استخدام الكنورهابدية إليجانس لدراسة الآثار عبر الأجيال ومتعددة من المواد السامة

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

والآثار العابرة للأجيال للمواد الكيميائية الثابتة ضرورية للحكم على آثارها الطويلة الأجل في البيئة وعلى صحة الإنسان. نحن نقدم طرق مفصلة جديدة لدراسة الآثار عبر ومتعددة الأجيال باستخدام الديدان الخيطية الحية الحرة Caenorhabditis elegans.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Li, Z., Ai, F., Zhang, J., Yu, Z., Yin, D. Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants. J. Vis. Exp. (149), e59367, doi:10.3791/59367 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

والمعلومات المتعلقة بسمية المواد الكيميائية ضرورية في تطبيقها وإدارة النفايات. وبالنسبة للمواد الكيميائية ذات التركيزات المنخفضة، فإن الآثار الطويلة الأجل هامة جداً في الحكم على آثارها في البيئة وعلى صحة الإنسان. وفي إظهار التأثيرات الطويلة الأجل، توفر آثار المواد الكيميائية على مدى أجيال في الدراسات الحديثة رؤية جديدة. هنا، ونحن نوصف بروتوكولات لدراسة آثار المواد الكيميائية على أجيال متعددة باستخدام الديدان الخيطية الحية الحرة Caenorhabditis elegans. ويُعرض جانبان هما: (1) دراسات الأثر عبر الأجيال (TG) و (2) التي تُفصل هذه الأخيرة إلى دراسات عن التعرض المتعدد الأجيال ودراسات الأثر المتبقية المتعددة الأجيال. دراسة تأثير TG قوية لغرض بسيط لتحديد ما إذا كان التعرض الكيميائي للوالدين يمكن أن يؤدي إلى أي عواقب متبقية على الذرية. بعد قياس الآثار على الآباء والأمهات، وتستخدم حلول هيبوكلوريت الصوديوم لقتل الوالدين والحفاظ على الذرية وذلك لتسهيل قياس تأثير على الذرية. يتم استخدام دراسة تأثير TG لتحديد ما إذا كان يتأثر الذرية عندما يتعرض أحد الوالدين للملوثات. وتُستخدم دراسة تأثير MGE وMGR بشكل منهجي لتحديد ما إذا كان التعرض المستمر للأجيال يمكن أن يؤدي إلى استجابات متكيفة في الذرية على مر الأجيال. وتستخدم بعناية البيك اب ونقل للتمييز بين الأجيال لتسهيل قياس تأثير على كل جيل. كما قمنا بدمج بروتوكولات لقياس سلوك الحركة، والتكاثر، وعمرها، والتغيرات في التعبير الكيميائي الحيوي والتعبير الجيني. كما تُقدَّم بعض التجارب على سبيل المثال لتوضيح دراسات الأثر عبر الأجيال ومتعددةها.

Introduction

ويعتمد تطبيق المواد الكيميائية وإدارتها اعتماداً كبيراً على المعلومات المتعلقة بآثارها بتركيزات معينة. وتجدر الإشارة إلى أن الوقت عنصر أساسي آخر بين الآثار والتركيزات. وهذا يعني أن المواد الكيميائية، ولا سيما تلك ذات التركيزات المنخفضة في البيئات الفعلية، تحتاج إلى وقت لإثارة آثار قابلة للقياس1. ولذلك، يقوم الباحثون بترتيب أطوال مختلفة لمدة التعرض في التجارب الحيوانية، وحتى تغطية دورة الحياة بأكملها. على سبيل المثال، تعرضت الفئران للنيكوتين لمدة 30 أو 90 أو 180 يوما لدراسة آثاره السامة 2. ومع ذلك، فإن فترات التعرض هذه لا تزال غير كافية لتوضيح الآثار الطويلة الأجل للملوثات (مثل الملوثات العضوية الثابتة) التي يمكن أن تستمر على مدى أجيال من الكائنات الحية في البيئة. ولذلك، فإن الدراسات المتعلقة بالآثار على مر الأجيال تكتسب المزيد والمزيد من الاهتمام.

هناك جانبان رئيسيان في دراسات تأثير الأجيال. الأول هو دراسة تأثير عبر الأجيال (TG) التي يمكن أن تختبر بقوة ما إذا كان التعرض الكيميائي للوالدين يمكن أن يؤدي إلى أي عواقب على الذرية3. والثاني هو دراسة تأثير متعددة الأجيال التي هي أكثر منهجية مع اعتبارات في كل من التعرض والآثار المتبقية. فمن ناحية، تُستخدم آثار التعرض المتعدد الأجيال لتوضيح الاستجابات التكيفية في الحيوانات للبيئات الصعبة الطويلة الأجل. ومن ناحية أخرى، تُستخدم الآثار المتبقية المتعددة الأجيال لإثبات العواقب المتبقية الطويلة الأجل بعد التعرض، حيث أن تعرض الأمهات يصاحب التعرض للجنين للذرية الأولى والتعرض للخط الجرثومي للثاني الذرية مما يجعل الذرية الثالثة كالجيل الأول تماما من التعرض4.

وعلى الرغم من أن الثدييات (مثل الفئران) هي كائنات نموذجية في دراسات السمية خاصة فيما يتعلق بالبشر، فإن تطبيقها في دراسة آثار الأجيال يستغرق وقتاً طويلاً جداً ومكلفاً وأخلاقياً فيما يتعلق بـ 5. وفقا لذلك، الكائنات الحية بما في ذلك القشريات Daphnia ماجنا6، الحشرات دروسوفيلا melanogaster7 وحمار وحشي دانيو ريووتوفير خيارات بديلة. ومع ذلك، فإن هذه الكائنات إما تفتقر إلى أوجه التشابه مع البشر، أو تتطلب معدات محددة في الدراسات.

Caenorhabditis elegans هو نيماتود صغير يعيش بحرية (حوالي 1 ملم في الطول) مع دورة حياة قصيرة (حوالي 84 ساعة في 20 درجة مئوية)9. هذا الديدان الخيطية تشترك في العديد من المسارات البيولوجية المحافظة على البشر، وبالتالي فقد استخدمت على نطاق واسع لتوضيح آثار الضغوط المختلفة أو المواد السامة10. وتجدر الإشارة إلى أن 99.5٪ من الديدان الخيطية هي hermaphrodites مما يجعل هذه الكائنات مناسبة للغاية في دراسة آثار الأجيال، على سبيل المثال، آثار TG من المعادن الثقيلة وsulfonamides3،11، آثار MGE من الجسيمات النانوية الذهب والثقيلة المعادن12 ودرجة الحرارة13، MGR آثار سلفوناميد14، وعلى حد سواء MGE وMGR آثار التشعيع غاما15 والليندين4. وعلاوة على ذلك، تم العثور على نتائج مماثلة بين آثار المواد الكيميائية (مثل zearalenone) على تطوير واستنساخ الفئران وC. elegans16،17، والتي من شأنها أن توفر ميزة لاستقراء الآثار من هذا الحيوان الصغير إلى البشر.

كل من TG وMG دراسات تأثير تستغرق وقتا طويلا وتحتاج إلى تصميم دقيق والأداء. وتجدر الإشارة إلى وجود اختلافات في خيارات مرحلة الحياة، وظروف التعرض، وأساليب فصل الأجيال في الدراسات المذكورة أعلاه. وتعوق هذه الاختلافات المقارنة المباشرة بين النتائج وتعوق المزيد من تفسير النتائج. ولذلك، لا بد من وضع بروتوكولات موحدة لتوجيه دراسات آثار الـ TG وMG، وكذلك تقديم صورة أكبر للكشف عن أنماط مماثلة من مختلف المواد السامة أو الملوثات في العواقب الطويلة الأجل. وسوف يظهر الهدف الزائد من هذه البروتوكولات عمليات عملية واضحة في دراسة الآثار عبر الأجيال ومتعددة مع C. elegans. وستستفيد البروتوكولات من الباحثين المهتمين بدراسة الآثار الطويلة الأجل للمواد السامة أو الملوثات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 - الثقافة E. coli OP50

  1. إعداد 1 M محلول هيدروكسيد الصوديوم عن طريق حل 4 غرام من هيدروكسيد الصوديوم في 100 مل من المياه.
  2. إعداد مرق lysogeny (LB) المتوسطة عن طريق حل 10 غرام من التربون، 5 غرام من استخراج الخميرة و 10 غرام من كلوريد الصوديوم مع 1 لتر من الماء النقي في قارورة مخروطية 1 لتر. ضبط الحموضة إلى 7.0 مع 1 M محلول هيدروكسيد الصوديوم.
  3. Aliquot السائل LB المتوسطة من step1.2 إلى 20 قوارير مخروطية (الحد الأقصى لحجم المسموح به: 100 مل) مع 50 مل المتوسطة في كل. تغطية قوارير مخروطية مع ورق كرافت.
  4. تعقيم السائل LB المتوسطة في 121 درجة مئوية و 0.105 MPa لمدة 20 دقيقة.
  5. ماصة 200 درجة مئوية من المعلقات البكتيرية (انظر الخطوة 1.8) أو اختيار مستعمرة صغيرة من أجار (في الخطوة 2.14) باستخدام حلقة تلقيح، وضعه في LB المتوسطة.
  6. احتضان وسط LB مع هز في 150 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة. سوف تتغير وسط LB من سائل بني شفاف إلى تعليق بلون كاكي عكر.
  7. استخدم التعليق البكتيري من 80% من إجمالي القوارير لتوفير E. coli OP50 كغذاء نيماتود لاستخدامه في الخطوة 2.11.
  8. تخزين بقية القوارير التي تحتوي على تعليق البكتيرية في الثلاجة في 4 درجة مئوية. ماصة 200 درجة مئوية من تعليق LB على الجانب العلوي من وسط LB الطازجة (الخطوة 1.4) وكرر step1.6 للحضانة اللاحقة.

