使用卡内哈布迪炎酶研究有毒物质的跨代和多代效应

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Summary

持久性化学品的跨代和多代影响对于判断其对环境和人类健康的长期影响至关重要。我们提供了研究跨代和多代效应使用自由生活线虫卡埃诺哈布迪炎埃莱甘斯的新方法。

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Li, Z., Ai, F., Zhang, J., Yu, Z., Yin, D. Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants. J. Vis. Exp. (149), e59367, doi:10.3791/59367 (2019).

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Abstract

有关化学品毒性的信息对于化学品的应用和废物管理至关重要。对于低浓度化学品,长期影响对于判断其对环境和人类健康的影响非常重要。在展示长期影响时,化学品对几代人的影响为最近的研究提供了新的见解。在这里,我们描述了使用自由生活线虫Caenorhabdiselegans研究多代化学物质影响的协议。提出了两个方面:(1)跨代(TG)和(2)多代效应研究,后者分为多代暴露(MGR)和多代残差(MGR)效应研究。TG效应研究是强大的,其目的很简单,即与父母接触化学品是否会对后代造成任何残留后果。在测量对父母的影响后,使用次氯酸钠溶液杀死父母并保留后代,以便促进对后代的影响测量。TG效应研究用于确定当后代的父母暴露于污染物时是否受到影响。MGE 和 MGR 效应研究用于系统化,用于确定连续的代接触是否会导致后代代代适应反应。小心的拾取和转移用于区分代,以方便对每一代人进行效果测量。我们还结合协议来测量运动行为、生殖、寿命、生化和基因表达变化。还给出了一些实例实验来说明跨代和多代效应研究。

Introduction

化学品的应用和废物管理高度依赖于其在特定浓度下的影响信息。值得注意的是,时间是影响和浓度之间的另一个基本要素。也就是说,化学品,特别是那些在实际环境中浓度低的化学品,需要时间来产生可衡量的效果。因此,研究人员在动物实验中安排了不同长度的暴露时间,甚至覆盖了整个生命周期。例如,老鼠接触尼古丁30天,90天或180天,以研究其毒性影响2。 然而,这种接触持续时间仍然不足以阐明污染物(例如持久性有机污染物[持久性有机污染物])的长期影响,这些污染物在环境中可以持续几代生物。因此,对几代人影响的研究越来越受到人们的重视。

代际效应研究主要有两个方面。第一个是跨代(TG)效应研究,它可以有力地测试与父母接触的化学物质是否会对后代造成任何后果3。第二个是多代效应研究,在接触和残余效应方面考虑更系统。一方面,多代暴露(MGE)效应用于说明动物对长期具有挑战性的环境的适应性反应。另一方面,多代残留效应用于证明接触后的长期残留后果,因为母体接触伴随着胚胎接触第一个后代和胚芽系接触第二个后代后代,使第三代作为第一代完全出暴露4。

虽然哺乳动物(例如,小鼠)是毒性研究中的模范生物体,特别是与人类有关的生物体,但在研究代际影响时,它们的应用相当耗时、昂贵和伦理上涉及5。 因此,包括甲壳类达芙尼亚麦格纳6号、昆虫果蝇黑色素7和斑马鱼达尼奥雷里奥8号在内的生物提供了替代选择。然而,这些生物要么缺乏与人类的相似性,要么在研究中需要特定的设备。

Caenorhabditis elegans是一种小型自由活线虫(长约 1 毫米),生命周期短(在 20 °C 时约为 84 小时)9。这种线虫与人类有许多保守的生物途径,因此被广泛用于说明各种应力或毒物的影响。值得注意的是,99.5%的线虫是甲虫,使这种生物极适合研究代际效应,例如重金属和磺胺的TG效应3,11,金纳米粒子和重重的MGE效应金属12和温度13,MGR效应的磺胺14,以及MGE和MGR效应的伽马辐照15和林丹4。此外,在化学品(如Zearalenone)对小鼠发育和繁殖的影响和16、17的C.elegans之间发现了类似的结果,这将为推断从这个小动物到人类的影响。

TG 和 MG 效应研究既耗时,也需要仔细的设计和性能。值得注意的是,上述研究中在生命阶段选择、暴露条件和代际分离方法方面存在差异。这种差异妨碍了结果之间的直接比较,也妨碍了对结果的进一步解释。因此,必须建立统一的协议,以指导TG和MG效应研究,并提供一个更大的图景,揭示各种有毒物质或污染物在长期后果中的相似模式。现行协议的首要目标将表明在研究C.elegans的跨代和多代效应方面的明确操作过程。这些协议将有利于那些有兴趣研究有毒物质或污染物的长期影响的研究人员。

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Protocol

1. 培养大肠杆菌OP50

  1. 通过在100 mL水中溶解4克氢氧化钠溶液制备1M氢氧化钠溶液。
  2. 在1L锥形烧瓶中溶解10克试金石、5克酵母提取物和10克氯化钠,制备溶质汤(LB)培养基。使用 1 M 氢氧化钠溶液将 pH 调整到 7.0。
  3. 将 LB 液体介质从步骤1.2压成 20 锥形烧瓶(最大允许体积:100 mL),每个介质为 50 mL 介质。用牛皮纸盖住圆锥形烧瓶。
  4. 在 121°C 和 0.105 MPa 下对 LB 液体介质进行消毒 20 分钟,将 LB 介质冷却至室温。
  5. 移液器 200 μL 从细菌悬浮液(参见步骤 1.8)或使用接种回路从琼脂(步骤 2.14 中)中挑选一个小菌群,将其置于 LB 介质中。
  6. 在 37°C 下以 150 rpm 的转速孵育 LB 介质,使用 24-48 小时。LB 介质将从棕色透明液体变为浑浊的卡其色悬浮液。
  7. 使用总烧瓶80%的细菌悬浮液提供大肠杆菌OP50作为线虫食品,用于步骤2.11。
  8. 将含有细菌悬浮液的其余烧瓶储存在冰箱4°C。将LB悬浮液200μL移液到新鲜LB介质的上侧(步骤1.4),并重复步骤1.6进行后续孵育。

