大規模な空間スケールでバイオフィルムの形態形成を解明する自動化された3D光コヘレンス断層撮影

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Summary

微生物バイオフィルムは、相間で複雑なアーキテクチャを形成し、高度にスケール依存する空間パターンに発展します。ここでは、3D光コヘレンス断層撮影(OCT)データセットの自動取得のための実験システム(ハードおよびソフトウェア)を紹介する。このツールセットは、空間と時間におけるバイオフィルム形態形成の非侵襲的かつ多スケールの特性を可能にする。

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Depetris, A., Wiedmer, A., Wagner, M., Schäfer, S., Battin, T. J., Peter, H. Automated 3D Optical Coherence Tomography to Elucidate Biofilm Morphogenesis Over Large Spatial Scales. J. Vis. Exp. (150), e59356, doi:10.3791/59356 (2019).

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Abstract

バイオフィルムは、最も成功した微生物のライフスタイルであり、環境とエンジニアリングされた設定の多くで普及しています。バイオフィルムの形態形成を理解することは、コミュニティ集会におけるバイオフィルムの構造的多様化であり、空間的および時間的スケールを越えた顕著な課題を表しています。ここでは、光コヘレンス断層撮影(OCT)に基づく自動バイオフィルムイメージングシステムを紹介する。OCTは、バイオフィルム研究における新しいイメージング技術です。しかし、現在取得および処理できるデータの量は、バイオフィルム形態における大規模なパターンの統計的推論を妨げる。自動化されたOCTイメージ投射システムはバイオフィルムの成長の大きい空間および拡張された時間的スケールをカバーすることを可能にする。市販のOCTシステムとロボット測位プラットフォーム、およびOCTスキャンプローブの位置を制御するソフトウェアソリューションのスイート、および3Dバイオフィルムイメージングデータセットの取得と処理を組み合わせたものです。このセットアップにより、バイオフィルム開発のオンサイトおよび非侵襲的な自動モニタリングが可能になり、OCTイメージングとマクロ撮影およびマイクロセンサープロファイリングを組み合わせてさらに開発することができます。

Introduction

バイオフィルムは、非常に成功した微生物のライフスタイル適応であり、微生物のこれらの相間関連およびマトリックス囲まれたコミュニティは、自然および産業の設定1、2で微生物の生命を支配する。そこで、バイオフィルムは、細長いストリーマー3、波紋4またはキノコのようなキャップ5などの複雑なアーキテクチャを形成し、バイオフィルムの成長、構造安定性および応力6に対する耐性に重要な結果をもたらす。バイオフィルムの構造的分化に関する多くは、ミニチュアフローチャンバーで栽培された単一種培養に関する研究から学びましたが、ほとんどのバイオフィルムは、多くの場合、生命6のすべてのドメインのメンバーを含む非常に複雑なコミュニティです。これらの複雑なバイオフィルムを微生物の景観7として鑑賞し、複雑なコミュニティにおけるバイオフィルムの構造と機能がどのように相互作用するかを理解することは、バイオフィルム研究の最前線にあります。

環境的手がかりに応じて複雑なバイオフィルムの形態形成を機械的に理解するには、関連するバイオフィルム物理構造の空間的および時間的に解決された観察と組み合わせて慎重に設計された実験が必要です。スケール8.しかしながら、実験システムにおけるバイオフィルムの成長の非破壊観察は、繊細なバイオフィルム構造を損傷することが多いサンプル(例えば、顕微鏡)を移動する必要性などのロジスティック制約によって厳しく制限されている。