2- الثقافة جيم إليغانس

ملاحظة: الثقافة C. elegans باستخدام وفقا للخطوات 2.1 إلى 2.11 استنادا إلى الأساليب القياسية18.

  1. حل 22.8 غرام من K2HPO4•3H2O في 100 مل من الماء المقطر المعقمة.
  2. حل 6.8 غرام من KH2PO4 في 50 مل من الماء المقطر المعقمة.
  3. خلط الحلول من الخطوتين 2.1 و 2.2، لإعداد 1 M K2HPO 4-KH2PO4 المخزن المؤقت (درجة الحموضة 6.0، 150 مل في المجموع).
  4. إعداد 1.0 M MgSO4 عن طريق حل 1.232 غرام من MgSO4• 7H2O في 5 مل من الماء المقطر المعقمة، وتعقيمه عن طريق تصفية الحل من خلال 0.22 م مرشح غشاء معقمة يمكن التخلص منها في حاوية معقمة.
  5. إعداد 1 M CaCl2 عن طريق حل 0.554 غرام من CaCl2 في 5 مل من الماء المقطر المعقمة، وتعقيمه عن طريق تصفية الحلول من خلال 0.22 ميكرومتر فلتر غشاء معقمة يمكن التخلص منها في حاوية معقمة.
  6. إعداد 1 M حل الكولسترول عن طريق حل 0.025 غرام من الكوليسترول في 5 مل من الإيثانول المطلق، وتعقيمه عن طريق تصفية الحل من خلال 0.22 م مرشح غشاء التخلص منها معقمة في حاوية معقمة.
  7. إعداد تدفق نمو الديدان الخيطية (NGM) أجار بإضافة 17 غرام من مسحوق أجار، 2.5 غرام من peptone و 3 غرام من كلوريد الصوديوم إلى قارورة مخروطية 1 لتر تحتوي على 1 لتر من الماء النقي جدا. إضافة 25 مل من K2HPO4-KH2PO4 الحل من الخطوة 2.3.
  8. تعقيم أجار NGM من الخطوة 2.7 في 121 درجة مئوية مع 0.105 ميغاباسكال لمدة 20 دقيقة.
  9. تبريد أجار NGM إلى حوالي 50 درجة مئوية، إضافة1 مل من 1 M MgSO 4، 1 M CaClو 5 ملغ / مل الكولسترول الإيثانول الحل من الخطوات 2.4 إلى 2.6 في المتوسط ومزجها جيدا.
  10. صب ~ 10 مل NGM أجار المتوسطة لكل طبق في 100 أطباق بيتري معقمة (6.0 سم قطرها). تبرد المتوسطة في أطباق بيتري إلى درجة حرارة الغرفة لتشكيل أجار الصلبة.
  11. ماصة 170 ميكرولتر من التعليق البكتيري من الخطوة 1.7 على أجار NGM المذكورة أعلاه باستخدام طرف معقم. هز أجار NGM قليلا لتوزيع وسط LB بالتساوي على سطح أجار NGM.
  12. تلقيح أجار NGM مع الجانب العلوي حتى في 37 درجة مئوية لمدة 8-12 ساعة لتشكيل العشب البكتيري.
  13. استخدام معظم أجار مع المروج البكتيرية من الخطوة 2.12 إلى الديدان الخيطية الثقافة في الخطوة 2.15 أو 2.19.
  14. تخزين 1 أو 2 أجار من أعلى الجانب إلى أسفل لتجنب تبخر المياه والتلوث في الثلاجات في 4 درجة مئوية وذلك للحفاظ على البكتيريا في التلوث.
  15. عندما يكون هناك أقل من 2000 الديدان الخيطية على أجار NGM تخزين (من التجارب السابقة أو الموهوبين من مختبرات أخرى)، وقطع سدس أجار NGM الذي يحتوي على C. elegans مع طرف معقمة ونقله إلى أجار NGM أعدت حديثا مع البكتيريا البكتيرية العشب (من الخطوة 2.13). حافظ على الـ NGM agars إلى أعلى إلى أسفل في حاضنة 22 درجة مئوية للثقافة اللاحقة.
  16. عندما يكون هناك أكثر من 2000 الديدان الخيطية على أجار NGM تخزين، وتدفق الديدان الخيطية من أجار NGM مع 2 مل من المياه المعقمة في أنابيب الطرد المركزي. وسيؤدي إدخال 2 مل من المياه إلى إنتاج 1.5 مل تقريباً.
  17. السماح للنيماتودس لتسوية في أنابيب الطرد المركزي من لمدة 30 دقيقة.
  18. تسوية الديدان الخيطية في أنابيب الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة. إضافة 1 مل من الماء المعقم في كل أنبوب لإعادة تعليق الديدان الخيطية.
  19. توزيع تعليق الديدان الخيطية (ما يقرب من 1.5 مل في المجموع) عن طريق الأنابيب 150 € L على كل أجار NGM جديدة مع العشب البكتيري (من الخطوة 2.13)، مما يجعل 8-10 أجار NGM جديدة في المجموع.
  20. حافظ على أجارNG NGM من الخطوة 2.19 إلى أعلى الجانب في حاضنة 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها ومن ثم أعلى الجانب لأسفل للثقافة اللاحقة.
  21. كرر الخطوة 2.15 أو الدرجة 2.16-2.20 كل ثلاثة أيام.

3. إعداد البيض المتزامن واليرقات L3 من C. elegans

  1. امسح الديدان الخيطية الجاذبة والبيض المنتج حديثاً من أجارNGM إلى أنابيب طرد مركزي معقمة، مع 2 مل من الماء المعقم على كل أجار NGM مما أدى إلى حوالي 1.5 مل من الناتج.
  2. تسوية الديدان الخيطية في أنابيب الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة، ومن ثم تجاهل 85٪ من supernatants عن طريق الأنابيب.
  3. إعداد حلول هيبوكلوريت الصوديوم عن طريق حل 0.6 غرام من هيدروكسيد الصوديوم و 5 مل من NaOCl (4-6٪ التدرجات النشطة، انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) مع 25 مل من الماء لجلب هيدروكسيد الصوديوم إلى 0.5 م وهيدروكسيد الصوديوم إلى 1٪.
  4. خلط الكريات من الخطوة 3.2 (وضععلامة على حجم V 0) مع 7 أضعاف V0 من حلول هيبوكلوريت الصوديوم من (الخطوة 3.3، أي نسبة الحجم من 1:7)19.
  5. هز أنابيب الطرد المركزي كل 2 دقيقة لمدة 10-15 دقيقة لlyse اليرقات والديدان الخيطية الكبار؛ لون تعليق الديدان الخيطية سوف تتحول من عكر لمسح.
  6. طرد مركزي الأنابيب في 700 × ز لمدة 3 دقائق في 20 درجة مئوية، ومن ثم التخلص من supernatants عن طريق الأنابيب.
  7. إعادة تعليق الكريات في 5 أضعاف V0 من الماء المعقم لغسل البيض متزامنة مع العمر. الطرد المركزي في 700 × ز لمدة 3 دقائق في 20 درجة مئوية، ومن ثم تجاهل supernatants.
  8. كرر الخطوة 3.7 مرتين.
  9. أضف 1 أضعاف V0 من الماء المعقم في الأنابيب لإعادة تعليق البيض المتزامن مع العمر.
  10. توزيع تعليق البيض عن طريق الأنابيب 50 € L على كل أجار NGM جديدة مع العشب البكتيري من الخطوة 2.13. حافظ على أجار NGM من أعلى جانب في حاضنة 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، مما يسمح للمياه أن تتبخر أو تُسْتَسْتَكِب من العشب البكتيري. ثم، جعل NGM أجارأعلى الجانب إلى أسفل للثقافة اللاحقة. وضع علامة على الوقتكما وقت البيض (T البيض).
  11. إعداد K-المتوسطة عن طريق حل 3 غرام من حمض الكلس و 2.36 غرام من كيلو كل في 1 لتر من الماء. تعقيم المتوسطة في 121 درجة مئوية و 0.105 MPa لمدة 20 دقيقة وتبريده إلى درجة حرارة الغرفة.
  12. عندما يصل الوقت إلى 36 ساعة بعدالبيضT ، تصل الديدان الخيطية إلى مرحلة يرقات L3 (L3 nematodes)20. اغسل الديدان الخيطية من أجارNGM في أنابيب الطرد المركزي، مع 2 مل من المياه المعقمة على كل أجار NGM مما أدى إلى ما يقرب من 1.5 مل من الناتج.
  13. بعد تسوية لمدة 30 دقيقة، واستبدال 85٪ من supernatants (عن طريق الأنابيب) مع K-المتوسطة من 2 ح لهضم الطعام في الشجاعة3.
  14. تخلص من الـ supernatants. استخدم K-medium (من الخطوة 3.11) لضبط تعليق الديدان الخيطية إلى حوالي 200 نيماتود لكل 100 ميكرولتر للتجارب اللاحقة.

4. استخدام C. elegans لدراسة تأثير عبر الأجيال

  1. إعداد الحلول الكيميائية مع 5 مستويات تركيز وواحد المذيبات أو السيطرة المطلقة، أي 6 مجموعات في المجموع.
  2. إضافة 100 ميكرولتر من التحكم أو الحلول الكيميائية مع 10 آبار كما يتكرر في كل مجموعة (أي، 60 بئرا في المجموع) في المنطقة الوسطى من ميكروبليت معقمة 96 جيدا لتجنب آثار الحافة.
  3. تمييع تعليق الديدان الخيطية من الخطوة 3.14 مع K-medium من الخطوة 3.11 بمقدار 10 أضعاف. إضافة 100 μL تعليق الديدان الخيطية إلى كل من الآبار 60 من الخطوة 4.2. وضع علامة على الوقت كما ر0.
  4. عندما يصل الوقت إلى 24 ساعة بعد ر0، عد الديدان الخيطية الحية والميتة في الآبار. حساب التركيز القاتل المتوسط (LC50).
  5. إعداد سلسلة من 5 تركيزات أقل من 10٪ من قيم LC50.
  6. إضافة 100 ميكرولتر من التحكم أو الحلول الكيميائية (من الخطوة 4.5) مع 10 الآبار كما يتكرر في كل مجموعة (أي، 60 بئرا في المجموع) في المنطقة الوسطى من ميكروبليت معقمة 96 جيدا لتجنب آثار الحافة.
  7. إضافة 100 درجة مئوية من K-المتوسطة التي تحتوي على ما يقرب من 200 L3 الديدان الخيطية (من الخطوة 3.14) إلى كل من الآبار 60 من الخطوة 4.6. وضع علامة على الوقت كما T0.
  8. إجراء التعرض لمدة 24 إلى96 ساعة منذ T 0.
  9. بعد التعرض، جمع الديدان الخيطية من خمسة آبار في كل مجموعة إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل عن طريق الأنابيب (أي 6 أنابيب في المجموع).
  10. تسوية الديدان الخيطية لمدة 30 دقيقة، وتجاهل supernatants عن طريق الأنابيب، وإعادة تعليق وغسل الديدان الخيطية في الجزء السفلي مع 1 مل من الماء المعقم.
  11. قم بتسوية الديدان الخيطية لمدة 30 دقيقة، وتجاهل الناطورات عن طريق الأنابيب واستخدام الديدان الخيطية في الجزء السفلي لقياسات المؤشر (انظر القسم 7) من الجيل الأم المعرضة التي تم وضع علامة F0.
  12. جمع وتسوية وغسل (عن طريق إعادة تعليق) الديدان الخيطية من الآبار الخمسة المتبقية في كل مجموعة في الخطوة 4.9 وفقا للخطوة 4.10.
  13. تسوية الديدان الخيطية من الخطوة 4.12 لمدة 30 دقيقة. نقل تعليق الديدان الخيطية بالتساوي على ثلاثة أجارNGM أعدت حديثا مع العشب البكتيري من الخطوة 2.13.
  14. احتضان الديدان الخيطية لمدة 36 ساعة لتصبح الجاذبية وأداء العمر المزامنة وفقا للخطوات 3.1-3.9. احتضان البيض متزامنة على أجار NGM المعنية مع العشب البكتيري من الخطوة 2.13 لمدة 36 ساعة.
  15. اغسل الديدان الخيطية على أجار NGM من الخطوة 4.14 إلى ستة أنابيب الطرد المركزي.
  16. تسوية الديدان الخيطية لمدة 30 دقيقة، وتجاهل supernatants عن طريق الأنابيب. إعادة تعليق وغسل الكريات مع 1 مل من الماء المعقم.
  17. تسوية الديدان الخيطية لمدة 30 دقيقة، وتجاهل supernatants عن طريق الأنابيب. استخدم الديدان الخيطية في الجزء السفلي لقياسات المؤشر (انظر القسم 7) من جيل الذرية الذي تم وضع علامة T1 عليه.

5. استخدام C. elegans للتعرض متعدد الأجيال (MGE) دراسة تأثير

  1. مزيج 99.0 مل NGM أجار (من الخطوة 2.9) مع 1 مل من التحكم أو الحلول الكيميائية (تركيزات منخفضة وعالية في هذا البروتوكول كأمثلة، أي ثلاث مجموعات في المجموع).
  2. صب ما يقرب من 10 مل من NGM أجار المتوسطة لكل طبق من الخطوة 5.1 إلى 100 أطباق بيتري معقمة (6.0 سم قطر). تبرد المتوسطة في أطباق بيتري إلى درجة حرارة الغرفة لتشكيل أجار الصلبة.
  3. تعليق الماصات البكتيرية على أجار وفقا للخطوة 2.11.
  4. توضع الأغطية العلوية لأطباق بيتري جانباً وتُعرّض العشب البكتيري للأشعة فوق البنفسجية (145 درجة مئوية/سم2)في خزانة السلامة الأحيائية لمدة 15 دقيقة.
  5. اختيار مستعمرة صغيرة باستخدام حلقة تلقيح، وضعه في وسط LB من أجار في الخطوة 1.4. احتضان وسط LB مع الهز بسرعة 150 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لتأكيد النمو البكتيري negligle، والتحقق من صحة الخطوة قتل 5.4.
  6. ماصّة البيض متزامنة العمر من الخطوة 3.9 على أجار (من الخطوة 5.4). حدد بداية التعرض للجيل الأصل F0 وعلامة اليوم 0 (D0).
  7. حضانة أجار لمدة 3 د في 20 درجة مئوية. ثم (أي على D3)، استخدم الديدان الخيطية الناضجة لقياس الآثار في F0 (انظر القسم 7).
  8. أيضا على D3، واختيار F0 الديدان الخيطية الناضجة على أجار NGM جديدة (من الخطوة 5.4) باستخدام قضيب زجاجي، الذي تم تجهيز نهايته مع سلك الألياف من صنع الإنسان عازمة في حلقة.
  9. على D4، اختيار وتجاهل الديدان الخيطية F0 ناضجة من أجار NGM. وضع علامة على الديدان الخيطية الذرية التي فقست حديثا داخل هذه 24 ساعة (من D3 إلى D4) كما F1 لتجربة التعرض من الجيل الثاني.
  10. في D6، مؤشرات القياس (انظر القسم 7) من الديدان الخيطية الناضجة F1 التي شهدت التعرض لمدة 3 أيام.
  11. على D9، كرر الخطوات 5.8-5.10، استخدم الديدان الخيطية F1 لإعادة إنتاج الديدان F2 وقياس الآثار على الديدان الخيطية F2.
  12. في D12، كرر الخطوة 5.11، استخدم الديدان الخيطية F2 لإعادة إنتاج الديدان F3 وقياس الآثار على الديدان الخيطية F3. من خلال نفس الطريق، إعادة إنتاج الذرية وقياس آثار MGE على جيل النسل ن(Fn).

6. استخدام C. elegans لدراسة تأثير المخلفات متعددة الأجيال (MGR)

  1. كرر الخطوات 5.1 إلى 5.7. على D3، واختيار F0 الديدان الخيطية الناضجة على أجار NGM جديدة دون المواد الكيميائية المضافة (من الخطوة 2.13).
  2. على D4، واختيار وتجاهل الديدان الخيطية F0 ناضجة. وضع علامة على الديدان الخيطية الذرية التي فقست حديثا داخل هذه 24 ح كما الديدان الخيطية T1.
  3. على D6، قياس المؤشرات (انظر القسم 7) من الديدان الخيطية الناضجة T1 التي نمت لمدة 3 أيام.
  4. في D9، كرر الخطوات 6.2-6.3، استخدم الديدان الخيطية T1 لإعادة إنتاج الديدان الخيطية T2 وقياس الآثار في الديدان الخيطية T1.
  5. في D12، كرر الخطوات 6.4، استخدم الديدان الخيطية T2 لإعادة إنتاج الديدان الخيطية T3 وقياس الآثار في الديدان الخيطية T2. من خلال نفس الطريقة، إعادة إنتاج الذرية وقياس آثار MGR على n th ذرية الجيل (Tn) الديدان الخيطية من F0، أو الديدان الخيطية nth (Tn') من Fn من الخطوة 5.12.

7- مؤشرات القياس

  1. قياس سلوك الحركة.
    1. امسح الديدان الخيطية من أجار NGM باستخدام المياه المعقمة وجمعها في أنابيب الطرد المركزي. تسوية الديدان الخيطية لمدة 30 دقيقة، وتجاهل supernatants واستخدام الديدان الخيطية في الكريات لقياس تأثير.
    2. إعادة تعليق الديدان الخيطية في الكريات مع 1 مل من الماء المعقم والماصة لهم على أجار NGM دون العشب البكتيري من الخطوة 2.10.
    3. استخدم مجهر تشريح لتسجيل الديدان الخيطية لتردد الانحناء (BBF) الذي يشير إلى الأوقات التي يغير فيها المصباح الخلفي للالبلعوم الاتجاه على طول الاتجاه الرأسي لمسار السفر ضمن فاصل زمني مدته 60 ثوانً.
    4. استخدم مجهر التشريح لتسجيل حركة الانعكاس (RM) التي تشير إلى الأوقات التي يتغير فيها اتجاه السفر أكثر من 90 درجة بما في ذلك المنعطفات الخلفية ومنعطف أوميغا (OT) في فاصل زمني من 60 s. يشير OT إلى الحركة عندما يلامس رئيس الديدان الخيطية أو اللمسات تقريبا ذيله مما يجعل شكل الديدان الخيطية مثل الرسالة اليونانية أوميغا (Ω).
      ملاحظة: تم فحص 6 على الأقل من الديدان الخيطية لكل علاج في كل تكرار تجريبي.
أمثلة على تأثيرات MGE (F0 إلى F3) على التكاثر والعمر مع 3 مجموعات (تحكم واحد وعلاجين للتعرض).
اليوم عدد الـ NGM أجار لدراسة MGE تفسير
عمر الاستنساخ
صفر 30 (التعرض F-0) 10 نسخ متماثل لكل مجموعة، تم وضع علامة F0-1-1-0 إلى F0-3-10-0، مع الرقم الأخير لإظهار أيام البقاء على قيد الحياة.
1 30 (F0 البقاء على قيد الحياة 1 د) F0-1-1-0 إلى F0-3-10-0 يجب تغيير F0-1-1-1 إلى F0-3-10-1.
2 30 (F0 البقاء على قيد الحياة 2 د) F0-1-1-1 إلى F0-3-10-1 يجب تغيير F0-1-1-2 إلى F0-3-10-2.
لا حاجة لنقل الديدان الخيطية F0 حتى 3 د.
3 30 (F0 البقاء على قيد الحياة 3 د، تطهيرها بعد نقل الديدان الخيطية وجمع) بعد 3 د، الديدان الخيطية F0 ناضجة وتستخدم 36 أجار NGM جديدة (مع 2 الديدان الخيطية على كل أجار) لمراقبة بقائهم والإنجاب.
36 (F0-1-1-3 إلى F0-3-12-3) وينبغي إجراء تجارب أولية لترتيب عدد الديدان الخيطية F0، مما يضمن ما لا يقل عن 200 ذرية لنجاح العمليات المتعددة الأجيال.
وتجدر الإشارة إلى أنه إذا تمت دراسة آثار الـ MGR، ينبغي نقل الديدان الخيطية F0 إلى أجار NGM واضحة دون التعرض للمواد الكيميائية، وينبغي الإشارة إلى أن T1 تبدأ.
يتم جمع معظم الديدان الخيطية F0 لقياس المؤشرات الكيميائية والوراثية ويتم تطهير 30 أجار في F0.
4 36 (F0-1-1-4 إلى F0-3-12-4) 36 (F1-1-1-1 إلى F1-3-12-1) القياس على العمر والتكاثر يتطلب نقل كل يوم.
يتم اختيار الديدان الخيطية الأم على F0-1-1-3 إلى F0-3-12-3 على أجار NGM جديدة تحمل علامة F0-1-1-4 إلى F0-3-12-4.
أما الديدان الخيطية المتبقية (أي F1 في MGE، أو T1 في MGR) في F0-1-1-3 إلى F0-3-12-3 agars فقد نمت لمدة 1 د، ويتم تغيير العلامات إلى F1-1-1-1 إلى F1-3-12-1. وتستخدم هذه الأجار أيضا لرصد عمر F1 مع النقل اليومي.
5 36 (F0-1-1-5 إلى F0-3-12-5) 36 (F1-1-1-2 إلى F1-3-12-2) الديدان الخيطية على F1-1-1-1 إلى F1-3-12-1 أجار نمت لمدة 2 د وتصبح سهلة الملاحظة ويتم حساب الديدان الخيطية، ويتم تغيير علامات إلى F1-1-1-2 إلى F1-3-12-2.
36 (F0-1-1-4 إلى F0-3-12-4) الديدان الخيطية الذرية في F0-1-1-4 إلى F0-3-12-4 أجار نمت لمدة 1 د.
6 36 (F0-1-1-6 إلى F0-3-12-6) 36 (F0-1-1-4 إلى F0-3-12-4، مسح بعد عد) وقد نمت Nematodes على F1-1-1-2 إلى F1-3-12-2 أجار لمدة 3 د ويتم تغيير علامات إلى F1-1-1-3 إلى F1-3-12-3. وتجدر الإشارة إلى أن الديدان الخيطية F1 تبدأ في إعادة إنتاج F2 في هذا اليوم، يجب نقل الديدان الخيطية F1 على أجارNGS NGM جديدة مما يجعل F2-1-1-0 إلى F1-3-12-0. بالنسبة لدراسات MGR، تبدأ T2 اليوم.
36 (F1-1-1-3 إلى F1-3-12-3) 36 (F0-1-1-5 إلى F0-3-12-5) ويمكن تأخير ذلك بسبب التعرض للمواد الكيميائية، وبالتالي ينبغي إجراء تغييرات مرنة في كل تجربة لضمان وجود ما يكفي من الديدان الخيطية للأجيال اللاحقة.
36 (F2-1-1-0 إلى F1-3-12-0) وقد نمت الديدان الخيطية على F0-1-1-4 إلى F0-3-12-4 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
الديدان الخيطية الذرية على F0-1-1-5 إلى F0-3-12-5 أجار نمت لمدة 1 د.
7 36 (F0-1-1-7 إلى F0-3-12-7) 36 (F0-1-1-5 إلى F0-3-12-5، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية على F0-1-1-5 إلى F0-3-12-5 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F1-1-1-4 إلى F1-3-12-4) 36 (F0-1-1-6 إلى F0-3-12-6) يتم استخدام عدد الديدان الخيطية الإجمالية في F1-1-1-1 إلى F1-3-12-1 agars و F0-1-1-1-4 إلى F0-3-12-4 agars و F0-1-1-5 إلى F0-3-12-5 لحساب الاستنساخ الأولي لF0.
36 (F2-1-1-1 إلى F2-3-12-1) الديدان الخيطية الذرية على F0-1-1-6 إلى F0-3-12-6 أجار نمت لمدة 1 د.
وقد نمت الديدان الخيطية F2 على F2-1-1-0 إلى F1-3-12-0 ل1 د ويتم تغيير علاماتها إلى F2-1-1-1 إلى F2-3-12-1.
8 36 (F0-1-1-8 إلى F0-3-12-8) 36 (F0-1-1-6 إلى F0-3-12-6، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية على F0-1-1-6 إلى F0-3-12-6 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F1-1-1-5 إلى F1-3-12-5) 36 (F0-1-1-7 إلى F0-3-12-7) وقد نمت الديدان الخيطية من F0 على F0-1-1-7 إلى F0-3-12-7 أجار ل1 د.
36 (F2-1-1-2 إلى F2-3-12-2) 36 (F1-1-1-4 إلى F1-3-12-4) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-4 إلى F1-3-12-4 أجار ل1 د.
36 (F2-1-1-1 إلى F2-3-12-1، تغيرت إلى F2-1-1-2 إلى F2-3-12-2 بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية F2 على F2-1-1-1 إلى F2-3-12-1 لمدة 2 د، يتم حساب الديدان الخيطية ويتم تغيير علاماتها إلى F2-1-1-2 إلى F2-3-12-2.
9 36 (F0-1-1-9 إلى F0-3-12-9) 36 (F0-1-1-7 إلى F0-3-12-7، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F0 على F0-1-1-7 إلى F0-3-12-7 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F1-1-1-6 إلى F1-3-12-6) 36 (F1-1-1-4 إلى F1-3-12-4، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-4 إلى F1-3-12-4 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F2-1-1-3 إلى F2-3-12-3) 36 (F0-1-1-8 إلى F0-3-12-8) وقد نمت الديدان الخيطية من F0 على F0-1-1-8 إلى F0-3-12-8 أجار ل1 د.
36 (F3-1-1-0 إلى F3-3-12-0) 36 (F1-1-1-5 إلى F1-3-12-5) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-5 إلى F1-3-12-5 أجار ل1 د.
وقد نمت الديدان الخيطية F2 على F2-1-1-2 إلى F2-3-12-2 لمدة 3 أيام ويتم تغيير علاماتها إلى F2-1-1-3 إلى F2-3-12-3. الديدان الخيطية F2 تبدأ في التكاثر اليوم ويتم نقلها إلى 36 أجار NGM جديدة هناك حاجة ووضع علامة F3-1-1-0 إلى F3-3-12-0. بالنسبة لدراسات MGR، تبدأ T3 اليوم.
10 سنوات 36 (F0-1-1-10 إلى F0-3-12-10) 36 (F0-1-1-8 إلى F0-3-12-8، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F0 على F0-1-1-8 إلى F0-3-12-8 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F1-1-1-7 إلى F1-3-12-7) 36 (F1-1-1-5 إلى F1-3-12-5، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-5 إلى F1-3-12-5 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F2-1-1-4 إلى F2-3-12-4) 36 (F0-1-1-9 إلى F0-3-12-9) يتم استخدام عدد الديدان الخيطية الإجمالية في F2-1-1-1 إلى F2-3-12-1 و F1-1-1-1-4 إلى F1-3-12-4 agars و F1-1-1-5 إلى F1-3-12-5 لحساب الاستنساخ الأولي لF1.
36 (F3-1-1-1 إلى F3-3-12-1) 36 (F1-1-1-6 إلى F1-3-12-6) وقد نمت الديدان الخيطية من F0 على F0-1-1-9 إلى F0-3-12-9 أجار ل1 د.
وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-6 إلى F1-3-12-6 أجار ل1 د.
وقد نمت الديدان الخيطية على F3-1-1-0 إلى F3-3-12-0 أجار ل1 د ويتم تغيير علامات إلى F3-1-1-1 إلى F3-3-12-1.
وتجدر الإشارة إلى أن استنساخ الديدان الخيطية F0 سوف ينخفض بشكل كبير بعد الأيام القليلة الأولى. ولذلك، فإن نقل الديدان الخيطية غير مطلوب بدقة أن يكون يوميا بعد D10 ويمكن القيام به كل يومين. ومع ذلك، فإن البقاء على قيد الحياة لا يزال يتطلب المراقبة اليومية.
وتنطبق نفس القاعدة أيضاً في F1 (T1 وT1') وF2 (T2 وT2') وF3 (T3 وT3').
11 36 (F0-1-1-11 إلى F0-3-12-11) 36 (F0-1-1-9 إلى F0-3-12-9، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F0 على F0-1-1-9 إلى F0-3-12-9 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F1-1-1-8 إلى F1-3-12-8) 36 (F1-1-1-6 إلى F1-3-12-6، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-6 إلى F1-3-12-6 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F2-1-1-5 إلى F2-3-12-5) 36 (F0-1-1-10 إلى F0-3-12-10) وقد نمت الديدان الخيطية من F0 على F0-1-1-10 إلى F0-3-12-10 أجار ل1 د.
36 (F3-1-1-2 إلى F3-3-12-2) 36 (F1-1-1-7 إلى F1-3-12-7) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-7 إلى F1-3-12-7 أجار ل1 د.
36 (F2-1-1-4 إلى F2-3-12-4) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-4 إلى F2-3-12-4 أجار ل1 د.
36 (F3-1-1-1 إلى F3-3-12-1، تغيرت إلى F3-1-1-2 إلى F3-3-12-2 بعد العد) وقد نمت الديدان الخيطية على F3-1-1-1 إلى F3-3-12-1 أجار لمدة 2 د، يتم حساب الديدان الخيطية ويتم تغيير علامات إلى F3-1-1-2 إلى F3-3-12-2.
12 36 (F0-1-1-12 إلى F0-3-12-12) 36 (F0-1-1-10 إلى F0-3-12-10، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F0 على F0-1-1-10 إلى F0-3-12-10 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F1-1-1-9 إلى F1-3-12-9) 36 (F1-1-1-7 إلى F1-3-12-7، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-7 إلى F1-3-12-7 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F2-1-1-6 إلى F2-3-12-6) 36 (F2-1-1-4 إلى F2-3-12-4، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-4 إلى F2-3-12-4 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F3-1-1-3 إلى F3-3-12-3) 36 (F0-1-1-11 إلى F0-3-12-11) وقد نمت الديدان الخيطية من F0 على F0-1-1-11 إلى F0-3-12-11 أجار ل1 د.
36 (F4-1-1-0 إلى F4-3-12-0) 36 (F1-1-1-8 إلى F1-3-12-8) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-8 إلى F1-3-12-8 أجار ل1 د.
36 (F2-1-1-5 إلى F2-3-12-5) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-5 إلى F2-3-12-5 أجار ل1 د.
وقد نمت الديدان الخيطية على F3-1-1-2 إلى F3-3-12-2 أجار لمدة 3 د ويتم تغيير علامات إلى F3-1-1-3 إلى F3-3-12-3. الديدان الخيطية F3 تبدأ في التكاثر اليوم ويتم نقلها إلى 36 أجار NGM جديدة هناك حاجة ووضع علامة F4-1-1-0 إلى F4-3-12-0. بالنسبة لدراسات MGR، يبدأ نسل F3 (أي T1') اليوم.
13 36 (F0-1-1-13 إلى F0-3-12-13) 36 (F0-1-1-11 إلى F0-3-12-11، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F0 على F0-1-1-11 إلى F0-3-12-11 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F1-1-1-10 إلى F1-3-12-10) 36 (F1-1-1-8 إلى F1-3-12-8، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-8 إلى F1-3-12-8 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F2-1-1-7 إلى F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-5 إلى F2-3-12-5، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-5 إلى F2-3-12-5 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F3-1-1-4 إلى F3-3-12-4) 36 (F0-1-1-12 إلى F0-3-12-12) يتم استخدام عدد الديدان الخيطية الإجمالية في F3-1-1-1 إلى F3-3-12-1 و F2-1-1-4 إلى F2-3-12-4 أجار وF2-1-1-5 إلى F2-3-12-5 لحساب الاستنساخ الأولي لF2.
36 (F4-1-1-1 إلى F4-3-12-1) 36 (F1-1-1-9 إلى F1-3-12-9) وقد نمت الديدان الخيطية من F0 على F0-1-1-12 إلى F0-3-12-12 أجار ل1 د.
36 (F2-1-1-6 إلى F2-3-12-6) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-9 إلى F1-3-12-9 أجار ل1 د.
وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-6 إلى F2-3-12-6 أجار ل1 د.
وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F4-1-1-0 إلى F4-3-12-0 ل1 د، ويتم تغيير علامات إلى F4-1-1-1 إلى F4-3-12-1.
14 سنة 36 (F0-1-1-14 إلى F0-3-12-14) 36 (F0-1-1-12 إلى F0-3-12-12، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F0 على F0-1-1-12 إلى F0-3-12-12 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F1-1-1-11 إلى F1-3-12-11) 36 (F1-1-1-9 إلى F1-3-12-9، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-9 إلى F1-3-12-9 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F2-1-1-8 إلى F2-3-12-8) 36 (F2-1-1-6 إلى F2-3-12-6، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-6 إلى F2-3-12-6 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F3-1-1-5 إلى F3-3-12-5) 36 (F4-1-1-1 إلى F4-3-12-1، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F4-1-1-1 إلى F4-3-12-1 لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم حساب الديدان الخيطية. بالنسبة لدراسات MGR، نمت الديدان الخيطية T1 'لمدة 2 د، وسوف تبدأ في إعادة إنتاج T2' في اليوم التالي (D15)، وT2' سوف تبدأ في إعادة إنتاج T3' على D18. العمر من نوع البرية C. elegans هو مثال 15 يوما. ثم، فإن نهاية عمر T3 'يكون على D33.
36 (F0-1-1-13 إلى F0-3-12-13) وقد نمت الديدان الخيطية من F0 على F0-1-1-13 إلى F0-3-12-13 أجار ل1 د.
36 (F1-1-1-10 إلى F1-3-12-10) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-10 إلى F1-3-12-10 أجار ل1 د.
36 (F2-1-1-7 إلى F2-3-12-7) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-7 إلى F2-3-12-7 أجار ل1 د.
36 (F3-1-1-4 إلى F3-3-12-4) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-4 إلى F2-3-12-4 أجار ل1 د.
15 36 (F0-1-1-15 إلى F0-3-12-15) 36 (F0-1-1-13 إلى F0-3-12-13، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F0 على F0-1-1-13 إلى F0-3-12-13 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F1-1-1-12 إلى F1-3-12-12) 36 (F1-1-1-10 إلى F1-3-12-10، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-10 إلى F1-3-12-10 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F2-1-1-9 إلى F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-7 إلى F2-3-12-7، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-7 إلى F2-3-12-7 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F3-1-1-6 إلى F3-3-12-6) 36 (F3-1-1-4 إلى F3-3-12-4، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-4 إلى F3-3-12-4 أجار ل2D، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F0-1-1-14 إلى F0-3-12-14) وقد نمت الديدان الخيطية من F0 على F0-1-1-14 إلى F0-3-12-14 أجار ل1 د.
36 (F1-1-1-11 إلى F1-3-12-11) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-11 إلى F1-3-12-11 أجار ل1 د.
36 (F2-1-1-8 إلى F2-3-12-8) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-8 إلى F2-3-12-8 أجار ل1 د.
36 (F3-1-1-5 إلى F3-3-12-5) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-5 إلى F2-3-12-5 أجار ل1 د.
16 سنة 36 (F0-1-1-15 إلى F0-3-12-15، أكثر) 36 (F0-1-1-14 إلى F0-3-12-14، مسح بعد عد) العمر من نوع البرية C. elegans هو مثال 15 يوما. لذلك، F0 كان ينبغي أن يموت جميع قبل اليوم 16 منذ التعرض.
36 (F1-1-1-13 إلى F1-3-12-13) 36 (F1-1-1-11 إلى F1-3-12-11، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F0 على F0-1-1-14 إلى F0-3-12-14 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F2-1-1-10 إلى F2-3-12-10) 36 (F2-1-1-8 إلى F2-3-12-8، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-11 إلى F1-3-12-11 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F3-1-1-7 إلى F3-3-12-7) 36 (F3-1-1-5 إلى F3-3-12-5، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-8 إلى F2-3-12-8 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F0-1-1-15 إلى F0-3-12-15) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-5 إلى F3-3-12-5 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F1-1-1-12 إلى F1-3-12-12) يتم استخدام عدد الديدان الخيطية الإجمالية في F4-1-1-1 إلى F4-3-12-1 و F3-1-1-4 إلى F3-3-12-4 أجار وF3-1-1-5 إلى F3-3-12-5 لحساب الاستنساخ الأولي لF3.
36 (F2-1-1-9 إلى F2-3-12-9) وقد نمت الديدان الخيطية من F0 على F0-1-1-15 إلى F0-3-12-15 أجار ل1 د.
36 (F3-1-1-6 إلى F3-3-12-6) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-12 إلى F1-3-12-12 أجار ل1 د.
وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-9 إلى F2-3-12-9 أجار ل1 د.
وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-6 إلى F2-3-12-6 أجار ل1 د.
17 سنة 36 (F1-1-1-14 إلى F1-3-12-14) 36 (F0-1-1-15 إلى F0-3-12-15، مسح بعد عدها، أكثر) وقد نمت الديدان الخيطية من F0 على F0-1-1-15 إلى F0-3-12-15 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية. لن يكون هناك المزيد من ذرية F0.
36 (F2-1-1-11 إلى F2-3-12-11) 36 (F1-1-1-12 إلى F1-3-12-12، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-12 إلى F1-3-12-12 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F3-1-1-8 إلى F3-3-12-8) 36 (F2-1-1-9 إلى F2-3-12-9، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-9 إلى F2-3-12-9 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F3-1-1-6 إلى F3-3-12-6، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-6 إلى F3-3-12-6 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F1-1-1-13 إلى F1-3-12-13) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-13 إلى F1-3-12-13 أجار ل1 د.
36 (F2-1-1-10 إلى F2-3-12-10) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-10 إلى F2-3-12-10 أجار ل1 د.
36 (F3-1-1-7 إلى F3-3-12-7) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-7 إلى F2-3-12-7 أجار ل1 د.
18 سنة 36 (F1-1-1-15 إلى F1-3-12-15) 36 (F1-1-1-13 إلى F1-3-12-13، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-13 إلى F1-3-12-13 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F2-1-1-12 إلى F2-3-12-12) 36 (F2-1-1-10 إلى F2-3-12-10، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-10 إلى F2-3-12-10 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F3-1-1-9 إلى F3-3-12-9) 36 (F3-1-1-7 إلى F3-3-12-7، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-7 إلى F3-3-12-7 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F1-1-1-14 إلى F1-3-12-14) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-14 إلى F1-3-12-14 أجار ل1 د.
36 (F2-1-1-11 إلى F2-3-12-11) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-11 إلى F2-3-12-11 أجار ل1 د.
36 (F3-1-1-8 إلى F3-3-12-8) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-8 إلى F2-3-12-8 أجار ل1 د.
في دراسات MGR، سوف تبدأ T2 ' لإعادة إنتاج T3' اليوم. العمر من نوع البرية C. elegans هو مثال 15 يوما. ثم، فإن نهاية عمر T3 'يكون على D33.
19 سنة 36 (F1-1-1-15 إلى F1-3-12-15، أكثر) 36 (F1-1-1-14 إلى F1-3-12-14، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-14 إلى F1-3-12-14 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F2-1-1-13 إلى F2-3-12-13) 36 (F2-1-1-11 إلى F2-3-12-11، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-11 إلى F2-3-12-11 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F3-1-1-10 إلى F3-3-12-10) 36 (F3-1-1-8 إلى F3-3-12-8، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-8 إلى F3-3-12-8 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F1-1-1-15 إلى F1-3-12-15) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-15 إلى F1-3-12-15 أجار ل1 د.
36 (F2-1-1-12 إلى F2-3-12-12) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-12 إلى F2-3-12-12 أجار ل1 د.
36 (F3-1-1-9 إلى F3-3-12-9) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-9 إلى F2-3-12-9 أجار ل1 د.
20 36 (F2-1-1-14 إلى F2-3-12-14) 36 (F1-1-1-15 إلى F1-3-12-15، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F1 على F1-1-1-14 إلى F1-3-12-14 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية. لن يكون هناك المزيد من ذرية الفورمولا 1.
36 (F3-1-1-11 إلى F3-3-12-11) 36 (F2-1-1-12 إلى F2-3-12-12، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-12 إلى F2-3-12-12 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F3-1-1-9 إلى F3-3-12-9، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-9 إلى F3-3-12-9 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F2-1-1-13 إلى F2-3-12-13) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-13 إلى F2-3-12-13 أجار ل1 د.
36 (F3-1-1-10 إلى F3-3-12-10) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-10 إلى F2-3-12-10 أجار ل1 د.
21 36 (F2-1-1-15 إلى F2-3-12-15) 36 (F2-1-1-13 إلى F2-3-12-13، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-13 إلى F2-3-12-13 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F3-1-1-12 إلى F3-3-12-12) 36 (F3-1-1-10 إلى F3-3-12-10، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-10 إلى F3-3-12-10 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F2-1-1-14 إلى F2-3-12-14) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-14 إلى F2-3-12-14 أجار ل1 د.
36 (F3-1-1-11 إلى F3-3-12-11) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-11 إلى F2-3-12-11 أجار ل1 د.
22 36 (F2-1-1-15 إلى F2-3-12-15، أكثر) 36 (F2-1-1-14 إلى F2-3-12-14، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-14 إلى F2-3-12-14 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F3-1-1-13 إلى F3-3-12-13) 36 (F3-1-1-11 إلى F3-3-12-11، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-11 إلى F3-3-12-11 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F3-1-1-12 إلى F3-3-12-12) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-12 إلى F2-3-12-12 أجار ل1 د.
23 36 (F3-1-1-14 إلى F3-3-12-14) 36 (F2-1-1-15 إلى F2-3-12-15، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F2 على F2-1-1-15 إلى F2-3-12-15 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية. لن يكون هناك المزيد من ذرية F2.
36 (F3-1-1-12 إلى F3-3-12-12، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-12 إلى F3-3-12-12 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F3-1-1-13 إلى F3-3-12-13) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-13 إلى F2-3-12-13 أجار ل1 د.
24 36 (F3-1-1-15 إلى F3-3-12-15) 36 (F3-1-1-13 إلى F3-3-12-13، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-13 إلى F3-3-12-13 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F3-1-1-14 إلى F3-3-12-14) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-14 إلى F2-3-12-14 أجار ل1 د.
25 36 (F3-1-1-15 إلى F3-3-12-15، أكثر) 36 (F3-1-1-14 إلى F3-3-12-14، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-14 إلى F3-3-12-14 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
36 (F3-1-1-15 إلى F3-3-12-15) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-15 إلى F2-3-12-15 أجار ل1 د.
26 36 (F3-1-1-15 إلى F3-3-12-15، مسح بعد عد) وقد نمت الديدان الخيطية من F3 على F3-1-1-15 إلى F3-3-12-15 أجار لمدة 2 د، ويتم تطهير أجار بعد أن يتم عد الديدان الخيطية.
وتجدر الإشارة إلى أن أول ذرية غير مكشوفة لF3 (أي T3') ستولد في D18 في دراسات MGR. العمر من نوع البرية C. elegans هو مثال 15 يوما. ثم، فإن نهاية عمر T3 'يكون على D33.
كل من MGE وMGR الدراسات سوف تغطي المزيد من الأيام عندما يكون عمر الديدان الخيطية أطول.

الجدول 1: قائمة بالعلامات وتعاريفها.

  1. قياس الاستنساخ والعمر في دراسات تأثير MGE.
    1. على D0 كرر الخطوة 5.6. وضع علامة على الأجار (3 مجموعات مع 10 تكرارات في كل منها) كما Fx-a-b-c، حيث يشير x إلى رقم الجيل، ويشير إلى رقم المجموعة (1 للتحكم، و2 لتركيز منخفض و 3 لتركيز عال ); (ب) يشير إلى التكرار من 1 إلى 10؛ وc يشير إلى مدة التعرض (0 يشير إلى البداية). لD0، علامات أجار كما F0-1-1-0 إلى F0-3-10-0. ويمكن للقراء الرجوع إلى الجدول 1 للحصول على معلومات مفصلة.
    2. على D1، تحقق من نمو الديدان الخيطية على أجار، وتغيير علامات من F0-1-1-0 إلى F0-3-10-0 إلى F0-1-1-1 إلى F0-3-10-1.
    3. على D2، تحقق من نمو الديدان الخيطية على أجار، وتغيير علامات F0-1-1-2 إلى F0-3-10-2.
    4. على D3، واختيار 24 F0 nematodes من كل مجموعة على 12 أجار NGM جديدة مع اثنين من أجار NGM من الخطوة 5.4. وضع علامة على أجار كما F0-1-1-3 إلى F0-3-12-3.
    5. على D4، نقل الديدان الخيطية الأم اثنين من F0-1-1-3 إلى F0-3-12-3 عن طريق اختيار على أجار NGM جديدة من الخطوة 5.4. وضع علامة على أجارNG الجديدة كما F0-1-1-4 إلى F0-3-12-4. تغيير علامات F0-1-1-3 إلى F0-3-12-3 إلى F1-1-1-1 إلى F1-3-12-1 لتمثيل ذرية F0 (أي F1) في اليوم الأول منذ F0 تبدأ في التكاثر.
    6. على D5، استخدم مجهر تشريح لحساب الديدان الخيطية على F1-1-1-1 إلى F1-3-12-1 أجار حيث نمت الديدان الخيطية 2 أيام. السماح F1-1-1-1 إلى F1-3-12-1 أجار لإعادة إنتاج F2 للأجيال المتعاقبة.
    7. نقل الديدان الخيطية الأم اثنين من F0-1-1-4 إلى F0-3-12-4 أجار عن طريق اختيار على أجار NGM جديدة من الخطوة 5.4. مارك NGM أجار كما F0-1-1-5 إلى F0-3-12-5. تغيير علامات F0-1-1-4 إلى F0-3-12-4 إلى F1-1-1-2 إلى F1-3-12-2 لتمثيل ذرية F0 (أي F1) في اليوم الثاني منذ F0 تبدأ في التكاثر.
    8. على D6، عد الديدان الخيطية على F1-1-1-2 إلى F1-3-12-2 أجار. نقل الديدان الخيطية الأم من F0-1-1-5 إلى F0-3-12-5 أجار إلى F0-1-1-6 إلى F0-3-12-6. تغيير علامات F0-1-1-5 إلى F0-3-12-5 إلى F1-1-1-3 إلى F1-3-12-3 لتمثيل ذرية F0 (أي F1) في اليوم الثالث منذ F0 تبدأ في التكاثر.
    9. الديدان الخيطية على F1-1-1-1 إلى F1-3-12-1 أجار نمت لمدة 3 أيام. استخدامها لإعادة إنتاج F2 في دراسات تأثير MGE التالية. من خلال نفس الطريقة، استخدم الديدان الخيطية F2 لإعادة إنتاج F3 لمواصلة دراسات تأثير MGE.
    10. من خلال نفس الطريق، نقل الديدان الخيطية الأم اثنين يوميا وحساب الديدان الخيطية الذرية في اليوم التالي، حتى الديدان الخيطية الأم في 6 أجار NGM (أي، نصف العود الكلي في كل مجموعة) وقف الاستنساخ.
    11. حساب إجمالي عدد الذرية على مدى مدة الاستنساخ بأكملها كإجمالي حجم الحضنة. استخدام عدد الذرية في غضون الأيام الثلاثة الأولى لتمثيل الإنجاب الأولي للوالدين.
    12. استخدم اليوم الذي يتوقف فيه استنساخ الديدان الخيطية الأم في 6 أجارNGM لتقدير مدة الاستنساخ. استخدم الأيام التي نجا فيها كل والد على حدة كعمر له.
    13. الحصول على الاستنساخ الأولي، ومدة الاستنساخ، وإجمالي حجم الحضنة وعمر F1 بنفس الطريقة كما فعلت لF0. وبالمثل، من خلال تكرار الإجراء المذكور أعلاه، يمكن الحصول على معلومات الاستنساخ وعمر F2 (إلى Fn).
  2. قياس الاستنساخ والعمر في دراسات تأثير MGR.
    1. تنفيذ الخطوة 7.2.4 مع أجارNG NGM من الخطوة 5.4 تغيير إلى تلك من الخطوة 2.13.
  3. قياس المؤشرات البيوكيميائية.
    1. امسح الديدان الخيطية من أجارNGM بالماء المعقم وجمعها في أنابيب الطرد المركزي. تسوية الديدان الخيطية لمدة 30 دقيقة وتجاهل supernatants. استخدام الديدان الخيطية في الكريات لقياس تأثير.
    2. إضافة 1 مل من الفوسفات البارد الجليد المخزنة المالحة (PBS، درجة الحموضة 7.0) في الديدان الخيطية (الكريات) في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل لغسل الديدان الخيطية.
    3. الطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية، وتجاهل بعناية supernatants مع ماصة.
    4. المفاجئة تجميد الكريات عن طريق النيتروجين السائل أو في الفريزر -80 درجة مئوية.
    5. تجانس الكريات باستخدام الآفات في حمام الجليد. استخدم 200 ميكرولتر من الـ PBS المثلج لغسل السوائل المتبقية على الآفة في أنبوب الطرد المركزي قبل إخراج الآفة.
    6. الطرد المركزي عند 10000 × ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية مرة أخرى، واستخدام المواد الفائقة لتحديد أنشطة أو كميات المواد الكيميائية الحيوية مع مجموعات التجارية (انظر جدول المواد للاطلاع على التفاصيل).
    7. قياس كميات البروتين الكلي (TP) في العينات، واستخدام النتائج كمقام في تمثيل المؤشرات البيوكيميائية الأخرى، بحيث يمكن القضاء على الفرق بين أرقام الديدان الخيطية بين العينات.
  4. قياس التعبير الجيني.
    1. كرر الخطوات 7.4.1 إلى 7.4.4. عزل مجموع الحمض النووي الريبي من عينات الديدان الخيطية باستخدام مجموعة استخراج RNA التجارية (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة21.
    2. استخدام الحمض النووي الريبي لتجميع cDNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة21.
    3. تحليل عينة cDNA في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز سلسلة (RT-PCR) باستخدام SYBR الأخضر RT-PCR مجموعات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدولالمواد)21.
    4. قياس مستويات التعبير النسبي للجينات المختارة بواسطة الطريقة2-ΔΔCT 22، وتعامل مستويات التعبير من الناتج المحلي الإجمالي-2 (أو الجينات المرجعية الأخرى) كمرجع سلبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هنا، نقوم بوصف بروتوكولات لدراسة آثار المواد الكيميائية على مر الأجيال باستخدام C. elegans في عبر الأجيال (TG)، والتعرض متعدد الأجيال (MGE) ودراسات تأثير بقايا متعددة الأجيال (MGR). وتقدم نتائج أبحاثنا الخاصة كأمثلة على ذلك. دراسة واحدة يعرض آثار TG من المعادن الثقيلة على سلوك الحركة3. وتقدم الدراستان الأخريان آثار الـ MGE وMGR للسلفوميثوكزازول والليندين على قياسات التكاثر والمؤشرات البيوكيميائية والوراثية4و14.

TG آثار المعادن الثقيلة على سلوك الحركة من جيم - إليغانز

تمت دراسة آثار TG من الكادميوم (Cd) والنحاس (Cu) والرصاص (Pb) والزنك (Zn) على تردد ثني الجسم (BBF) في الأم الديدان الخيطية (F0) بعد تعرض الأمهات وذريتهم (T1)3. وأظهرت آثار المعادن على BBF أن الموانع في T1 كانت أكبر مما كانت عليه في F0، مما يدل على سمية أكثر شدة من المعادن الثقيلة على سلوك الحركة في الذرية المعرضة للجنين مما كانت عليه في الوالد المعرضة مباشرة. وقد أظهرت آثار TG للمعادن الثقيلة بتركيزات واقعية بيئياً أن تعرض الأمهات يمكن أن يضاعف من مخاطر تلوث المعادن الثقيلة في الأجيال المقبلة. انظر الشكل 1.

Figure 1
الشكل 1 آثار الكادميوم (Cd)، والنحاس (Cu)، والرصاص (الرصاص) والزنك (الزنك) على تردد الانحناء الجسم من الأم الديدان الخيطية (F0، فارغة) بعد التعرض قبل الولادة وذريتهم (T1، مظللة). شريط الخطأ = خطأ قياسي; * = تختلف اختلافا كبيرا عن عنصر التحكم، p < 0.05؛ # = تختلف اختلافا كبيرا عن التركيز المنخفض، p < 0.05؛ + ينطوي على آثار مختلفة إلى حد كبير في F1 مما كانت عليه في F0، ص < 0.05. وقد تم تعديل هذا الرقم من يو وآخرون3 بإذن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

آثار MGR من سلفاميثواكسازول (SMX) على عمر الديدان الخيطية والاستنساخ

تمت دراسة آثار الـ MGR لسلفاميثوإكسازول (SMX) على عمر الديدان الخيطية والتكاثر14 على الوالد (F0)، الذرية المعرضة للجنين (T1)، الذرية المكشوفة بالجراثيم (T2)، الذرية الأولى غير المكشوفة (T3) والثلاثة الأجيال التالية (T4-T6). وأظهرت النتائج أن التكاثر (وهو حجم إجمالي للحضنة بنسبة 49 في المائة من السيطرة) تأثر تأثراً كبيراً بالتعرض للجرثومة (T2)، واستمرت السمية في الأجيال غير المعرضة من أجيال T3 إلى T6 (الشكل2). أثارت النتائج التي توصلنا إليها مخاوف جديدة فيما يتعلق بالتأثيرات الطويلة الأجل للمضادات الحيوية نفسها إلى جانب آثارها على مقاومة المضادات الحيوية.

Figure 2
الشكل 2 حجم الحضنة (في (A)، معبرا عنه في النسبة المئوية للرقابة) والاستنساخ الأولي (في (B)) من C. elegans في الوالد المعرضة وذريتها (F0، T1 إلى T6، من اليسار إلى اليمين في كل تركيز). شريط الخطأ = خطأ قياسي; أ = مختلفة اختلافا كبيرا عن عنصر التحكم من قبل ANOVA (p < 0.05)؛ (ب) تختلف اختلافاً كبيراً عن عنصر التحكم وعن الجيل السابق بنفس التركيز (p < 0.05)؛ ج = مختلفة اختلافا كبيرا عن السيطرة وعن التركيز المنخفض في نفس الجيل (p < 0.05)؛ د = تختلف اختلافاً كبيراً عن السيطرة وعن الجيل السابق بنفس التركيز وانخفاض التركيز في نفس الجيل (p < 0.05)؛ (هـ) تختلف اختلافاً كبيراً عن الجيل السابق بنفس التركيز وتركيز أقل في نفس الجيل (p < 0.05)؛ (و) تختلف اختلافاً كبيراً عن الجيل السابق بنفس التركيز (p < 0.05). وقد تم تعديل هذا الرقم من يو وآخرون14 بإذن.

آثار الليندين على مؤشرات الديدان الخيطية والوراثية

وقد تمت دراسة آثار الليندين على المواد الكيميائية الحيوية الرئيسية في عمليات التمثيل الغذائي للدهون وتغيرات التعبير الوراثيفي المسار 4 الشبيه بالأنسولين المرتبط بالأنسولين. وأظهرت النتائج أن الليندين أظهرت آثار السمنة معاضطرابات في تنظيم إشارة الأنسولين (الشكل 3). وعلاوة على ذلك، فإن التغيرات بين sgk-1 (F0 وF3 وT1' و T3') وakt-1 (T1 و T3) تشير إلى أن الديدان الخيطية من أجيال التعرض المختلفة أظهرت استراتيجيات استجابة مختلفة للتسامح والتجنب.

Figure 3
الشكل 3 التغيرات في مستويات التعبير من الجينات الرئيسية في مسار إشارة تشبه الأنسولين في الديدان الخيطية مع تجارب التعرض المختلفة. →: تنظيم إيجابي; symbol التنظيم السلبي؛ : تعبير [أوب-رلّد]; : التعبير أسفل التنظيم. تم تعديل هذا الرقم من تشن في al.4 بإذن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ومن أجل تنفيذ البروتوكول الموصوف بنجاح، ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار الاقتراحات التالية. تنفيذ العمليات التجريبية الشاملة في بيئة معقمة. قد تؤدي العملية غير السليمة إلى تلوث سلالات القولونية E. ، على سبيل المثال ، الفطريات والعث قد تعوق النمو الطبيعي لـ C. elegans وبالتالي تؤثر على النتائج التجريبية. في القسم الذي يصف زراعة C. elegans، لاحظ مقياس نمو C. elegans على أجار NGM عن طريق العين المجردة أو المجاهر. عندما يتجاوز حجم C. elegans على أجار 75٪ في المنطقة، أو وقت الثقافة يتجاوز أسبوع واحد، وأداء جولة جديدة من التطعيم لتجنب الإفراط في النمو أو انخفاض السكان من C. elegans. قبل عملية التزامن ، استخدم المجهر لمراقبة نمو C. elegans، ومواصلة العملية عندما يتم توزيع بيض الديدان الخيطية على نطاق واسع على أجار. وبالإضافة إلى ذلك، إذا استخدمت المذيبات (مثل ثنائي ميثيل سلفوكسيد [DMSO]) ينبغي أن تكون تركيزاتها في حلول المخزونات أقل من 1 في المائة لضمان ألا تتجاوز تركيزاتها النهائية 0.5 في المائة (v/v) لتجنب الآثار الضارة للالمذيبات نفسها. في دراسات تأثير TG، مدة التعرض أكثر من 24 ساعة ضرورية لضمان أن وقت التعرض يغطي تكوين الجنين من الجيل القادم، وينبغي أن تكون المدة في حدود 96 ساعة لتسهيل فصل الجيل اللاحق. استخدام كميات صغيرة من الديدان الخيطية (عادة في غضون 20) لقياس العمر والتكاثر. من ناحية أخرى، استخدم كميات كبيرة من الديدان الخيطية (عادة أكثر من 500) لقياس مؤشرات التنظيم البيوكيميائي والوراثي. وبالتالي، من أجل ضمان عدد كاف من العينات، وإجراء تجارب أولية لتقدير ما يقرب من عدد الذرية الناضجة F0 الديدان الخيطية يمكن أن تتكاثر في غضون 24 ساعة الأولى منذ أن تبدأ الاستنساخ. ثم تحديد عدد الديدان الخيطية F0 المطلوبة لضمان وجود ما لا يقل عن 200 ذرية لإجراء دراسات متعددة الأجيال.

بالمقارنة مع التقارير السابقة من دراسات TG مع C. elegans، كان البروتوكول التجريبي الحالي أكثر مراعاة لاختيار مرحلة الحياة. في C. elegans، يتم تشكيل الحيوانات المنوية في مرحلة L4 لتخصيب البويضات في وقت لاحق شكلت23. وبناء على ذلك، فإن التعرض الذي يغطي فترة تكوين الحيوانات المنوية والتكوين الأوسيتوجيني سيوفر نافذة خاصة لدراسة آثار TG على الذرية. يتم استخدام البيض المتزامن ة العمر لدراسات تأثير متعددة الأجيال لضمان أن التعرض يغطي الفترة الإجمالية من بداية كل دورة حياة. وبالمقارنة مع الدراسات السابقة المتعددة الأجيال، يسّر البروتوكول التجريبي الحالي قياس الآثار على مدى أجيال متعددة بدلا ً من جيل واحد أو جيلين فقط. وعلاوة على ذلك، نظر هذا البروتوكول في آثار كل من الـ MGE وMGR، وهي أكثر منهجية من الدراسات السابقة التي لم تقيس سوى آثار MGE أو MGR.

وتجدر الإشارة إلى أنه لا تزال هناك بعض المسائل التي يتعين النظر فيها في البروتوكول التجريبي الحالي. ويستخدم البروتوكول الحالي من النوع البري C. elegans الذي يبلغ وقت جيله حوالي 60 ساعة وعمرها 20 يوماً. وهذا يجعل المدة الإجمالية للتجربة طويلة إلى حد ما (على سبيل المثال، دراسة آثار MGE على عمر أكثر من 3 أجيال يتطلب ما لا يقل عن 30 يوما). من أجل تقصير الوقت، يمكن للباحثين اختيار متحولة C. elegans، مثل الديدان الخيطية متحولة قصيرة الأجل. قضية أخرى هي علاج القتل على البكتيريا، والحالة الحية التي من الضروري للحفاظ على الديدان الخيطية صحية 24. أيضا، فإن عملية القتل فوق البنفسجية قد تحدث تغييرات في المواد الكيميائية25. ولذلك، ينبغي النظر في علاجات أخرى على البكتيريا، وقد يكون من الضروري الرصد الدقيق للتغيرات الكيميائية أثناء عملية الإعداد أو التعرض، وخاصة بالنسبة للمركبات غير المستقرة. في الوقت نفسه، هناك قيود في دراسة الاختلافات بين الجنسين في الآثار السامة لأن معظم حقيقة أن C. elegans هو hermaphrodite. وثمة حاجة إلى مزيد من التحسينات للتحقيق في المساهمة الجنسية في آثار الـ TG أو MGE أو MGR. وباختصار، نتوقع أن يكون للبروتوكول المقترح أهمية كبيرة لاستخدام C. elegans لدراسة آثار السمية على TG وMGE وMGR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعرب المؤلفون عن امتنانهم للدعم المالي الذي قدمه المشروع الوطني الرئيسي للعلوم والتكنولوجيا لمكافحة تلوث المياه ومعالجته (2017ZX07201004)، والبرنامج الدولي للتعاون في مجال العلوم والتكنولوجيا في الصين (رقم 2016YFE0123700).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 agar powder OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 9002-18-0
79nnHT Fast Real-Time PCR System  Applied Biosystems 
96-well sterile microplate Costar?Corning?America
Autoclave sterilizer Tomy, Tomy Digital Biology, Japan
Biosafety cabinet LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China
calcium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10043-52-4
centrifuge  5417R Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Centrifuge tubes Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America
cholesterol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 57-88-5
Dimethyl sulfoxide VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America 67-68-5
disodium hydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7558-79-4
ethanol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 64-17-5
Filter Thermo, Thermo Fisher Scientific, America
incubator YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China
inoculating loop
K2HPO4•3H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 16788-57-1
kraft paper
Mcroplate Reader Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America
MgSO4•7H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10034-99-8
Microscopes XTL-BM-9TD BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China 
Petri dishes
Pipette Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Potassium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7447-40-7
potassium dihydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7778-77-0
Qiagen RNeasy kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States
sodium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7647-14-5
sodium hydroxide Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 1310-73-2
sodium hypochlorite solution Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China 7681-52-9
tryptone OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 73049-73-7
yeast extract OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 119-44-8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
  2. Li, W., et al. Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells. Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).
  3. Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny. Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).
  4. Chen, R., Yu, Z., Yin, D. Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway. Chemosphere. 210, 607-614 (2018).
  5. Van Norman, G. A. A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation. International Anesthesiology Clinics. 53, (3), 63-78 (2015).
  6. Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, (7), 1877-1888 (2018).
  7. Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 13, 20160966 (2017).
  8. Coimbra, A. M., et al. Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study. Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).
  9. Sugi, T. Genome editing in C. elegans and other nematode species. International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).
  10. Leung, M. C. K., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Science. 106, (1), 5-28 (2008).
  11. Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration. Journal of Environmental Sciences-China. 23, (2), 294-300 (2011).
  12. Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure. Environmental Science & Technology. 47, 5393-5399 (2013).
  13. Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans. Science. 356, 320 (2017).
  14. Yu, Z. Y., et al. Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).
  15. Buisset-Goussen, A., et al. Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans. Radioactivity. 137, 190-197 (2014).
  16. Zhao, F., et al. Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice. Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).
  17. Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans. Asian Journal of Ecotoxicology. 11, (4), 61-68 (2016).
  18. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis dlegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  19. Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).
  20. Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, (38), 13496-13501 (2005).
  21. Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).
  22. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, (4), 402-408 (2001).
  23. Hill, R., et al. Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes. Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).
  24. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).
  25. Breider, F., von Gunten, U. Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide. Analytical Chemistry. 89, (3), 1574-1582 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics