Automatiserad 3D optisk koherens tomografi för att belysa biofilm morfogenes över stora rumsliga skalor

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Mikrobiella biofilmer bildar komplexa arkitekturer på interfaser och utvecklas till mycket skala beroende rumsliga mönster. Här introducerar vi ett experimentellt system (hård-och programvara) för automatiserad förvärv av 3D optisk konsekvens tomografi (OCT) DataSet. Denna verktygslåda möjliggör icke-invasiv och flerskalig karakterisering av biofilm morfogenes i tid och rum.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Depetris, A., Wiedmer, A., Wagner, M., Schäfer, S., Battin, T. J., Peter, H. Automated 3D Optical Coherence Tomography to Elucidate Biofilm Morphogenesis Over Large Spatial Scales. J. Vis. Exp. (150), e59356, doi:10.3791/59356 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Biofilmer är en mycket framgångsrik mikrobiell livsstil och råder i en mängd miljö-och konstruerade miljöer. Förstå biofilm morphogenesis, det är den strukturella diversifiering av biofilmer under gemenskapens församling, utgör en anmärkningsvärd utmaning över rumsliga och temporala skalor. Här presenterar vi en automatiserad biofilm Imaging system baserat på optisk koherens tomografi (ULT). OCT är en framväxande bildteknik i biofilm forskning. Men den mängd data som för närvarande kan förvärvas och bearbetas hämmar Statistisk inferens av storskaliga mönster i biofilm morfologi. Den automatiserade OCT Imaging system kan täcka stora rumsliga och utökade tidsmässiga skalor av biofilm tillväxt. Den kombinerar en kommersiellt tillgänglig OCT-system med en robotstyrd positionerings plattform och en svit av mjukvarulösningar för att styra placeringen av OCT skanning sond, samt förvärv och bearbetning av 3D biofilm Imaging DataSet. Denna inställning tillåter in situ och icke-invasiv automatiserad övervakning av biofilms utveckling och kan vidareutvecklas för att par okt Imaging med makrofotografering och MicroSensor profilering.

Introduction

Biofilmer är en mycket framgångsrik mikrobiell livsstil anpassning och dessa Interphase-associerade och Matrix-slutna samhällen av mikroorganismer dominerar mikrobiella livet i naturliga och industriella inställningar1,2. Där bildar biofilmer komplexa arkitekturer, såsom långsträckta streamers3, krusningar4 eller svampliknande CAPS5 med viktiga konsekvenser för biofilmer tillväxt, strukturell stabilitet och motståndskraft mot stress6. Medan mycket om biofilm strukturell differentiering har lärt sig från arbetet med mono-arter kulturer odlas i miniatyr flöde kammare, de flesta biofilmer är mycket komplexa samhällen ofta inklusive medlemmar av alla områden i livet6. Uppskattar dessa komplexa biofilmer som mikrobiell landskap7 och förstå hur biofilm struktur och funktion samverkar i komplexa samhällen är därför i spetsen för biofilm forskning.

En mekanistisk förståelse av morfogenes av komplexa biofilmer som svar på miljömässiga signaler kräver noggrant utformade experiment i samband med rumsligt och temporalt lösta observationer av biofilm fysisk struktur över relevanta skalor8. Den oförstörande iakttagelsen av biofilms tillväxt i experimentella system har dock kraftigt begränsats av logistiska begränsningar såsom behovet av att flytta prover (t. ex. till ett Mikroskop) som ofta skadar den känsliga bio film strukturen.

Det protokoll som presenteras här introducerar ett helt automatiserat system baserat på optisk koherens tomografi (ULT), som möjliggör in situ, icke-invasiv övervakning av biofilm morfogenes i mesoskalig (mm-området). Oct är en framväxande bildteknik i biofilm forskning med tillämpningar inom vattenrening och påväxt forskning, medicin9 och Stream ekologi10. I ULT är en låg samstämmighet ljuskälla uppdelad i ett prov och referens arm; störningen av det ljust reflekterat och skingrat av biofilmen (ta prov beväpnar), och det ljust av hänvisa till beväpnar analyseras. En serie axiella intensitetsprofiler (A-skanningar) som innehåller djuplösta strukturella uppgifter förvärvas och slås samman till en B-Scan (ett tvärsnitt). En serie intilliggande B-skanningar komponerar den slutliga 3D-volymskanningen10. ULT ger en lateral optisk upplösning i intervallet cirka 10 μm och är därför väl lämpad att studera Mesoskopisk strukturell differentiering av biofilmer10,12. För en mer detaljerad beskrivning av ULT, se Drexler och Fujimoto13och fercher och kollegor14. Även om synfält av en enda OCT XY-Scan når upp till hundratals kvadratiska mikrometrar, kan större skala mönster inte kvantifieras med hjälp av ULT i en enda genomsökning. När det gäller biofilmer i naturliga livsmiljöer såsom bäckar och floder, detta begränsar för närvarande vår förmåga att bedöma biofilm morfogenes i skalor som matchar den fysiska och hydrauliska mall av livsmiljön.

För att överträffa dessa rumsliga gränser och att förvärva OCT skannar automatiskt, en spektral-domän OCT Imaging sond var monterad på en 3-axlig positioneringssystem. Installationen tillåter förvärv av flera Oct skannar i ett överlappande mosaikmönster (kakel skanning), effektivt uppnå tomografiska tycks Imaging av ytan områden upp till 100 cm2. Dessutom möjliggör den höga positionerings precisionen hos detta system att på ett tillförlitligt sätt övervaka tillväxten och utvecklingen av bio Films funktioner på specifika platser under långvariga experiment. Systemet är moduluppbyggda och enskilda komponenter (dvs positionerings enhet och Oct) av anläggningen kan användas som fristående lösningar eller flexibelt kombinerade. Figur 1 ger en översikt över de hård-och programvarukomponenter som finns i installationen.

Systemet testades med en kommersiellt tillgänglig GRBL-styrd CNC-positioneringsenhet (tabell över material). Drifts avståndet för denna specifika positionerings plattform är 600 × 840 × 140 mm, med en tillverkarspecifik noggrannhet på +/-0,05 mm och en programmerbar upplösning på 0,005 mm. GRBL är en öppen källkod (GPLv3 License), högpresterande Motion Control för CNC- Enheter. Därför bör varje GRBL-baserad (version > 1,1) positioneringsenhet vara kompatibel med de riktlinjer och programvarupaket som presenteras här. Dessutom kan programvaran anpassas till andra stepmotor Controller med STEP-DIR input typ med några ändringar.

Den ULT-enhet som används för att bedöma systemets prestanda (tabell över material) har en låg samstämmighet ljuskälla med en mittvåglängd på 930 nm (bandbredd = 160 Nm) och justerbar referens arm längd och intensitet. I det exempel som presenteras här, en Immersion adapter för doppning av OCT sonden i strömmande vatten användes också (tabell över material). Den programvara som utvecklats här för automatiserad OCT Scan förvärvet kritiskt beror på SDK som tillsammans med den specifika ULT-systemet, dock, ULT system från samma tillverkare med olika Scan linser och centrala våglängder bör vara lätt kompatibel.

GRBL-enheten styrs av en webbserver som är installerad på en enda dator (bild 1). Detta ger fjärrstyrning av enheten från vilken dator som helst med lokalt nätverk eller Internetåtkomst. ULT enheten styrs av en separat dator, vilket gör att driften av ULT systemet undan den automatiserade experimentella installationen. Slutligen programvarupaketen inkluderar bibliotek för att synkronisera OCT PROBE positionering och OCT Scan förvärv (dvs. att automatiskt förvärva 3D Imaging dataset i en mosaikmönster eller i en uppsättning av definierade positioner). Definiera positionen för OCT sonden i 3D effektivt gör det möjligt att justera fokalplanet specifikt för (regionala) uppsättningar av skanningar. Specifikt, på ojämna ytor, olika fokalplan (dvs olika positioner i z-riktning) kan specificeras för varje OCT Scan.