ここで提示されるプロトコルは、光学コヘレンス断層撮影(OCT)に基づく完全に自動化されたシステムを導入し、メソスケール(mm範囲)でのバイオフィルム形態形成の非侵襲的なモニタリングを可能にする。OCTは、水処理およびバイオファウリング研究、医学9およびストリーム生態学10の応用を伴うバイオフィルム研究における新しいイメージング技術である。OCTでは、低コハサイレンス光源がサンプルアームとリファレンスアームに分割されます。バイオフィルム(サンプルアーム)とリファレンスアームの光によって反射され散乱する光の干渉を解析します。深度解決構造情報を含む一連の軸強度プロファイル(A-ss)が取得され、Bスキャン(断面)にマージされます。一連の隣接する B スキャンは、最終的な 3D ボリューム スキャン10を構成します。OCTは、約10μmの範囲で横光学分解能を提供し、したがって、バイオフィルム10、12のメソスコピック構造分化を研究するのに適しています。OCTの詳細については、ドレクスラーと藤本13とファーチャーと同僚14を参照してください。1つのOCT xyスキャンの視野は数百平方マイクロメートルに達するが、より大きいスケールパターンは1回のスキャンでOCTによって定量することはできない。河川や河川などの自然生息地におけるバイオフィルムに関しては、現在、生息地の物理的および油圧テンプレートに一致するスケールでバイオフィルム形態形成を評価する能力が制限されています。

これらの空間的限界を超え、OCTスキャンを自動的に取得するために、スペクトルドメインOCTイメージングプローブを3軸測位システムに搭載しました。このインストールにより、重なり合うモザイクパターン(タイルスキャン)で複数のOCTスキャンを取得することができ、100 cm2までの表面積の断層撮影を効果的に達成します。さらに、このシステムの高い位置決め精度は、長期実験中に特定の部位におけるバイオフィルム機能の成長と発展を確実に監視することを可能にする。システムは、モジュラーおよび個々のコンポーネント(すなわち、位置決め装置およびOCT)をスタンドアロンソリューションとして使用するか、または柔軟に組み合わせることができる。図 1は、インストールのハード コンポーネントとソフトウェア コンポーネントの概要を説明します。

システムは市販のGRBL制御CNC測位装置(材料のテーブル)によってテストされた。この特定の位置のプラットホームの作動距離は600×840×140のmm、+/- 0.05 mmの製造業者指定の正確さおよび0.005のmmのプログラム可能な決断はオープンソース(GPLv3ライセンス)、CNCのための高性能の動き制御であるデバイス。したがって、すべての GRBL ベース (バージョン > 1.1) 測位デバイスは、ここに示すガイドラインおよびソフトウェア パッケージと互換性がある必要があります。さらに、ソフトウェアは、いくつかの変更でSTEP-DIR入力タイプを持つ他のステップモータコントローラに適応することができます。

システムの性能を評価するために使用されるOCT装置(材料の表)は930 nm(帯域幅=160 nm)および調節可能な参照腕の長さおよび強度の中心波長の低コハサイレンス光源を特色にする。ここで示す例では、OCTプローブを流れる水に浸すための浸漬アダプターも使用した(材料の表)。自動OCTスキャン集録のためにここで開発されたソフトウェアパッケージは、特定のOCTシステムと一緒に提供されるSDKに大きく依存しますが、異なるスキャンレンズと中央波長を持つ同じメーカーのOCTシステムは、容易に互換性があります。

GRBL デバイスは、シングルボード コンピュータにインストールされている Web サーバーによって制御されます (1)。これにより、ローカル ネットワークまたはインターネット アクセスを持つ任意のコンピュータからデバイスのリモート 制御が許可されます。OCTデバイスは別のコンピュータによって制御され、自動実験セットアップを除いてOCTシステムの動作を可能にします。最後に、ソフトウェアパッケージには、OCTプローブの位置決めとOCTスキャン集録を同期するライブラリ(すなわち、モザイクパターンまたは定義された位置のセットで3Dイメージングデータセットを自動的に取得する)が含まれます。OCTプローブの位置を3Dで効果的に定義すると、(地域的な)スキャンセット専用の焦点面を効果的に調整できます。具体的には、不均一な表面では、各OCTスキャンに対して異なる焦点面(すなわち、z方向の異なる位置)を指定することができる。

