毒性物質のトランスおよび多世代効果の研究のためのカエナルハブ炎エレガンスの使用

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Summary

永続的な化学物質のトランスおよび多世代の影響は、環境と人間の健康に対する長期的な影響を判断する上で不可欠です。我々は、自由に生きている線虫カエノルハブ炎エレガンスを用いて、トランスおよび多世代の効果を研究するための新しい詳細な方法を提供する。

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Li, Z., Ai, F., Zhang, J., Yu, Z., Yin, D. Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants. J. Vis. Exp. (149), e59367, doi:10.3791/59367 (2019).

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Abstract

化学物質の毒性に関する情報は、その用途と廃棄物管理に不可欠です。低濃度の化学物質の場合、長期的な影響は、環境と人間の健康への影響を判断する上で非常に重要です。長期的な影響を実証する上で、最近の研究で世代を超えた化学物質の影響は、新しい洞察を提供します。ここでは、自由に生きている線虫カエオルハブ炎エレガンスを用いて、複数世代にわたる化学物質の効果を研究するためのプロトコルについて説明する。(1)トランスジェネレーション(TG)と(2)多世代効果研究、(後者)を多世代露光(MGE)と多世代残差(MGR)効果スタディに分ける2つの側面を提示する。TG効果研究は、親への化学暴露が子孫に残留結果をもたらす可能性があるかどうかを決定する単純な目的で堅牢です。効果が親に測定された後、次亜塩素酸ナトリウム溶液は、親を殺し、子孫に対する効果測定を容易にするために子孫を保つために使用されます。TG効果試験は、親が汚染物質にさらされたときに子孫が影響を受けるかどうかを判断するために使用されます。MGEおよびMGR効果試験は、連続的な世代暴露が世代を超えて子孫の適応応答をもたらす可能性があるかどうかを決定するために体系的に使用されます。慎重なピックアップと転送は、各世代の効果測定を容易にするために世代を区別するために使用されます。また、プロトコルを組み合わせて、移動挙動、生殖、寿命、生化学的および遺伝子発現の変化を測定しました。いくつかの実験例はまた、トランスおよび多世代効果研究を説明するために提示される。

Introduction

化学物質の適用および廃棄物管理は、特定の濃度での効果の情報に大きく依存します。特に、時間は効果と濃度の間のもう一つの重要な要素です。すなわち、化学物質、特に実際の環境で低濃度のものは、測定可能な効果引き起こす時間を必要とします 1.したがって、研究者は、動物実験で露光期間の異なる長さを配置し、さらにはライフサイクル全体をカバーします。例えば、マウスは、その毒性効果2を研究するために30、90または180日間ニコチンにさらされた。 しかし、このような暴露期間は、環境中の生物の世代にわたって持続する汚染物質(例えば、持続的な有機汚染物質[POP])の長期的な影響を解明するのに十分ではありません。したがって、世代を超えた効果に関する研究はますます注目を集めています。

世代効果研究には主に2つの側面があります。1つ目は、親への化学暴露が子孫3に何らかの影響をもたらすかどうかを強くテストできるトランスジェネレーション(TG)効果試験です。2つ目は、露出効果と残留効果の両方を考慮した、より体系的な多世代効果研究です。一方で、多世代暴露(MGE)効果は、長期的に困難な環境に対する動物の適応応答を示すために使用される。一方、母体暴露は第1子子への胚暴露と第2の生殖線暴露を伴うため、多世代残差(MGR)効果は、暴露後の長期的な残留結果を実証するために使用される。第三世代として第三の子孫を露出から完全に外す子孫4.

哺乳動物(例えば、マウス)は、特にヒトに関連する毒性研究におけるモデル生物であるが、世代的影響の研究におけるその応用は非常に時間がかかり、高価で倫理的に5に関する。したがって、甲殻類ダフニアマグナ6、昆虫ショウジョウバエメラノガスター7およびゼブラフィッシュダニオレリオ8を含む生物は、代替選択肢を提供する。しかし、これらの生物は人間との類似性を欠いているか、研究に特定の装置を必要とします。

カエオルハブ炎エレガンスは、短いライフサイクル(20°Cで約84時間)9の小さな自由に生きている線虫(長さ約1mm)です。この線虫は、人間に対して保守的な多くの生物学的経路を共有し、したがって、様々なストレスまたは毒性物質10の効果を示すために広く採用されている。特に、線虫の99.5%は、重金属やスルホンアミド3、11、金ナノ粒子および重体のMGE効果の生成効果など、世代的効果の研究に非常に適したこの生物を作るハーマフロダイトである。金属12および温度13、スルホンアミド14のMGR効果、およびガンマ照射15およびリンダン4のMGEおよびMGR効果の両方が及ぶ。さらに、マウスとC.エレガンス16、17の発達および繁殖に及ぼす化学物質(例えばゼアラレノン)の効果との間に同等の結果が見出された。この小動物から人間への影響。

TG と MG 効果の研究は両方の時間がかかり、慎重な設計とパフォーマンスが必要です。.特に、前述の研究では、ライフステージの選択、暴露条件、および生成分離方法に違いが存在していました。このような違いは、結果間の直接比較を妨げ、結果のさらなる解釈を妨げました。したがって、TGおよびMG効果研究を導く統一プロトコルを確立し、また、長期的な結果における様々な毒性物質または汚染物質の同様のパターンを明らかにするために、より大きな画像を提供することが不可欠である。本プロトコルのオーバーゴールは、C.エレガンスとのトランスおよび多世代効果を研究する際の明確な操作プロセスを示す。プロトコルは、有毒物質や汚染物質の長期的な影響を研究することに興味を持っている研究者に利益をもたらす.

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Protocol

1. 培養大腸菌OP50

  1. 水酸化ナトリウム4gを100mLの水に溶解して1M水酸化ナトリウム溶液を調出す。
  2. リソジェニーブロス(LB)培地を1L円錐フラスコに10gのトリプトン、5gの酵母エキス、10gの塩化ナトリウムを1Lの円錐形フラスコに溶解させ、1Lの円錐形のフラスコに1Lの超純水を溶かして調剤する。水酸化ナトリウム溶液1MでpHを7.0に調整します。
  3. ステップ1.2から20円錐フラスコ(最大許容容積:100 mL)にLB液体媒体をそれぞれ50 mLの媒体とアリコートする。円錐形のフラスコをクラフト紙で覆います。
  4. LB液体培地を121°C、0.105 MPaで20分間殺菌し、LB培地を室温まで冷やします。
  5. 細菌懸濁液からピペット200μL(ステップ1.8を参照)または接種ループを使用して寒天から小さなコロニーを選ぶか(ステップ2.14)、LB培地に入れます。
  6. LB培地を37°Cで150rpmで24~48時間振ってインキュベートします。LB培地は茶色の透明液から濁ったカーキ色のサスペンションに変わります。
  7. 全フラスコの80%の細菌懸濁液を使用して、ステップ2.11で使用する線虫食品として大腸菌OP50を提供します。
  8. 細菌懸濁液を含むフラスコの残りの部分を冷蔵庫に4°Cで保管してください。LB懸濁液のピペット200μLを新鮮なLB培地の上側(ステップ1.4)にし、その後のインキュベーションのためにステップ1.6を繰り返す。