2.文化C.埃莱甘人

注: 文化C. elegans使用的步骤 2.1 到 2.11 基于标准方法18

  1. 在100 mL的无菌蒸馏水中溶解22.8克K2HPO 4~3H2O。
  2. 在50 mL无菌蒸馏水中溶解6.8克KH2PO4。
  3. 混合步骤 2.1 和 2.2 中的解决方案,准备 1 M K2HPO4-KH2PO4缓冲器(pH 6.0,总计 150 mL)。
  4. 在 5 mL 无菌蒸馏水中溶解 1.232 g MgSO4,通过 0.22 μm 无菌一次性膜过滤器将溶液过滤到无菌容器中,制备 1.0 M MgSO4。
  5. 在 5 mL 无菌蒸馏水中溶解 0.554 g 的 CaCl 2,并通过 0.22 μm 无菌一次性膜过滤器将溶液过滤到无菌容器中,制备 1 M CaCl2。
  6. 在5 mL的绝对乙醇中溶解0.025克胆固醇,通过0.22μm无菌一次性膜过滤器过滤溶液将其消毒,制备1M胆固醇溶液。
  7. 在含有1L超纯水的1L锥形烧瓶中加入17克琼脂粉、2.5克肽和3克氯化钠,制备线虫生长培养基(NGM)琼脂。从步骤 2.3 添加 25 mL 的 K2HPO4-KH2PO4解决方案。
  8. 在 121°C 下用 0.105 MPa 对步骤 2.7 处的 NGM 琼脂进行 20 分钟的灭菌。
  9. 将 NGM 琼脂冷却至约 50°C,将 1 mL的 1 M MgSO 4、1 M CaCl2和 5 mg/mL 胆固醇-乙醇溶液从步骤 2.4 到 2.6 添加到介质中,并彻底混合。
  10. 将每道菜的 ±10 mL NGM 琼脂培养基倒入 100 个无菌培养皿(直径 6.0 厘米)。将培养皿中的介质冷却至室温,形成固体琼脂。
  11. 移液器 170 μL 的细菌悬浮液从步骤 1.7 到上述 NGM 琼脂使用无菌尖端。稍微摇动 NGM 琼脂,将 LB 介质均匀地分布在 NGM 琼脂表面上。
  12. 在 37°C 的顶面上加接种 NGM 琼脂,8-12 小时形成细菌草坪。
  13. 在步骤 2.15 或 2.19 中,将大部分琼脂与细菌草坪一起用于培养线虫。
  14. 将 1 或 2 个琼边向下存放,以避免水蒸发和 4°C 冰箱中的污染,从而维持细菌的污染。
  15. 当库存的 NGM 琼脂体上线虫少于 2,000 个(来自早期实验或从其他实验室赠送)时,切割六分之一的 NGM 琼脂酮,其中含有无菌尖端的C. elegan,并将其转移到具有细菌的新制备的 NGM 琼脂草坪(从步骤 2.13 起)。将 NGM 琼脂保持在 22°C 培养箱中,用于后续培养。
  16. 当库存的 NGM 琼脂上有超过 2,000 个线虫时,用 2 mL 的无菌水将 NGM 琼脂的线虫冲洗到离心管中。输入 2 mL 的水将导致约 1.5 mL 输出。
  17. 让线虫在离心管中沉淀30分钟,通过移液丢弃1mL的上生子,并在每根管中加入1mL的无菌水,以洗净粒(即线虫)。
  18. 在离心管中稳定线虫30分钟,通过移液丢弃1mL的上生子。将1 mL的无菌水加入每个管中,以重新悬浮线虫。
  19. 通过用细菌草坪(从步骤 2.13)将 150 μL 移液到每个新的 NGM 琼脂上(从步骤 2.13 开始),将线虫悬浮液(总计约 1.5 mL)分配,使总共 8-10 个新的 NGM 琼脂。
  20. 将 NGM 琼脂从步骤 2.19 向上向上放在 20°C 培养箱中过夜,然后向上向下,以进行后续培养。
  21. 每三天重复步骤 2.15 或步骤 2.16-2.20。

3. 制备同步卵子和L3幼虫

  1. 将 NGM 琼脂的肉汁线虫和新生产的鸡蛋冲洗到无菌离心管中,每个 NGM 琼脂酮上含有 2 mL 的无菌水,输出量约为 1.5 mL。
  2. 将离心管中的线虫沉淀30分钟,然后通过移液丢弃85%的上生子。
  3. 用25 mL的水溶解0.6克NaOH和5 mL的NaOCl(4-6%活性梯度,详情见材料表),使NaOH达到0.5M,NaOCl达到1%。
  4. 将步骤 3.2 中的颗粒(将体积标记为 V0)与来自(步骤 3.3,即体积比 1:7)7 倍 V0次氯酸钠溶液混合。
  5. 每2分钟摇动离心管10-15分钟,使幼虫和成年线虫变白;线虫悬浮液的颜色将从浑浊变为清晰。
  6. 在 700 x g下在 20°C 下将管子离心 3 分钟,然后通过移液丢弃上生子。
  7. 将颗粒重新悬浮在5倍V0无菌水中,以洗涤年龄同步的卵子。在700 x g下在20°C下离心3分钟,然后丢弃上生子。
  8. 重复步骤 3.7 两次。
  9. 将1折V0的无菌水加入管中,以重新悬浮年龄同步的卵子。
  10. 从步骤2.13开始,通过移液50μL将50μL移至每个新的NGM琼脂,用细菌草坪将卵子悬浮液分发。将 NGM 琼脂体顶在 20°C 培养箱中 30 分钟,让水蒸发或被细菌草坪吸附。然后,使 NGM 琼脂为后续文化。将时间标记为鸡蛋时间 (T鸡蛋)。
  11. 在 1 L 水中溶解 3 克 NaCl 和 2.36 g KCl,制备 K-培养基。在121°C和0.105 MPa下对介质进行消毒20分钟,将其冷却至室温。
  12. 当T后时间达到36小时时,线虫将到达L3幼虫阶段(L3线虫)20。将线虫从NGM琼脂液冲洗到离心管中,每个NGM琼脂上用2 mL的无菌水,产生约1.5 mL的输出。
  13. 在沉淀30分钟后,用K-培养基从2小时起用85%的上生子(通过移液)来消化肠道中的食物3。
  14. 丢弃上生物。使用 K-media(从步骤 3.11 开始)将线虫悬浮液调整到每 100 μL 约 200 个线虫,以便进行后续实验。

4.使用C.elegans进行跨代效应研究

  1. 制备5浓度水平和1种溶剂或绝对控制的化学溶液,即共6组。
  2. 将100 μL的控制或化学溶液与10口孔一起复制,每组(即共60口孔)加入96孔无菌微孔板的中间区域,以避免边缘效应。
  3. 将步骤 3.14 中的线虫悬浮液从步骤 3.14 中稀释 10 倍。从步骤 4.2 到 60 口井中,每口加 100 μL 线虫悬浮液。将时间标记为 t0
  4. 当时间在t0后达到24小时时,计算井中活线虫和死线虫。计算中位致命浓度 (LC50)。
  5. 准备一系列 5 浓度低于 LC50值的 10%。
  6. 将100 μL的控制或化学溶液(从步骤4.5开始)与每组10口井(即共60口孔)复制到96孔无菌微孔板的中间区域,以避免边缘效应。
  7. 在步骤 4.6 的 60 口井中,每口含有约 200 L3 线虫(从步骤 3.14 开始),添加 100 μL 的 K 培养基。将时间标记为 T0
  8. 自 T0起,执行 24 至 96 小时的曝光。
  9. 接触后,通过移液(即共6管)从每组5口井中收集线虫,放入1.5 mL离心管中。
  10. 将线虫沉降30分钟,通过移液丢弃上生子,用1mL的灭菌水在底部重新悬浮和清洗线虫。
  11. 将线虫沉降 30 分钟,通过移液丢弃上生,并使用底部的线虫进行标记为 F0 的暴露父代指标测量值(参见第 7 节)。
  12. 根据步骤 4.10,在步骤 4.9 中,从每组剩余的五口井中收集、定居和洗涤(通过重新悬浮)线虫。
  13. 从步骤4.12中稳定线虫30分钟,通过移液丢弃上生子,加入100μL无菌水,重新悬浮线虫。从步骤2.13将线虫悬浮液均匀转移到三个新制备的NGM琼脂上,并带有细菌草坪。
  14. 孵育线虫36小时,成为肉体,并按照步骤3.1-3.9执行年龄同步。从步骤2.13开始,用细菌草坪在各自的NGM琼脂上孵育同步卵子36小时。
  15. 将 NGM 琼脂上的线虫从步骤 4.14 冲洗到六个离心管中。
  16. 将线虫沉降30分钟,然后通过移液丢弃上生子。用1 mL的消毒水重新悬浮和清洗颗粒。
  17. 将线虫沉降30分钟,然后通过移液丢弃上生子。使用底部的线虫测量标记为 T1 的后代的指标测量值(见第 7 节)。

5. 使用C. elegan进行多代接触 (MGE) 效应研究

  1. 将 99.0 mL NGM 琼脂(从步骤 2.9 起)与 1 mL 的控制或化学溶液混合(本协议中的低浓度和高浓度为例,即共三组)。
  2. 将每道菜约 10 mL 的 NGM 琼脂培养基从步骤 5.1 倒入 100 个无菌培养皿(直径 6.0 厘米)。将培养皿中的介质冷却至室温,形成固体琼脂。
  3. 根据步骤 2.11 将移液器细菌悬浮液悬浮在琼脂上。
  4. 将培养皿的上盖放在一边,将细菌草坪暴露在生物安全柜中的紫外线(145 μW/cm2)下 15 分钟。
  5. 使用接种回路选择一个小菌群,在步骤 1.4 中将其置于 LB 介质中。在 37°C 下以 150 rpm 的速度孵育 LB 介质,持续 24 小时,以确认内落细菌生长,验证杀伤步骤 5.4。
  6. 将年龄同步的鸡蛋从步骤 3.9 移至琼脂上(从步骤 5.4 开始)。标记与父代 F0 接触的开始,并将标记为第 0 天 (D0)。
  7. 在20°C下孵育3d的琼脂。然后(即 D3 上),使用成熟的线虫测量 F0 中的效果(参见第 7 节)。
  8. 此外,在 D3 上,使用玻璃棒将 F0 成熟线虫挑到新的 NGM 琼脂(从步骤 5.4 开始),其末端装有弯曲成环的人造纤维线。
  9. 在 D4 上,从 NGM 琼脂获得并丢弃成熟的 F0 线虫。将在这 24 小时(从 D3 到 D4)内新孵化的后代线虫标记为 F1,以体验第二代暴露。
  10. 在 D6 上,测量 F1 成熟线虫的测量指数(见第 7 节),这些线虫经历了 3 天的暴露。
  11. 在 D9 上,重复步骤 5.8-5.10,使用 F1 线虫重现 F2 蠕虫并测量对 F2 线虫的影响。
  12. 在 D12 上,重复步骤 5.11,使用 F2 线虫重现 F3 蠕虫并测量对 F3 线虫的影响。通过同样的方式,繁殖后代并测量MGE对第1代后代(Fn)的影响。

6. 使用C. elegan进行多代残差 (MGR) 效应研究

  1. 重复步骤 5.1-5.7。在 D3 上,在不添加化学物质的情况下(从步骤 2.13)中将 F0 成熟线虫挑到新的 NGM 琼脂上。
  2. 在 D4 上,挑出并丢弃成熟的 F0 线虫。将在这24小时内新孵化的后代线虫标记为T1线虫。
  3. 在 D6 上,测量 T1 成熟线虫的测量指数(见第 7 节),这些线虫已经生长了 3 天。
  4. 在 D9 上,重复步骤 6.2-6.3,使用 T1 线虫重现 T2 线虫,并在 T1 线虫中测量效果。
  5. 在 D12 上,重复步骤 6.4,使用 T2 线虫重现 T3 线虫,并在 T2 线虫中测量效果。通过同样的方式,从步骤5.12中繁殖后代并测量MGR对F0的第n代(Tn)线虫或Fn的第n后代(Tn')线虫的影响。

7. 测量指标

  1. 测量运动行为。
    1. 使用无菌水冲洗 NGM 琼脂,并将其收集到离心管中。将线虫沉降30分钟,丢弃上生子,并使用颗粒中的线虫进行效果测量。
    2. 从步骤2.10开始,用1mL的无菌水将线虫悬浮在颗粒中,并移液将其移至NGM琼脂上,无需使用细菌草坪。
    3. 使用解剖显微镜对(数量)体弯曲频率 (BBF) 的线虫进行评分,该频率是指咽后灯泡在 60 秒间隔内沿行驶路径的垂直方向改变方向的时间。
    4. 使用解剖显微镜对反转运动 (RM) 进行评分,该反转运动 (RM) 是指行驶方向变化超过 90° 的时间,包括向后转弯和欧米茄转弯 (OT),间隔为 60 秒。OT 是指当线虫的头部接触或几乎触摸其尾巴,使线虫形状像希腊字母欧米茄 (+) 的运动。
      注:每次实验复制中,至少对6个线虫进行了检查。
MGE(F0 至 F3)对3组(一组对照和两次暴露处理)对生殖和寿命的影响示例。
一天 用于 MGE 研究的 NGM 琼脂号 解释
寿命 繁殖
0 30 (F0 曝光) 每组 10 个复制,标记为 F0-1-1-0 到 F0-3-10-0,最后一个数字显示生存天数。
1 30 (F0 幸存 1 d) F0-1-1-0 到 F0-3-10-0 应更改为 F0-1-1-1-1 到 F0-3-10-1。
2 30 (F0 幸存 2 d) F0-1-1-1-1 到 F0-3-10-1 应更改为 F0-1-1-2 到 F0-3-10-2。
无需在 3 d 之前转移 F0 线虫。
3 30 (F0 生存 3 d,线虫转移和收集后清除) 3 d 后,F0 线虫成熟,36 个新的 NGM 琼脂(每个琼脂上有 2 个线虫)用于观察其生存和繁殖。
36 (F0-1-1-3 到 F0-3-12-3) 应进行初步实验,以安排F0线虫的数量,确保至少200个后代用于后续多代手术。
值得注意的是,如果研究MGR效应,F0线虫应转移到没有化学暴露的透明NGM琼脂,并应注意为T1开始。
大多数F0线虫被收集来测量化学和遗传指数,F0中的30个琼脂被清除。
4 36 (F0-1-1-4 到 F0-3-12-4) 36 (F1-1-1-1 到 F1-3-12-1) 测量寿命和生殖需要每天转移。
F0-1-1-3 到 F0-3-12-3 的父线虫被选取到标记为 F0-1-1-1-4 到 F0-3-12-4 的新 NGM 琼脂。
F0-1-1-3 到 F0-3-12-3 琼脂中的剩余后代线虫(即 MGE 中的 F1 或 MGR 中的 T1)已长为 1 d,标记更改为 F1-1-1-1-1 到 F1-3-12-1。这些琼脂也用于监测F1的寿命与每日转移。
5 36 (F0-1-1-5 到 F0-3-12-5) 36 (F1-1-1-2 到 F1-3-12-2) F1-1-1-1-1 到 F1-3-12-1 琼脂上的线虫已长 2 d,易于观察,线虫被计算在内,标记更改为 F1-1-1-2 到 F1-3-12-2。
36 (F0-1-1-4 到 F0-3-12-4) F0-1-1-4 到 F0-3-12-4 琼脂的后代线虫已经长了 1 d。
6 36 (F0-1-1-6 到 F0-3-12-6) 36 (F0-1-1-4 到 F0-3-12-4,计数后清除) F1-1-1-2 到 F1-3-12-2 琼脂上的线虫已长 3 d,标记更改为 F1-1-1-1-3 到 F1-3-12-3。值得注意的是,F1线虫在这一天开始复制F2,F1线虫应该转移到新的NGM琼脂,使F2-1-1-0到F1-3-12-0。对于 MGR 研究,T2 从今天开始。
36 (F1-1-1-3 到 F1-3-12-3) 36 (F0-1-1-5 到 F0-3-12-5) 这可以通过化学暴露来延迟,因此,在每个实验中应进行灵活的改变,以确保为后代提供足够的线虫。
36 (F2-1-1-0 到 F1-3-12-0) F0-1-1-4 到 F0-3-12-4 琼脂上的后代线虫已长出 2 d,线虫计数后,琼脂被清除。
F0-1-1-5 到 F0-3-12-5 琼脂的后代线虫已经长了 1 d。
7 36 (F0-1-1-7 到 F0-3-12-7) 36 (F0-1-1-5 到 F0-3-12-5,计数后清除) F0-1-1-5 到 F0-3-12-5 琼脂上的后代线虫已长出 2 d,线虫计数后,琼脂被清除。
36 (F1-1-1-4 到 F1-3-12-4) 36 (F0-1-1-6 到 F0-3-12-6) F1-1-1-1-1 到 F1-3-12-1 琼脂、F0-1-1-4 到 F0-3-12-4 琼脂和 F0-1-1-5 到 F0-3-12-5 中的总线虫编号用于计算 F0 的初始复制。
36 (F2-1-1-1 到 F2-3-12-1) F0-1-1-6 到 F0-3-12-6 琼脂的后代线虫已经长了 1 d。
F2-1-1-0 至 F1-3-12-0 的 F2 线虫已增长 1 d,其标记更改为 F2-1-1-1-1 到 F2-3-12-1。
8 36 (F0-1-1-8 到 F0-3-12-8) 36 (F0-1-1-6 到 F0-3-12-6,计数后清除) F0-1-1-6 到 F0-3-12-6 琼脂的后代线虫已长出 2 d,线虫计数后,琼脂被清除。
36 (F1-1-1-5 到 F1-3-12-5) 36 (F0-1-1-7 到 F0-3-12-7) F0-1-1-7 到 F0-3-12-7 琼脂的 F0 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F2-1-1-2 到 F2-3-12-2) 36 (F1-1-1-4 到 F1-3-12-4) F1-1-1-4 至 F1-3-12-4 琼脂的 F1 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F2-1-1-1 到 F2-3-12-1,计数后更改为 F2-1-1-2 到 F2-3-12-2) F2-1-1-1 至 F2-3-12-1 的 F2 线虫已增长 2 d,线虫计数,其标记更改为 F2-1-1-2 到 F2-3-12-2。
9 36 (F0-1-1-9 到 F0-3-12-9) 36 (F0-1-1-7 到 F0-3-12-7,计数后清除) F0-1-1-7 至 F0-3-12-7 琼脂上的 F0 后代线虫已长出 2 d,并且线虫计数后清除琼脂。
36 (F1-1-1-6 到 F1-3-12-6) 36 (F1-1-1-4 到 F1-3-12-4,计数后清除) F1-1-1-4 至 F1-3-12-4 琼脂的 F1 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后,琼脂被清除。
36 (F2-1-1-3 到 F2-3-12-3) 36 (F0-1-1-8 到 F0-3-12-8) F0-1-1-8 到 F0-3-12-8 琼脂的 F0 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F3-1-1-0 到 F3-3-12-0) 36 (F1-1-1-5 到 F1-3-12-5) F1-1-1-5 至 F1-3-12-5 琼脂的 F1 后代线虫已经长了 1 d。
F2-1-1-2 到 F2-3-12-2 的 F2 线虫已增长 3 天,其标记更改为 F2-1-1-3 到 F2-3-12-3。F2 线虫今天开始繁殖,它们被转移到 36 个新的 NGM 琼脂,并标记为 F3-1-1-0 到 F3-3-12-0。对于 MGR 研究,T3 从今天开始。
10 36 (F0-1-1-10 到 F0-3-12-10) 36 (F0-1-1-8 到 F0-3-12-8,计数后清除) F0-1-1-8 至 F0-3-12-8 琼脂上的 F0 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F1-1-1-7 到 F1-3-12-7) 36 (F1-1-1-5 到 F1-3-12-5,计数后清除) F1-1-1-5 至 F1-3-12-5 琼脂的 F1 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F2-1-1-4 到 F2-3-12-4) 36 (F0-1-1-9 到 F0-3-12-9) F2-1-1-1-1 到 F2-3-12-1、F1-1-1-4 到 F1-3-12-4 琼脂和 F1-1-1-1-5 到 F1-3-12-5 的总线虫编号用于计算 F1 的初始复制。
36 (F3-1-1-1 到 F3-3-12-1) 36 (F1-1-1-6 到 F1-3-12-6) F0-1-1-9 到 F0-3-12-9 琼脂的 F0 后代线虫已经长了 1 d。
F1-1-1-6 至 F1-3-12-6 琼脂的 F1 后代线虫已经长了 1 d。
F3-1-1-0 到 F3-3-12-0 琼脂上的后代线虫已长 1 d,标记更改为 F3-1-1-1-1 到 F3-3-12-1。
值得注意的是,F0线虫的繁殖将在头几天后显著减少。因此,线虫转移并非严格要求每天在D10之后进行,并且每2天进行一次。然而,生存仍然需要每天观察。
同样的规则也适用于 F1(T1、T1')、F2(T2、T2')和 F3(T3、T3')。
11 36 (F0-1-1-11 到 F0-3-12-11) 36 (F0-1-1-9 到 F0-3-12-9,计数后清除) F0-1-1-9 至 F0-3-12-9 琼脂上的 F0 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F1-1-1-8 到 F1-3-12-8) 36 (F1-1-1-6 到 F1-3-12-6,计数后清除) F1-1-1-6 至 F1-3-12-6 琼脂的 F1 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F2-1-1-5 到 F2-3-12-5) 36 (F0-1-1-10 到 F0-3-12-10) F0-1-1-10 到 F0-3-12-10 琼脂的 F0 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F3-1-1-2 到 F3-3-12-2) 36 (F1-1-1-7 到 F1-3-12-7) F1-1-1-7 至 F1-3-12-7 琼脂的 F1 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F2-1-1-4 到 F2-3-12-4) F2-1-1-4 到 F2-3-12-4 琼脂的 F2 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F3-1-1-1 到 F3-3-12-1,计数后更改为 F3-1-1-2 到 F3-3-12-2) F3-1-1-1-1 到 F3-3-12-1 琼脂上的线虫已长 2 d,线虫被计数,标记更改为 F3-1-1-2 到 F3-3-12-2。
12 36 (F0-1-1-12 到 F0-3-12-12) 36 (F0-1-1-10 到 F0-3-12-10,计数后清除) F0-1-1-10 至 F0-3-12-10 琼脂上的 F0 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F1-1-1-9 到 F1-3-12-9) 36 (F1-1-1-7 到 F1-3-12-7,计数后清除) F1-1-1-7 至 F1-3-12-7 琼脂的 F1 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F2-1-1-6 到 F2-3-12-6) 36 (F2-1-1-4 到 F2-3-12-4,计数后清除) F2-1-1-4 到 F2-3-12-4 琼脂上的 F2 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F3-1-1-3 到 F3-3-12-3) 36 (F0-1-1-11 到 F0-3-12-11) F0-1-1-11 到 F0-3-12-11 琼脂的 F0 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F4-1-1-0 到 F4-3-12-0) 36 (F1-1-1-8 到 F1-3-12-8) F1-1-1-8 至 F1-3-12-8 琼脂的 F1 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F2-1-1-5 到 F2-3-12-5) F2-1-1-5 到 F2-3-12-5 琼脂的 F2 后代线虫已经长了 1 d。
F3-1-1-2 到 F3-3-12-2 琼脂上的线虫已长 3 d,标记更改为 F3-1-1-3-3 到 F3-3-12-3。F3 线虫今天开始繁殖,它们被转移到 36 个新的 NGM 琼脂,并标记为 F4-1-1-0 到 F4-3-12-0。对于 MGR 研究,F3 的后代(即 T1')从今天开始。
13 36 (F0-1-1-13 到 F0-3-12-13) 36 (F0-1-1-11 到 F0-3-12-11,计数后清除) F0-1-1-11 到 F0-3-12-11 琼脂的 F0 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F1-1-1-10 到 F1-3-12-10) 36 (F1-1-1-8 到 F1-3-12-8,计数后清除) F1-1-1-8 至 F1-3-12-8 琼脂的 F1 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F2-1-1-7 到 F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-5 到 F2-3-12-5,计数后清除) F2-1-1-5 至 F2-3-12-5 琼脂上的 F2 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F3-1-1-4 到 F3-3-12-4) 36 (F0-1-1-12 到 F0-3-12-12) F3-1-1-1-1 到 F3-3-12-1、F2-1-1-4 到 F2-3-12-4 琼脂和 F2-1-1-1-5 到 F2-3-12-5 中的总线虫编号用于计算 F2 的初始复制。
36 (F4-1-1-1 到 F4-3-12-1) 36 (F1-1-1-9 到 F1-3-12-9) F0-1-1-12 到 F0-3-12-12 琼脂的 F0 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F2-1-1-6 到 F2-3-12-6) F1-1-1-9 到 F1-3-12-9 琼脂的 F1 后代线虫已经长了 1 d。
F2-1-1-6 到 F2-3-12-6 琼脂的 F2 后代线虫已经长了 1 d。
F4-1-1-0 至 F4-3-12-0 的 F3 后代线虫已增长 1 d,标记更改为 F4-1-1-1-1 到 F4-3-12-1。
14 36 (F0-1-1-14 到 F0-3-12-14) 36 (F0-1-1-12 到 F0-3-12-12-12,计数后清除) F0-1-1-12 到 F0-3-12-12 琼脂的 F0 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F1-1-1-11 到 F1-3-12-11) 36 (F1-1-1-9 到 F1-3-12-9,计数后清除) F1-1-1-9 至 F1-3-12-9 琼脂的 F1 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F2-1-1-8 到 F2-3-12-8) 36 (F2-1-1-6 到 F2-3-12-6,计数后清除) F2-1-1-6 到 F2-3-12-6 琼脂上的 F2 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F3-1-1-5 到 F3-3-12-5) 36 (F4-1-1-1 到 F4-3-12-1,计数后清除) F4-1-1-1-1 至 F4-3-12-1 的 F3 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。对于 MGR 研究,T1' 线虫已长 2 d,第二天(D15) 将开始复制 T2',T2' 将在 D18 上开始复制 T3' 。野生类的E.elegans的寿命被举为15天。然后,T3 的寿命将在 D33 上结束。
36 (F0-1-1-13 到 F0-3-12-13) F0-1-1-13 到 F0-3-12-13 琼脂的 F0 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F1-1-1-10 到 F1-3-12-10) F1-1-1-10 至 F1-3-12-10 琼脂的 F1 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F2-1-1-7 到 F2-3-12-7) F2-1-1-7 到 F2-3-12-7 琼脂的 F2 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F3-1-1-4 到 F3-3-12-4) F3-1-1-4 到 F2-3-12-4 琼脂的 F3 后代线虫已经长了 1 d。
15 36 (F0-1-1-15 到 F0-3-12-15) 36 (F0-1-1-13 到 F0-3-12-13,计数后清除) F0-1-1-13 到 F0-3-12-13 琼脂的 F0 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F1-1-1-12 到 F1-3-12-12) 36 (F1-1-1-10 到 F1-3-12-10,计数后清除) F1-1-1-10 至 F1-3-12-10 琼脂的 F1 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F2-1-1-9 到 F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-7 到 F2-3-12-7,计数后清除) F2-1-1-7 到 F2-3-12-7 琼脂上的 F2 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F3-1-1-6 到 F3-3-12-6) 36 (F3-1-1-4 到 F3-3-12-4,计数后清除) F3-1-1-4 到 F3-3-12-4 琼脂上的 F3 后代线虫已长出 2d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F0-1-1-14 到 F0-3-12-14) F0-1-1-14 到 F0-3-12-14 琼脂的 F0 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F1-1-1-11 到 F1-3-12-11) F1-1-1-11 至 F1-3-12-11 琼脂的 F1 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F2-1-1-8 到 F2-3-12-8) F2-1-1-8 到 F2-3-12-8 琼脂的 F2 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F3-1-1-5 到 F3-3-12-5) F3-1-1-5 到 F2-3-12-5 琼脂的 F3 后代线虫已经长了 1 d。
16 36 (F0-1-1-15 到 F0-3-12-15,超过) 36 (F0-1-1-14 到 F0-3-12-14,计数后清除) 野生类的E.elegans的寿命被举为15天。因此,F0应该在第16天之前全部死亡,因为暴露。
36 (F1-1-1-13 到 F1-3-12-13) 36 (F1-1-1-11 到 F1-3-12-11,计数后清除) F0-1-1-14 到 F0-3-12-14 琼脂的 F0 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F2-1-1-10 到 F2-3-12-10) 36 (F2-1-1-8 到 F2-3-12-8,计数后清除) F1-1-1-11 至 F1-3-12-11 琼脂的 F1 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F3-1-1-7 到 F3-3-12-7) 36 (F3-1-1-5 到 F3-3-12-5,计数后清除) F2-1-1-8 至 F2-3-12-8 琼脂上的 F2 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F0-1-1-15 到 F0-3-12-15) F3-1-1-5 至 F3-3-12-5 琼脂上的 F3 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F1-1-1-12 到 F1-3-12-12) F4-1-1-1-1 到 F4-3-12-1、F3-1-1-4 到 F3-3-12-4 琼脂和 F3-1-1-1-5 到 F3-3-12-5 中的总线虫编号用于计算 F3 的初始复制。
36 (F2-1-1-9 到 F2-3-12-9) F0-1-1-15 到 F0-3-12-15 琼脂的 F0 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F3-1-1-6 到 F3-3-12-6) F1-1-1-12 至 F1-3-12-12 琼脂的 F1 后代线虫已经长了 1 d。
F2-1-1-9 到 F2-3-12-9 琼脂的 F2 后代线虫已经长了 1 d。
F3-1-1-6 到 F2-3-12-6 琼脂的 F3 后代线虫已经长了 1 d。
17 36 (F1-1-1-14 到 F1-3-12-14) 36 (F0-1-1-15 到 F0-3-12-15,计数后清除,结束) F0-1-1-15 到 F0-3-12-15 琼脂的 F0 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。将不再有F0后代。
36 (F2-1-1-11 到 F2-3-12-11) 36 (F1-1-1-12 到 F1-3-12-12,计数后清除) F1-1-1-12 至 F1-3-12-12 琼脂的 F1 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F3-1-1-8 到 F3-3-12-8) 36 (F2-1-1-9 到 F2-3-12-9,计数后清除) F2-1-1-9 到 F2-3-12-9 琼脂上的 F2 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F3-1-1-6 到 F3-3-12-6,计数后清除) F3-1-1-6 到 F3-3-12-6 琼脂上的 F3 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F1-1-1-13 到 F1-3-12-13) F1-1-1-13 至 F1-3-12-13 琼脂的 F1 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F2-1-1-10 到 F2-3-12-10) F2-1-1-10 到 F2-3-12-10 琼脂的 F2 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F3-1-1-7 到 F3-3-12-7) F3-1-1-7 到 F2-3-12-7 琼脂的 F3 后代线虫已经长了 1 d。
18 36 (F1-1-1-15 到 F1-3-12-15) 36 (F1-1-1-13 到 F1-3-12-13,计数后清除) F1-1-1-13 至 F1-3-12-13 琼脂的 F1 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F2-1-1-12 到 F2-3-12-12) 36 (F2-1-1-10 到 F2-3-12-10,计数后清除) F2-1-1-10 至 F2-3-12-10 琼脂上的 F2 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F3-1-1-9 到 F3-3-12-9) 36 (F3-1-1-7 到 F3-3-12-7,计数后清除) F3-1-1-7 到 F3-3-12-7 琼脂上的 F3 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F1-1-1-14 到 F1-3-12-14) F1-1-1-14 至 F1-3-12-14 琼脂的 F1 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F2-1-1-11 到 F2-3-12-11) F2-1-1-11 到 F2-3-12-11 琼脂的 F2 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F3-1-1-8 到 F3-3-12-8) F3-1-1-8 到 F2-3-12-8 琼脂的 F3 后代线虫已经长了 1 d。
在MGR研究中,T2'今天将开始复制T3'。野生类的E.elegans的寿命被举为15天。然后,T3 的寿命将在 D33 上结束。
19 36 (F1-1-1-15 到 F1-3-12-15,超过) 36 (F1-1-1-14 到 F1-3-12-14,计数后清除) F1-1-1-14 至 F1-3-12-14 琼脂的 F1 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F2-1-1-13 到 F2-3-12-13) 36 (F2-1-1-11 到 F2-3-12-11,计数后清除) F2-1-1-11 到 F2-3-12-11 琼脂的 F2 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F3-1-1-10 到 F3-3-12-10) 36 (F3-1-1-8 到 F3-3-12-8,计数后清除) F3-1-1-8 至 F3-3-12-8 琼脂上的 F3 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F1-1-1-15 到 F1-3-12-15) F1-1-1-15 至 F1-3-12-15 琼脂的 F1 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F2-1-1-12 到 F2-3-12-12) F2-1-1-12 到 F2-3-12-12 琼脂的 F2 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F3-1-1-9 到 F3-3-12-9) F3-1-1-9 到 F2-3-12-9 琼脂的 F3 后代线虫已经长了 1 d。
20 36 (F2-1-1-14 到 F2-3-12-14) 36 (F1-1-1-15 到 F1-3-12-15,计数后清除) F1-1-1-14 至 F1-3-12-14 琼脂的 F1 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。将不再有F1的后代。
36 (F3-1-1-11 到 F3-3-12-11) 36 (F2-1-1-12 到 F2-3-12-12-12,计数后清除) F2-1-1-12 至 F2-3-12-12 琼脂的 F2 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F3-1-1-9 到 F3-3-12-9,计数后清除) F3-1-1-9 到 F3-3-12-9 琼脂上的 F3 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F2-1-1-13 到 F2-3-12-13) F2-1-1-13 到 F2-3-12-13 琼脂的 F2 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F3-1-1-10 到 F3-3-12-10) F3-1-1-10 到 F2-3-12-10 琼脂的 F3 后代线虫已经长了 1 d。
21 36 (F2-1-1-15 到 F2-3-12-15) 36 (F2-1-1-13 到 F2-3-12-13,计数后清除) F2-1-1-13 到 F2-3-12-13 琼脂的 F2 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后,琼脂被清除。
36 (F3-1-1-12 到 F3-3-12-12) 36 (F3-1-1-10 到 F3-3-12-10,计数后清除) F3-1-1-10 至 F3-3-12-10 琼脂的 F3 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F2-1-1-14 到 F2-3-12-14) F2-1-1-14 到 F2-3-12-14 琼脂的 F2 后代线虫已经长了 1 d。
36 (F3-1-1-11 到 F3-3-12-11) F3-1-1-11 到 F2-3-12-11 琼脂的 F3 后代线虫已经长了 1 d。
22 36 (F2-1-1-15 到 F2-3-12-15,超过) 36 (F2-1-1-14 到 F2-3-12-14,计数后清除) F2-1-1-14 至 F2-3-12-14 琼脂的 F2 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后,琼脂被清除。
36 (F3-1-1-13 到 F3-3-12-13) 36 (F3-1-1-11 到 F3-3-12-11,计数后清除) F3-1-1-11 到 F3-3-12-11 琼脂的 F3 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F3-1-1-12 到 F3-3-12-12) F3-1-1-12 到 F2-3-12-12 琼脂的 F3 后代线虫已经长了 1 d。
23 36 (F3-1-1-14 到 F3-3-12-14) 36 (F2-1-1-15 到 F2-3-12-15,计数后清除) F2-1-1-15 至 F2-3-12-15 琼脂的 F2 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。将不再有F2后代。
36 (F3-1-1-12 到 F3-3-12-12-12,计数后清除) F3-1-1-12 至 F3-3-12-12 琼脂的 F3 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后将清除琼脂。
36 (F3-1-1-13 到 F3-3-12-13) F3-1-1-13 到 F2-3-12-13 琼脂的 F3 后代线虫已经长了 1 d。
24 36 (F3-1-1-15 到 F3-3-12-15) 36 (F3-1-1-13 到 F3-3-12-13,计数后清除) F3-1-1-13 到 F3-3-12-13 琼脂的 F3 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后,琼脂被清除。
36 (F3-1-1-14 到 F3-3-12-14) F3-1-1-14 到 F2-3-12-14 琼脂的 F3 后代线虫已经长了 1 d。
25 36 (F3-1-1-15 到 F3-3-12-15,超过) 36 (F3-1-1-14 到 F3-3-12-14,计数后清除) F3-1-1-14 至 F3-3-12-14 琼脂的 F3 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后,琼脂被清除。
36 (F3-1-1-15 到 F3-3-12-15) F3-1-1-15 到 F2-3-12-15 琼脂的 F3 后代线虫已经长了 1 d。
26 36 (F3-1-1-15 到 F3-3-12-15,计数后清除) F3-1-1-15 至 F3-3-12-15 琼脂的 F3 后代线虫已长出 2 d,线虫计数后,琼脂被清除。
值得注意的是,在MGR研究中,F3(即T3')的第一批未暴露后代将在D18上出生。野生类的E.elegans的寿命被举为15天。然后,T3 的寿命将在 D33 上结束。
当线虫寿命更长时,MGE 和 MGR 研究都将涵盖更多天。

表1:标记列表及其定义。

  1. 在MGE效应研究中测量生殖和寿命。
    1. 在 D0 上,重复步骤 5.6。将琼脂(3组,每个10个复制)标记为Fx-a- b- c,其中x指代数,个指组数(1个用于控制,2个用于低浓度,3个用于高浓度);b指从1到10的复制;和c指曝光持续时间(0 表示开始)。对于 D0,将琼脂标记为 F0-1-1-0 到 F0-3-10-0。读者可参阅表 1了解详细信息。
    2. 在 D1 上,检查琼脂上的线虫生长,并将标记从 F0-1-1-0 更改为 F0-3-10-0 到 F0-1-1-1-1 到 F0-3-10-1。
    3. 在 D2 上,检查琼脂上的线虫生长,并将标记 F0-1-1-2 更改为 F0-3-10-2。
    4. 在 D3 上,从每组中挑选 24 个 F0 线虫到 12 个新的 NGM 琼脂,步骤 5.4 中带有两个 NGM 琼脂。将琼脂标记为 F0-1-1-3 到 F0-3-12-3。
    5. 在 D4 上,通过从步骤 5.4 拾取到新的 NGM 琼脂,将两个母线虫从 F0-1-1-3 转移到 F0-3-12-3。将新的 NGM 琼脂标记为 F0-1-1-4 到 F0-3-12-4。将 F0-1-1-3 的标记更改为 F0-3-12-3 到 F1-1-1-1 到 F1-3-12-1,以表示 F0(即 F1)自 F0 开始繁殖后的第一天内的后代。
    6. 在 D5 上,使用解剖显微镜对 F1-1-1-1-1 到 F1-3-12-1 琼脂上的线虫进行计数,其中线虫已长了 2 天。允许 F1-1-1-1 到 F1-3-12-1 琼脂,以连续几代人重现 F2。
    7. 将两个母线虫从 F0-1-1-4 转移到 F0-3-12-4 琼脂,从步骤 5.4 拾取到新的 NGM 琼脂。将 NGM 琼脂标记为 F0-1-1-5 到 F0-3-12-5。将 F0-1-1-4 的标记更改为 F0-3-12-4 到 F1-1-1-2 到 F1-3-12-2,以表示 F0(即 F1)自 F0 开始繁殖后的第二天内的后代。
    8. 在 D6 上,计算 F1-1-1-2 到 F1-3-12-2 琼脂上的线虫。将母线虫从 F0-1-1-5 转移到 F0-3-12-5 琼脂到 F0-1-1-6 到 F0-3-12-6。将 F0-1-1-5 的标记更改为 F0-3-12-5 到 F1-1-1-3 到 F1-3-12-3,以表示 F0(即 F1)自 F0 开始繁殖后的第三天内的后代。
    9. F1-1-1-1-1 到 F1-3-12-1 琼脂上的线虫已经生长了 3 天。使用它们在后续的 MGE 效应研究中重现 F2。通过同样的方式,使用F2线虫复制F3,以继续MGE效应研究。
    10. 通过同样的方式,每天转移两个母线虫,第二天计算后代线虫,直到6NGM琼脂的母线虫(即每组总琼脂的一半)停止繁殖。
    11. 计算整个繁殖持续时间的总后代数,作为总育雏大小。使用前3天内的后代编号表示父母的初始繁殖。
    12. 使用父母线虫在 6 个 NGM 琼脂中停止繁殖的一天来估计繁殖持续时间。使用每个父母存活的天数作为其寿命。
    13. 获得F1的初始繁殖、繁殖持续时间、总育雏尺寸和寿命,方式与F0相同。同样,通过重复上述程序,可以获得F2(对Fn)的复制和寿命信息。
  2. 在 MGR 效应研究中测量生殖和寿命。
    1. 使用步骤 5.4 中的 NGM 琼脂对步骤 2.13 中的 NGM 加长执行步骤 7.2.4。
  3. 测量生化指数。
    1. 用无菌水冲洗NGM琼脂,并将其收集到离心管中。将线虫沉降30分钟,然后丢弃上生子。使用颗粒中的线虫进行效果测量。
    2. 在1.5 mL离心管中向线虫(颗粒)中加入1mL的冰冷磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.0),以清洗线虫。
    3. 在 10,000 x g下在 4°C 下离心 5 分钟,并小心地用移液器丢弃上生子。
    4. 用液氮或-80°C冷冻颗粒进行冷冻。
    5. 在冰浴中使用虫子对颗粒进行均匀化。使用 200 μL 冰冷的 PBS 将虫子上的残余液体洗入离心管中,然后再拿出虫子。
    6. 在10,000 x g下再次在4°C下离心5分钟,并使用超生物与商业试剂盒一起确定生物化学物的活动或量(详情见材料表)。
    7. 测量样品中总蛋白(TP)的含量,并将结果作为分母表示其他生化指标,从而消除样品中线虫数量的差异。
  4. 测量基因表达。
    1. 重复步骤 7.4.1 到 7.4.4。根据制造商的说明21,使用商业RNA提取试剂盒从线虫样品中分离出总RNA(详情见材料表)。
    2. 使用RNA根据制造商的说明21合成cDNA。
    3. 根据制造商的说明(见材料表)21,使用SYBR绿色RT-PCR试剂盒分析实时聚合酶链反应(RT-PCR)中的cDNA样品。
    4. 用2-+CT方法22量化所选基因的相对表达水平,并将gdp-2(或其他参考基因)的表达水平视为负参考。

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Representative Results

在这里,我们描述了在跨代(TG)、多代接触(MGE)和多代残留(MGR)效应研究中使用C.elegans研究化学物质对几代人的影响的协议。我们自己的研究结果作为例子提出。一项研究介绍了重金属对运动行为3的TG影响。其他两项研究显示硫磺胺和林丹对繁殖和生化及遗传指数测量4、14的MGE和MGR效应。

重金属对运动行为的TG影响 C. 埃莱甘斯

镉(Cd)、铜(Cu)、铅(Pb)和锌(Zn)对身体弯曲频率(BBF)的TG效应在母体暴露后及其后代(T1)3中研究。金属对BBF的影响表明,T1中的抑制作用大于F0,表明重金属对胚胎暴露后代运动行为的毒性比直接暴露的母体毒性更严重。重金属在环境现实浓度下的影响表明,母体接触可以使后代重金属污染的危害成倍增加。参见图 1

Figure 1
图 1:镉(Cd)、铜(Cu)、铅(Pb)和锌(锌)在产前暴露后对线虫父母(F0,空白)的身体弯曲频率及其后代(T1,遮蔽)的影响。错误栏 = 标准错误;[ ] 与控件明显不同,p < 0.05;[ ] 与低浓度明显不同,p < 0.05;• 意味着 F1 中的效果与 F0 中显著不同,p < 0.05。这个数字已由Yu等人3号修改,并经许可。请点击此处查看此图的较大版本。

磺胺类二氮(SMX)对线虫寿命和繁殖的MGR影响

对虫寿命和繁殖 14的 MGR 效应进行了研究 , 研究对象为生殖母体 ( F0 ) 、胚胎暴露后代 ( T1 ) 、生殖系暴露后代 ( T2 ) 、第一批未暴露后代 ( T3 ) 和 3 个后代 (T4-T6)。结果表明,生殖生殖(总育雏大小占对照的49%)在生殖系暴露(T2)中受到显著影响,毒性在T3至T6代非暴露代中持续存在(图2)。我们的发现对抗生素本身的长期影响,除了对抗生素耐药性的影响外,也提出了新的担忧。

Figure 2
图 2: 胸带大小(以(A)表示,以控制百分比表示)和初始繁殖(在(B)中)暴露的父项及其后代中的 elegan(F0、T1 到 T6,每次浓度从左到右)。 错误栏 = 标准错误;a = 与 ANOVA 的控制明显不同(p < 0.05);b = 与对照和上一代在相同浓度下显著不同(p < 0.05);c = 与对照和同一代较低浓度的显著不同(p < 0.05);d = 与对照和上一代明显不同,同一代浓度相同,浓度较低(p < 0.05);e = 同一代浓度相同、浓度较低的上一代与上一代明显不同(p < 0.05);f = 与上一代在相同浓度下显著不同(p < 0.05)。这个数字已由Yu等人14号修改,并经许可。

林丹对线虫生化和遗传指数的MGE和MGR影响

研究了林丹(一种持久性有机污染物[POP])的MGE和MGR效应,研究对相关胰岛素样通路4中脂质代谢的关键生化和遗传表达变化。结果表明,林丹在胰岛素信号调节中表现出对细胞生成效应(图3)。此外,sgk-1(F0、F3、T1'和T3')和akt-1(T1和T3)信号之间的变化表明,不同暴露代的线虫表现出不同的耐受性和避免反应策略。

Figure 3
图 3:不同暴露体验的线虫胰岛素样信号通路中关键基因表达水平的变化。*:积极监管;symbol :负调节;: 表达向上调节;*: 表达向下调节。这个数字已被修改从陈在第在许可。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

为了成功实施所述协议,应考虑以下建议。在无菌环境中执行总体实验操作。操作不当可能导致大肠杆菌菌株(如真菌和虫子)的污染,从而阻碍大肠杆菌的正常生长,从而影响实验结果。在描述培养C. elegan 的章节中,用肉眼或显微镜观察 NGM 琼脂上C. elegans的生长尺度。当琼脂的C.elegans在面积上超过75%,或养殖时间超过一周时,进行新一轮的接种,以避免C.elegans的过度增长或人口下降。在同步过程之前,使用显微镜观察C.elegans的生长,并在线虫蛋在琼脂上广泛分布时继续这一过程。此外,如果使用溶剂(例如二甲基硫酸盐 [DMSO]),其库存溶液中的浓度应低于 1%,以确保其最终浓度不超过 0.5%(v/v),以避免溶剂本身的不利影响。在TG效应研究中,24h以上的暴露持续时间是必要的,以确保暴露时间涵盖下一代的胚胎形成,并且持续时间应在96小时以内,以促进后续的分离。使用少量线虫(通常在20内)测量寿命和繁殖。另一方面,使用大量的线虫(通常超过500)来测量生化和遗传调节指数。因此,为了确保足够的样本数量,进行初步实验,大致估计成熟F0线虫自开始繁殖后24小时内可以繁殖多少后代。然后确定所需的F0线虫数量,以确保至少有200个后代进行多代研究。

与早先关于TG研究与C.elegans的研究相比,本实验方案对生命阶段的选择更为体贴。在C.elegan中,精子在L4阶段形成,以受精后来形成的卵母细胞23。因此,覆盖精子发生和卵母细胞生成期的暴露将为研究TG对后代的影响提供一个特定的窗口。年龄同步的卵子用于多代效应研究,以确保接触覆盖每个生命周期开始的整体周期。与早期的多代研究相比,本实验方案有助于测量多代效应,而不是仅仅1-2代。此外,本协议还考虑了MGE效应和MGR效应,这比早期仅测量MGE或MGR效应的研究更系统。

值得注意的是,本实验协议中仍有一些问题需要考虑。本协议采用野生型C.elegans,其生成时间约为60小时,寿命为20天。这使得实验的总体持续时间相当长(例如,MGE效应研究对寿命超过3代至少需要30天)。为了缩短时间,研究人员可以选择突变的C.elegans,如短寿命的突变线虫。另一个问题是对细菌的杀灭治疗,其生存状态是保持线虫健康的24。 此外,紫外线杀灭过程可能会引入化学品25的变化。因此,应考虑对细菌进行其他处理,并且可能需要仔细监测制备或暴露过程中的化学变化,尤其是对于不稳定的化合物。同时,在研究毒性效应的性别差异方面也有局限性,因为大多数事实认为,剖腹产是赫马普罗狄特。需要进一步改进,以调查TG、MGE或MGR效应中的性别贡献。综上所述,我们预计该议定书对利用C.elegans研究毒剂的TG、MGE和MGR效应具有重要意义。

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Disclosures

感谢国家水污染防治重大科技重大项目(2017ZX07201004)和中国国际科技合作项目(2016YFE0123700号)的财政支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 agar powder OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 9002-18-0
79nnHT Fast Real-Time PCR System  Applied Biosystems 
96-well sterile microplate Costar?Corning?America
Autoclave sterilizer Tomy, Tomy Digital Biology, Japan
Biosafety cabinet LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China
calcium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10043-52-4
centrifuge  5417R Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Centrifuge tubes Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America
cholesterol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 57-88-5
Dimethyl sulfoxide VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America 67-68-5
disodium hydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7558-79-4
ethanol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 64-17-5
Filter Thermo, Thermo Fisher Scientific, America
incubator YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China
inoculating loop
K2HPO4•3H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 16788-57-1
kraft paper
Mcroplate Reader Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America
MgSO4•7H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10034-99-8
Microscopes XTL-BM-9TD BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China 
Petri dishes
Pipette Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Potassium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7447-40-7
potassium dihydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7778-77-0
Qiagen RNeasy kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States
sodium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7647-14-5
sodium hydroxide Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 1310-73-2
sodium hypochlorite solution Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China 7681-52-9
tryptone OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 73049-73-7
yeast extract OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 119-44-8

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References

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