生のOCTスキャンを処理するために一連のソフトウェアパッケージが開発されました(表1)。測位デバイスのナビゲーション、OCTスキャン取得、データセット処理はPythonコード化されたJupyterノートブックで行われ、ソフトウェアの開発と最適化に非常に柔軟性があります。このようなノートブックの2つの作業と注記の例(それぞれ画像の取得と処理のために)は、https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.gitから入手可能です彼らはカスタマイズの出発点として意図されていますメソッドの。Jupyter ノートブックは、Python コードに付いたセルを含む Web ブラウザベースのアプリケーションです。各ステップはノートブックのセルに含まれており、個別に実行できます。スキャンレンズを通る光経路の長さが異なるため(球面収差)15は、生のOCTスキャンが歪んで見える(図2A)。取得したOCTスキャン(ImageProcessing.ipynb、補足ファイル1に含まれる)でこの歪みを自動的に補正するアルゴリズムを開発しました。さらに、バイオフィルム形態は、膜システム16で以前に使用されていたように、2D標高マップとして視覚化することができ、タイリングアレイで撮影したスキャンから得られた標高マップをステッチする方法を示す。

最後に、説明された実験室設置の機能性は、光栄養流れバイオフィルムが流速の勾配にさらされるフルーム実験を用いて示される。

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Protocol

1. 測位装置のセットアップ

  1. https://github.com/grbl/grbl/wiki/Connecting-Grblの指示に従って、測位装置をマイクロコントローラボードに配線します。
  2. マイクロコントローラをUSBケーブルでインターネット接続したシングルボードコンピュータに接続し、https://gitlab.com/FlumeAutomation/GRBL_Server.gitに記載されているGRBLサーバーを取り付けます。これで、位置決めデバイスは、http://IP:5020/でホストされている Web ページからナビゲート可能にする必要があります。または、配置デバイスは、作業例ImageAcquisition.ipynb (補足ファイル2) の最初の部分で示すように、Python スクリプトを使用してナビゲートできます。

2. 10月のセットアップ

  1. 互換性のある鳩尾ホルダーを使用して、OCTプローブを測位装置に取り付けます。必要に応じて、対物レンズに浸漬アダプターを取り付けます。
  2. 実験の隣のベンチにコンピュータとOCTベースユニットを配置します(例えば、マイクロ流体デバイス、フローチャンバー、フルーム、濾過システム)。光コード(最大長約1.8m)が自由に動き、意図した場所に到達するのに十分な長さで、実験設定に干渉しないことを確認してください。
  3. 製造元が説明する利用可能なソフトウェアと共に OCT システムをインストールします。
  4. https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.gitに記載されているように、自動OCTスキャン集録用のソフトウェアパッケージをインストールします。

3. 画像取得

  1. OCTシステムと測位装置の電源を入れ。デバイスが自由に動くことができることを確認します。
  2. テキスト エディタでファイルconfig.jsonを開きます。config.jsonファイルを編集して、屈折率 (20 °C の水の場合は 1.33、空気の場合は 1.00) や取得したデータとメタデータの宛先フォルダーなど、既定の画像取得パラメータ (2) を調整します。
  3. config.jsonのビューフィールド (FOV) のサイズと B スキャンあたりの A スキャンの数を定義します。
    注: これらの 2 つのパラメータは、最終的なデータセットのボクセルのサイズと出力ファイルのサイズを決定し、プローブの光学解像度と一致する必要があります(x-y ボクセルサイズは光学解像度の半分より小さくしないでください)。A スキャンと B スキャンの数は、使用可能なディスク領域と処理能力に対してトレードオフする空間範囲に影響します。
  4. config.jsonで出力 OCT スキャンの信号境界を定義します。これらはサンプルの種類によって異なります。したがって、一連の予備スキャンの強度ヒストグラムに基づいてこれらのパラメータを決定することをお勧めします。config.jsonに変更を保存します。
  5. OCT プローブを対象のサイトに移動します。サンプルに焦点を合わせ、最適な画質を実現するために、リファレンスアームと光源強度を調整します。この手順をいくつもの位置に対して繰り返し、座標をメモします。
    注: これにより、これらの参照点の周りに後続の自動 OCT スキャンを取得できます。自動画像集録中は、参照アームの長さと強度を変更できないことに注意してください。
  6. Juypter ノートブックでImageAcquisition.ipynbファイル (補足ファイル2) を開きます。各セルには、特定のタスクを実行するコードが含まれており、Cell キーを押して個別に実行できます。を実行するか、Ctrlキーを押しながら入力するか、シフトを入力するか、または入力します。
    1. 必要なライブラリと既定の構成パラメーターにパスを設定します。または、新しい一時パラメーターのセットを定義します。
    2. 測位装置に接続し、OCTを初期化します。
    3. 測位装置を校正する(すなわち、「ホーミング」を実行する)。
    4. 単一スキャンまたはモザイク パターンの関心の位置をカバーするデータセットを取得し、数値と重複を指定します(例: 30%)隣接するタイルの。
      注: メモリはスキャンの前に割り当てられ、コンピュータ リソースの使用が最適化されます。データは 8 ビット *.raw形式で保存され、ストレージ領域を節約し、config.jsonで定義された宛先フォルダーに、タイム スタンプと位置を命名規則として使用します (つまり、%Y%%m%d_%H%M%S%S_)。OCT 設定と座標を含むメタデータは、同じ命名規則を持つ *.srmファイル内の同じフォルダーに保存されます。FOV や解像度などの設定によっては、ファイル サイズが OCT スキャンあたり最大 1.5 GB に達する場合があります。
  7. データ取得の中絶を避けるには、十分な空きディスク領域があることを確認するか、OCT データセットを外付けハード ドライブに継続的に移動します。