En uppsättning mjukvarupaket utvecklades för att bearbeta RAW OCT-skanningar (tabell 1). Navigering på positionerings enheten, OCT Scan förvärv och databearbetning utförs med python-kodade Jupyter notebooks, som möjliggör anmärkningsvärd flexibilitet i utvecklingen och optimering av programvaran. Två arbetade och kommenterade exempel på sådana anteckningsböcker (för bild förvärv och bearbetning, respektive) är tillgängliga från https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git de är avsedda som utgångspunkt för anpassning av metoden. En Jupyter Notebook är en webbläsare baserat program som innehåller celler med kommenterade python-kod. Varje steg ingår i en cell i anteckningsboken, som kan köras separat. På grund av den olika längden av ljusbanan genom Scan Lens (sfärisk aberration)15, den råa Oct skannar verkar förvrängd (figur 2A). Vi utvecklade en algoritm för att automatiskt korrigera för denna förvrängning i förvärvade OCT-skanningar (som finns i ImageProcessing. ipynb, kompletterande fil 1). Dessutom kan biofilmmorfologi visualiseras som en 2D höjd karta, som tidigare användes i membransystem16, och vi illustrerar hur höjd kartor som erhållits från skanningar tagna i en plattsättning array kan sys.

Slutligen illustreras funktionaliteten hos den beskrivna laboratorie installationen med hjälp av ett FLUME-experiment där phototrophic Stream biofilm utsätts för en gradient av flödeshastigheten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. inställning av positionerings enheten

  1. För in positionerings enheten på en mikrostyrenhets tavla, enligt instruktionen i https://github.com/grbl/grbl/wiki/Connecting-Grbl.
  2. Anslut mikrokontroller till en enda dator med internetuppkoppling via en USB-kabel och installera grbl-servern enligt beskrivningen i https://GitLab.com/FlumeAutomation/GRBL_Server.git. Nu positionerings enheten bör vara navigerbar från en webbsida värd på http://IP:5020/. Alternativt kan positionerings enheten navigeras med ett Python-skript, vilket visas i den första delen av det fungerade exemplet imagesacquisition. ipynb (kompletterande fil 2).

2. OCT inställning

  1. Montera OCT-sonden på positionerings enheten med en kompatibel Dove tail-hållare. Installera vid behov en doppadapter på objektivlinsen.
  2. Placera datorn och OCT-basenheten på en bänk bredvid experimentet (t. ex. mikrofluidiska enheter, flödes kammare, flumes, filtreringssystem). Se till att den optiska sladden (maxlängden ca. 1,8 m) är fritt rörlig, tillräckligt lång för att nå alla avsedda platser och inte störa den experimentella installationen.
  3. Installera OCT-systemet tillsammans med den tillgängliga programvaran enligt tillverkarens anvisningar.
  4. Installera mjukvarupaket för automatiserad OCT Scan förvärv enligt beskrivningen i https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git.

