विषाक्त पदार्थों के ट्रांस और बहु-पीढ़ी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए Caenorhabditis elegans का उपयोग करना

Environment

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Summary

पर्यावरण में और मानव स्वास्थ्य पर उनके दीर्घकालिक परिणामों को पहचानने में लगातार रसायनों के ट्रांस और बहु-पीढ़ी के प्रभाव आवश्यक हैं। हम मुक्त रहने वाले सूत्रकृमि केनोरब्डाइटिस एलेगेन्सका उपयोग करके ट्रांस और बहु-पीढ़ी के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए उपन्यास विस्तृत तरीके प्रदान करते हैं.

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Li, Z., Ai, F., Zhang, J., Yu, Z., Yin, D. Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants. J. Vis. Exp. (149), e59367, doi:10.3791/59367 (2019).

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Abstract

रसायनों की विषाक्तता के बारे में जानकारी उनके आवेदन और अपशिष्ट प्रबंधन में आवश्यक हैं. कम सांद्रता पर रसायनों के लिए, दीर्घकालिक प्रभाव पर्यावरण में और मानव स्वास्थ्य पर उनके परिणामों को पहचानने में बहुत महत्वपूर्ण हैं. लंबी अवधि के प्रभावों का प्रदर्शन करने में, हाल के अध्ययनों में पीढ़ियों से अधिक रसायनों के प्रभाव नई अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं. यहाँ हम मुक्त रहने वाले सूत्रकृमि केनोरब्डाइटिस एलेगेन्सका उपयोग करके अनेक पीढ़ियों से अधिक रसायनों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉलों का वर्णन करते हैं। दो पहलू प्रस्तुत किए गए हैं: (1) ट्रांस-जेनरेशनल (टीजी) और (2) बहु-पीढ़ीगत प्रभाव अध्ययन, जिनमें से बाद बहु पीढ़ी के जोखिम (एमजीई) और बहु पीढ़ी के अवशिष्ट (एमजीआर) प्रभाव अध्ययन के लिए अलग है। टीजी प्रभाव अध्ययन एक सरल उद्देश्य के साथ मजबूत है निर्धारित करने के लिए कि क्या माता पिता के लिए रासायनिक जोखिम वंश पर किसी भी अवशिष्ट परिणाम में परिणाम कर सकते हैं. के बाद प्रभाव माता पिता पर मापा जाता है, सोडियम hypochlorite समाधान माता पिता को मारने और वंश रखने के लिए इतनी के रूप में वंश पर प्रभाव माप की सुविधा के लिए उपयोग किया जाता है. टीजी प्रभाव अध्ययन का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि जब उनके माता-पिता प्रदूषकों के संपर्क में होते हैं तो संतान प्रभावित होती है या नहीं। एमजीई और एमजीआर प्रभाव अध्ययन का व्यवस्थित उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि क्या सतत पीढ़ीगत जोखिम के परिणामस्वरूप पीढ़ियों से वंशमें वंशमें अनुकूली अनुक्रियाएँ हो सकती हैं। सावधान पिक-अप और हस्तांतरण प्रत्येक पीढ़ी पर प्रभाव माप की सुविधा के लिए पीढ़ियों भेद करने के लिए उपयोग किया जाता है। हम भी चलन व्यवहार, प्रजनन, उम्र, जैव रासायनिक और जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन को मापने के लिए प्रोटोकॉल संयुक्त. कुछ उदाहरण प्रयोगों को भी ट्रांस और बहु पीढ़ी के प्रभाव अध्ययन वर्णन प्रस्तुत कर रहे हैं.

Introduction

रसायनों के अनुप्रयोग और अपशिष्ट प्रबंधन कुछ सांद्रता पर उनके प्रभाव की जानकारी पर अत्यधिक निर्भर है। विशेष रूप से, समय प्रभाव और सांद्रता के बीच एक और आवश्यक तत्व है. कहने का तात्पर्य यह है कि रसायन, विशेष रूप से वास्तविक वातावरण में कम सांद्रता वाले लोगों को औसत दर्जे का प्रभाव1को उत्तेजित करने के लिए समय की आवश्यकता होती है। इसलिए, शोधकर्ताओं पशु प्रयोगों में जोखिम अवधि के विभिन्न लंबाई की व्यवस्था, और यहां तक कि पूरे जीवन चक्र को कवर. उदाहरण के लिए, चूहों को इसके विषाक्त प्रभावों का अध्ययन करने के लिए 30, 90 या 180 दिनों के लिए निकोटीन के संपर्क में आया 2. फिर भी, इस तरह के जोखिम की अवधि अभी भी प्रदूषकों के दीर्घकालिक प्रभावों को स्पष्ट करने के लिए पर्याप्त नहीं है (उदाहरण के लिए, लगातार जैविक प्रदूषक [POPs]) जो पर्यावरण में जीवों की पीढ़ियों से अधिक समय तक चल सकते हैं। इसलिए, पीढ़ियों से प्रभाव पर अध्ययन अधिक से अधिक ध्यान प्राप्त कर रहे हैं.

पीढ़ीगत प्रभाव अध्ययन में दो मुख्य पहलू हैं। पहला है ट्रांस-जेनरेशनल (टीजी) प्रभाव अध्ययन जो मजबूती से परीक्षण कर सकता है कि क्या माता-पिता के रासायनिक संपर्क के परिणामस्वरूप संतान ों पर कोई परिणाम हो सकताहै 3. दूसरा एक एक बहु पीढ़ी के प्रभाव का अध्ययन है जो जोखिम और अवशिष्ट प्रभाव दोनों में विचारों के साथ अधिक व्यवस्थित है. एक तरफ, बहु पीढ़ी जोखिम (MGE) प्रभाव लंबे समय तक चुनौतीपूर्ण वातावरण के लिए पशुओं में अनुकूली प्रतिक्रियाओं वर्णन करने के लिए उपयोग किया जाता है. दूसरी ओर, बहु पीढ़ी के अवशिष्ट (एमजीआर) प्रभाव जोखिम के बाद लंबी अवधि के अवशिष्ट परिणामों को प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किया जाता है, क्योंकि मातृ जोखिम पहली संतान और दूसरे के लिए रोगाणु लाइन जोखिम के लिए भ्रूण जोखिम के साथ साथ है संतान जो तीसरी संतान को पहली पीढ़ी के रूप में पूरी तरह से जोखिम4से बाहर कर देती है .

हालांकि स्तनधारियों (जैसे, चूहों) विशेष रूप से मनुष्य के संबंध में विषाक्तता अध्ययन में मॉडल जीव हैं, पीढ़ीगत प्रभाव का अध्ययन करने में उनके आवेदन काफी समय लेने वाली है, महंगी और नैतिक रूप से संबंधित 5. तदनुसार, क्रस्टेशियन डैफिनिया मैग्ना6,कीट ड्रोसोफिला मेलेनोगैस्टर7 और जेब्राफिश दानियो रीरियो8सहित जीव वैकल्पिक विकल्प प्रदान करते हैं। फिर भी, इन जीवों या तो मनुष्य के लिए समानता की कमी है, या अध्ययन में विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता है.

Caenorhabditis elegans एक छोटे से मुक्त रहने वाले सूत्रकृमि (लगभग 1 मिमी लंबाई में) एक लघु जीवन चक्र के साथ (लगभग 84 एच पर 20 डिग्री सेल्सियस)9है। यह सूत्रकृमि अनेक जैविक मार्ग ों का जो्दुम है , जो मनुष्यों के प्रतिरूढ़िवादी हैं और इसलिए विभिन्न तनावों या विषैले 10 के प्रभावों को दर्शाने के लिए इसे व्यापक रूप से नियोजित किया गया है . विशेष रूप से, सूत्रकृमि के 99.5% हेमेफ्रोडाइट हैं जो इस जीव को पीढ़ीगत प्रभावों का अध्ययन करने में अत्यंत उपयुक्त बनाते हैं, जैसे भारी धातुओं और सल्फोनामाइडों के टीजी प्रभाव3,11, सोने के नैनोकणों और भारी के एमजीई प्रभाव धातु12 और तापमान13, सल्फोनामाइड14के एमजीआर प्रभाव , और गामा विकिरण15 और लिन्डेन4के एमजीई और एमजीआर दोनों प्रभाव . इसके अलावा, चूहों और सी elegans16,17,जो extrapolate करने के लिए एक लाभ प्रदान करेगा के विकास और प्रजनन पर रसायनों (उदा., zearalenone) के प्रभाव के बीच तुलनीय परिणाम पाए गए मनुष्य के लिए इस छोटे जानवर से प्रभाव.

दोनों टीजी और एमजी प्रभाव अध्ययन समय लेने वाले हैं और सावधान डिजाइन और प्रदर्शन की जरूरत है. विशेष रूप से, ऊपर उल्लिखित अध्ययनों में जीवन-स्तरीय विकल्पों, जोखिम की स्थितियों और पीढ़ी पृथक्करण विधियों में मतभेद मौजूद थे। इस तरह के मतभेदों ने परिणामों के बीच प्रत्यक्ष तुलना में बाधा डाली और परिणामों की आगे की व्याख्या में बाधा डाली। इसलिए, टीजी और एमजी प्रभाव अध्ययन मार्गदर्शन करने के लिए एक समान प्रोटोकॉल स्थापित करना, और दीर्घकालिक परिणामों में विभिन्न विषाक्त पदार्थों या प्रदूषकों के समान पैटर्न प्रकट करने के लिए एक बड़ी तस्वीर भी प्रदान करना आवश्यक है। वर्तमान प्रोटोकॉल के अधिलक्ष्य सी एलिगन्सके साथ ट्रांस और बहु-पीढ़ी के प्रभावों के अध्ययन में स्पष्ट प्रचालन प्रक्रियाओं को प्रदर्शित करेंगे। प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं कि विषाक्त पदार्थों या प्रदूषकों के दीर्घकालिक प्रभाव का अध्ययन करने में रुचि रखते हैं लाभ होगा.