4. 画像補正・表示

  1. OCT画像処理(歪みの補正、背景減算、標高マップの計算、標高マップステッチ)の例については、JupyterノートブックImageProcessing.ipynb(補足ファイル1)を開きます。
  2. 必要に応じて、偽の信号を除外し、データセットの方向を変えるためにOCTスキャンをトリミングします(バイオフィルムは地下層の上に表示されるはずです)。
  3. 球面収差を正しくします。これは、平坦であることが知られている高反射基準面(例えば、フルームの底部、地下層)を利用する補正アルゴリズムによって達成される。まず、このアルゴリズムは、OCTスキャンのxy平面を横切って定期的に間隔をあけた20×20本の垂直線のグリッドを定義します。次に、各点の周囲の円形領域を選択し、垂直プロファイルに沿って信号強度を平均します(図2B)。垂直プロファイルは、変更されたガウスフィルタで処理されます。
    Equation 1
    ここでxは入力信号であり、σ は標準偏差を、C は次のように決定します。
    Equation 2
    参照サーフェスは、これらの各プロファイルでローカル最大値としてローカライズされます。誤認識されたポイントは、近傍の位置に基づいて 3 次元でフィルタリングされます (図 2C)。最後に、スキャンレンズによってもたされる歪みを反映した2多項式の表面を、これらの点にまたがって取り付けます(図2C)。次に、フィットサーフェスを使用して各ピクセルを Z 方向にシフトし、フラット化されたイメージを取得します。このアルゴリズムのパラメータは、OCTスキャンの特性に合わせて調整する必要があります。
  4. バックグラウンドノイズを修正します。画像の空の領域(通常はバイオフィルムの上)を識別し、補正アルゴリズムを使用して画像の強度値から平均バックグラウンド強度を減算し、最終的な補正OCT画像を生成します(図2D)。
  5. 3D OCT データセットから標高マップを計算します。このステップでは、特定の実験に対する対象の参照面(例えば、地下層)と適切なしきい値強度を定義する。次に、標高マップ計算アルゴリズムを使用して、バイナリ マスクの各座標 (x,y) のバイオフィルムの厚さを計算し、新しい 2D マトリックスに割り当てます (図 3A)。厚さの値は、x 方向と y 方向の元のイメージのサイズの 2D マトリックスに割り当てられます。イメージは、サーフェスの標高がグレースケール値 (図 3B)として報告されるレンダリングされます。
  6. 複数の OCT スキャンをモザイク パターンで行う場合は、行と列の数を定義し、それぞれの標高マップをステッチします。図 5は、ステッチされた標高マップの例を示し、説明した設定で実現可能な幅広い空間縮尺と解像度をカバーしています。

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Representative Results

光栄養流れバイオフィルムの時空間的形態形成を研究するために設計されたフルーム実験を用いて、自動OCTイメージングシステムの機能を実証する。蛍石の徐々に狭いジオメトリは、蛍石の中心に沿った流速の勾配を誘発しました(参照 17を参照)。 バイオフィルムの時間的発達と構造分化は、バイオフィルム形態形成に対する流体力学的条件の影響をよりよく理解することを目的として18日間にわたってモニタリングされた。図4は、18日間の成長に続くバイオフィルムマイクロコロニーの成長を示す。バイオフィルムの表面形態は、上述したツールセットを用いて定量した(図4A)。生体積を計算した(例ImageProcessing.ipynb,補足ファイル1参照)、流速勾配に沿った各位置について3.6mmのエッジ長(図4B)を持つ正方形の移動ウィンドウについて(図4C)。バイオフィルムの蓄積は、流速の増加に伴って有意に減少した(煙道の最も広い部分からの距離として示される;4)。重要なことに、この実験設定により、大きな空間勾配に沿って構造パラメータ(生体体積、厚さ、粗さなど)を連続的に測定できます。したがって、この新しいツールは、バイオフィルム構造と環境手がかりとの関係に関する洞察を得る手段を提供します。

ソフトウェア コンポーネント 説明
stepcraft.py 測位デバイスを制御する Python ライブラリ。これには、デバイスをナビゲートおよびホーミングするための定義が含まれています。
オクコントロール.cpp OCT システムと共に配布されるソフトウェア開発キット (SDK) から派生した C++ コード。これは、VisualStudio 2017、PythonC/API、および SDK を使用してコンパイルする必要があります。
ImagesAcquisition.py 選択した位置でOCTスキャンを行い、スキャンタイリングパターンを定義するためのコマンドを含むPythonライブラリ。
画像取得.ipynb 測位装置をナビゲートし、OCTスキャンを取得し、自動画像取得のために使用されるジュピターノートブック。
OctCorrection.py 生のOCT画像と背景減算の補正に使用される関数を定義する Python ライブラリ。
OctProcessing.py 標高マップを計算してステッチする関数を含む Python ライブラリ。
10月処理.ipynb OCTスキャンを視覚化、修正、処理するジュピターノートブック。これには、生体体量計算の例も含まれています。

表 1.ソフトウェア コンポーネント。

パラメーター 説明
ガニメデ 1, 2, 3 OCTシステムとバージョンの選択
プローブ 1, 2 スキャンレンズの選択
ナスキャンス 32-900 B スキャンあたりの A スキャン数
nBscans 1-900 B スキャンの数
nCスカン 128-1024 深度ピクセル数
X 0.1-10 X 方向の画像のサイズ (mm)
Y 0.1-10 y 方向の画像のサイズ (mm)
屈折 1-1.6 屈折率(空気1、水1.33)
アスキャンス 3 A スキャン平均の数
スキャンスピード 1,2,3 A-スキャンレート(5.5、15、36 kHz)
パス "../ %Y%m-%d_%H_%M_%S" 取得した OCT スキャンの宛先フォルダーは、タイム スタンプを命名コンフィデンスとして使用します。
色の境界 [0.0-256.0,0.0-256.0] 取得したスキャンの色の境界