2.カルチャーC.エレガンス

注: 標準的な方法18に基づいて、ステップ 2.1 から 2.11 に従って使用するカルチャ C.エレガンス 。

  1. 無菌蒸留水の100 mLでK2HPO4の22.8gを溶解します。
  2. 無菌蒸留水の50mLにKH2 PO4の6.8gを溶解します。
  3. ステップ2.1および2.2からの溶液を混合し、1 M K2HPO4-KH2PO4バッファー(pH 6.0、合計150 mL)を準備する。
  4. 滅菌蒸留水の5 mLでMgSO4•7H2Oの1.232gを溶解することにより1.0 M MgSO4を調作し、0.22 μmの滅菌可能な使い捨て用膜フィルターを通して溶液を滅菌容器に濾過して殺菌します。
  5. 無菌蒸留水の5 mLでCaCl2の0.554gを溶解して1M CaCl2を調作し、0.22 μmの無菌使い捨て膜フィルターを通して溶液を滅菌容器に濾過して殺菌します。
  6. 絶対エタノールの5mLにコレステロール0.025gを溶解して1Mコレステロール溶液を調作し、0.22μmの無菌使い捨て膜フィルターを通して無菌容器に濾過して殺菌する。
  7. 1Lの超純水を含む1Lの円錐フラスコに17gの寒天粉末、2.5gのペプトン、3gの塩化ナトリウムを加えて線虫成長培地(NGM)寒天を調少します。ステップ 2.3 から K2HPO4-KH 2 PO4溶液の25mL を追加します。
  8. 0.105 MPaでステップ2.7から121 °CでNGM寒天を20分間殺菌します。
  9. NGM寒天を約50°Cに冷却し、1 M MgSO 4、1 M CaCl2、および5mg/mLコレステロールエタノール溶液を2.4~2.6の培地に加え、十分に混ぜます。
  10. 1皿につき~10mL NGM寒天媒体を100個の滅菌ペトリ皿(直径6.0cm)に注ぎます。ペトリ皿の中の媒体を室温に冷やし、固寒天を形成する。
  11. ステップ1.7から前述のNGM寒天に対する細菌懸濁液のピペット170μLは、無菌先端を用いた。NGM寒天を少し振り、LB培地をNGM寒天面に均等に分配します。
  12. NGM寒天を37°Cの上側に接種し、8~12時間、細菌の芝生を形成する。
  13. ステップ2.12から培養線虫にステップ2.12または2.19で細菌の芝生と寒天のほとんどを使用してください。
  14. 1または2寒天を上下に下に保管し、4°Cの冷蔵庫での水蒸発や汚染を避け、細菌を汚染に維持します。
  15. ストッキングNGM寒天に2,000未満の線虫がある場合(以前の実験または他の研究室から贈られたもの)、無菌先端を持つC.エレガンを含むNGM寒天の6分の1を切り、細菌で新たに調製されたNGM寒天に移します。芝生(ステップ2.13から)。NGM寒天を22°Cのインキュベーターで上下に保ち、その後の培養物を使用します。
  16. NGM寒天に2,000以上の線虫がある場合は、NGM寒天の線虫を2mLの滅菌水で遠心管に流し込みます。2mLの水を入力すると、約1.5mLの出力になります。
  17. 線虫が30分間遠心管に落ち着くように、ピペッティングによって上清の1 mLを捨て、各チューブに滅菌水の1 mLを加えてペレット(すなわち、線虫)を洗浄します。
  18. 遠心管の線虫を30分間落ち着かせ、ピペッティングで上清を1mL捨てます。各チューブに1mLの滅菌水を加え、線虫を再懸濁させます。
  19. 線虫懸濁液(合計約1.5mL)を、細菌芝生(ステップ2.13から)で新しいNGM寒天に150μLをピペッティングし、合計で8-10の新しいNGM寒天を作ります。
  20. NGM寒天をステップ2.19から上側に20°Cのインキュベーターで一晩上に保ち、その後の培養のために上側に置きます。
  21. ステップ 2.15 またはステップ 2.16-2.20 を 3 日ごとに繰り返します。

3. C.エレガンスの同期卵とL3幼虫を準備する

  1. NGM寒天から生まれた赤毛線虫と新たに作られた卵を無菌遠心管に流し込み、各NGM寒天に2mLの滅菌水を加え、約1.5mLの出力を得る。
  2. 遠心管の線虫を30分間落ち着かせ、ピペッティングで上清の85%を捨てます。
  3. 次亜塩素酸ナトリウム溶液を0.6gのNaOHと5mLのNaOCl(4-6%活性勾配、詳細は材料表を参照)を25mLの水で溶解させ、NaOHを0.5M、NaOClを1%にします。
  4. ステップ3.2からペレットを混合し(体積をV0としてマークする)、次亜塩素酸ナトリウム溶液の7倍V0(ステップ3.3、すなわち、体積比1:7)19を混合する。
  5. 幼虫と成体線虫をlyseseに10〜15分間2分ごとに遠心管を振ります。線虫懸濁液の色は濁りからクリアに変わります。
  6. チューブを700xgで20°Cで3分間遠心分離し、ピペッティングで上清を捨てます。
  7. 無菌水の5倍V0でペレットを再懸濁し、加齢卵を洗浄する。遠心分離機を20°Cで3分間700xgで、次いで上清を捨てます。
  8. 手順 3.7 を 2 回繰り返します。
  9. 無菌水の1倍V0をチューブに加え、年齢同期卵を再懸濁させる。
  10. ステップ2.13から細菌の芝生を持つ各新しいNGM寒天に50 μLをピペッティングすることにより、卵懸濁液を分配します。NGM寒天を20°Cのインキュベーターで30分間上に置き、細菌の芝生で水を蒸発または吸着できるようにします。次に、NGM 寒天を上下に下にして、その後の文化を作ります。卵時間(T卵)として時間をマークします。
  11. 1Lの水にNaClの3gとKClの2.36gを溶解することによりK培地を調製する。121 °C と 0.105 MPa で 20 分間殺菌し、室温まで冷却します。
  12. Tの後に時間が36時間に達すると、線虫はL3幼虫ステージ(L3線虫)20に達する。NGM寒天から線虫を遠心管に流し、各NGM寒天に2mLの滅菌水を加え、約1.5mLの出力を得る。
  13. 30分間沈降した後、上清の85%を(ピペッティングによって)2時間からK培地に置き換え、腸3で食物を消化する。
  14. 上清を捨てる。K-培地(ステップ3.11から)を使用して、線虫懸濁液を100 μLあたり約200 μLに調整し、その後の実験を行います。

4. 世代間効果研究にC.エレガンスを使用する

  1. 5濃度レベルと1つの溶媒または絶対制御、すなわち合計6群の化学溶液を調達する。
  2. エッジ効果を避けるために、各グループ(合計60ウェル)の中間領域に100 μLの制御または化学溶液を100 μLのレプリケートとして追加します。
  3. ステップ 3.14 から線虫懸濁液をステップ 3.11 から K ミディアムで 10 倍に希釈します。ステップ4.2から60ウェルのそれぞれに100 μL線虫懸濁液を追加します。時刻を t0としてマークします。
  4. 時間がt0の後に24時間に達すると、井戸の生きていると死んだ線虫を数えます。中央値致死濃度(LC50)を計算します。
  5. LC50値の10%以下の5濃度のシリーズを準備します。
  6. 100 μL の制御または化学溶液(ステップ 4.5 から)を各グループの反復として 10 ウェル(合計で 60 ウェル)を 96 ウェル滅菌マイクロプレートの中間領域に追加し、エッジ効果を回避します。
  7. 約200 L3線虫を含むK培地の100 μLをステップ4.6から60ウェルのそれぞれに加えます。時刻を T0としてマークします。
  8. T0以降 24 ~ 96 h の露出を実行します。
  9. 暴露後、各群の5つの井戸から線虫をピペッティング(合計6本)で1.5mL遠心管に集めます。
  10. 線虫を30分間決済し、ピペッティングで上清を捨て、1mLの殺菌水で底部の線虫を再懸濁して洗う。
  11. 線虫を30分間決済し、ピペッティングで上清を捨て、下部の線虫を使用して、F0としてマークされた露出親世代の指標測定(セクション7を参照)を行います。
  12. ステップ4.10に従って、各グループの残りの5つの井戸から線虫を収集、決済、洗浄します。.
  13. ステップ4.12から線虫を30分間決済し、ピペッティングで上清を捨て、100μLの滅菌水を加えて線虫を再懸濁させる。線虫懸濁液をステップ2.13から細菌の芝生を持つ3つの新しく調製されたNGM寒天に均等に移す。
  14. 線虫を36時間インキュベートして重力化し、手順3.1~3.9に従って年齢同期を実行します。ステップ2.13から細菌の芝生でそれぞれのNGM寒天の同期卵を36時間インキュベートします。
  15. NGM寒天の線虫をステップ4.14から6本の遠心管に洗い流します。
  16. 線虫を30分間決済し、ピペッティングで上清を捨てます。滅菌水の1 mLでペレットを再懸濁し、洗浄します。
  17. 線虫を30分間決済し、ピペッティングで上清を捨てます。下部の線虫を使用して、T1 としてマークされた子孫生成のインジケーター測定値(セクション 7 を参照)に使用します。

5. 多世代暴露(MGE)効果研究にC.エレガンを使用

  1. 99.0 mL NGM寒天(ステップ2.9から)を1mLの制御または化学溶液(本プロトコルの低濃度および高濃度、すなわち合計3群)と混合する。
  2. ステップ5.1から100の滅菌ペトリ皿(直径6.0 cm)に1皿あたり約10mLのNGM寒天媒体を注ぎます。ペトリ皿の中の媒体を室温に冷やし、固寒天を形成する。
  3. ステップ2.11に基づいて寒天にピペット細菌懸濁液。
  4. ペトリ皿の上蓋を脇に置き、バイオセーフティキャビネットの紫外線(145 μW/cm2)に細菌の芝生を15分間さらします。
  5. 接種ループを使用して小さなコロニーを選択し、ステップ1.4で寒天からLB培地に入れます。LB培地を37°Cで150rpmの速度で24時間振ってインキュベートし、細菌の増殖を確認し、殺し工程5.4を検証する。
  6. ステップ3.9から寒天に年齢同期卵をピペットします(ステップ5.4から)。親世代 F0 への露出の開始をマークし、0 日 (D0) としてマークします。
  7. 寒天を20°Cで3dにインキュベートします。次に(すなわち、D3で)、成熟した線虫を使用してF0の効果を測定します(セクション7を参照)。
  8. また、D3では、F0成熟線虫を新しいNGM寒天(ステップ5.4から)に取り付け、その端部に人工繊維ワイヤーをリングに曲げて装着します。
  9. D4では、成熟したF0線虫をNGM寒天から選び出して捨てる。この 24 時間 (D3 から D4 まで) 内の新しく孵化した子孫線虫を F1 としてマークし、第 2 世代の露出を体験します。
  10. D6では、3日間の暴露を経験したF1成熟線虫の指標(セクション7参照)を測定します。
  11. D9では、手順5.8~5.10を繰り返し、F1線虫を使用してF2ワームを再現し、F2線虫への影響を測定します。
  12. D12 でステップ 5.11 を繰り返し、F2 線虫を使用して F3 ワームを再現し、F3 線虫への影響を測定します。同じ方法で、子孫を再現し、n番目の子孫生成(Fn)に対するMGE効果を測定する。

6. 多世代残差(MGR)効果スタディにC.エレガンスを使用

  1. 手順 5.1-5.7 を繰り返します。D3では、F0成熟線虫を追加した化学物質なしで新しいNGM寒天に取り入れ(ステップ2.13から)。
  2. D4で、成熟したF0線虫を選び出して捨てる。この 24 時間以内に新しく孵化した子孫線虫を T1 線虫としてマークします。
  3. D6では、3日間成長したT1成熟線虫の指標(セクション7参照)を測定します。
  4. D9では、手順6.2~6.3を繰り返し、T1線虫を使用してT2線虫を再現し、T1線虫の効果を測定します。
  5. D12では、ステップ6.4を繰り返し、T2線虫を使用してT3線虫を再現し、T2線虫の効果を測定します。同じ方法で、子孫を再現し、F0 のn番目の子孫生成 (Tn) 線虫、またはステップ 5.12 から Fn のn番目の子孫 (Tn') 線虫に対する MGR 効果を測定します。

7. 指標の測定

  1. 移動動作の動作を測定します。
    1. 無菌水を使用してNGM寒天から線虫を洗い流し、遠心管に集めます。線虫を30分間決済し、上清を捨て、ペレットの線虫を使用して効果測定を行います。
    2. 滅菌水の1 mLでペレット内の線虫を再懸濁し、ステップ2.10から細菌の芝生なしでNGM寒天にそれらをピペット。
    3. 解剖顕微鏡を使用して、咽頭の後球が60秒間隔内の走行経路の垂直方向に沿って方向を変化する回数を指す(数)体曲げ頻度(BBF)の線虫をスコアリングする。
    4. 解剖顕微鏡を使用して、60秒間隔で後方旋回やオメガターン(OT)を含む90°を超えて進む方向が変化する時間を指す反転運動(RM)をスコアリングします。OTは、線虫の頭がギリシア文字オメガ(Ω)のような線虫の形を作るその尾に触れたり、ほとんど触れたりしたときの動きを指します。
      注:各実験反復における各処置について少なくとも6つの線虫を調べた。
MGE(F0~F3)が3群(1対1および2回の暴露治療)による生殖および寿命に及ぼす影響の例。
MGE研究のためのNGM寒天数 説明
寿命 再現
0 30 (F0 露出) F0-1-1-0 から F0-3-10-0 にマークされた各グループの 10 反復は、生存日を示す最後の数字で表示されます。
1 30 (F0 は 1 d を生き残る) F0-1-1-0 から F0-3-10-0 を F0-1-1-1 に変更する必要があります。
2 30 (F0 は 2 d を生き残る) F0-1-1-1 から F0-3-10-1 に変更する必要があります F0-1-1-2 から F0-3-10-2 に変更してください。
F0線虫を3dまで転送する必要はありません。
3 30(F0は3dを生き残り、線虫の移動および回収後にクリアされる) 3dの後、F0線虫は成熟し、36の新しいNGM寒天(各寒天に2つの線虫を含む)が生存と生殖を観察するために使用される。
36 (F0-1-1-3 から F0-3-12-3) F0線虫の数を整理するために予備的な実験を行い、多世代の操作を成功させるために少なくとも200人の子孫を保証する必要があります。
特に、MGR効果が研究されている場合、F0線虫は化学暴露なしで透明なNGM寒天に移されるべきであり、T1開始として留意すべきである。
F0線虫のほとんどは、化学的および遺伝的指数を測定するために収集され、F0の30寒天はクリアされます。
4 36 (F0-1-1-4 から F0-3-12-4) 36 (F1-1-1-1 から F1-3-12-1) 寿命と生殖に関する測定には、毎日転送が必要です。
F0-1-1-3 から F0-3-12-3 の親線虫は、F0-1-1-4 から F0-3-12-4 とマークされた新しい NGM 寒天にピッキングされます。
F0-1-1-3からF0-3-12-3に対する残りの子孫線虫(MGEのF1、またはMGRのT1)は1dに成長し、マーカーはF1-1-1-1にF1-1-1-1に変更されます。これらの寒天はまた、毎日の転送でF1の寿命を監視するために使用されます。
5 36 (F0-1-1-5 から F0-3-12-5) 36 (F1-1-1-2 から F1-3-12-2) F1-1-1-1からF1-3-12-1に対する線虫は2dに成長し、簡単に観察できるようになり、線虫をカウントし、マーカーをF1-1-1-1-2からF1-3-12-2に変更します。
36 (F0-1-1-4 から F0-3-12-4) F0-1-1-4からF0-3-12-4寒天の子孫線虫は1dに成長した。
6 36 (F0-1-1-6 から F0-3-12-6) 36 (F0-1-1-4 から F0-3-12-4、カウント後にクリア) F1-1-1-2からF1-3-12-2に対する線虫は3dに成長し、マーカーはF1-1-1-3からF1-3-12-3に変更されます。特に、F1線虫はこの日からF2を再現し始め、F1線虫はF2-1-1-0をF1-3-12-0にする新しいNGM寒天に移管されるべきである。MGR研究の場合、T2は今日開始します。
36 (F1-1-1-3 から F1-3-12-3) 36 (F0-1-1-5 から F0-3-12-5) これは化学暴露によって遅れる可能性があるため、その後の世代のために十分な線虫を確保するために、各実験で柔軟な変更を行う必要があります。
36 (F2-1-1-0 から F1-3-12-0) F0-1-1-4からF0-3-12-4寒天の子孫線虫は2dに成長し、線虫をカウントした後に寒天がクリアされます。
F0-1-1-5からF0-3-12-5寒天の子孫線虫は1dに成長した。
7 36 (F0-1-1-7 から F0-3-12-7) 36 (F0-1-1-5 から F0-3-12-5、カウント後にクリア) F0-1-1-5からF0-3-12-5寒天の子孫線虫は2dに成長し、線虫をカウントした後に寒天がクリアされます。
36 (F1-1-1-4 から F1-3-12-4) 36 (F0-1-1-6 から F0-3-12-6) F1-1-1-1 から F1-3-12-1 寒天、F0-1-1-4 から F0-3-12-4、F0-1-1-5 から F0-3-12-5 までの線虫数を使用して、F0 の初期再現を計算します。
36 (F2-1-1-1 から F2-3-12-1) F0-1-1-6からF0-3-12-6寒天の子孫線虫は1dに成長した。
F2-1-1-0からF1-3-12-0のF2線虫は1dに拡大し、マーカーはF2-1-1-1からF2-3-12-1に変更されます。
8 36 (F0-1-1-8 から F0-3-12-8) 36 (F0-1-1-6 から F0-3-12-6、カウント後にクリア) F0-1-1-6からF0-3-12-6寒天の子孫線虫は2dに成長し、線虫をカウントした後に寒天がクリアされます。
36 (F1-1-1-5 から F1-3-12-5) 36 (F0-1-1-7 から F0-3-12-7) F0-1-1-7からF0-3-12-7寒天のF0の子孫線虫は1dに成長した。
36 (F2-1-1-2 から F2-3-12-2) 36 (F1-1-1-4 から F1-3-12-4) F1-1-1-1-4からF1-3-12-4に対するF1の子孫線虫は1dに成長しました。
36 (F2-1-1-1 から F2-3-12-1 に、カウント後に F2-1-1-2 から F2-3-12-2 に変更) F2-1-1-1からF2-3-12-1のF2線虫は2dに成長し、線虫はカウントされ、マーカーはF2-1-1-2からF2-3-12-2に変更されます。
9 36 (F0-1-1-9 から F0-3-12-9) 36 (F0-1-1-7 から F0-3-12-7、カウント後にクリア) F0-1-1-7からF0-3-12-7寒天の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされる。
36 (F1-1-1-6 から F1-3-12-6) 36 (F1-1-1-1-4 から F1-3-12-4、カウント後にクリア) F1-1-1-4からF1-3-12-4のF1の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F2-1-1-3 から F2-3-12-3) 36 (F0-1-1-8 から F0-3-12-8) F0-1-1-8からF0-3-12-8に対するF0の子孫線虫は1dのために成長した。
36 (F3-1-1-0 から F3-3-12-0) 36 (F1-1-1-5 から F1-3-12-5) F1-1-1-5からF1-3-12-5に対するF1の子孫線虫は1dのために成長しました。
F2-1-1-2からF2-3-12-2のF2線虫は3日間成長し、マーカーはF2-1-1-3からF2-3-12-3に変更されます。F2線虫は今日再生を開始し、彼らは36の新しいNGM寒天に転送され、F3-1-1-0からF3-3-12-0にマークされています。MGR研究の場合、T3は今日から始まります。
10歳 36 (F0-1-1-10 から F0-3-12-10) 36 (F0-1-1-8 から F0-3-12-8、カウント後にクリア) F0-1-1-8からF0-3-12-8寒天の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされる。
36 (F1-1-1-7 から F1-3-12-7) 36 (F1-1-1-1-5 から F1-3-12-5、カウント後にクリア) F1-1-1-5からF1-3-12-5寒天の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F2-1-1-4 から F2-3-12-4) 36 (F0-1-1-9 から F0-3-12-9) F2-1-1-1 から F2-3-12-1、F1-1-1-4 から F1-3-12-4、F1-1-1-5 から F1-3-12-5 の全体的な線虫数は、F1 の初期再現を計算するために使用されます。
36 (F3-1-1-1 から F3-3-12-1) 36 (F1-1-1-6 から F1-3-12-6) F0-1-1-9からF0-3-12-9に対するF0の子孫線虫は1dに成長した。
F1-1-1-6からF1-3-12-6に対するF1の子孫線虫は1dに成長しました。
F3-1-1-0からF3-3-12-0に対する子孫線虫は1dに成長し、マーカーはF3-1-1-1からF3-3-12-1に変更されます。
特に、F0線虫の再生は、最初の数日後に大幅に減少します。したがって、線虫転写はD10以降に毎日行う必要がなくなり、2日ごとに行うことができる。しかし、生存はまだ毎日の観察を必要とします。
同じルールは、F1 (T1、T1')、F2 (T2、T2')、F3 (T3, T3') にも適用されます。
11歳 36 (F0-1-1-11 から F0-3-12-11) 36 (F0-1-1-9 から F0-3-12-9、カウント後にクリア) F0-1-1-9からF0-3-12-9寒天の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされる。
36 (F1-1-1-8 から F1-3-12-8) 36 (F1-1-1-6 から F1-3-12-6、カウント後にクリア) F1-1-1-6からF1-3-12-6のF1の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F2-1-1-5 から F2-3-12-5) 36 (F0-1-1-10 から F0-3-12-10) F0-1-1-10からF0-3-12-10寒天のF0の子孫線虫は1dに成長した。
36 (F3-1-1-2 から F3-3-12-2) 36 (F1-1-1-7 から F1-3-12-7) F1-1-1-1-7からF1-3-12-7に対するF1の子孫線虫は1dに成長しました。
36 (F2-1-1-4 から F2-3-12-4) F2-1-1-4からF2-3-12-4に対するF2の子孫線虫は1dに成長した。
36 (F3-1-1-1 から F3-3-12-1 に、カウント後に F3-1-1-2 から F3-3-12-2 に変更) F3-1-1-1 から F3-3-12-1 に対する線虫は 2 d に成長し、線虫はカウントされ、マーカーは F3-1-1-2 から F3-3-12-2 に変更されます。
12歳 36 (F0-1-1-12 から F0-3-12-12) 36 (F0-1-1-1-10 から F0-3-12-10、カウント後にクリア) F0-1-1-10からF0-3-12-10寒天の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされる。
36 (F1-1-1-9 から F1-3-12-9) 36 (F1-1-1-1-7 から F1-3-12-7、カウント後にクリア) F1-1-1-1-7からF1-3-12-7寒天の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F2-1-1-6 から F2-3-12-6) 36 (F2-1-1-4 から F2-3-12-4、カウント後にクリア) F2-1-1-4からF2-3-12-4のF2の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F3-1-1-3 から F3-3-12-3) 36 (F0-1-1-11 から F0-3-12-11) F0-1-1-11からF0-3-12-11に対するF0の子孫線虫は1dに成長した。
36 (F4-1-1-0 から F4-3-12-0) 36 (F1-1-1-8 から F1-3-12-8) F1-1-1-1-8からF1-3-12-8に対するF1の子孫線虫は1dのために成長しました。
36 (F2-1-1-5 から F2-3-12-5) F2-1-1-5からF2-3-12-5に対するF2の子孫線虫は1dのために成長した。
F3-1-1-2 から F3-3-12-2 に対する線虫は 3 d に成長し、マーカーは F3-1-1-3 から F3-3-12-3 に変更されます。F3線虫は今日再生を開始し、彼らは36の新しいNGM寒天に転送され、F4-1-1-0からF4-3-12-0にマークされています。MGR研究では、F3の子孫(すなわち、T1')が今日開始されます。
13歳 36 (F0-1-1-13 から F0-3-12-13) 36 (F0-1-1-1-11 から F0-3-12-11、カウント後にクリア) F0-1-1-11からF0-3-12-11のF0の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされる。
36 (F1-1-1-1-10 から F1-3-12-10) 36 (F1-1-1-1-8 から F1-3-12-8、カウント後にクリア) F1-1-1-8からF1-3-12-8のF1の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F2-1-1-7 から F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-5 から F2-3-12-5、カウント後にクリア) F2-1-1-5からF2-3-12-5寒天の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F3-1-1-4 から F3-3-12-4) 36 (F0-1-1-12 から F0-3-12-12) F3-1-1-1 から F3-3-12-1、F2-1-1-4 から F2-3-12-4、F2-1-1-5 から F2-3-12-5 の全体的な線虫数は、F2 の初期再生を計算するために使用されます。
36 (F4-1-1-1 から F4-3-12-1) 36 (F1-1-1-9 から F1-3-12-9) F0-1-1-12からF0-3-12-12に対するF0の子孫線虫は1dに成長した。
36 (F2-1-1-6 から F2-3-12-6) F1-1-1-9からF1-3-12-9に対するF1の子孫線虫は1dに成長しました。
F2-1-1-6からF2-3-12-6に対するF2の子孫線虫は1dに成長した。
F4-1-1-0からF4-3-12-0のF3の子孫線虫は1dに成長し、マーカーはF4-1-1-1からF4-3-12-1に変更されます。
14歳 36 (F0-1-1-1-14 から F0-3-12-14) 36 (F0-1-1-1-12 から F0-3-12-12、カウント後にクリア) F0-1-1-12からF0-3-12-12のF0の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされる。
36 (F1-1-1-1-11 から F1-3-12-11) 36 (F1-1-1-9 から F1-3-12-9、カウント後にクリア) F1-1-1-9からF1-3-12-9にF1の子孫線虫は2dで成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F2-1-1-8 から F2-3-12-8) 36 (F2-1-1-6 から F2-3-12-6、カウント後にクリア) F2-1-1-6からF2-3-12-6寒天の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされる。
36 (F3-1-1-5 から F3-3-12-5) 36 (F4-1-1-1 から F4-3-12-1、カウント後にクリア) F4-1-1-1からF4-3-12-1のF3の子孫線虫は2dに成長し、線虫をカウントした後に寒天がクリアされます。MGRの研究では、T1'線虫は2dのために成長し、翌日(D15)にT2'を再現し始め、T2'はD18でT3'を再現し始めます。野生型C.エレガンスの寿命は15日として例示される。その後、T3'寿命の終わりはD33になります。
36 (F0-1-1-13 から F0-3-12-13) F0-1-1-13からF0-3-12-13に対するF0の子孫線虫は1dに成長した。
36 (F1-1-1-1-10 から F1-3-12-10) F1-1-1-1-10からF1-3-12-10にF1の子孫線虫は1dのために成長しました。
36 (F2-1-1-7 から F2-3-12-7) F2-1-1-7からF2-3-12-7寒天の子孫線虫は1dに成長した。
36 (F3-1-1-4 から F3-3-12-4) F3-1-1-4からF2-3-12-4に対するF3の子孫線虫は1dに成長しました。
15歳 36 (F0-1-1-1-15 から F0-3-12-15) 36 (F0-1-1-1-13 から F0-3-12-13、カウント後にクリア) F0-1-1-13からF0-3-12-13のF0の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされる。
36 (F1-1-1-1-12 から F1-3-12-12) 36 (F1-1-1-1-10 から F1-3-12-10、カウント後にクリア) F1-1-1-10からF1-3-12-10のF1の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F2-1-1-9 から F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-7 から F2-3-12-7、カウント後にクリア) F2-1-1-7からF2-3-12-7寒天の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F3-1-1-6 から F3-3-12-6) 36 (F3-1-1-4 から F3-3-12-4、カウント後にクリア) F3-1-1-4からF3-3-12-4のF3の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F0-1-1-1-14 から F0-3-12-14) F0-1-1-14からF0-3-12-14に対するF0の子孫線虫は1dに成長した。
36 (F1-1-1-1-11 から F1-3-12-11) F1-1-1-1-11からF1-3-12-11に対するF1の子孫線虫は1dに成長しました。
36 (F2-1-1-8 から F2-3-12-8) F2-1-1-8からF2-3-12-8に対するF2の子孫線虫は1dのために成長した。
36 (F3-1-1-5 から F3-3-12-5) F3-1-1-5からF2-3-12-5に対するF3の子孫線虫は1dのために成長しました。
16歳 36 (F0-1-1-1-15 から F0-3-12-15、以上) 36 (F0-1-1-1-14 から F0-3-12-14、カウント後にクリア) 野生型C.エレガンスの寿命は15日として例示される。したがって、F0は暴露以来16日目までにすべて死亡しているはずです。
36 (F1-1-1-1-13 から F1-3-12-13) 36 (F1-1-1-1-11 から F1-3-12-11、カウント後にクリア) F0-1-1-14からF0-3-12-14のF0の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされる。
36 (F2-1-1-1-10 から F2-3-12-10) 36 (F2-1-1-8 から F2-3-12-8、カウント後にクリア) F1-1-1-11からF1-3-12-11のF1の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F3-1-1-7 から F3-3-12-7) 36 (F3-1-1-5 から F3-3-12-5、カウント後にクリア) F2-1-1-8からF2-3-12-8のF2の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F0-1-1-1-15 から F0-3-12-15) F3-1-1-5からF3-3-12-5寒天の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F1-1-1-1-12 から F1-3-12-12) F4-1-1-1 から F4-3-12-1、F3-1-1-4 から F3-3-12-4、F3-1-1-5 から F3-3-12-5 の全体的な線虫数は、F3 の初期再現を計算するために使用されます。
36 (F2-1-1-9 から F2-3-12-9) F0-1-1-15からF0-3-12-15に対するF0の子孫線虫は1dに成長した。
36 (F3-1-1-6 から F3-3-12-6) F1-1-1-1-12からF1-3-12-12にF1の子孫線虫は1dのために成長しました。
F2-1-1-9からF2-3-12-9に対するF2の子孫線虫は1dに成長した。
F3-1-1-6からF2-3-12-6に対するF3の子孫線虫は1dに成長した。
17歳 36 (F1-1-1-1-14 から F1-3-12-14) 36 (F0-1-1-1-15 から F0-3-12-15、カウント後にクリア、オーバー) F0-1-1-15からF0-3-12-15のF0の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされる。これ以上F0の子孫はいません。
36 (F2-1-1-11 から F2-3-12-11) 36 (F1-1-1-1-12 から F1-3-12-12、カウント後にクリア) F1-1-1-12からF1-3-12-12にF1の子孫線虫は2dで成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F3-1-1-8 から F3-3-12-8) 36 (F2-1-1-9 から F2-3-12-9、カウント後にクリア) F2-1-1-9からF2-3-12-9にF2の子孫線虫が2dで成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F3-1-1-6 から F3-3-12-6、カウント後にクリア) F3-1-1-6からF3-3-12-6のF3の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F1-1-1-1-13 から F1-3-12-13) F1-1-1-1-13からF1-3-12-13に対するF1の子孫線虫は1dに成長しました。
36 (F2-1-1-1-10 から F2-3-12-10) F2-1-1-10からF2-3-12-10に対するF2の子孫線虫は1dに成長した。
36 (F3-1-1-7 から F3-3-12-7) F3-1-1-7からF2-3-12-7に対するF3の子孫線虫は1dに成長しました。
18歳 36 (F1-1-1-1-15 から F1-3-12-15) 36 (F1-1-1-1-13 から F1-3-12-13、カウント後にクリア) F1-1-1-13からF1-3-12-13のF1の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F2-1-1-1-12 から F2-3-12-12) 36 (F2-1-1-1-10 から F2-3-12-10、カウント後にクリア) F2-1-1-10からF2-3-12-10寒天の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F3-1-1-9 から F3-3-12-9) 36 (F3-1-1-7 から F3-3-12-7、カウント後にクリア) F3-1-1-7からF3-3-12-7寒天の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F1-1-1-1-14 から F1-3-12-14) F1-1-1-1-14からF1-3-12-14に対するF1の子孫線虫は1dに成長しました。
36 (F2-1-1-11 から F2-3-12-11) F2-1-1-11からF2-3-12-11に対するF2の子孫線虫は1dに成長した。
36 (F3-1-1-8 から F3-3-12-8) F3-1-1-8からF2-3-12-8に対するF3の子孫線虫は1dのために成長しました。
MGR研究では、T2'は今日T3'を再現し始めます。野生型C.エレガンスの寿命は15日として例示される。その後、T3'寿命の終わりはD33になります。
19歳 36 (F1-1-1-1-15 から F1-3-12-15、以上) 36 (F1-1-1-1-14 から F1-3-12-14、カウント後にクリア) F1-1-1-14からF1-3-12-14のF1の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F2-1-1-1-13 から F2-3-12-13) 36 (F2-1-1-1-11 から F2-3-12-11、カウント後にクリア) F2-1-1-11からF2-3-12-11のF2の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F3-1-1-10 から F3-3-12-10) 36 (F3-1-1-8 から F3-3-12-8、カウント後にクリア) F3-1-1-8からF3-3-12-8のF3の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F1-1-1-1-15 から F1-3-12-15) F1-1-1-1-15からF1-3-12-15にF1の子孫線虫は1dのために成長しました。
36 (F2-1-1-1-12 から F2-3-12-12) F2-1-1-12からF2-3-12-12に対するF2の子孫線虫は1dに成長した。
36 (F3-1-1-9 から F3-3-12-9) F3-1-1-9からF2-3-12-9に対するF3の子孫線虫は1dに成長しました。
20歳 36 (F2-1-1-1-14 から F2-3-12-14) 36 (F1-1-1-1-15 から F1-3-12-15、カウント後にクリア) F1-1-1-14からF1-3-12-14のF1の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。これ以上のF1子孫はいません。
36 (F3-1-1-11 から F3-3-12-11) 36 (F2-1-1-1-12 から F2-3-12-12、カウント後にクリア) F2-1-1-12からF2-3-12-12にF2の子孫線虫は2dで成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F3-1-1-9 から F3-3-12-9、カウント後にクリア) F3-1-1-9からF3-3-12-9にF3の子孫線虫は2dで成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F2-1-1-1-13 から F2-3-12-13) F2-1-1-13からF2-3-12-13に対するF2の子孫線虫は1dに成長した。
36 (F3-1-1-10 から F3-3-12-10) F3-1-1-10からF2-3-12-10にF3の子孫線虫は1dのために成長しました。
21歳 36 (F2-1-1-1-15 から F2-3-12-15) 36 (F2-1-1-1-13 から F2-3-12-13、カウント後にクリア) F2-1-1-13からF2-3-12-13のF2の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F3-1-1-12 から F3-3-12-12) 36 (F3-1-1-1-10 から F3-3-12-10、カウント後にクリア) F3-1-1-10からF3-3-12-10のF3の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F2-1-1-1-14 から F2-3-12-14) F2-1-1-14からF2-3-12-14に対するF2の子孫線虫は1dに成長した。
36 (F3-1-1-11 から F3-3-12-11) F3-1-1-11からF2-3-12-11に対するF3の子孫線虫は1dに成長した。
22歳 36 (F2-1-1-1-15 から F2-3-12-15、以上) 36 (F2-1-1-1-14 から F2-3-12-14、カウント後にクリア) F2-1-1-14からF2-3-12-14のF2の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F3-1-1-13 から F3-3-12-13) 36 (F3-1-1-1-11 から F3-3-12-11、カウント後にクリア) F3-1-1-11からF3-3-12-11にF3の子孫線虫は2dで成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F3-1-1-12 から F3-3-12-12) F3-1-1-12からF2-3-12-12に対するF3の子孫線虫は1dに成長した。
23歳 36 (F3-1-1-14 から F3-3-12-14) 36 (F2-1-1-1-15 から F2-3-12-15、カウント後にクリア) F2-1-1-15からF2-3-12-15のF2の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。これ以上のF2子孫は存在しません。
36 (F3-1-1-1-12 から F3-3-12-12、カウント後にクリア) F3-1-1-12からF3-3-12-12にF3の子孫線虫は2dで成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F3-1-1-13 から F3-3-12-13) F3-1-1-13からF2-3-12-13に対するF3の子孫線虫は1dに成長した。
24歳 36 (F3-1-1-15 から F3-3-12-15) 36 (F3-1-1-1-13 から F3-3-12-13、カウント後にクリア) F3-1-1-13からF3-3-12-13のF3の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F3-1-1-14 から F3-3-12-14) F3-1-1-14からF2-3-12-14に対するF3の子孫線虫は1dに成長しました。
25名 36 (F3-1-1-1-15 から F3-3-12-15、以上) 36 (F3-1-1-1-14 から F3-3-12-14、カウント後にクリア) F3-1-1-14からF3-3-12-14のF3の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
36 (F3-1-1-15 から F3-3-12-15) F3-1-1-15からF2-3-12-15にF3の子孫線虫は1dのために成長しました。
26歳 36 (F3-1-1-1-15 から F3-3-12-15、カウント後にクリア) F3-1-1-15からF3-3-12-15のF3の子孫線虫は2dに成長し、線虫を数えた後に寒天がクリアされます。
特に、MGR研究では、F3の最初の非露出子孫(すなわち、T3')がD18で生まれる。野生型C.エレガンスの寿命は15日として例示される。その後、T3'寿命の終わりはD33になります。
MGEとMGRの両方の研究は、線虫の寿命が長い日数をカバーします。

表 1: マーカーとその定義の一覧。

  1. MGE効果スタディの生殖と寿命を測定します。
    1. D0 で、ステップ 5.6 を繰り返します。寒天(それぞれに10の反復を持つ3つのグループ)をFx-a-b- c、xは生成番号を指し、aはグループ番号を指し、グループ番号(対照用は1、高濃度の場合は3)を指します。 );bは 1 から 10 までの反復を指します。と cは露出時間を指します (0 は開始を示します)。D0 の場合、寒天を F0-1-1-0 から F0-3-10-0 としてマークします。詳細については、表 1を参照してください。
    2. D1では、寒天の線虫の成長を確認し、マーカーをF0-1-1-0からF0-3-10-0に変更し、F0-1-1-1からF0-3-10-1に変更します。
    3. D2で寒天の線虫の成長を確認し、マーカーF0-1-1-2をF0-3-10-2に変更します。
    4. D3では、ステップ5.4から2つのNGM寒天を持つ12の新しいNGM寒天に各グループから24 F0線虫を選びます。寒天を F0-1-1-3 から F0-3-12-3 にマークします。
    5. D4では、ステップ5.4から新しいNGM寒天にピッキングして、F0-1-1-3からF0-3-12-3に2つの親線虫を転送します。新しい NGM 寒天を F0-1-1-4 から F0-3-12-4 にマークします。F0-1-1-3のマーカーをF0-3-12-3からF1-1-1に変更し、F0の子孫(すなわちF1)を再現開始してから1日目にF0の子孫を表します。
    6. D5では、解剖顕微鏡を使用して、線虫が2日間成長したF1-1-1-1からF1-3-12-1寒天に線虫を数えます。F1-1-1-1をF1-3-12-1にして、F2を連続して再現させます。
    7. ステップ5.4から新しいNGM寒天にピッキングして、F0-1-1-4からF0-3-12-4寒天に2つの親線虫を転送します。NGM 寒天を F0-1-1-5 から F0-3-12-5 としてマークします。F0-1-1-4のマークをF0-3-12-4からF1-1-1-2に変更し、F0の子孫(すなわちF1)を再現開始してから2日目にF0の子孫を表します。
    8. D6 では、F1-1-1-2 の線虫を F1-3-12-2 寒天に数えます。親線虫を F0-1-1-5 から F0-3-12-5 に F0-1-1-6 から F0-3-12-6 に転送します。F0-1-1-5のマーカーをF0-3-12-5からF1-1-1-3に変更し、F0の子孫(すなわちF1)を再現開始してから3日目にF0の子孫を表します。
    9. F1-1-1-1からF1-3-12-1に向けての線虫は3日間成長した。後続のMGE効果スタディでF2を再現するためにそれらを使用してください。同じ方法で、F2線虫を使用してF3を再現し、MGE効果スタディを継続します。
    10. 同じ方法で、2つの親線虫を毎日転送し、次の日に子孫線虫を数え、親線虫が6NGM寒天(すなわち、各群の全寒天の半分)で繁殖を停止するまで。
    11. 合計ブロッドサイズとして、再生期間全体の合計子孫数を計算します。最初の 3 日以内に子孫番号を使用して、親の最初の繁殖を表します。
    12. 親線虫再生が6NGM寒天で停止した日を使用して、再生期間を推定します。個々の親が生き残った日数をその寿命として使用します。
    13. F0と同じ方法で、F1の初期再生、再生期間、総ブロッドサイズと寿命を取得します。同様に、前述の手順を繰り返すことにより、F2(Fn)の再現および寿命情報を得ることができる。
  2. MGR効果研究における生殖と寿命を測定します。
    1. ステップ 5.4 からステップ 2.13 に変更された NGM 寒天を使用して、ステップ 7.2.4 を実行します。
  3. 生化学的指標を測定する。
    1. NGM寒天から線虫を無菌水で洗い流し、遠心管に集めます。線虫を30分間決済し、上清を捨てます。効果測定にはペレット内の線虫を使用します。
    2. 1.5 mL遠心管の線虫管に1mLの冷たいリン酸緩衝生理食塩分(PBS、pH 7.0)を加え、線虫を洗浄します。
    3. 4°Cで5分間10,000 x gで遠心分離機を、ピペットで慎重に上清を廃棄します。
    4. 液体窒素または-80°C冷凍庫でペレットを凍結します。
    5. 氷浴中の害虫を使用してペレットを均質化します。200 μL の氷冷 PBS を使用して、害虫を取り出す前に遠心管に残留液体を洗浄します。
    6. 4°Cで5分間10,000 x gで遠心分離し、商業キットで生化学物質の活性または量を決定するために上清を使用します(詳細は材料の表を参照)。
    7. サンプル中の総タンパク質(TP)の量を測定し、その結果を他の生化学的指標を表す分母として使用し、サンプル間の線虫数の差を排除できるようにします。
  4. 遺伝子発現を測定する。
    1. 手順 7.4.1 から 7.4.4 を繰り返します。製造元の指示21に従って、市販のRNA抽出キット(詳細については材料の表を参照)を使用して線虫試料から総RNAを分離する。
    2. 製造元の指示21に従って cDNA を合成するには、RNA を使用します。
    3. 製造元の指示に従ってSYBRグリーンRT-PCRキットを用いてリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)でcDNAサンプルを分析する(材料の表を参照)21。
    4. 選択した遺伝子の相対発現レベルを2-ΔΔCT法22により定量し、gdp-2(または他の参照遺伝子)の発現レベルを負の基準として扱う。

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Representative Results

ここでは、世代間(TG)、多世代暴露(MGE)および多世代残差(MGR)効果研究におけるC.エレガンスを用いて世代を超えた化学物質の効果を研究するためのプロトコルについて述べた。独自の研究成果を事例として紹介します。ある研究は、移動行動3に対する重金属のTG効果を提示する。他の2つの研究は、再生および生化学的および遺伝的指標の測定に対するスルホメトキサゾールおよびリンダンのMGEおよびMGR効果を提示する4,14.

重金属の移動挙動に及ぼすTG効果 C. エレガンス

カドミウム(Cd)、銅(Cu)、鉛(Pb)および亜鉛(Zn)の体曲げ頻度(BBF)のTG効果は、母体暴露後の線虫親(F0)およびその子孫(T1)3で研究された。BBFに対する金属の影響は、T1の阻害がF0よりも大きいことを示し、直接露出した親よりも胚にさらされた子孫の移動行動に対する重金属のより重篤な毒性を示した。環境的に現実的な濃度での重金属のTG効果は、母体暴露が後継世代の重金属汚染の危険性を増大させることができることを実証した。図 1を参照してください。

Figure 1
図 1: 出生前暴露後の線虫親(F0、ブランク)の体曲げ頻度に対するカドミウム(Cd)、銅(Cu)、鉛(Pb)および亜鉛(Zn)の影響(T1、シェーディング)。エラー バー = 標準エラー。* = コントロール、p < 0.05 とは大きく異なります。# = 低濃度、p < 0.05 とは大きく異なります。+はF0、p<0.05とはF1で有意に異なる効果を意味します。この数値は、許可を受けて Yu ら3から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

線虫の寿命と生殖に対するスルファムトキサゾール(SMX)のMGR効果

線虫の寿命および生殖対するスルファムトキサゾール(SMX)のMGR効果は、ゲステイン親(F0)、胚暴露子孫(T1)、生殖細胞生殖細胞暴露子孫(T2)、最初の非暴露子孫(T3)および3つについて研究された。次の世代(T4-T6)。結果は、生殖(対照の49%としての総雄大)が生殖細胞暴露(T2)に有意に影響を受け、T3からT6世代までの非暴露世代で毒性が持続することを示した(図2)。我々の知見は、抗生物質耐性への影響に加えて、抗生物質自体の長期的な影響に関する新たな懸念を提起した。

Figure 2
図 2:ブロッドサイズ((A)、対照のパーセンテージで表される)および初期再生((B))の露出した親とその子孫のC.エレガンス(F0、T1からT6、各濃度で左から右へ)。エラー バー = 標準エラー。a = ANOVA によるコントロールとは有意に異なります (p < 0.05);b = コントロールと同じ濃度で以前の世代とは大きく異なります (p < 0.05);c = コントロールと同じ世代の低濃度 (p < 0.05) とは大きく異なります。d = コントロールと同じ世代の以前の世代と同じ世代の低濃度 (p < 0.05) とは大きく異なります。e = 同じ濃度で前の世代と同じ世代の低濃度 (p < 0.05);f = 同じ濃度で前世代と有意に異なる(p < 0.05)。この数値は、許可を受けて Yu et14から変更されています。

線虫生化学および遺伝的指標に対するリンダンのMGEおよびMGR効果

リンダンのMGEおよびMGR効果(持続的な有機汚染物質[POP])は、関連するインスリン様経路における脂質代謝および遺伝的発現変化における主要な生化学物質について研究された4。結果は、リンダンがインスリンシグナル調節の乱れを伴うオベストゲン効果を示したことを示した(図3)。さらに、sgk-1(F0、F3、T1'およびT3')とakt-1(T1およびT3)シグナリングの間の変化は、異なる暴露世代からの線虫が許容値と回避のための異なる応答戦略を示したことを示した。

Figure 3
図 3: 異なる曝露経験を持つ線虫におけるインスリン様シグナル経路における主要遺伝子の発現レベルの変化→: 肯定的な規制;symbol : 否定的な規制;: 式アップレギュレーション;: 表現ダウンレギュレーション。この数字は、許可を受けて4.4でChenから変更されました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

記述されたプロトコルを正常に実行するためには、次の提案を考慮する必要があります。無菌環境で全体的な実験操作を実行します。不適切な操作は、大腸菌株の汚染、例えば、真菌およびダニは、C.エレガンスの正常な成長を妨げる可能性があり、したがって、実験結果に影響を与える可能性があります。C.エレガンスの栽培について説明するセクションでは、裸眼または顕微鏡でNGM寒天上のC.エレガンの成長尺度を観察する。寒天上のC.エレガンのスケールが地域の75%を超えた場合、または培養時間が1週間を超えた場合、C.エレガンスの過剰成長または人口減少を避けるために新しい接種を行う。同期のプロセスの前に、顕微鏡を使用してC.エレガンの成長を観察し、線虫の卵が寒天に広く分布しているときのプロセスを続けます。さらに、溶媒(例えば、ジメチルスルホキシド[DMSO])を使用する場合、その最終濃度が溶媒自体の悪影響を避けるために、ストック溶液中の濃度が1%未満でなければなりません。TG効果研究では、暴露時間が次世代の胚形成をカバーすることを確実にするために24時間を超える曝露期間が必要であり、その後の生成分離を容易にするために持続時間は96時間以内にする必要があります。寿命と生殖量を測定するために少量の線虫(通常は20以内)を使用してください。一方、生化学的および遺伝的調節指標の測定には、大量の線虫(通常は500以上)を使用します。したがって、十分な数のサンプルを確保するために、予備実験を行い、成熟したF0線虫が生殖を開始してから最初の24時間以内に生殖できる子孫の数を大まかに推定する。次に、進行中の多世代研究のために少なくとも200の子孫がいることを確認するために必要なF0線虫の数を決定します。

C.エレガンスとのTG研究の以前の報告と比較して、本実験プロトコルは、生命段階の選択をより考慮的であった。C.エレガンスでは、精子は後発卵性卵母細胞23を受精させるためにL4段階で形成される。したがって、精子形成および卵細胞形成期をカバーする暴露は、子孫に対するTG効果を研究するための特定のウィンドウを提供する。年齢同期卵は、暴露が各ライフサイクルの初めから全体的な期間をカバーすることを確実にするために、多世代効果研究に使用されます。以前の多世代研究と比較して、本実験プロトコルは、1〜2世代ではなく、複数の世代にわたって効果の測定を容易にしました。さらに、本プロトコルはMGEとMGR効果の両方を考慮し、これはMGEまたはMGR効果のみを測定した以前の研究よりも系統的である。

特に、本実験プロトコルでは考慮すべき問題がいくつかある。現在のプロトコルは、生成時間が約60時間で寿命が20日である野生型C.エレガンを採用しています。これにより、実験の全体的な持続時間はかなり長くなります(例えば、3世代以上の寿命に対するMGE効果研究は、少なくとも30日を必要とします)。時間を短縮するために、研究者は、短命の変異体線虫のような変異型C.エレガンを選択することができます。もう一つの問題は、細菌の殺害治療であり、線虫を健康に保つために必要な生きている状態24.また、紫外線殺しプロセスは、化学物質25の変化を導入する可能性があります。したがって、細菌に関する他の治療法を考慮する必要があり、特に不安定な化合物の場合は、調製または暴露プロセス中の化学変化を注意深く監視する必要があります。同時に、C.エレガンスがヘルマフロダイトであるという事実のほとんどは、毒性効果の性差を研究する上で限界があります。TG、MGEまたはMGR効果における性寄与を調査するためのさらなる改善が必要である。要約すると、提案されたプロトコルは、C.エレガンスを使用して毒性物質のTG、MGEおよびMGR効果を研究するために大きな意義があると予想される。

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Disclosures

著者らは、水質汚濁防止のための国家科学技術専攻プロジェクト(2017ZX07201004)と中国の国際科学技術協力プログラム(No.2016YFE0123700)による財政的支援に感謝しています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 agar powder OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 9002-18-0
79nnHT Fast Real-Time PCR System  Applied Biosystems 
96-well sterile microplate Costar?Corning?America
Autoclave sterilizer Tomy, Tomy Digital Biology, Japan
Biosafety cabinet LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China
calcium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10043-52-4
centrifuge  5417R Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Centrifuge tubes Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America
cholesterol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 57-88-5
Dimethyl sulfoxide VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America 67-68-5
disodium hydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7558-79-4
ethanol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 64-17-5
Filter Thermo, Thermo Fisher Scientific, America
incubator YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China
inoculating loop
K2HPO4•3H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 16788-57-1
kraft paper
Mcroplate Reader Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America
MgSO4•7H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10034-99-8
Microscopes XTL-BM-9TD BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China 
Petri dishes
Pipette Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Potassium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7447-40-7
potassium dihydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7778-77-0
Qiagen RNeasy kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States
sodium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7647-14-5
sodium hydroxide Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 1310-73-2
sodium hypochlorite solution Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China 7681-52-9
tryptone OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 73049-73-7
yeast extract OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 119-44-8

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References

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