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Protocol

1. संस्कृति ई. कोलाई OP50

  1. 100 एमएल जल में 4 ग्राम सोडियम हाइड्रॉक्साइड को भंग करके 1 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड विलयन की तैयारी की।
  2. 10 ग्राम ट्रिप्टोन, 5 ग्राम खमीर निकालने और 1 एल शंकु फ्लास्क में 1 एल अल्ट्राप्यूर पानी के साथ 10 ग्राम सोडियम क्लोराइड को भंग करके लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) माध्यम तैयार करें। 1 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड विलयन के साथ पीएच को 7.0 तक समायोजित करें।
  3. अलीकोट LB तरल माध्यम चरण 1.2 से 20 शंकु फ्लास्क में (अधिकतम स्वीकार्य मात्रा: 100 एमएल) प्रत्येक में 50 एमएल माध्यम के साथ। शंकु फ्लास्क को क्राफ्ट पेपर से ढक दें।
  4. एलबी तरल माध्यम को 121 डिग्री सेल्सियस और 0.105 एमपीए को 20 मिनट के लिए स्टरलाइज़ करें। LB माध्यम को कमरे के तापमान के नीचे ठंडा करें।
  5. बैक्टीरियल निलंबन से पिपेट 200 डिग्री सेल्सियस (चरण 1.8 देखें) या एक inoculating पाश का उपयोग कर agars से एक छोटी सी कॉलोनी लेने (चरण 2.14 में), यह LB माध्यम में जगह है.
  6. 24-48 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 150 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ एलबी माध्यम को इनक्यूबेट करें। LB माध्यम एक भूरे रंग के पारदर्शी तरल से turbid खाकी रंग निलंबन के लिए बदल जाएगा.
  7. चरण 2.11 में उपयोग किए जाने वाले सूत्रकृमि भोजन के रूप में ई कोलाई OP50 प्रदान करने के लिए कुल फ्लास्क के 80% से जीवाणु निलंबन का उपयोग करें।
  8. शेष फ्लास्क को 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में फ्रिज में रखें। ताजा LB मध्यम (चरण 1.4) के ऊपरी पक्ष पर LB निलंबन के Pipette 200 $L और बाद में ऊष्मायन के लिए चरण 1.6 दोहराएँ.

2. संस्कृति सी elegans

नोट: संस्कृति C. elegans मानक विधियों के आधार पर 2.1 से 2.11 के अनुसार का उपयोग कर18.

  1. 100 एमएल बाँझ आसुत जल में 22ण्8 ह2एचपीओ4ण् 3 एच2हे को भंग करें।
  2. 50 एमएल बाँझ आसुत जल में 6.8 ग्राम KH2PO4 को भंग करें।
  3. 1 M K2HPO4-KH2PO4 बफर (पीएच 6.0, कुल में 150 एमएल) तैयार करने के लिए चरण 2.1 और 2.2 से मिक्स समाधान।
  4. 1ण्0 उ MgSO4 को भंग करके 1ण्232 ग्राम MgSO4•7H2O में 5 एमएल बाँझ आसुत जल की तैयारी करें, और एक बाँझ कंटेनर में 0ण्22 डिग्री ग्राम बाँझ डिस्पोजेबल झिल्ली फिल्टर के माध्यम से समाधान को छानकर इसे स्टरलाइज़ करें।
  5. बाँझ आसुत पानी के 5 एमएल में CaCl2 के 0.554 ग्राम भंग करके 1 एम CaCl2 तैयार करें, और एक बाँझ कंटेनर में एक 0.22 डिग्री बाँझ डिस्पोजेबल झिल्ली फिल्टर के माध्यम से समाधान छानने के द्वारा बाँझ।
  6. निरपेक्ष इथेनॉल के 5 एमएल में कोलेस्ट्रॉल के 0.025 ग्राम भंग करके 1 एम कोलेस्ट्रॉल समाधान तैयार करें, और एक बाँझ कंटेनर में एक 0.22 डिग्री बाँझ डिस्पोजेबल झिल्ली फिल्टर के माध्यम से समाधान को छानने के द्वारा बाँझ।
  7. सूत्रकृमि वृद्धि माध्यम (एनजीएम) आगर को 17 ग्राम ऐगार पाउडर, 2.5 ग्राम पेपटोन तथा 3 ग्राम सोडियम क्लोराइड को 1 एल शंकु फ्लास्क में मिलाकर तैयार कीजिये जिसमें 1 एल अल्ट्रापुरे जल होता है। चरण 2.3 से K2HPO4-KH2PO4 समाधान के 25 एमएल जोड़ें।
  8. 20 मिनट के लिए 0.105 MPa के साथ 121 डिग्री सेल्सियस पर चरण 2.7 से एनजीएम आगर स्टरलाइज़ करें।
  9. एनजीएम आगर को लगभग 50 डिग्री सेल्सियस तकठंडा करें, 1 एमएल 1 एम एमजीएसओ 4, 1 एम सी सीएल2,और 5 मिलीग्राम/एमएल कोलेस्ट्रॉल-एथेनोल समाधान को 2.4 से 2.6 तक मध्यम में मिलाकर अच्छी तरह मिला लें।
  10. 100 बाँझ पेट्री व्यंजन (6.0 सेमी व्यास) में प्रति डिश $ 10 एमएल एनजीएम गार मध्यम डालो। पेट्री व्यंजन में मध्यम को कमरे के तापमान में ठंडा करें ताकि ठोस आगर बना हो।
  11. पिपेट 170 डिग्री जीवाणु निलंबन के कदम 1.7 से ऊपर उल्लिखित एनजीएम आगर पर एक बाँझ टिप का उपयोग कर। एनजीएम आगर सतह पर समान रूप से एलबी माध्यम को वितरित करने के लिए एनजीएम आगर को थोड़ा हिलाओ।
  12. एक जीवाणु लॉन बनाने के लिए 8-12 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर शीर्ष पक्ष के साथ एनजीएम आगर टीका।
  13. चरण 2.12 से संस्कृति सूत्रकृमि के लिए चरण 2.15 या 2.19 में जीवाणु लॉन के साथ आगर के अधिकांश का उपयोग करें।
  14. फ्रिज में पानी वाष्पीकरण और संदूषण से बचने के लिए 1 या 2 agars ऊपर-साइड स्टोर करें ताकि बैक्टीरिया को संदूषण में बनाए रखा जा सके।
  15. जब स्टॉकिंग एनजीएम agars पर कम से कम 2,000 सूत्रकृमि हैं (पहले के प्रयोगों से या अन्य प्रयोगशालाओं से उपहार में), एनजीएम आगर के एक छठे में कटौती जिसमें एक बाँझ टिप के साथ सी एलिगन होते हैं और इसे जीवाणु के साथ नए तैयार एनजीएम agars पर स्थानांतरित करते हैं लॉन (चरण 2.13 से)। बाद की संस्कृति के लिए एक 22 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एनजीएम agars ऊपर-साइड रखें।
  16. जब भंडारण एनजीएम आगर पर 2,000 से अधिक सूत्रकृमि हों, तो एनजीएम आगर के सूत्रकृमि को 2 एमएल बाँझ पानी के साथ अपकेंद्रण ट्यूबों में फ्लश करें। 2 एमएल जल के इनपुट के परिणामस्वरूप लगभग 1.5 एमएल उत्पादन होगा।
  17. सूत्रकृमि को 30 मिनट तक अपकेंद्रण ट्यूबों में बसने की अनुमति दें। सुपरनेट्स के 1 एमएल को पाइपिंग करके छोड़ें और छर्रों को धोने के लिए प्रत्येक ट्यूब में 1 एमएल बाँझ पानी जोड़ें (यानी सूत्रकृमि)।
  18. अपकेंद्रण ट्यूबों में सूत्रकृमि को 30 मिनट के लिए बसाएं। पाइपिंग द्वारा सुपरनेट्स के 1 एमएल को त्याग दें। सूत्रकृमियों को पुन: निलंबित करने के लिए प्रत्येक ट्यूब में 1 एमएल बाँझ पानी जोड़ें।
  19. सूत्रकृमि निलंबन (कुल में लगभग 1.5 एमएल) को प्रत्येक नए एनजीएम आगर पर बैक्टीरियल लॉन (चरण 2.13 से) पर पाइपिंग द्वारा वितरित करें, कुल में 8-10 नए एनजीएम एगर बनाते हैं।
  20. एनजीएम agars कदम 2.19 से ऊपर एक 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर और फिर ऊपर की ओर नीचे बाद की संस्कृति के लिए रखें.
  21. चरण 2.15 दोहराएँ या चरण 2.16-2.20 हर तीन दिन.

3. सी elegans के सिंक्रनाइज़ अंडे और L3 लार्वा तैयार करें

  1. ग्रेविड सूत्रकृमि और नव उत्पादित अंडे एनजीएम गार्स से बाँझ अपकेंद्रण ट्यूबों में फ्लश करें, प्रत्येक एनजीएम आगर पर 2 एमएल बाँझ पानी के साथ लगभग 1.5 एमएल उत्पादन होता है।
  2. 30 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूबों में सूत्रकृमि को बसाएं, और फिर पाइपिंग द्वारा 85% सुपरनेट्स को त्याग दें।
  3. 0.6 ग्राम नाओएच और 5 एमएल नाओएच (4-6% सक्रिय ग्रेडिएंट्स) को भंग करके सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान तैयार करें, विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) 25 एमएल पानी के साथ NaOH को 0.5 M और NaOCl को 1% तक ले जाएं।
  4. चरण 3-2 से छर्रों को मिलाएं (मात्रा को ट0के रूप में चिह्नित करें ) सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधानों के 7 गुना ट0 के साथ (चरण 3.3 अर्थात 1:7 का आयतन अनुपात)19.
  5. लार्वा और वयस्क सूत्रकृमियों को lyse करने के लिए 10-15 मिनट के लिए हर 2 मिनट में अपकेंद्रित्र ट्यूब हिलाएं; सूत्रकृमि निलंबन का रंग अशांत से स्पष्ट करने के लिए बंद हो जाएगा।
  6. 20 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 700 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर पाइपिंग द्वारा सुपरनेट्स को त्याग दें।
  7. उम्र-सिंक्रनाइज़किए हुए अंडे को धोने के लिए बाँझ पानी के 5 गुना वी0 में छर्रों को फिर से भरें। 20 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 700 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, और फिर supernatants त्याग दें।
  8. चरण 3.7 दोहराएँ 3.7 दो बार.
  9. उम्र-सिंक्रनाइज़किए हुए अंडे को फिर से चालू करने के लिए ट्यूबों में बाँझ पानी का 1 गुना वी0 जोड़ें।
  10. कदम 2.13 से बैक्टीरियल लॉन के साथ प्रत्येक नए एनजीएम agars पर 50 $L पाइपिंग द्वारा अंडे निलंबन वितरित करें। एनजीएम agars ऊपर रखें 30 मिनट के लिए एक 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ऊपर, पानी वाष्पित या जीवाणु लॉन द्वारा adsorbed की अनुमति. फिर, बाद की संस्कृति के लिए NGM agars ऊपर की ओर नीचे बनाते हैं. अंडे के समय (टीअंडे)के रूप में समय को चिह्नित करें।
  11. के-माध्यम को 1 ल् जल में 3 छ नाक्कर तथा 2ण्36 छ केसीएल को भंग करके तैयार की जा सके। माध्यम को 121 डिग्री सेल्सियस और 0.105 एमपीए को 20 मिनट के लिए स्टरलाइज़ करें और इसे कमरे के तापमान पर ठंडा करें।
  12. जब समय टीअंडेके बाद 36 एच तक पहुंच ता है तो सूत्रकृमि एल 3 लार्वा चरण (एल 3 सूत्रकृमि )20तक पहुंच जाएंगे . एनजीएम आगरों से सूत्रकृमि को अपकेंद्रित्र ट्यूबों में प्रवाहित करते हैं, जिसमें प्रत्येक एनजीएम आगर पर 2 एमएल बाँझ पानी होता है जिसके परिणामस्वरूप लगभग 1.5 एमएल उत्पादन होता है।
  13. 30 मिनट के लिए एक बसने के बाद, हिम्मत3में भोजन को पचाने के लिए 2 एच से के-मध्यम के साथ supernatants के 85% की जगह (पाइपिंग द्वारा) .
  14. महानितियों को त्याग दें। बाद के प्रयोगों के लिए सूत्रकृमि निलंबनों को 100 डिग्री सेल्सियस प्रति लगभग 200 सूत्रकृमि को समायोजित करने के लिए K-मध्यम (चरण 3.11 से) का उपयोग करें।