表 2.OCT パラメータ設定。

Figure 1
図 1.ハード コンポーネントとソフトウェア コンポーネントの概要。GRBL制御測位装置のステップモーターはマイクロコントローラに配線され、USB経由でシングルボードコンピュータに接続されます。GRBLサーバは後者に設置され、測位装置の動きはTCP/IP接続を介して任意のウェブブラウザから制御することができる。あるいは、位置決めデバイスのナビゲーションは、GRBLServer.pyライブラリを使用して、Pythonでコード化されたJupyterノートブック(ImagesAcquisition.ipynb、補足ファイル2)から実行することができます。OCTシステムは、自動OCTスキャン集録をPythonスクリプトを介して実行できる別のコンピュータに接続されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2.OCT スキャン補正ワークフロー。パネルAは、平らなプレキシガラス表面に成長するバイオフィルムの非処理B-スキャンを示す。レンズを通る低コサイレンス光のパス長さの違いにより、画像が歪みます(曲げ)。OCT画像の歪みは、画像内の強く反射する平坦な参照面を識別することによって補正することができる。まず、20×20 の参照点は、画像のスタック全体に均等に分散されます。これらの各点において、画像信号は、各深さ(z平面)の円形領域(x-y方向)にわたって平均化され、信号強度の平均深度プロファイルを得る。次に、変更されたガウスフィルタが 400 個の参照プロファイルのそれぞれに適用されます。パネル B は、パネル A の垂直赤線で示される深度プロファイルに沿った元の信号の例、平均深度プロファイル、および変更されたガウス フィルタが適用された後の同じプロファイルを示します。変更されたガウスフィルタは、信号強度で局所最大値を識別し、強く反射する参照面の位置を識別することを可能にします。正しく識別された参照点は、3 次元の近傍の座標に基づいて選択されます。パネルCの例では、黄色の点は後続の画像補正のために保持され、紫色のものは廃棄された。2の多項式サーフェスは、正しく配置された参照点にフィットし、ピクセルを z 方向にシフトして元の OCT イメージの歪みを補正するために使用されます。平均背景強度は、画像の空の領域から推定され、修正された画像から差し引かされます。パネル D は、補正と背景減算の後に同じ B スキャンを示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3.標高マップ。バイオフィルムトポロジは、バイオマスの厚さが色分けされた2D標高マップとして視覚化できます。このために、3D OCT画像は閾値化され、バイオフィルムの厚さは基板への最上部信号の距離として計算されます。パネルAは、閾値化後に得られたB-スキャンのバイナリマスクを示す。青い線は最上部の信号を示し、赤い線は参照面を示します。パネルBは、OCTプローブの軸解像度に従ってスケールされた、得られた標高マップの例を示す。赤い線はパネルAのBスキャンの位置を示す。

Figure 4
図 4.バイオフィルムの成長に及ぼす流速の影響を示す代表的な結果。我々は、フルーム実験を用いて流速の勾配に沿って光栄養流のバイオフィルム形態形成を研究した。流速は、煙道の入口からの距離に伴って増加した。成長の10日後、バイオフィルム形態は、異なる解像度で自動化されたOCTによって特徴付けられ、異なる空間スケールをカバーした。標高マップ(A、B、C)は、それぞれ低、中、高流速下で成長したバイオフィルムの形態を示しています。これらの標高マップは、ボクセルサイズが x、y 方向が 4 μm の OCT スキャンから計算されます。スキャン表面積は3.6 mmの端の長さの正方形である。パネルD、E、Fは、11 μmのxy方向のボクセルサイズで3×3 OCTスキャンをステッチすることによって得られた標高マップ(低、中、高流速)、10 mm2のスキャン領域、および30%の隣接するスキャン間の重複を示しています。パネルGは、このフルーム実験で達成された速度勾配全体に沿って成長するバイオフィルムの標高図を示す。40 μmのxy方向のボクセルサイズで3×51 OCTスキャンをステッチし、10mm2のスキャン領域と30%の隣接するスキャン間のオーバーラップを縫い合わせて得た。達成された総スキャン面積は24×353のmm.パネルHは3.6 mmの端の正方形の動く窓の生体積を報告する。平均生体積は入り込み(I)からの距離の関数として有意に減少した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図 5.測位装置の精密テスト。測位装置の精度は、カラーマークに焦点を当てた35mmマクロレンズを搭載した20.2メガピクセルカメラを搭載して評価した。測位装置は、マークから離れたランダムな方向に移動し、合計80サイクルの後ろに位置決めました。その後、マークの位置を比較しました。図は、最初の図に対する x 方向と y 方向のシフトを示しています。最大シフトはY方向で約16μm、X方向でも少ないことに注意してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 1.ImageProcessing.ipynb. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 2.Images ImageAcquisition.ipynb. ここをクリックしてこのファイルをダウンロードしてください。

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Discussion

OCTイメージングは、数平方ミリメートルのFOVを持つマイクロメータ範囲の構造を解決するのに適しています。したがって、バイオフィルム研究10、18のための強力なツールです。しかし、OCTは現在、最大スキャン面積100~256mm2に制限されていますが、バイオフィルム構造パターンは、特に大規模な環境勾配によって形態学的分化が駆動される場合、この空間スケール19を超えることが多い。20.このプロトコルで説明する自動OCTイメージングシステムは、OCTによって特徴付けられた表面積を数平方センチメートルに拡張し、関連する空間スケールの範囲にわたってバイオフィルム形態学的分化を効果的に監視することを可能にする(数ミリメートルから数センチメートル)。高い位置決め精度(16 μm以内。図 5)長期間にわたってバイオフィルムの構造発達を正確に監視することができ(図4)、バイオフィルムの形態学的分化のドライバに関する機械的理解を得る機会を効果的に高める.同時に、この現場のバイオフィルム特性認証技術は非侵襲的であり、バイオフィルムの成長との干渉を最小限に抑える。ここで紹介する画像処理ソリューションは、以前に採用されたバイオフィルムOCTデータセット16の分析に基づいて構築されていますが、オートメーションは、前例のない時間と空間解決されたOCTデータセット分析のためのツールを提供します。

このシステムは、プロトコルで説明されているように、特定のOCTデバイスで考案され、ベンチマークされました。プロトコルの重要な手順は、主に OCT 解像度とフォーカスの設定に関するものであり、高画質の場合に重要です。球面収差ルーチンの補正の限界は、反射性の高い平らな表面の存在に依存するということです。あるいは、標準的な補正面を測定し、OCTスキャンを修正するために使用することもできます。さらに、OCTスキャンのステッチは、隣接するスキャンを整列するのに十分な構造機能に依存します。均一なバイオフィルム分布または低バイオフィルムカバレッジの場合、ステッチは測位装置の精度のみに依存して達成され得る。最後に、他の画像処理パイプラインと同様に、これらのツールをセットアップする際には、画像のバッチを処理する前に、一連の代表的なスキャンで処理アルゴリズムのパフォーマンスを慎重に評価することが重要です。

ハードとソフトウェアの両方が個々の部品の完全なモジュール性を提供するように設計されました。より具体的には、このシステムは、ハイパースペクトルカメラやマイクロセンサープロファイリングを使用したマクロ撮影イメージングなどのバイオフィルム特性解析のための他のツールと容易に動作させることができます。バイオフィルムの周りおよびバイオフィルム内の資源における局所的な勾配との構造情報の結合は、バイオフィルムが資源配分を最適化するためにどのように適応されるかについての新しい重要な洞察を提供します。柔軟性はまた、Jupyterノートブック、オープンアクセス、高速かつ汎用性の高いソフトウェア開発ツールを使用して実装されています。

一般にOCTイメージングの重要な制限は、急速に動く物体を解決する障害のままである。たとえば、流れに伸びて移動するストリーマーは正確には描かれていない。したがって、このツールの適用性は、比較的固定された非移動バイオフィルム構造に限定されます。システムは自律的に動作するように最適化されていますが、初期設定と必要に応じて、フォーカスと照明の手動調整が必要です。これは、サンプルの密度と反射特性が大きく異なる場合に大きな制限を表します。ソフトウェアガイド付きフォーカスや照明の調整を含む完全な自動化は、同様の原理(ステッパーモータやソフトウェアハードウェアフィードバックなど)を使用して達成することができます。

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Disclosures

セバスチャン・シェーファーはソーラブス社に勤務しています。

Acknowledgments

我々は、マウリシオ・アギーレ・モラレスがこのシステムの開発に貢献してくれたことに感謝する。 財政支援はスイス国立科学財団からT.J.B.に寄付されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OCT Probe Thorlabs GAN210C1 OCT imaging device
OCT scan lens Thorlabs  OCT-LK3-BB
Immersion adapter Thorlabs  OCT-IMM3-SP1
Stepcraft 840 CK STEPCRAFT NA positioning device
microcontroller Arduino Uno R3 NA
Single-board computer Raspberry PI NA
camera Canon EOS 7D Mark II NA
camera lens Canon MACRO EFS 35 mm NA

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References

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