3. bild förvärv

  1. Ström på ULT-systemet och positionerings enheten. Se till att enheten kan röra sig fritt.
  2. Öppna filen config. JSON i en textredigerare. Redigera filen config. JSON för att justera standardbild anskaffnings parametern (tabell 2), till exempel brytningsindex (1,33 för vatten vid 20 ° c, 1,00 för Air) och målmappen för förvärvade data och metadata.
  3. Definiera storleken på synfält (FOV) och antalet A-skanningar per B-Scan i config. JSON.
    Obs: dessa två parametrar bestämma storleken på voxels av den slutliga datauppsättningen och storleken på utdatafilen och bör matcha den optiska upplösningen av sonden (x-y Voxel storlek bör inte vara mindre än hälften av den optiska upplösningen). Numrera av A-och B-scanningar påverkar den rumsliga graden som ska täckas som handel-av mot tillgängligt diskutrymme och bearbeta driver.
  4. Definiera signal gränser för utdata OCT Scan i config. JSON. Dessa beror på typen av prov. Det rekommenderas därför att fastställa dessa parametrar baserat på intensitet histogram av en uppsättning preliminära skanningar. Spara ändringarna i config. JSON.
  5. Navigera den OCT sonden till en plats av intresse. Fokusera provet och justera referens armen och Ljuskällans intensitet för optimal bildkvalitet. Upprepa proceduren för ett antal positioner och anteckna koordinaterna.
    Obs: detta kommer att möjliggöra efterföljande automatisk OCT Scan förvärv runt dessa referenspunkter. Observera att referens armen längd och intensitet inte kan ändras under automatiserad bild anskaffning.
  6. Öppna filen Imageacquisition. ipynb (tilläggsfil 2) i juypter Notebook. Varje cell innehåller kod för att utföra specifika uppgifter och kan köras separat genom att trycka på cell | Köreller CTRL + RETUR eller SKIFT + RETUR.
    1. Ange sökvägen till de bibliotek som krävs och standardparametrarna för konfigurationen. Du kan också definiera en ny uppsättning tillfälliga parametrar.
    2. Anslut till positionerings enheten och initiera ULT.
    3. Kalibrera positionerings enheten(d.v.s. utföra en "homing").
    4. Förvärva de dataset som täcker positionerna av intressen i Single-Scan eller mosaikmönster, ange antalet och överlappningen (t. ex., 30%) av intilliggande kakelplattor.
      Obs: minnet allokeras före genomsökningen, vilket optimerar dator resursanvändningen. Data sparas i 8 bits *. RAW -format för att spara lagringsutrymme, i målmappen som definierats i config. JSON, med hjälp av tidsstämpel och befattningen som namngivningskonvention (d.v.s.% Y% m% D_% H% m% S_ < position >). Metadata inklusive OCT-inställningar och koordinater sparas i samma mapp i en *. SRM -fil med samma namngivningskonvention. Beroende på inställningar som FOV och upplösning, filstorlek kan nå upp till 1,5 GB per OCT Scan.
  7. För att undvika abort av datainsamling, se till att det finns tillräckligt med ledigt diskutrymme eller kontinuerligt flytta OCT datauppsättningar till en extern hårddisk.

