 @.srm文件中的同一文件夹中。根据 FOV 和分辨率等设置,文件大小可能达到每个 OCT 扫描的 1.5 GB。
  7. 为了避免数据采集流产,请确保有足够的可用磁盘空间或连续将 OCT 数据集移动到外部硬盘驱动器。

4. 图像校正和显示

  1. 打开 Jupyter 笔记本图像处理.ipynb补充文件 1) 的 OCT 图像处理工作示例(失真校正、背景减法、高程贴图计算、高程贴图拼接)。
  2. 如果需要,裁剪 OCT 扫描以排除杂散信号并重新定向数据集(生物膜应显示在底层上方)。
  3. 正确进行球面畸变。这是通过一种校正算法实现的,该算法利用已知为平坦的高反射参考表面(例如,烟道底部、底层)。首先,该算法定义一个20×20垂直线的网格,该网格在OCT扫描的xy平面上定期间隔。然后,它选择每个点周围的圆形区域,并沿垂直轮廓平均信号强度(图 2B)。垂直轮廓使用修改后的高斯滤波器进行处理:
    Equation 1
    其中x是输入信号,并且 = 其标准差,而 C 被确定为:例如:
    Equation 2
    参考曲面在每个配置文件中本地化为局部最大值。根据相邻点在三维中的位置进行筛选,但误分点(图 2C)。最后,在这些点上安装一个反映扫描透镜变形的二阶多项式表面(图2C)。然后,拟合曲面用于以 z 方向移动每个像素,从而获得拼合的图像。该算法的参数应根据OCT扫描的特点进行调整。
  4. 正确使用背景噪音。识别图像的空白区域(通常高于生物膜),并使用校正算法从图像的强度值中减去平均背景强度,以生成最终校正的 OCT 图像(图 2D)。
  5. 从 3D OCT 数据集计算高程贴图。在此步骤中,为特定实验(例如,底层)定义感兴趣的参考面和适当的阈值强度。然后,使用高程图计算算法计算二进制掩膜的每个坐标 (x,y) 的生物膜厚度,并将其分配给新的 2D 矩阵 (图 3A)。然后,将厚度值分配给 x 和 y 方向中原始图像大小的 2D 矩阵。渲染的图像,其中曲面的高程报告为灰度值 (图 3B)。
  6. 如果以镶嵌模式进行多个 OCT 扫描,请定义行数和列数,并拼接相应的高程贴图。图 5提供了拼接高程图的示例,涵盖了通过所述设置可实现的广泛空间比例和分辨率。

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Representative Results

我们使用烟流实验演示了自动OCT成像系统的功能,该实验旨在研究光营养流生物膜的时空形态发生。流流逐渐变窄的几何体沿流流中心在流速中诱导梯度(参见参考值17)。 对生物膜的时间发育和结构分化进行了18天的监测,目的是更好地了解水动力条件对生物膜形态形成的影响。图4显示了生物膜微创菌的生长情况,经过18天的生长。使用上述工具集(图4A)对生物膜的表面形态进行了量化。生物体积计算(见工作示例ImageProcessing.ipynb,补充文件1)的方形移动窗口,每个位置沿流速梯度3.6毫米边缘长度(图4B)(图4C)。生物膜积累随着流动速度的增加而显著减少(表示为与流流最宽部分的距离;图 4.重要的是,该实验设置允许沿大空间梯度连续测量结构参数(例如,生物体积、厚度、粗糙度)。因此,这个新工具提供了获得生物膜结构与环境线索之间关系的见解的方法。

软件组件 描述
stepcraft.py 用于控制定位设备的 Python 库。它包含用于导航和定位设备的定义。
Oct控制.cpp 从与 OCT 系统一起分发的软件开发工具包 (SDK) 派生的 C# 代码。这必须使用 VisualStudio 2017、PythonC/API 和 SDK 进行编译。
ImagesAcquisition.py 一个 Python 库,其中包含用于在选定位置进行 OCT 扫描和定义扫描切片模式的命令。
图像采集.ipynb 用于导航定位设备、获取 OCT 扫描和自动图像采集的 Jupyter 笔记本。
OctCorrection.py 一个 Python 库,用于校正原始 OCT 图像和背景减法。
OctProcessing.py 一个 Python 库,其中包含用于计算和拼接高程贴图的函数。
八进制处理.ipynb Jupyter 笔记本可可视化、校正和处理 OCT 扫描。这还包含生物体积计算的示例。

表1.软件组件。

参数 价值 描述
甘尼梅德 1, 2, 3 OCT 系统和版本的选择
探针 1, 2 扫描镜头的选择
nAscans 32-900 每次 B 扫描的 A 扫描数
nBscans 1-900 B 扫描数
nC坎斯坎 128-1024 深度像素数
0.1-10 X 方向(毫米)的图像大小
Y 0.1-10 y 方向的图像大小 (mm)
refr 1-1.6 折射率(1指空气,1.33为水)
avg_阿斯坎斯 3 平均 A 扫描数
扫描速度 1,2,3 A 扫描速率(5.5、15 和 36 kHz)
路径 "../ %Y-%-%-%d_%H_%M_%S" 获取的 OCT 扫描的目标文件夹,使用时间戳作为命名康量
颜色边界 [0.0-256.0,0.0-256.0] 采集扫描的颜色边界

表2.OCT 参数设置。

Figure 1
图 1.硬组件和软件组件概述。GRBL 控制的定位设备的步进电机连接到微控制器,通过 USB 连接到单板计算机。GRBL 服务器安装在后者上,定位装置的运动可以通过 TCP/IP 连接从任何 Web 浏览器进行控制。或者,可以使用GRBLServer.py库从Python编码的Jupyter笔记本(Images获取.ipynb,补充文件2)执行定位设备的导航。OCT 系统连接到单独的计算机,可通过 Python 脚本执行自动 OCT 扫描采集。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2.OCT 扫描校正工作流。面板 A 显示了在平坦的有机玻璃表面上生长的生物膜的未经加工的 B 扫描。图像失真(弯曲),因为通过镜头的低相干光的路径长度不同。通过识别图像中强烈反射的平面参考面,可以校正 OCT 图像失真。首先,20×20 个参考点均匀分布在整个图像堆栈中。在每个点中,图像信号在每个深度(z 平面)的圆形区域(以 x-y 方向)求平均值,从而获得信号强度的平均深度剖面。然后,对 400 个参考配置文件中的每个参考配置文件应用经过修改的高斯滤波器。面板 B 提供了原始信号示例,沿面板 A 中的垂直红线、平均深度轮廓以及应用修改后的高斯滤波器后的相同轮廓指示的深度轮廓。修改后的高斯滤波器允许在信号强度下识别局部最大值,从而识别强反射参考表面的位置。然后,根据三维中相邻要素的坐标选择正确标识的参考点。在面板 C 中的示例中,黄色点被保留以进行后续图像校正,而紫色点被丢弃。然后,第二阶多项式曲面适合正确放置的参考点,并通过在 z 方向移动像素来校正原始 OCT 图像中的失真。平均背景强度是从图像的空区域估计,并从校正的图像中减去。面板 D 在校正和背景减法后显示相同的 B 扫描。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3.高程贴图。生物膜拓扑可以可视化为二维高程图,其中生物量的厚度是彩色编码的。为此,3D OCT 图像被阈值,生物膜厚度计算为到基材的最上部信号的距离。面板 A 显示了阈值后获得的 B 扫描的二进制掩码。蓝线表示最上面的信号,而红线显示参考表面。面板 B 显示了根据 OCT 探头的轴向分辨率缩放获取的高程图的示例。红线表示 B 扫描在面板 A 中的位置。

Figure 4
图 4.具有代表性的结果,显示了流速对生物膜生长的影响。利用烟流实验,研究了光营养流生物膜沿流速梯度的形态发生。流速随着与烟道入口的距离而增加。经过10天的生长,生物膜形态的特点是以不同分辨率的自动OCT和覆盖不同的空间尺度。高程图(A、B和C)分别展示了在低、中、高流速下生长的生物膜的形态。这些高程图是根据 OCT 扫描计算的,体素大小为 x,y 方向为 4 μm。扫描表面面积为 3.6 mm 边缘长度的正方形。面板 D、E 和 F 显示高程图(分别为低、中和高流速),通过拼接 3⁄3 OCT 扫描获得,其体素大小为 xy 方向为 11 μm,扫描区域为 10 mm 2,相邻扫描之间的重叠为 30%。G面板显示了生物膜沿此烟流实验中实现的整个速度梯度生长的高程图。通过缝合3×51 OCT扫描,体素尺寸为40μm,扫描面积为10mm2,相邻扫描重叠30%。总扫描面积为24×353 mm。面板H在3.6mm边缘的方形移动窗口中报告生物体积。平均生物体积显著减少,因为与入口(I)的距离。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图 5.定位装置的精密测试。通过在定位装置上安装一个配备 35 mm 微距镜头的 2020 万像素摄像头来评估定位装置的精度,该摄像头聚焦在彩色标记上。定位装置以随机方向移动,远离标记,然后返回共 80 个循环。然后比较标记的位置。下图显示了相对于第一张图片的 x 和 y 方向的变化。请注意,在 y 方向上,最大偏移约为 16 μm,在 x 方向上更短。请点击此处查看此图的较大版本。

补充文件1。图像处理.ipynb. 请点击这里下载此文件。

补充文件2。图片采集.ipynb. 请点击这里下载此文件.

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Discussion

OCT 成像非常适合在微米范围内解决结构,FOV 为几平方毫米。因此,它是生物膜研究的有力工具10,18。然而,OCT目前被限制在100-256毫米2的最大扫描面积,而生物膜结构模式往往超过这个空间尺度19,特别是当形态分化是由大规模环境梯度驱动时20.该协议中描述的自动OCT成像系统将OCT特征的表面面积扩大到几平方厘米,从而有效地监测相关空间尺度范围内的生物膜形态分化(从几毫米到几厘米)。高定位精度(16μm以内;图 5)能够准确监测生物膜在较长时间内的结构发展(图4),有效地增加了获得生物膜形态分化驱动因素的机械性理解的机会.同时,这种原位生物膜表征技术是非侵入性的,最大限度地减少了对生物膜生长的干扰。此处提供的图像处理解决方案基于以前采用的生物膜 OCT 数据集16分析,但自动化为前所未有的时间和空间解析 OCT 数据集分析提供了工具。

如协议所述,该系统是使用特定的 OCT 设备构思和基准测试的。协议中的关键步骤主要涉及 OCT 分辨率和对焦的设置,这两者对高图像质量都至关重要。球面畸变例程校正的一个限制是,它取决于高反射平面的存在。或者,可以测量标准校正表面,然后用于校正 OCT 扫描。此外,OCT 扫描的拼接取决于足够的结构特征来对齐相邻的扫描。在生物膜分布均匀或生物膜覆盖率低的情况下,完全依靠定位装置的精度实现缝合。最后,与任何其他图像处理管道一样,在设置这些工具时,在处理成批图像之前,仔细评估处理算法在一组代表性扫描上的性能至关重要。

硬硬件和软件都设计为提供各个部件的完整模块化。更具体地说,该系统可以很容易地适应其他工具的生物膜特征化,如使用高光谱相机或微传感器分析的宏观摄影成像。结构信息与生物膜周围和内部资源中的局部梯度相结合,将为生物膜如何适应优化资源分配提供新颖和关键见解。灵活性也通过使用 Jupyter 笔记本电脑实现,这是一种开放、快速和多功能的软件开发工具。

一般来说,OCT成像的一个关键限制仍然是解决快速移动物体的残疾。例如,流式长线与流一起移动,则没有准确描述。因此,此工具的适用性仅限于相对固定、不移动的生物膜结构。系统经过优化以自动工作,但是,初始设置和必要时仍需要手动调整对焦和照明。如果样品的密度和反射特性存在显著差异,则这表示一个重大限制。然而,完全自动化(包括软件引导的对焦和照明调整)可以通过类似的原则(例如,步进电机和软件硬件反馈)来实现。

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Disclosures

塞巴斯蒂安·舍费尔受雇于索拉布斯公司。

Acknowledgments

我们感谢毛里西奥·阿吉雷·莫拉莱斯为这一制度的发展所作的贡献。 瑞士国家科学基金会向T.J.B.提供财政支助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OCT Probe Thorlabs GAN210C1 OCT imaging device
OCT scan lens Thorlabs  OCT-LK3-BB
Immersion adapter Thorlabs  OCT-IMM3-SP1
Stepcraft 840 CK STEPCRAFT NA positioning device
microcontroller Arduino Uno R3 NA
Single-board computer Raspberry PI NA
camera Canon EOS 7D Mark II NA
camera lens Canon MACRO EFS 35 mm NA

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