4. ट्रांस पीढ़ी के प्रभाव अध्ययन के लिए सी elegans का प्रयोग करें

  1. 5 एकाग्रता स्तर और एक विलायक या पूर्ण नियंत्रण के साथ रासायनिक समाधान तैयार करें, यानी कुल में 6 समूह।
  2. धार प्रभाव से बचने के लिए एक 96-वेल बाँझ माइक्रोप्लेट के मध्य क्षेत्र में प्रत्येक समूह (यानी, कुल में 60 कुओं) में प्रतिकृति के रूप में 10 कुओं के साथ नियंत्रण या रासायनिक समाधान के 100 $L जोड़ें।
  3. के-मध्यम से चरण 3.11 से 10 गुना के साथ सूत्रकृमि निलंबन को दूर करें। चरण 4-2 से प्रत्येक 60 कुओं में 100 $एल सूत्रकृमि निलंबन जोड़ें। समय को टी0के रूप में चिह्नित करें.
  4. जब समय ट0के बाद 24 ज तक पहुँचता है , तो कुएं में जीवित और मृत सूत्रकृमि की गणना करें। माध्य घातक सांद्रता की गणना कीजिए (एलसी50)।
  5. की एक श्रृंखला तैयार 5 LC के 10% से नीचे सांद्रता50 मूल्यों.
  6. एक 96 अच्छी तरह से बाँझ microplate के मध्य क्षेत्र में प्रत्येक समूह में प्रतिकृति के रूप में 10 कुओं के साथ नियंत्रण या रासायनिक समाधान (चरण 4.5 से) के 10 डिग्री सेल्सियस जोड़ें (यानी, कुल में 60 कुओं) बढ़त प्रभाव से बचने के लिए एक 96 अच्छी तरह से बाँझ microplate के मध्य क्षेत्र में.
  7. चरण 4-6 से प्रत्येक 60 कुओं में लगभग 200 एल3 सूत्रकृमि (चरण 3.14 से) युक्त 100 ख्00लकार्ं का लगभग मिलाएं। T0के रूप में समय चिह्नित करें.
  8. टी0के बाद से 24 से 96 एच के लिए जोखिम प्रदर्शन करते हैं।
  9. जोखिम के बाद, प्रत्येक समूह में पांच कुओं से सूत्रकृमि को पाइपिंग (अर्थात कुल 6 ट्यूब) द्वारा 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में एकत्र करें।
  10. 30 मिनट के लिए सूत्रकृमि को व्यवस्थित करें, पाइपिंग द्वारा सुपरनेट्स को त्याग दें, और 1 एमएल बाँझ पानी के साथ नीचे सूत्रकृमि को पुन: निलंबित करें और धोएं।
  11. 30 मिनट के लिए सूत्रकृमि को व्यवस्थित करें, सुपरनेट्स को पाइपिंग द्वारा त्यागें और सूचक माप के लिए नीचे सूत्रकृमि का उपयोग करें (एफ0 के रूप में चिह्नित उजागर मूल पीढ़ी के अनुभाग 7 देखें)।
  12. चरण 4.9 में प्रत्येक समूह के शेष पांच कुओं से सूत्रकृमि चरण 4.10 के अनुसार एकत्र, व्यवस्थित और धोएं।
  13. सूत्रकृमि को चरण 4.12 से 30 मिनट के लिए बसाएं। अति-नटों को पाइपिंग द्वारा त्यागें और सूत्रकृमियों को पुन: स्थापित करने के लिए बाँझ पानी का 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ दें। सूत्रकृमि निलंबन को चरण 2.13 से जीवाणु लॉन के साथ तीन नवनिर्मित एनजीएम गर्स पर समान रूप से स्थानांतरित करें।
  14. 36 h के लिए सूत्रकृमि को गुरुग्राम में शामिल करें और चरण 3-1-3.9 के अनुसार आयु-सिंक्रनाइजेशन करें। 36 एच के लिए चरण 2.13 से बैक्टीरियल लॉन के साथ संबंधित एनजीएम agars पर सिंक्रनाइज़ अंडे इनक्यूबेट करें।
  15. एनजीएम गरों पर सूत्रकृमि को चरण 4.14 से छह अपकेंद्रित्र ट्यूबों में भरें।
  16. 30 मिनट के लिए सूत्रकृमि बसाएं, और पाइपिंग द्वारा supernatants त्याग दें। 1 एमएल बाँझ पानी के साथ छर्रों को पुन: निलंबित करें और धोएं।
  17. 30 मिनट के लिए सूत्रकृमि बसाएं, और पाइपिंग द्वारा supernatants त्याग दें। टी 1 के रूप में चिह्नित वंश पीढ़ी के सूचक माप (अनुभाग 7 देखें) के लिए नीचे सूत्रकृमि का उपयोग करें।

5. बहु पीढ़ी के जोखिम (MGE) प्रभाव अध्ययन के लिए सी elegans का प्रयोग करें

  1. मिश्रण 99.0 एमएल एनजीएम agars (चरण 2.9 से) नियंत्रण या रासायनिक समाधान के 1 एमएल के साथ (उदाहरण के रूप में वर्तमान प्रोटोकॉल में कम और उच्च सांद्रता, अर्थात्, कुल में तीन समूहों).
  2. 100 बाँझ पेट्री व्यंजन (6.0 सेमी व्यास) में कदम 5.1 से प्रति डिश एनजीएम आगर मध्यम के लगभग 10 एमएल डालो। पेट्री व्यंजन में मध्यम को कमरे के तापमान में ठंडा करें ताकि ठोस आगर बना हो।
  3. चरण 2.11 के अनुसार आगर पर पिपेट जीवाणु निलंबन।
  4. पेट्री व्यंजन के ऊपरी ढक्कनों को अलग रखें और 15 मिनट केलिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में यूवी प्रकाश (145 डिग्री सेल्सियस 2) के लिए जीवाणु लॉन को बेनकाब करें।
  5. एक टीका पाश का उपयोग कर एक छोटी सी कॉलोनी उठाओ, यह कदम 1.4 में agars से LB माध्यम में जगह है. LB माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस पर 37 डिग्री सेल्सियस की गति से मिलाते हुए 24 घंटे के लिए, हत्या कदम 5.4 मान्य करने के लिए, नेगल जीवाणु विकास की पुष्टि करने के लिए।
  6. पिपेट उम्र से सिंक्रनाइज़ अंडे चरण 3.9 से agars पर (चरण 5.4 से)। पैरेंट जनरेशन F0 के लिए जोखिम की शुरुआत को चिह्नित करें और दिन 0 (D0) के रूप में चिह्नित करें.
  7. 20 डिग्री सेल्सियस पर 3 घ के लिए आगर को इनक्यूबेट करें। फिर (अर्थात, D3 पर), F0 में प्रभाव को मापने के लिए परिपक्व सूत्रकृमि का उपयोग करें (अनुभाग 7 देखें)।
  8. इसके अलावा D3 पर, नए NGM agars पर F0 परिपक्व सूत्रकृमि चुनें (चरण 5.4 से) एक ग्लास रॉड, जिसका अंत एक अंगूठी में तुला एक मानव निर्मित फाइबर तार के साथ फिट है का उपयोग कर.
  9. D4 पर, बाहर ले और NGM agars से परिपक्व F0 सूत्रकृमि को त्याग दें। दूसरी पीढ़ी के जोखिम का अनुभव करने के लिए इन 24 ज (D3 से D4) के भीतर नए पैदा हुए वंश सूत्रकृमि को F1 के रूप में चिह्नित करें।
  10. D6 पर, 3 दिनों के लिए जोखिम का अनुभव किया है कि F1 परिपक्व सूत्रकृमि के सूचकांक (अनुभाग 7 देखें) को मापने।
  11. D9 पर, चरण 5-8-5.10 दोहराएँ, F2 कीड़े पुन: उत्पन्न करने और F2 सूत्रकृमियों पर प्रभाव को मापने के लिए F1 सूत्रकृमि का उपयोग करें।
  12. D12 पर, चरण 5.11 दोहराएँ, F3 कीड़े पुन: उत्पन्न करने और F3 सूत्रकृमि पर प्रभाव को मापने के लिए F2 सूत्रकृमि का उपयोग करें। उसी प्रकार, वंशों को पुन: उत्पन्न करें तथा वें वंश पीढ़ी (Fn) पर MGE प्रभावों को मापें।

6. बहु पीढ़ी अवशिष्ट (एमजीआर) प्रभाव अध्ययन के लिए सी elegans का प्रयोग करें

  1. 5-1-5-7 चरणे। D3 पर, जोड़े गए रसायनों के बिना नए एनजीएम agars पर F0 परिपक्व सूत्रकृमि चुनें (चरण 2.13 से)।
  2. D4 पर, बाहर ले और परिपक्व F0 सूत्रकृमि को त्याग दें। इन 24 ज के भीतर नव निर्मित वंश सूत्रकृमि को टी 1 सूत्रकृमि के रूप में चिह्नित की गई है।
  3. D6 पर, 3 दिनों के लिए बड़े हो गए हैं कि T1 परिपक्व सूत्रकृमि के सूचकांक (अनुभाग 7 देखें) को मापने।
  4. D9 पर, चरण 6-2-6-3 दोहराएँ, T2 सूत्रकृमि को पुन: उत्पन्न करने और T1 सूत्रकृमि में प्रभावको मापने के लिए T1 सूत्रकृमि का उपयोग करें।
  5. D12 पर, चरण 6-4 दोहराएँ, T3 सूत्रकृमि को पुन: उत्पन्न करने और T2 सूत्रकृमि में प्रभावको मापने के लिए T2 सूत्रकृमि का उपयोग करें। उसी प्रकार, संतानों को पुनरुज्जीवन तथा थ्0 वंश पीढ़ी (टी0) निमाड़ों पर, थ्0 वंश (टीएन) के सूत्रकृमि को चरण 5ण्12 से एफ एन के सूत्रकृमि को मापता है।

7. उपाय संकेतक

  1. चलन व्यवहार को मापने.
    1. बाँझ पानी का उपयोग कर एनजीएम आगरों से सूत्रकृमि को फ्लश करें और उन्हें अपकेंद्रित्र ट्यूबों में एकत्र करें। 30 मिनट के लिए सूत्रकृमि बसाएं, महादलितों को त्याग दें और प्रभाव माप के लिए छर्रों में सूत्रकृमि का उपयोग करें।
    2. छर्रों में सूत्रकृमि को 1 एमएल बाँझ पानी के साथ पुन: निलंबित करें और उन्हें कदम 2.10 से बैक्टीरियल लॉन के बिना एनजीएम गर्स पर पिपेट करें।
    3. (संख्या) शरीर झुकने आवृत्ति (बीबीएफ) के लिए सूत्रकृमि स्कोर करने के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें जो ग्रसनी के पीछे के बल्ब को 60 के अंतराल के भीतर यात्रा पथ की ऊर्ध्वाधर दिशा के साथ दिशा में परिवर्तन करने के समय को संदर्भित करता है।
    4. उत्क्रमण आंदोलन (आरएम) स्कोर करने के लिए विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें जो उस समय को संदर्भित करता है जब यात्रा की दिशा 60 एस के अंतराल में पिछड़े मोड़ और ओमेगा टर्न (ओटी) सहित 90 डिग्री से अधिक बदलती है। ओटी उस गति को संदर्भित करता है जब सूत्रकृमि का सिर छूता है या लगभग इसकी पूंछ को छूता है जिससे सूत्रकृमि आकार ग्रीक अक्षर ओमेगा (जेड) की तरह होता है।
      नोट: प्रत्येक प्रयोगात्मक प्रतिकृति में प्रत्येक उपचार के लिए कम से कम 6 सूत्रकृमि की जांच की गई।
MGE के लिए उदाहरण (F0 F3) 3 समूहों (एक नियंत्रण और दो जोखिम उपचार) के साथ प्रजनन और जीवन पर प्रभाव.
दिन MGE अध्ययन के लिए NGM agar संख्या विवरण
उम्र प्रजनन
0 30 (एफ0 जोखिम) प्रत्येक समूह के लिए 10 प्रतिकृतियां, F0-1-1-0 के रूप में F0-3-10-0 के लिए चिह्नित, अंतिम अंक के साथ अस्तित्व के दिन दिखाने के लिए.
1 30 (F0 जीवित 1 घ) F0-1-1-0 से F0-3-10-0 F0-1-1 करने के लिए F0-3-10-1 में परिवर्तित किया जाना चाहिए।
30 (एफ0 जीवित 2 घ) F0-1-1-1 से F0-3-10-1 को F0-1-1-2 से F0-3-10-2 में परिवर्तित किया जाना चाहिए।
3 घ तक F0 सूत्रकृमि स्थानांतरित करने की आवश्यकता नहीं है।
3 30 (F0 जीवित 3 घ, सूत्रकृमि हस्तांतरण और संग्रह के बाद मंजूरी दे दी) 3 घ के बाद, एफ 0 सूत्रकृमि परिपक्व होते हैं और 36 नए एनजीएम आगर (प्रत्येक आगर पर 2 सूत्रकृमि के साथ) का उपयोग उनके जीवित रहने और प्रजनन का प्रेक्षण करने के लिए किया जाता है।
36 (एफ0-1-1-3 से F0-3-12-3) प्रारंभिक प्रयोग F0 सूत्रकृमियों की संख्या की व्यवस्था करने के लिए किया जाना चाहिए, बहु पीढ़ी के संचालन के सफल होने के लिए कम से कम 200 संतानों को आश्वस्त.
विशेष रूप से, यदि एमजीआर प्रभाव का अध्ययन किया जाता है, तो F0 सूत्रकृमि को रासायनिक जोखिम के बिना स्पष्ट एनजीएम आगर पर स्थानांतरित किया जाना चाहिए, और इसे T1 प्रारंभ के रूप में नोट किया जाना चाहिए।
अधिकांश एफ0 सूत्रकृमि रासायनिक तथा आनुवंशिक सूचकांकों को मापने के लिए एकत्र किए जाते हैं तथा एफ0 में 30 आगरों को साफ किया जाता है।
4 36 (एफ0-1-1-4 से F0-3-12-4) 36 (F1-1-1-1 से F1-3-12-1) उम्र और प्रजनन पर माप हर दिन हस्तांतरण की आवश्यकता है.
F0-1-1-3 से F0-3-12-3 पर जनक सूत्रकृमि को नए एनजीएमएम agars पर चुना जाता है जो F0-1-1-4 से F0-3-12-4 के रूप में चिह्नित किया जाता है।
शेष वंश सूत्रकृमि (अर्थात, एमजीई में F1, या एमजीआर में T1) F0-1-1-3 से F0-3-12-3 agars 1 d के लिए बड़े हो गए हैं, और मार्करों F1-1-1 करने के लिए F1-1-1 करने के लिए F1-3-12-1 में बदल रहे हैं। इन agars भी दैनिक हस्तांतरण के साथ F1 की उम्र पर नजर रखने के लिए उपयोग किया जाता है.
5 36 (एफ0-1-1-5 से F0-3-12-5) 36 (F1-1-1-2 से F1-3-12-2) F1-1-1-1 से F1-3-12-1 agars पर Nematodes 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं और आसानी से नजर आ रहे हैं और सूत्रकृमि गिना जाता है, और मार्करों F1-1-1-2 करने के लिए F1-1-2 करने के लिए बदल रहे हैं 3-3-12-2.
36 (एफ0-1-1-4 से F0-3-12-4) F0-1-4 से F0-3-12-4 agars में वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है.
6 36 (F0-1-1-6 से F0-3-12-6) 36 (F0-1-1-4 करने के लिए F0-3-12-4, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F1-1-1-2 से F1-3-12-2 agars पर Nematodes 3 घ के लिए बड़े हो गए हैं और मार्करों F1-1-1-3 करने के लिए F1-3-3 करने के लिए बदल रहे हैं 3-12-3. विशेष रूप से, F1 सूत्रकृमि इस दिन F2 पुन: पेश करने के लिए शुरू, F1 सूत्रकृमि नए एनबीएम agars पर स्थानांतरित किया जाना चाहिए F2-1-1-0 करने के लिए F1-3-12-0. एमजीआर अध्ययन के लिए, T2 आज शुरू करते हैं.
36 (F1-1-1-3 से F1-3-12-3) 36 (एफ0-1-1-5 से F0-3-12-5) यह रासायनिक जोखिम द्वारा देरी हो सकती है, और इसलिए लचीला परिवर्तन प्रत्येक प्रयोग में किया जाना चाहिए करने के लिए बाद की पीढ़ियों के लिए पर्याप्त सूत्रकृमि सुनिश्चित करें.
36 (F2-1-1-0 करने के लिए F1-3-12-0) F0-1-1-4 से F0-3-12-4 agars पर वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और आगर को सूत्रकृमि की गणना के बाद साफ कर दिया जाता है।
F0-1-1-5 से F0-3-12-5 agars पर वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए बड़े हो गए हैं.
7 36 (F0-1-1-7 से F0-3-12-7) 36 (F0-1-1-5 से F0-3-12-5, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F0-1-1-5 से F0-3-12-5 agars पर वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और आगर को सूत्रकृमि की गणना के बाद साफ कर दिया जाता है।
36 (F1-1-1-4 से F1-3-12-4) 36 (F0-1-1-6 से F0-3-12-6) F1-1-1-1 से F1-3-12-1 agars, F0-1-4 से F0-3-12-4 agars और F0-1-1-5 से F0-3-12-5 में समग्र सूत्रकृमि संख्या F0 के प्रारंभिक प्रजनन की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है।
36 (F2-1-1-1 से F2-3-12-1) F0-1-1-6 से F0-3-12-6 agars पर वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है.
F2-1-1-0 पर F2 सूत्रकृमि 1 d के लिए बड़े हो गए हैं और उनके मार्करों F2-1-1 में बदल रहे हैं F2-3-12-1.
8 36 (F0-1-1-8 से F0-3-12-8) 36 (F0-1-1-6 करने के लिए F0-3-12-6, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F0-1-1-6 से F0-3-12-6 agars पर वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और आगर को सूत्रकृमि की गणना के बाद साफ कर दिया जाता है।
36 (F1-1-1-5 से F1-3-12-5) 36 (F0-1-1-7 से F0-3-12-7) F0-1-7 पर F0 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F0-3-3-12-7 agars के लिए वृद्धि हुई है।
36 (F2-1-1-2 से F2-3-12-2) 36 (F1-1-1-4 से F1-3-12-4) F1-1-4 पर F1-1-4 से F1-3-12-4 agars के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए बड़े हो गए हैं।
36 (F2-1-1-1 करने के लिए F2-3-12-1, F2-1-1-2 करने के लिए बदल गया F2-3-12-2 गिनती के बाद) F2-1-1-1 से F2-3-12-1 पर F2 सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, सूत्रकृमि गिना जाता है और उनके मार्करों F2-1-1-2 में परिवर्तित कर रहे हैं F2-3-3-12-2.
9 36 (F0-1-1-9 करने के लिए F0-3-12-9) 36 (F0-1-1-7 से F0-3-12-7, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F0-1-7 पर F0 के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और आगर सूत्रकृमि की गणना के बाद साफ कर रहे हैं।
36 (F1-1-1-6 से F1-3-12-6) 36 (F1-1-1-4 करने के लिए F1-3-12-4, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F1-1-4 से F1-1-4 से F1-3-12-4 agars के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और आगर सूत्रकृमि की गणना के बाद साफ कर रहे हैं।
36 (F2-1-1-3 करने के लिए F2-3-12-3) 36 (F0-1-1-8 से F0-3-12-8) F0-1-8 पर F0 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F0-3-3-12-8 agars के लिए वृद्धि हुई है।
36 (F3-1-1-0 से F3-3-12-0) 36 (F1-1-1-5 से F1-3-12-5) F1-1-1-5 पर F1-1-5 से F1-3-12-5 agars के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए बड़े हो गए हैं।
F2-1-1-2 से F2-3-12-2 पर F2 सूत्रकृमि 3 दिनों के लिए हो गए हैं और उनके मार्करों F2-1-1-3 करने के लिए F2-1-3 करने के लिए बदल रहे हैं 3-3-12-3. F2 सूत्रकृमि आज पुन: उत्पन्न करने के लिए शुरू करते हैं और वे 36 नए एनजीएम agars को स्थानांतरित कर रहे हैं की जरूरत है और F3-1-0 के रूप में चिह्नित करने के लिए F3-3-12-0. MGR अध्ययन के लिए, T3 आज शुरू करते हैं.
10 36 (F0-1-1-10 से F0-3-12-10) 36 (F0-1-1-8 करने के लिए F0-3-12-8, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F0-1-8 पर F0 के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गणना के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F1-1-1-7 से F1-3-12-7) 36 (F1-1-1-5 से F1-3-12-5, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F1-1-1-5 पर F1-1-5 से F1-3-12-5 agars के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गणना के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F2-1-1-4 करने के लिए F2-3-12-4) 36 (F0-1-1-9 करने के लिए F0-3-12-9) F2-1-1-1 से F2-3-12-1, F1-1-4 से F1-3-12-4 agars और F1-1-5 से F1-3-12-5 में समग्र सूत्रकृमि संख्या का उपयोग F1 के प्रारंभिक प्रजनन के लिए किया जाता है।
36 (F3-1-1-1 से F3-3-12-1) 36 (F1-1-1-6 से F1-3-12-6) F0-1-9 पर F0 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F0-3-3-12-9 agars के लिए वृद्धि हुई है।
F1-1-1-6 पर F1-1-6 से F1-3-12-6 agars के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए बड़े हो गए हैं।
F3-1-1-0 पर वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए बड़े हो गए हैं और मार्करF3-1-1-1 से F3-3-12-1 में बदल रहे हैं।
विशेष रूप से, पहले कई दिनों के बाद एफ0 सूत्रकृमि का प्रजनन काफी कम हो जाएगा। इसलिए, सूत्रकृमि स्थानांतरण सख्ती से D10 के बाद दैनिक होने की आवश्यकता नहीं है और हर 2 दिन किया जा सकता है। फिर भी, अस्तित्व अभी भी दैनिक अवलोकन की आवश्यकता है.
एक ही नियम भी F1 में लागू होता है (T1, T1'), F2 (T2, T2') और F3 (T3, T3').
11 36 (F0-1-1-11 करने के लिए F0-3-12-11) 36 (F0-1-1-9 करने के लिए F0-3-12-9, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F0-1-9 पर F0 के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गणना के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F1-1-1-8 से F1-3-12-8) 36 (F1-1-1-6 करने के लिए F1-3-12-6, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F1-1-1-6 पर F1-1-6 से F1-3-12-6 agars के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गणना के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F2-1-1-5 से F2-3-12-5) 36 (F0-1-1-10 से F0-3-12-10) F0-1-10 पर F0 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F0-3-3-12-10 agars के लिए.
36 (F3-1-1-2 से F3-3-12-2) 36 (F1-1-1-7 से F1-3-12-7) F1-1-7 पर F1-1-7 से F1-3-12-7 agars के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए बड़े हो गए हैं।
36 (F2-1-1-4 करने के लिए F2-3-12-4) F2-1-4 पर F2 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F2-3-12-4 agars के लिए.
36 (F3-1-1-1 से F3-3-12-1, F3-1-1-2 करने के लिए बदल गिनती के बाद F3-3-12-2) F3-1-1-1 से F3-3-12-1 agars पर सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, सूत्रकृमि गिना जाता है और मार्करों F3-1-1-2 में परिवर्तित कर रहे हैं F3-3-3-12-2.
12 36 (एफ0-1-1-12 से F0-3-12-12) 36 (F0-1-1-10 करने के लिए F0-3-12-10, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F0-1-10 पर F0 के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F1-1-1-9 करने के लिए F1-3-12-9) 36 (F1-1-1-7 से F1-3-12-7, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F1-1-7 से F1-1-7 से F1-3-12-7 agars के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गणना के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F2-1-1-6 से F2-3-12-6) 36 (F2-1-1-4 करने के लिए F2-3-12-4, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F2-1-4 से F2-1-4 से F2-3-12-4 agars के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गणना के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F3-1-1-3 करने के लिए F3-3-12-3) 36 (F0-1-1-11 करने के लिए F0-3-12-11) F0-1-1-11 पर F0 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F0-3-3-12-11 agars के लिए हो गई है।
36 (F4-1-1-0 से F4-3-12-0) 36 (F1-1-1-8 से F1-3-12-8) F1-1-8 पर F1-1-8 से F1-3-12-8 agars के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए बड़े हो गए हैं।
36 (F2-1-1-5 से F2-3-12-5) F2-1-5 पर F2 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F2-3-12-5 agars के लिए.
F3-1-1-2 से F3-3-12-2 agars पर सूत्रकृमि 3 घ के लिए बड़े हो गए हैं और मार्करों F3-1-1-3 में बदल रहे हैं F3-3-3-12-3. F3 सूत्रकृमि आज पुन: पेश करने के लिए शुरू करते हैं और वे 36 नए एनजीएम agars को स्थानांतरित कर रहे हैं की जरूरत है और F4-1-0 के रूप में चिह्नित करने के लिए F4-3-12-0. MGR अध्ययन के लिए, F3 की संतान (यानी, T1') आज शुरू करते हैं.
13 36 (F0-1-1-13 से F0-3-12-13) 36 (F0-1-1-11 करने के लिए F0-3-12-11, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F0-1-1-11 पर F0 के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F1-1-10 से F1-3-12-10) 36 (F1-1-1-8 करने के लिए F1-3-12-8, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F1-1-8 से F1-1-8 से F1-3-12-8 agars के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गणना के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F2-1-1-7 से F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-5 करने के लिए F2-3-12-5, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F2-1-5 से F2-1-5 से F2-3-12-5 agars के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गणना के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F3-1-1-4 से F3-3-12-4) 36 (एफ0-1-1-12 से F0-3-12-12) F3-1-1-1 से F3-3-12-1, F2-1-4 से F2-3-12-4 agars और F2-1-5 से F2-3-12-5 में समग्र सूत्रकृमि संख्या F2 के प्रारंभिक प्रजनन के लिए गणना कर रहे हैं।
36 (F4-1-1-1 से F4-3-12-1) 36 (F1-1-1-9 करने के लिए F1-3-12-9) F0-1-12 पर F0 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F0-3-3-12-12 agars के लिए हो गई है।
36 (F2-1-1-6 से F2-3-12-6) F1-1-9 पर F1-1-9 से F1-3-12-9 agars के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए बड़े हो गए हैं।
F2-1-6 पर F2 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F2-3-12-6 agars के लिए.
F4-1-1-0 पर F3 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और मार्करों F4-1-1 में बदल रहे हैं F4-3-12-1.
14 36 (एफ0-1-1-14 से F0-3-12-14) 36 (F0-1-1-12 करने के लिए F0-3-12-12, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F0-1-1-12 पर F0 के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F1-1-1-11 करने के लिए F1-3-12-11) 36 (F1-1-1-9 करने के लिए F1-3-12-9, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F1-1-9 से F1-1-9 से F1-3-12-9 agars के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और आगर सूत्रकृमि की गणना के बाद साफ हो जाते हैं।
36 (F2-1-1-8 करने के लिए F2-3-12-8) 36 (F2-1-1-6 करने के लिए F2-3-12-6, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F2-1-6 से F2-1-6 से F2-3-12-6 agars के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गणना के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F3-1-1-5 से F3-3-12-5) 36 (F4-1-1-1 करने के लिए F4-3-12-1, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F4-1-1-1 से F4-3-1-1 पर F3 के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गणना के बाद मंजूरी दे दी है. एमजीआर अध्ययन के लिए, T1' सूत्रकृमि 2 d के लिए बड़े हो गए हैं, और अगले दिन (D15) पर T2 पुन: पेश करने के लिए शुरू कर देंगे, और T2' D18 पर T3 को पुन: पेश करने के लिए शुरू कर देंगे। जंगली प्रकार सी elegans की उम्र 15 दिनों के रूप में उदाहरण दिया है. फिर, T3' उम्र का अंत D33 पर होगा.
36 (F0-1-1-13 से F0-3-12-13) F0-1-13 पर F0 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F0-3-3-12-13 agars के लिए हो गई है।
36 (F1-1-10 से F1-3-12-10) F1-1-10 पर F1-1-10 से F1-3-12-10 agars के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए बड़े हो गए हैं।
36 (F2-1-1-7 से F2-3-12-7) F2-1-7 पर F2 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F2-3-12-7 agars के लिए.
36 (F3-1-1-4 से F3-3-12-4) F3-1-4 पर F3 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F2-3-12-4 agars के लिए.
15 36 (F0-1-1-15 से F0-3-12-15) 36 (F0-1-1-13 करने के लिए F0-3-12-13, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F0-1-1-13 पर F0 के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F1-1-1-12 से F1-3-12-12) 36 (F1-1-10 करने के लिए F1-3-12-10, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F1-1-1-10 पर F1-1-10 के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F2-1-1-9 करने के लिए F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-7 से F2-3-12-7, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F2-1-7 से F2-1-7 से F2-3-12-7 agars के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गणना के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F3-1-1-6 से F3-3-12-6) 36 (F3-1-1-4 करने के लिए F3-3-12-4, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F3-1-4 पर F3-1-4 से F3-3-12-4 agars 2d के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गणना के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (एफ0-1-1-14 से F0-3-12-14) F0-1-1-14 पर F0 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F0-3-3-12-14 agars के लिए हो गई है।
36 (F1-1-1-11 करने के लिए F1-3-12-11) F1-1-1-11 पर F1-1-11 से F1-3-12-11 agars के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए बड़े हो गए हैं।
36 (F2-1-1-8 करने के लिए F2-3-12-8) F2-1-8 पर F2 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F2-3-12-8 agars के लिए.
36 (F3-1-1-5 से F3-3-12-5) F3-1-5 पर F3 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F2-3-12-5 agars के लिए.
16 36 (F0-1-1-15 से F0-3-12-15, ओवर) 36 (F0-1-1-14 करने के लिए F0-3-12-14, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) जंगली प्रकार सी elegans की उम्र 15 दिनों के रूप में उदाहरण दिया है. इसलिए, F0 सभी जोखिम के बाद से 16 दिन से पहले मर गया होना चाहिए था.
36 (F1-1-13 करने के लिए F1-3-12-13) 36 (F1-1-11 करने के लिए F1-3-12-11, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F0-1-1-14 पर F0 के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F2-1-10 से F2-3-12-10) 36 (F2-1-1-8 करने के लिए F2-3-12-8, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F1-1-1-11 पर F1-1-11 से F1-3-12-11 agars 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F3-1-1-7 से F3-3-12-7) 36 (F3-1-1-5 से F3-3-12-5, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F2-1-8 से F2-1-8 से F2-3-12-8 agars के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गणना के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F0-1-1-15 से F0-3-12-15) F3-1-5 पर F3 के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गणना के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F1-1-1-12 से F1-3-12-12) F4-1-1-1 से F4-3-12-1, F3-1-4 से F3-3-12-4 agars और F3-1-5 से F3-3-12-5 में समग्र सूत्रकृमि संख्या F3 के प्रारंभिक प्रजनन के लिए गणना कर रहे हैं।
36 (F2-1-1-9 करने के लिए F2-3-12-9) F0-1-1-15 पर F0 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F0-3-3-12-15 agars के लिए हो गई है।
36 (F3-1-1-6 से F3-3-12-6) F1-1-1-12 पर F1-1-12 से F1-3-12-12 agars के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए बड़े हो गए हैं।
F2-1-9 पर F2 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F2-3-3-12-9 agars के लिए वृद्धि हुई है।
F3-1-6 पर F3 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F2-3-12-6 agars के लिए.
17 36 (F1-1-1-14 से F1-3-12-14) 36 (F0-1-1-15 से F0-3-12-15, गिनती के बाद मंजूरी दे दी, खत्म) F0-1-1-15 पर F0 के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है. वहाँ कोई और अधिक F0 वंश होगा.
36 (F2-1-1-11 करने के लिए F2-3-12-11) 36 (F1-1-1-12 करने के लिए F1-3-12-12, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F1-1-12 पर F1-1-12 से F1-3-12 agars 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F3-1-1-8 करने के लिए F3-3-12-8) 36 (F2-1-1-9 करने के लिए F2-3-12-9, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F2-1-9 से F2-1-9 से F2-3-12-9 agars के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गणना के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F3-1-1-6 करने के लिए F3-3-12-6, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F3-1-6 पर F3 के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गणना के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F1-1-13 करने के लिए F1-3-12-13) F1-1-13 पर F1-1-13 से F1-3-12-13 agars के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए बड़े हो गए हैं।
36 (F2-1-10 से F2-3-12-10) F2-1-10 पर F2 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए बढ़ गए हैं F2-3-3-12-10 agars.
36 (F3-1-1-7 से F3-3-12-7) F3-1-7 पर F3 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F2-3-12-7 agars के लिए.
18 36 (F1-1-1-15 से F1-3-12-15) 36 (F1-1-13 करने के लिए F1-3-12-13, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F1-1-1-13 पर F1-1-13 से F1-3-12-13 agars 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F2-1-1-12 करने के लिए F2-3-12-12) 36 (F2-1-10 करने के लिए F2-3-12-10, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F2-1-10 पर F2-1-10 के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F3-1-1-9 करने के लिए F3-3-12-9) 36 (F3-1-1-7 से F3-3-12-7, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F3-1-7 से F3-1-7 से F3-3-12-7 agars के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गणना के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F1-1-1-14 से F1-3-12-14) F1-1-1-14 पर F1-1-14 से F1-3-12-14 agars के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए बड़े हो गए हैं।
36 (F2-1-1-11 करने के लिए F2-3-12-11) F2-1-1-11 पर F2 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए बढ़ गए हैं F2-3-3-12-11 agars.
36 (F3-1-1-8 करने के लिए F3-3-12-8) F3-1-8 पर F3 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F2-3-12-8 agars के लिए वृद्धि हुई है।
MGR अध्ययन में, T2' आज T3 पुन: पेश करने के लिए शुरू कर देंगे. जंगली प्रकार सी elegans की उम्र 15 दिनों के रूप में उदाहरण दिया है. फिर, T3' उम्र का अंत D33 पर होगा.
19 36 (F1-1-1-15 से F1-3-12-15, ओवर) 36 (F1-1-1-14 करने के लिए F1-3-12-14, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F1-1-1-14 पर F1-1-14 से F1-3-12-14 agars 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F2-1-1-13 करने के लिए F2-3-12-13) 36 (F2-1-11 करने के लिए F2-3-12-11, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F2-1-11 पर F2-1-11 से F2-3-12-11 agars के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F3-1-10 से F3-3-12-10) 36 (F3-1-1-8 करने के लिए F3-3-12-8, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F3-1-8 पर F3 के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गणना के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F1-1-1-15 से F1-3-12-15) F1-1-1-15 पर F1-1-15 से F1-3-12-15 agars के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए बड़े हो गए हैं।
36 (F2-1-1-12 करने के लिए F2-3-12-12) F2-1-12 पर F2 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए बढ़ गए हैं F2-3-3-12-12 agars के लिए.
36 (F3-1-1-9 करने के लिए F3-3-12-9) F3-1-9 पर F3 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F2-3-12-9 agars के लिए.
20 36 (F2-1-1-14 से F2-3-12-14) 36 (F1-1-1-15 करने के लिए F1-3-12-15, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F1-1-1-14 पर F1-1-14 से F1-3-12-14 agars 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है. वहाँ कोई और अधिक F1 वंश होगा.
36 (F3-1-1-11 करने के लिए F3-3-12-11) 36 (F2-1-1-12 करने के लिए F2-3-12-12, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F2-1-12 पर F2-1-12 से F2-3-12 agars 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars के वंश सूत्रकृमि की गिनती कर रहे हैं के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F3-1-1-9 करने के लिए F3-3-12-9, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F3-1-9 से F3-3-12-9 agars पर F3 के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गणना के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F2-1-1-13 करने के लिए F2-3-12-13) F2-1-13 पर F2 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F2-3-3-12-13 agars के लिए वृद्धि हुई है।
36 (F3-1-10 से F3-3-12-10) F3-1-10 पर F3 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F2-3-12-10 agars के लिए.
21 36 (F2-1-1-15 से F2-3-12-15) 36 (F2-1-13 करने के लिए F2-3-12-13, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F2-1-13 पर F2-1-13 से F2-3-12-13 agars के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F3-1-1-12 करने के लिए F3-3-12-12) 36 (F3-1-10 करने के लिए F3-3-12-10, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F3-1-10 पर F3-1-10 पर वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F2-1-1-14 से F2-3-12-14) F2-1-1-14 पर F2-1-14 से F2-3-12-14 agars के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए बड़े हो गए हैं।
36 (F3-1-1-11 करने के लिए F3-3-12-11) F3-1-11 पर F3 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F2-3-12-11 agars के लिए.
22 36 (F2-1-1-15 करने के लिए F2-3-12-15, ओवर) 36 (F2-1-1-14 करने के लिए F2-3-12-14, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F2-1-1-14 पर F2-1-14 के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F3-1-1-13 करने के लिए F3-3-12-13) 36 (F3-1-11 करने के लिए F3-3-12-11, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F3-1-11 पर F3-1-11 पर वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F3-1-1-12 करने के लिए F3-3-12-12) F3-1-12 पर F3 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F2-3-12-12 agars के लिए.
23 36 (F3-1-1-14 से F3-3-12-14) 36 (F2-1-1-15 करने के लिए F2-3-12-15, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F2-1-1-15 पर F2-1-15 से F2-3-12-15 agars के वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है. वहाँ कोई और अधिक F2 वंश होगा.
36 (F3-1-1-12 करने के लिए F3-3-12-12, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F3-1-12 पर F3-1-12 से F3-3-12 agars 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars के वंश सूत्रकृमि की गिनती कर रहे हैं के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F3-1-1-13 करने के लिए F3-3-12-13) F3-1-13 पर F3 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F2-3-12-13 agars के लिए वृद्धि हुई है।
24 36 (F3-1-1-15 से F3-3-12-15) 36 (F3-1-13 से F3-3-12-13, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F3-1-13 पर F3-1-13 से F3-3-12-13 agars 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars के वंश सूत्रकृमि की गिनती कर रहे हैं के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F3-1-1-14 से F3-3-12-14) F3-1-1-14 पर F3 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F2-3-12-14 agars के लिए.
25 36 (F3-1-1-15 से F3-3-12-15, ओवर) 36 (F3-1-1-14 से F3-3-12-14, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F3-1-1-14 पर F3-1-14 पर वंश सूत्रकृमि 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है.
36 (F3-1-1-15 से F3-3-12-15) F3-1-1-15 पर F3 के वंश सूत्रकृमि 1 घ के लिए वृद्धि हुई है F2-3-12-15 agars के लिए हो गई है।
26 36 (F3-1-1-15 से F3-3-12-15, गिनती के बाद मंजूरी दे दी) F3-1-1-15 पर F3-1-15 से F3-3-12-15 agars 2 घ के लिए बड़े हो गए हैं, और agars के वंश सूत्रकृमि की गिनती के बाद मंजूरी दे दी है.
विशेष रूप से, एमजीआर अध्ययन में, F3 के पहले गैर उजागर वंश (यानी, T3') D18 पर पैदा होगा. जंगली प्रकार सी elegans की उम्र 15 दिनों के रूप में उदाहरण दिया है. फिर, T3' उम्र का अंत D33 पर होगा.
एमजीई और एमजीआर दोनों अध्ययन अधिक दिनों को कवर करेंगे जब सूत्रकृमि की उम्र लंबी है।

तालिका 1: मार्करों और उनकी परिभाषाओं की सूची.

  1. MGE प्रभाव अध्ययन में प्रजनन और उम्र को मापने.
    1. D0 पर, चरण 5.6 दोहराएँ. Agars (3 प्रत्येक में प्रतिकृति के साथ 10 समूहों के साथ) के रूप में Fx-a-b-c, जहां एक्स पीढ़ी संख्या को संदर्भित करता है, एक समूह संख्या को संदर्भित करता है (1 नियंत्रण के लिए, 2 कम एकाग्रता के लिए और 3 उच्च एकाग्रता के लिए ); 1 से 10 तक प्रतिकृति को संदर्भित करता है; और c जोखिम अवधि (0 प्रारंभ इंगित करता है) को संदर्भित करता है। D0 के लिए, F0-1-1-0 के रूप में agars के निशान F0-3-10-0. पाठक विस्तृत जानकारी के लिए तालिका 1 का संदर्भ ले सकते हैं.
    2. D1 पर, agars पर सूत्रकृमि वृद्धि की जाँच करें, और F0-1-0 से F0-3-10-0 करने के लिए F0-1-1-1 करने के लिए F0-3-10-1 से मार्करों बदल जाते हैं।
    3. D2 पर, agars पर सूत्रकृमि विकास की जाँच करें, और मार्करों F0-1-1-2 करने के लिए F0-3-10-2 बदल जाते हैं।
    4. D3 पर, चरण 5.4 से दो एनजीएम agars के साथ 12 नए एनजीएमएम agars पर प्रत्येक समूह से 24 F0 सूत्रकृमि चुनें। आगरको F0-1-1-3 से F0-3-12-3 के रूप में चिह्नित करें।
    5. D4 पर, दो मूल सूत्रकृमि F0-1-1-3 से F0-3-12-3 के लिए कदम 5.4 से नए एनजीएमएम agars पर उठा द्वारा स्थानांतरण. नए एनजीएम agars को F0-1-1-4 से F0-3-12-4 के रूप में चिह्नित करें। F0-1-1-3 के मार्कर परिवर्तित करने के लिए F0-3-3-12-3 करने के लिए F1-1-1-1 करने के लिए F1-3-12-1 के लिए F0 की संतान का प्रतिनिधित्व करने के लिए (यानी, F1) पहले दिन के भीतर F0 के बाद से पुन: पेश करने के लिए शुरू करते हैं.
    6. D5 पर, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए F1-1-1-1 पर सूत्रकृमि गिनती F1-3-3-12-1 agars जहां सूत्रकृमियों 2 दिन हो गए हैं. F1-1-1-1 से F1-3-12-1 agars को क्रमिक पीढ़ियों के लिए F2 पुन: उत्पन्न करने की अनुमति दें।
    7. दो मूल सूत्रकृमि को F0-1-1-4 से F0-3-12-4 agars में चरण 5-4 से नए एनजीएम आगरों पर चुनकर स्थानांतरित करें। मार्क NGM agars के रूप में F0-1-1-5 करने के लिए F0-3-12-5. F0-1-1-4 के अंक को F0-3-12-4 से F1-1-1-2 से F1-3-12-2 में परिवर्तित करें ताकि F0 की संतानों का प्रतिनिधित्व किया जा सके (यानी F1) F0 के बाद से दूसरे दिन के भीतर प्रजनन करना शुरू करें।
    8. D6 पर, F1-1-1-2 पर सूत्रकृमि को F1-3-12-2 agars पर गिनें। मूल सूत्रकृमि को एफ0-1-1-5 से एफ0-3-12-5 तक एफ0-1-1-6 से एफ0-3-12-6 में स्थानांतरित करें। F0-1-1-5 के मार्कर परिवर्तित करने के लिए F0-3-12-5 करने के लिए F1-1-1-3 करने के लिए F1-3-12-3 F0 की संतान का प्रतिनिधित्व करने के लिए (यानी, F1) F0 के बाद से तीसरे दिन के भीतर प्रजनन शुरू करते हैं.
    9. F1-1-1-1 से F1-3-12-1 agars पर सूत्रकृमि 3 दिनों के लिए बड़े हो गए हैं. उन्हें का उपयोग करने के लिए सफल MGE प्रभाव अध्ययन में F2 पुन: पेश. उसी प्रकार, MGE प्रभाव अध्ययन जारी रखने के लिए F3 को पुन: उत्पन्न करने के लिए F2 सूत्रकृमि का उपयोग करें।
    10. उसी प्रकार, प्रतिदिन दो मूल सूत्रकृमिकोड़ों को अंतरित करें तथा अगले दिन वंश सूत्रकृमि की गणना करें, जब तक कि 6 एनजीएम आगरों में मूल सूत्रकृमि (अर्थात् प्रत्येक समूह के कुल आगरों का आधा) प्रजनन बंद कर दें।
    11. संपूर्ण जनन अवधि में कुल वंश संख्या की गणना कुल अंड आकार के रूप में कीजिए। माता-पिता के प्रारंभिक प्रजनन का प्रतिनिधित्व करने के लिए पहले 3 दिनों के भीतर वंश संख्या का उपयोग करें।
    12. प्रतिपाद सूत्रकृमि जनन 6 एनजीएम गरों में प्रजनन अवधि का अनुमान लगाने के लिए बंद होने पर उस दिन का उपयोग करें। दिन है कि प्रत्येक व्यक्ति के माता पिता अपनी उम्र के रूप में बच गया है का प्रयोग करें.
    13. प्रारंभिक जनन, जनन अवधि, च्1 का कुल अंड आकार तथा आयु फल्वम को उसी प्रकार प्राप्त की जिस प्रकार F0 के लिए किया गया था। इसी प्रकार, उपर्युक्त प्रक्रिया को दोहराकर, एफ 2 (से एफएएन) की प्रजनन और आयु की जानकारी प्राप्त की जा सकती है।
  2. MGR प्रभाव अध्ययन में प्रजनन और उम्र को मापने.
    1. चरण 7.2.4 के साथ चरण 5.4 से उन चरण 2.13 से बदल कार्य करें।
  3. जैव रासायनिक सूचकांकों को मापें।
    1. एनजीएम आगरों से सूत्रकृमि को बाँझ पानी से निकाल कर अपकेंद्रण ट्यूबों में भरकर एकत्र करें। सूत्रकृमि को 30 मिनट के लिए बसाएं और महादलितों को त्याग दें। प्रभाव माप के लिए छर्रों में सूत्रकृमि का प्रयोग करें।
    2. सूत्रकृमि को धोने के लिए 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 1 एमएल बर्फ-ठंडा फॉस्फेट बफर्ड लवण (पीबीएस, पीएच 7.0) जोड़ें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, और ध्यान से एक पिपेट के साथ supernatants त्याग दें।
    4. स्नैप तरल नाइट्रोजन द्वारा या एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में छर्रों फ्रीज।
    5. एक बर्फ स्नान में मूसल का उपयोग कर छर्रों homogenize. मूसल को बाहर निकालने से पहले मूसल पर अवशिष्ट तरल पदार्थ को अपकेंद्रण ट्यूब में धोने के लिए 200 डिग्री सेल्सियस बर्फ-ठंडा पीबीएस का उपयोग करें।
    6. फिर से 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, और वाणिज्यिक किट के साथ जैव रासायनिक गतिविधियों या मात्रा का निर्धारण करने के लिए supernatants का उपयोग करें (विस्तार के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
    7. नमूनों में कुल प्रोटीन (टीपी) की मात्रा को मापने, और अन्य जैव रासायनिक संकेतकों का प्रतिनिधित्व करने में हर के रूप में परिणाम का उपयोग करें, ताकि नमूनों के बीच सूत्रकृमि संख्या के बीच अंतर समाप्त किया जा सकता है।
  4. जीन अभिव्यक्ति को मापने.
    1. 7.4.1 से 7.4.4 तक चरणों को दोहराएँ. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके सूत्रकृमि नमूनों से कुल आरएनए को अलग करें (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार cDNA संश्लेषित करने के लिए आरएनए का उपयोग करें21.
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार SYBR ग्रीन RT-PCR किट का उपयोग कर वास्तविक समय polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर) में cDNA नमूना का विश्लेषण करें (सामग्री की तालिकादेखें)21.
    4. चुने गए जीनों के सापेक्ष व्यंजक स्तरों को 2-[CT विधि22द्वारा, और gdp-2 (या अन्य संदर्भ जीन) के अभिव्यक्ति स्तरों को ऋणात्मक संदर्भ के रूप में मानें।

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Representative Results

यहाँ, हम ट्रांस पीढ़ी (TG), बहु पीढ़ी के जोखिम (MGE) और बहु पीढ़ी अवशिष्ट (एमजीआर) प्रभाव अध्ययन में सी elegans का उपयोग कर पीढ़ियों से अधिक रसायनों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन. हमारे अपने अनुसंधान के परिणाम उदाहरण के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. एक अध्ययन में लोकोमोशन व्यवहार3पर भारी धातुओं के टीजी प्रभाव को प्रस्तुत किया गया है . अन्य दो अध्ययनों में यूल्फोमेथोक्साज़ोल और लिन्डेन के एमजीई और एमजीआर प्रभाव प्रजनन और जैव रासायनिक तथा आनुवंशिक सूचकांकों माप4,14पर प्रस्तुत किए गए हैं .

के चलन व्यवहार पर भारी धातुओं के टीजी प्रभाव C. एलिगन्स

कैडमियम (सीडी), कॉपर (सीयू), सीसा (पीबी) और जिंक (जेडएन) के टीजी प्रभाव शरीर बंकिंग आवृत्ति (बीबीएफ) पर मातृ जोखिम और उनकी संतति (टी 1)3के बाद सूत्रकृमि माता-पिता (एफ00) में अध्ययन किए गए। BBF पर धातुओं के प्रभाव से पता चला कि T1 में संकोच F0 की तुलना में अधिक थे, सीधे उजागर माता पिता की तुलना में भ्रूण उजागर वंश में चलन व्यवहार पर भारी धातुओं के अधिक गंभीर toxicities का प्रदर्शन. पर्यावरण की दृष्टि से यथार्थवादी सांद्रता पर भारी धातुओं के टीजी प्रभावों ने यह प्रदर्शित किया कि मातृ जोखिम आने वाली पीढ़ियों में भारी धातु प्रदूषण के खतरों को गुणा कर सकता है। चित्र 1देखें.

Figure 1
चित्र 1 : प्रसव पूर्व जोखिम और उनकी संतति (टी 1, छायांकित) के बाद सूत्रकृमि माता-पिता (एफ0, रिक्त) की शरीर बंकिंग आवृत्ति पर कैडमियम (सीडी), कॉपर (सीयू), सीसा (पीबी) और जिंक (जेडएन)का प्रभाव। त्रुटि पट्टी [ मानक त्रुटि; * - नियंत्रण से काफी अलग, पी और lt; 0.05; - कम एकाग्रता से काफी अलग, p और lt; 0.05; + F0, p और lt; 0.05 की तुलना में F1 में काफी अलग प्रभाव का तात्पर्य है। यह आंकड़ा यू एट अल 3 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सूत्रकृमि जीवन और प्रजनन पर सल्फामथोक्साज़ोल (SMX) के एमजीआर प्रभाव

सूत्रकृमि जीवन और प्रजनन14 पर सल्फामोथोक्सज़ोल (SMX) के एमजीआर प्रभाव gestating माता पिता पर अध्ययन किया गया (F0), भ्रूण उजागर वंश (T1), gerline उजागर वंश (T2), पहले गैर उजागर वंश (T3) और तीन निम्नलिखित पीढ़ियों (T4-T6) परिणामों से पता चला कि प्रजनन (नियंत्रण के 49% के रूप में कुल विचार आकार) जर्मलाइन जोखिम (टी 2) में काफी प्रभावित हुए थे, और विषाक्तताएं टी 3 से टी 6 पीढ़ियों तक गैर-एक्सपोज्ड पीढ़ियों में बनी रहीं (चित्र 2)। हमारे निष्कर्षों एंटीबायोटिक प्रतिरोध पर उनके प्रभाव के अलावा खुद एंटीबायोटिक दवाओं के दीर्घकालिक प्रभावों के बारे में नई चिंताओं को उठाया.

Figure 2
चित्र 2 : ब्रोड आकार (ए) में, नियंत्रण के प्रतिशत में व्यक्त) और प्रारंभिक प्रजनन (में (बी)) की उजागर माता पिता और उसकी संतान में सी elegans (F0, T1 T6 के लिए, बाएँ से दाएँ प्रत्येक एकाग्रता में). त्रुटि पट्टी [ मानक त्रुटि; ANOVA द्वारा नियंत्रण से काफी अलग एक $(p और lt; 0.05); ख ] नियंत्रण से और एक ही एकाग्रता में पहले की पीढ़ी से काफी अलग (p और lt; 0.05); c ] नियंत्रण से और एक ही पीढ़ी में कम एकाग्रता से काफी अलग (p और lt; 0.05); घ - नियंत्रण से और एक ही एकाग्रता में पहले की पीढ़ी से काफी अलग है और एक ही पीढ़ी में कम एकाग्रता (च और lt; 0.05); एक ही एकाग्रता में पहले की पीढ़ी से काफी अलग और एक ही पीढ़ी में कम एकाग्रता (च और lt; 0.05); च ] एक ही सांद्रता में पिछली पीढ़ी से काफी भिन्न (च एवं 0ण्05)। यह आंकड़ा यू एट अल14 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है.

सूत्रकृमि जैव रासायनिक और आनुवंशिक सूचकांकों पर लिन्डेन के एमजीई और एमजीआर प्रभाव

लिंडेन के एमजीई और एमजीआर प्रभाव (एक लगातार जैविक प्रदूषक [पीओपी]) लिपिड चयापचयों में प्रमुख जैव रासायनिक पर अध्ययन किया गया और संबंधित इंसुलिन जैसे मार्ग4में आनुवंशिक अभिव्यक्ति परिवर्तन . परिणामों से पता चला कि लिन्डेन ने इंसुलिन संकेत विनियमन में गड़बड़ी के साथ obesogenic प्रभाव दिखाया (चित्र 3)। इसके अलावा, एसके-1 (एफ0, एफ 3, टी 1' और टी 3) और अकट-1 (टी 1 और टी 3) के बीच हुए परिवर्तनों से संकेत मिलता है कि विभिन्न जोखिम पीढ़ियों के सूत्रकृमि ने सहिष्णुता और परिहार के लिए अलग-अलग प्रतिक्रिया रणनीतियों को दिखाया।

Figure 3
चित्र 3 : विभिन्न जोखिम अनुभवों के साथ सूत्रकृमि में इंसुलिन जैसे संकेत मार्ग में प्रमुख जीनों के अभिव्यक्ति स्तर में परिवर्तन। ]: सकारात्मक विनियमन; symbol : नकारात्मक विनियमन; ]:अभिव्यक्ति अप विनियमन; ]:अभिव्यक्ति नीचे विनियमन. यह आंकड़ा अनुमति के साथ अल4 में चेन से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक संचालित करने के लिए निम्नलिखित सुझावों पर विचार किया जाना चाहिए। एक बाँझ वातावरण में समग्र प्रयोगात्मक आपरेशन प्रदर्शन. अनुचित संचालन ई. कोलाई उपभेदों के संदूषण में परिणाम हो सकता है, उदा., कवक और कण सी elegans के सामान्य विकास में बाधा और इसलिए प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं. सी elegans की खेती का वर्णन अनुभाग में, नग्न आंखों या माइक्रोस्कोप द्वारा NGM agars पर सी elegans के विकास के पैमाने का निरीक्षण करें. जब आगर पर सी एलिगन का पैमाना क्षेत्र में 75% से अधिक हो जाता है, या संस्कृति का समय एक सप्ताह से अधिक हो जाता है, तो सी एलिगोंकी अधिक वृद्धि या जनसंख्या में गिरावट से बचने के लिए टीका का एक नया दौर करें। तुल्यकालन की प्रक्रिया से पहले, सी एलिगनके विकास का निरीक्षण करने के लिए एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें, और जब सूत्रकृमि अंडे को आगर पर व्यापक रूप से वितरित किया जाता है, तो प्रक्रिया जारी रखें। इसके अलावा, यदि सॉल्वैंट्स (जैसे, डाइमेथिल सल्फाइड [डीएमएसओ]) का उपयोग किया जाता है, तो स्टॉक समाधानों में उनकी सांद्रता 1% से कम होनी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि उनकी अंतिम सांद्रता 0.5% से अधिक नहीं है (v/v) स्वयं सॉल्वैंट्स के प्रतिकूल प्रभावों से बचने के लिए। टीजी प्रभाव अध्ययन में, 24 एच से अधिक जोखिम की अवधि यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि जोखिम समय अगली पीढ़ी के भ्रूण के गठन को कवर करता है, और अवधि बाद की पीढ़ी जुदाई की सुविधा के लिए 96 एच के भीतर होनी चाहिए। उम्र और प्रजनन को मापने के लिए सूत्रकृमि (आमतौर पर 20 के भीतर) की छोटी मात्रा का उपयोग करें। दूसरी ओर, जैव रासायनिक और आनुवंशिक विनियमन सूचकांकों को मापने के लिए बड़ी मात्रा में सूत्रकृमि (आमतौर पर 500 से अधिक) का उपयोग करें। इसलिए, नमूनों की पर्याप्त संख्या सुनिश्चित करने के लिए, मोटे तौर पर अनुमान लगाने के लिए प्रारंभिक प्रयोग करें कि परिपक्व F0 सूत्रकृमि पहले 24 एच के भीतर प्रजनन शुरू करने के बाद से कितने वंश पुन: उत्पन्न कर सकते हैं। फिर आगे बढ़ने बहु पीढ़ी के अध्ययन के लिए कम से कम 200 संतानें हैं यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक F0 सूत्रकृमि की संख्या निर्धारित करें।

सी elegansके साथ टीजी अध्ययन के पहले की रिपोर्टों के साथ तुलना में , वर्तमान प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल जीवन चरण के चुनाव के अधिक विचारशील था. सी एलिगन में, बाद में बने अंडाणुओं को उपजाऊ बनानेके लिए एल 4 अवस्था में शुक्राणुओं का निर्माण होता है . तदनुसार, शुक्राणुजनन और अंडाणुजनन अवधि को कवर जोखिम वंश पर टीजी प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक विशेष खिड़की प्रदान करेगा। उम्र-सिंक्रनाइज़्ड अंडे का उपयोग बहु-पीढ़ी के प्रभाव अध्ययनों के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है कि जोखिम प्रत्येक जीवन चक्र की शुरुआत से समग्र अवधि को कवर करता है। पहले बहु पीढ़ी के अध्ययन के साथ तुलना में, वर्तमान प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल केवल 1-2 पीढ़ियों के बजाय कई पीढ़ियों पर प्रभाव की माप की सुविधा. इसके अलावा, वर्तमान प्रोटोकॉल दोनों MGE और एमजीआर प्रभाव पर विचार किया, जो पहले के अध्ययन से अधिक व्यवस्थित है कि केवल MGE या एमजीआर प्रभाव मापा.

विशेष रूप से, वहाँ अभी भी कुछ मुद्दों पर वर्तमान प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में विचार किया जाना है. वर्तमान प्रोटोकॉल में जंगली-प्रकार के सी एलिगन का इस्तेा किया गया है, जिनकी पीढ़ी का समय लगभग 60 एच है और उम्र 20 दिन है। यह प्रयोग की समग्र अवधि काफी लंबी बनाता है (उदा., MGE प्रभाव अध्ययन उम्र पर 3 पीढ़ियों से कम से कम 30 दिनों की आवश्यकता है). समय को कम करने के लिए, शोधकर्ताओं उत्परिवर्ती सी elegans चुन सकते हैं, इस तरह के अल्पकालिक उत्परिवर्ती सूत्रकृमियों के रूप में. एक अन्य मुद्दा बैक्टीरिया पर हत्या उपचार है, जिसकी जीवित स्थिति सूत्रकृमि को स्वस्थ रखने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, यूवी हत्या की प्रक्रिया रसायनों में परिवर्तन परिचय हो सकताहै 25. इसलिए, बैक्टीरिया पर अन्य उपचार पर विचार किया जाना चाहिए, और तैयारी या जोखिम प्रक्रिया के दौरान रासायनिक परिवर्तन पर सावधान निगरानी आवश्यक हो सकती है, विशेष रूप से अस्थिर यौगिकों के लिए। एक ही समय में, विषाक्त प्रभाव में लिंग मतभेद का अध्ययन करने में सीमाएं हैं क्योंकि तथ्य यह है कि सी elegans hermaphrodite है की सबसे अधिक है. टीजी, एमजीई या एमजीआर प्रभाव में सेक्स योगदान की जांच करने के लिए आगे सुधार की आवश्यकता है। संक्षेप में, हम आशा करते हैं कि प्रस्तावित प्रोटोकॉल TG, MGE और विषाक्त पदार्थों के एमजीआर प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सी elegans का उपयोग करने के लिए बहुत महत्व होगा.

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Disclosures

लेखकों जल प्रदूषण नियंत्रण और उपचार के लिए राष्ट्रीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी प्रमुख परियोजना (2017 -X07201004), और चीन के अंतर्राष्ट्रीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी सहयोग कार्यक्रम (नहीं 2016YFE0123700) द्वारा वित्तीय समर्थन के लिए आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 agar powder OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 9002-18-0
79nnHT Fast Real-Time PCR System  Applied Biosystems 
96-well sterile microplate Costar?Corning?America
Autoclave sterilizer Tomy, Tomy Digital Biology, Japan
Biosafety cabinet LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China
calcium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10043-52-4
centrifuge  5417R Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Centrifuge tubes Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America
cholesterol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 57-88-5
Dimethyl sulfoxide VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America 67-68-5
disodium hydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7558-79-4
ethanol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 64-17-5
Filter Thermo, Thermo Fisher Scientific, America
incubator YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China
inoculating loop
K2HPO4•3H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 16788-57-1
kraft paper
Mcroplate Reader Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America
MgSO4•7H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10034-99-8
Microscopes XTL-BM-9TD BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China 
Petri dishes
Pipette Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Potassium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7447-40-7
potassium dihydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7778-77-0
Qiagen RNeasy kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States
sodium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7647-14-5
sodium hydroxide Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 1310-73-2
sodium hypochlorite solution Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China 7681-52-9
tryptone OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 73049-73-7
yeast extract OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 119-44-8

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References

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