4. bildkorrigering och visning

  1. Öppna Jupyter Notebook ImageProcessing. ipynb (kompletterande fil 1) för ett arbetat exempel på Oct bildbehandling (korrigering av distorsion, bakgrund subtraktion, beräkning av höjd kartor, höjd karta sömmar).
  2. Om det behövs, Beskär OCT skannar för att utesluta falska signaler och omorienteras datauppsättningen (biofilm bör visas ovanför underlaget).
  3. Korrekt för sfärisk aberration. Detta åstadkoms genom en korrigeringsalgoritm som utnyttjar en starkt reflekterande referensyta som är känd för att vara platt (t. ex. botten av FLUME, substratet). Först definierar algoritmen ett rutnät av 20 × 20 vertikala linjer regelbundet fördelade över XY-planet i OCT Scan. Sedan väljer den ett cirkel område runt varje punkt och medelvärden signal intensiteter längs den vertikala profilen (figur 2b). De vertikala profilerna bearbetas med ett modifierat Gaussiskt filter:
    Equation 1
    där x är ingångssignalen, och σ dess standardavvikelse, medan C bestäms såsom:
    Equation 2
    Referensytan är lokaliserad som lokala Maxima i var och en av dessa profiler. Felidentifierade punkter filtreras baserat på positionerna för sina grannar i tre dimensioner (figur 2C). Slutligen, en 2nd för polynom yta som återspeglar den snedvridning som införts av Scan objektivet monteras över dessa punkter (figur 2C). Den monterade ytan används sedan för att flytta varje pixel i z-riktning, och därmed få en tillplattad bild. Parametrarna för denna algoritm bör anpassas till egenskaperna för OCT Scan.
  4. Korrekt för bakgrundsbrus. Identifiera ett tomt område på bilden (vanligtvis ovanför biofilmen) och Använd korrigeringsalgoritmen för att subtrahera den genomsnittliga bakgrundsintensiteten från bildens intensitetsvärden för att producera en slutlig korrigerad OCT-bild (figur 2D).
  5. Beräkna en höjd karta från 3D OCT datauppsättning. I det här steget definierar du en referensyta av intresse för det specifika experimentet (t. ex. underlaget) och en lämplig tröskelintensitet. Använd sedan algoritmen för höjd kartans beräkning för att beräkna tjockleken på biofilmen för varje koordinat (x, y) för den binära masken och tilldela den till en ny 2D-matris (figur 3a). Tjock Leks värden tilldelas sedan till en 2D-matris av storleken på den ursprungliga bilden i x-och y-riktningar. En bild återges där höjden på ytan rapporteras som gråskalevärde (figur 3b).
  6. Om flera OCT-skanningar tas i ett mosaikmönster, definiera antalet rader och kolumner och sy respektive höjd kartor. Figur 5 presenterar exempel på sydda höjd kartor, som täcker det breda utbudet av rumsliga skalor och upplösningar som är uppnåeliga med den beskrivna installationen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi visar funktionaliteten i den automatiserade OCT Imaging system med hjälp av ett FLUME experiment för att studera den spatio-temporal morfogenes av phototrophic Stream bio Films. En gradvis minskande geometri av Flumes inducerade gradienter i flödeshastighet längs centrum av FLUME (se referens17).  Den temporala utvecklingen och strukturell differentiering av biofilm övervakades under 18 dagar med syfte att bättre förstå effekterna av hydrodynamiska förhållanden på biofilm morfogenes. Figur 4 visar tillväxten av en biofilm microcolony följt över 18 dagar av tillväxt. Biofilmens ytmorfologi kvantifierades med hjälp av den verktygsuppsättning som beskrivs ovan (figur 4a). Bio volym beräknades (se fungerade exempel ImageProcessing. ipynb, kompletterande fil 1) för ett kvadratiskt rörligt fönster med 3,6 mm kantlängd (figur 4b) för varje position längs Flödeshastighetgradienten (figur 4c). Biofilmackumulering minskade signifikant med ökande flödeshastighet (indikeras som avståndet från den bredaste delen av FLUME; Figur 4). Viktigt, denna experimentella inställning möjliggör en kontinuerlig mätning av strukturella parametrar (t. ex. Bio volym, tjocklek, ojämnhet) längs stora rumsliga gradienter. Därför ger detta nya verktyg möjlighet att få insikter i relationerna mellan biofilm struktur och Miljösignaler.

Programvarukomponent Beskrivning
stepcraft.py Ett Python-bibliotek för att styra positionerings enheten. Den innehåller definitioner för att navigera och homing enheten.
OctControl. cpp C++-kod som härleds från Programutvecklingspaketet (SDK) som distribueras med ULT-systemet. Detta måste kompileras med hjälp av VisualStudio 2017, PythonC/API och SDK.
ImagesAcquisition.py Ett Python-bibliotek som innehåller kommandona för att ta OCT-skanningar i valda befattningar och definiera mönstret Skanna plattsättning.
ImagesAcquisition. ipynb Jupyter Notebook används för att navigera positionerings enheten, förvärva OCT skannar och för automatiserad bild förvärv.
OctCorrection.py Ett Python-bibliotek som definierar de funktioner som används för korrigering av RAW OCT-bilder och bakgrunds subtraktion.
OctProcessing.py Ett Python-bibliotek som innehåller funktionerna för att beräkna och sy höjd kartor.
OctProcessing. ipynb Jupyter Notebook för att visualisera, korrigera och bearbeta OCT-skanningar. Detta innehåller också ett exempel på bio volyms beräkning.

Tabell 1. Programvarukomponenter.

Parametern Värde Beskrivning
Ganymedes 1, 2, 3 Val av ULT-system och version
Sond 1, 2 Val av skanner lins
nAscans 32-900 Antal A-skanningar per B-skanning
nBscans 1-900 Antal B-skanningar
nCscans 128-1024 Antal djup pixlar
X 0.1-10 Bildens storlek i x-riktning (mm)
Y 0.1-10 Bildens storlek i y-riktning (mm)
uppfriskand 1-1,6 Brytningsindex (1 för luft, 1,33 för vatten)
avg_Ascans 3 Antal A-Scan medelvärdes
scanSpeed 1, 2, 3 A-scanningsfrekvens (5,5, 15 och 36 kHz)
Sökvägen ".. /% Y-% m-% D_% H_% M_% S " Målmapp för den förvärvade OCT skannar, använder tidsstämpel som namngivning confention
Colorgränser [0,0-256.0, 0,0-256.0] Färg gränser för de förvärvade skanningarna

Tabell 2. OCT parameterinställningar.

Figure 1
Figur 1. Översikt över hård-och mjukvarukomponenter. Steg motorerna i en GRBL-styrd positioneringsenhet är kabelanslutna till en Microcontroller, ansluten via USB till en enda dator. GRBL-servern är installerad på den senare, och rörelse av positionerings enheten kan styras från vilken webbläsare som helst via TCP/IP-anslutning. Alternativt kan navigeringen på positionerings enheten utföras från en python-kodad Jupyter-anteckningsbok (Imagesacquisition. ipynb, tilläggsfil 2) med hjälp av GRBLServer.py-biblioteket. ULT systemet är anslutet till en separat dator från vilken automatiserad OCT Scan förvärv kan utföras via ett Python-skript. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. OCT Scan korrigering arbetsflöde. Panel A visar en icke-bearbetade B-Scan av biofilm växer på en platt plexiglas yta. Bilden är förvrängd (böj) på grund av skillnader i banans längd av låg samstämmighet ljus genom linsen. OCT bildförvrängning kan korrigeras genom att identifiera en starkt reflekterande, platt referensyta i bilden. Först, 20 × 20 referenspunkter är jämnt fördelade över hela stacken av bilder. I var och en av dessa punkter är bildsignalen i genomsnitt över ett cirkel område (i x-y-riktning) för varje djup (z-plan), vilket ger en genomsnittlig djup profil för signalintensitet. Därefter appliceras ett modifierat Gaussiskt filter på för var och en av referens profilerna för 400. Panel B ger ett exempel på den ursprungliga signalen längs djup profilen som indikeras av den vertikala röda linjen i panel A, den genomsnittliga djup profilen och samma profil efter det modifierade Gaussiska filtret har tillämpats. Det modifierade Gaussiska filtret gör det möjligt att identifiera lokala Maxima i signalintensitet, vilket identifierar platsen för den starkt reflekterande referensytan. Korrekt identifierade referenspunkter väljs sedan baserat på koordinaterna för deras grannar i tre dimensioner. I exemplet i panel C hölls de gula punkterna för efterföljande bildkorrigering medan lila sådana förkastades. En 2nd för polynom yta är sedan passa till korrekt placerade referenspunkter och används för att korrigera förvrängningen i den ursprungliga Oct bilden genom att skifta pixlar i z-riktning. Genomsnittlig bakgrundsintensitet uppskattas från ett tomt område i bilden och subtrareras från de korrigerade bilderna. Panel D visar samma B-Scan efter korrigering och bakgrund subtraktion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Höjd kartor. Biofilm topologi kan visualiseras som 2D höjd kartor där tjockleken av biomassan är färgkodade. För detta, en 3D-okt bild är thresholded och biofilm tjocklek beräknas som avståndet av den översta signalen till underlaget. Panel A visar den binära masken för en B-skanning som erhålls efter tröskelvärde. Den blå linjen indikerar den översta signalen medan den röda linjen visar referensytan. Panel B visar ett exempel på den erhållna höjd kartan, skalas enligt den axiella upplösningen av OCT sonden. Den röda linjen indikerar B-skannens position i panel A.

Figure 4
Figur 4. Representativa resultat som visar effekten av flödeshastighet på biofilm tillväxt. Vi studerade phototrophic Stream biofilm morfogenes längs en gradient i flödeshastighet med hjälp av FLUME experiment. Flödeshastigheten ökas med avståndet från FLUME-inloppet. Efter 10 dagars tillväxt, biofilm morfologi kännetecknades av automatiserade OCT i olika upplösning och täcker olika rumsliga skalor. Höjd kartor (A, B och C) uppvisar morfologin av biofilm odlas under låg, medelhög och Högflödes hastighet, respektive. Dessa höjd kartor beräknas från OCT-skanningar med voxels-storlek i x, y-riktning på 4 μm. Skannings ytans yta är en kvadrat med 3,6 mm kantlängd. Panelerna D, E och F visar höjd kartor (låg, medelhög och Högflödes hastighet, respektive) erhålls genom sömnad 3 × 3 OCT skannar med en Voxel storlek i XY-riktning av 11 μm, skanningsområdet 10 mm2 och en överlappning mellan angränsande skanningar av 30%. Panel G visar en höjd karta över biofilm som växer längs hela den hastighetgradienten som uppnåtts i detta FLUME-experiment. Det erhölls genom att sy 3 × 51 OCT skannar med en Voxel storlek i XY-riktning 40 μm, skanningsområdet 10 mm2 och en överlappning mellan angränsande skanningar av 30%. Den totala skanningsyta som uppnåtts är 24 × 353 mm. panel H rapporterar bio volym i ett fyrkantigt rörligt fönster på 3,6 mm kant. Den genomsnittliga bio volymen minskade signifikant som en funktion av avståndet från inloppet (I). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Precisionstest för positionerings enheten. Precisionen för positionerings enheten bedömdes genom att montera en 20,2 megapixelkamera utrustad med ett 35 mm makroobjektiv på positionerings enheten, fokuserat på en färgad markering. Positionerings enheten flyttades i en slumpmässig riktning bort från märket och sedan positionerade tillbaka för totalt 80 cykler. Positionen för märket jämfördes sedan. Figuren visar skiftet i x-och y-riktning med avseende på den första bilden. Observera att den maximala förskjutningen är cirka 16 μm i y-riktning och ännu mindre i x-riktning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande fil 1. ImageProcessing. ipynb. please Klicka här för att ladda ner denna fil.

Kompletterande fil 2. Imagesacquisition. ipynb. please Klicka här för att ladda ner denna fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

OCT Imaging lämpar sig väl för att lösa strukturer i mikrometerområdet med en FOV av flera kvadratmillimeter. Det är alltså ett kraftfullt verktyg för biofilmforskning10,18. Men, OCT är för närvarande begränsad till en maximal skanningsyta på 100-256 mm2, medan biofilm strukturella mönster ofta överstiger denna rumsliga skalan19, särskilt när morfologisk differentiering drivs av storskaliga miljö gradienter 20. det automatiserade ULT-bildsystem som beskrivs i detta protokoll utökar den yta som kännetecknas av ULT till flera kvadratcentimeter, vilket effektivt möjliggör övervakning av den morfologiska differentieringen av biofilm över ett relevant intervall av rumsliga skalor (från några millimeter till flera centimeter). Den höga positioneringsnoggrannheten (inom 16 μm; Figur 5) gör det möjligt att korrekt övervaka den strukturella utvecklingen av biofilmer under längre tidsperioder (figur 4), effektivt öka möjligheterna att få en mekanistisk förståelse av drivkrafterna för biofilmer morfologisk differentiering . På samma gång är detta in situ biofilm karakterisering teknik är icke-invasiv och minimerar interferens med biofilm tillväxt. Den bildbehandling lösningar som presenteras här bygger på tidigare anställda analyser av biofilm OCT datauppsättningar16, men automatiseringen ger verktyg för oöverträffad tid och utrymme löst Oct datauppsättning analyser.

Detta system utformades och benchmarkades med en specifik ULT-enhet, enligt beskrivningen i protokollet. Kritiska steg i protokollet gäller främst fastställandet av OCT upplösning och fokusering, som båda är kritiska för hög bildkvalitet. En begränsning av korrigering av sfäriska avvikelser rutin är att det beror på närvaron av en mycket reflekterande plan yta. Alternativt kan en standard korrigering yta mätas, och sedan användas för att korrigera OCT skannar. Dessutom, sömnad av OCT skannar beror på tillräckliga strukturella funktioner för att anpassa angränsande skanningar. Vid enhetlig bio filmdistribution eller låg biofilm täckning kan sömnad uppnås endast på precisionen i positionerings anordningen. Slutligen, som i alla andra bildbearbetning pipeline, när du konfigurerar dessa verktyg, är det viktigt att noggrant utvärdera prestanda för bearbetningsalgoritmen på en uppsättning representativa skanningar innan du hanterar batchar med bilder.

Både hård-och programvara utformades för att ge full modularitet av de enskilda delarna. Mer specifikt kan detta system enkelt anpassas för att arbeta med andra verktyg för biofilmer karakterisering som makrofotografering med hjälp av Hyperspektrala kameror eller mikrosensorprofilering. Kopplingen av strukturell information med lokaliserade gradienter i resurser runt och inom bio Films kommer att ge nya och avgörande insikter om hur biofilmer anpassas för att optimera resurstilldelningen. Flexibiliteten genomförs också med hjälp av Jupyter notebooks, ett Open-Access, snabb och mångsidig programvara utveckla verktyg.

En kritisk begränsning av OCT Imaging i allmänhet förblir funktionshindret för att lösa snabbt rörliga objekt. Till exempel, streamers vid förlängning till och flytta med flödet är inte korrekt avbildas. Tillämpligheten av detta verktyg är således begränsad till relativt fasta, icke-rörliga biofilm strukturer. Systemet är optimerat för att fungera självständigt, men initiala inställningar och vid behov, manuell justering av fokus och belysning, krävs fortfarande. Detta innebär en betydande begränsning om proverna skiljer sig avsevärt i densitet och reflekterande egenskaper. Fullständig automatisering, inklusive programvarustyrd fokusering och justering av belysningen, kan dock uppnås med hjälp av liknande principer (t. ex. stepper-motorer och programvaru återkopplingar).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Sebastian Schäfer är anställd på Thorlabs Inc.

Acknowledgments

Vi tackar Mauricio Aguirre Morales för hans bidrag till utvecklingen av detta system.  Finansiellt stöd kom från Swiss National Science Foundation till T.J.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OCT Probe Thorlabs GAN210C1 OCT imaging device
OCT scan lens Thorlabs  OCT-LK3-BB
Immersion adapter Thorlabs  OCT-IMM3-SP1
Stepcraft 840 CK STEPCRAFT NA positioning device
microcontroller Arduino Uno R3 NA
Single-board computer Raspberry PI NA
camera Canon EOS 7D Mark II NA
camera lens Canon MACRO EFS 35 mm NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).
  2. Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature reviews. Microbiology. 14, 563 (2016).
  3. Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop. Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).
  4. Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow. Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).
  5. Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).
  6. Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Microbiology. 14, 251-263 (2016).
  7. Battin, T. J., et al. Microbial landscapes: new paths to biofilm research. Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).
  8. Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).
  9. Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm. J. of Biomedical Optics. 21, (12), 127002 (2016).
  10. Wagner, M., Horn, H. Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review. Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).
  11. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
  12. Haisch, C., Niessner, R. Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography. Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).
  13. Drexler, W., Fujimoto, J. G. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. Springer Verlag. (2008).
  14. Fercher, A. F. Optical coherence tomography – development, principles, applications. Zeitschrift für Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).
  15. Lee, H. -C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy. Biomedical Optics Express. 41236-41254 (2013).
  16. Fortunato, L., Leiknes, T. In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping. Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).
  17. Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics. Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).
  18. Roche, K. R., et al. Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams. Water Resources. 53, 222-236 (2016).
  19. Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor. Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).
  20. Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics