Toxicants Trans ve çok jenerasyonel etkileri okumak için Caenorhabditis elegans kullanma

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Sürekli kimyasalların Trans-ve çok jenerasyonel etkileri, çevre ve insan sağlığı üzerinde uzun vadeli sonuçlarını yargılamak için esastır. Ücretsiz yaşam nematod Caenorhabditis eleganskullanarak Trans-ve çok jenerasyonel etkileri incelemek için yeni ayrıntılı Yöntemler sağlıyoruz.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Li, Z., Ai, F., Zhang, J., Yu, Z., Yin, D. Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants. J. Vis. Exp. (149), e59367, doi:10.3791/59367 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kimyasalların toksisiteleri hakkında bilgi, uygulama ve atık yönetiminde esastır. Düşük konsantrasyonlarda kimyasallar için, uzun vadeli etkileri çok çevre ve insan sağlığı üzerindeki sonuçlarını yargılamak önemlidir. Uzun vadeli etkileri göstererek, kimyasalların son çalışmalarda nesiller boyunca etkileri yeni bir anlayış sağlar. Burada, biz serbest yaşam nematod Caenorhabditis eleganskullanarak birden fazla nesiller üzerinde kimyasalların etkilerini incelemek için protokoller açıklanmaktadır. İki yönü sunulmaktadır: (1) Trans-jenerasyonel (TG) ve (2) çok jenerasyonel etkisi çalışmaları, ikincisi çok jenerasyonel pozlama (MGE) ve çok jenerasyonel kalıntı (MGR) etkisi çalışmalarda ayrılır. TG etkisi çalışma ebeveynler için kimyasal maruz yavru üzerinde herhangi bir kalıntı sonuçları neden olabilir olup olmadığını belirlemek için basit bir amaç ile sağlam. Etkileri ebeveynler üzerinde ölçülen sonra, sodyum hipoklorit çözümleri ebeveynler öldürmek ve yavru üzerinde etki ölçümü kolaylaştırmak için yavru tutmak için kullanılır. TG efekt çalışması, çocuklarının ebeveyn kirleticiler maruz kaldığında etkilenir olup olmadığını belirlemek için kullanılır. MGE ve MGR efekt Etüdü sürekli jenerasyonel pozlama nesiller boyunca yavru uyarlanabilir yanıtlar neden olup olmadığını belirlemek için kullanılan sistematik. Her nesildeki efekt ölçümünü kolaylaştırmak için nesiller ayırt etmek için dikkatli pick-up ve transfer kullanılır. Ayrıca lokomotif davranışlarını, üreme, ömür, biyokimyasal ve gen ifade değişikliklerini ölçmek için protokoller birleştirdik. Bazı örnek deneyler de Trans-ve çok jenerasyonel etkisi etütler göstermek için sunulmaktadır.

Introduction

Kimyasalların uygulama ve atık yönetimi, belirli konsantrasyonlarda etkilerinin bilgilerine son derece bağlıdır. Özellikle, zaman etkileri ve konsantrasyonları arasında başka bir temel unsurdur. Demek ki, kimyasallar, özellikle de gerçek ortamlarda düşük konsantrasyonlarda, ölçülebilir etkileri provoke etmek için zaman gerekir1. Bu nedenle, araştırmacılar hayvan deneylerinde pozlama süresinin farklı uzunlukları düzenlemek ve hatta tüm yaşam döngüsü kapsayacak. Örneğin, fareler nikotin için maruz kaldı 30, 90 veya 180 zehirli etkileri incelemek için gün 2. Ancak, bu tür pozlama süreleri hala kirleticilerin uzun vadeli etkilerini (örneğin, kalıcı organik kirleticiler [POPs]) çevre organizmaların nesiller boyunca sürebilir için yeterli değildir. Bu nedenle, nesiller üzerinde etkileri üzerinde çalışmalar daha fazla ilgi kazanıyor.

Jenerasyonel etki çalışmalarında iki ana yönü vardır. İlki Trans-jenerasyonel (TG) etkisi çalışma, anne-babalar için kimyasal pozlama yavru3herhangi bir sonuca neden olabilir olup olmadığını test edebilirsiniz. İkincisi, hem pozlama hem de kalıntı etkileri ile ilgili hususlar ile daha sistematik olan çok jenerasyonel bir etki çalışmadır. Bir yandan, çok jenerasyonel pozlama (MGE) efektleri, hayvanlarda uzun vadeli zorlu ortamlarda uyarlanabilir tepkiler göstermek için kullanılır. Öte yandan, çok jenerasyonel kalıntı (MGR) etkileri maruz kaldıktan sonra uzun vadeli kalıntı sonuçları göstermek için kullanılır, maternal pozlama ilk yavrularını embriyo maruz kalma ve ikinci germ-Line pozlama ile birlikte olduğundan ilk nesil olarak üçüncü yavrusu tamamen pozlama4yapar yavru.

Memeliler (örn. fareler), özellikle insan varlıklarıyla ilgili olarak toksisite çalışmalarında model organizmalar olmakla birlikte, jenerasyonel etkilere yönelik çalışma uygulamaları oldukça zaman alıcı, pahalı ve etik olarak 5ile ilgili. Buna göre, kabuklu Daphnia magna6, böcek Drosophila melanogaster7 ve zebra balığı Danio rerio8dahil organizmalar, alternatif seçimler sağlar. Ancak, bu organizmaların ya insan, ya da çalışmalar belirli ekipman gerektiren benzerlikleri eksikliği.

Caenorhabditis elegans kısa bir yaşam döngüsü ile küçük bir serbest canlı nematod (yaklaşık 1 mm uzunluğunda) (20 °c ' de yaklaşık 84 h)9. Bu nematod insanlar için muhafazakar birçok biyolojik yolları paylaşır, ve bu nedenle yaygın çeşitli stresler veya toksisitan etkileri göstermek için istihdam edilmiştir10. Özellikle,% 99,5 nematitlerin bu organizmalar jenerasyonel etkileri, örneğin, ağır metaller ve sülfonamidler3,11, MGE etkileri TG etkileri eğitim çok uygun hale Hünsa altın Nanopartiküllerin ve ağır metallerin12 ve sıcaklık13, MGR sülfonamid14etkileri, ve Gamma ıŞıNLAMA hem MGE ve MGR etkileri15 ve Lindane4. Ayrıca, kimyasal maddelerin etkileri arasında karşılaştırılabilir sonuçlar bulundu (örneğin, Zearalenone) farelerin geliştirilmesi ve üreme üzerinde ve C. elegans16,17, hangi ayırt etmek için bir avantaj sağlayacak Bu küçük hayvandan insana etkileri.

Hem TG hem de MG efekt çalışmaları zaman alıcı ve dikkatli tasarım ve performansa ihtiyaç vardır. Özellikle, söz konusu çalışmalarda yaşam aşaması seçimleri, pozlama koşulları ve nesil ayırma yöntemlerinde farklılıklar vardı. Bu tür farklılıklar sonuçları arasında doğrudan karşılaştırma engelledi ve sonuçların daha fazla yorumlanması engel. Bu nedenle, TG ve MG etkileri çalışmaları rehberlik etmek için üniforma protokolleri kurmak zorunludur, ve aynı zamanda uzun vadeli sonuçları çeşitli toksisitan veya kirleticiler benzer desenleri ortaya çıkarmak için daha büyük bir resim sağlamak için. Mevcut protokollerin amacı, C. elegansile Trans-ve çok jenerasyonel etkileri araştıran açık çalışma süreçleri gösterecektir. Protokoller, hidrokarbonlar veya kirleticilerin uzun vadeli etkilerini incelemek isteyen araştırmacıların yararına olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. kültür E. coli OP50

  1. 100 mL suda 4 gr sodyum hidroksit çözünerek 1 M sodyum hidroksit çözeltisi hazırlayın.
  2. 10 gr Tripton, 5 g maya ekstresi ve 1 l konik Flask içinde 1 l ultra saf su ile 10 gr sodyum klorür çözünerek lysogeny suyu (lb) orta hazırlayın. 1 M sodyum hidroksit çözeltisi ile pH 'yi 7,0 olarak ayarlayın.
  3. Her biri 50 ml Orta ile 20 konik şişeler (maksimum izin verilen hacim: 100 ml) içine adım 1.2 den lb sıvı orta aliquot. Konik flsorlarla Kraft kağıdıyla Kapla.
  4. LB sıvı ortamını 121 °C ve 0,105 MPa 'da 20 dakika sterilize edin. LB ortamını oda sıcaklığına kadar soğutur.
  5. Pipet 200 bakteriyel süspansiyonlardan μL (bkz. Adım 1,8) veya bir Birmanya döngü kullanarak Agarlar (adım 2,14) küçük bir koloni seçmek, lb orta yerleştirin.
  6. 24-48 h için 37 °C ' de 150 RPM 'de sallayarak LB ortamını inküt. LB orta kahverengi şeffaf bir sıvı bulanık Haki renkli süspansiyon değişecek.
  7. Toplam flsorların% 80 ' inden gelen bakteriyel süspansiyonlar, 2,11 adımda kullanılmak üzere nematod gıda olarak E. coli OP50 sağlamak için kullanın.
  8. 4 °C ' de bir buzdolabında bakteriyel süspansiyonlar içeren flsorların geri kalanını saklayın. Pipet 200 μL LB süspansiyonları taze LB Orta (adım 1,4) üst tarafına ve sonraki kuluçl için adım 1,6 tekrarlayın.

2. kültür C. elegans

Not: kültür C. elegans kullanarak adımları 2,1 başına 2,11 standart yöntemler18dayalı.

  1. Çözünür 22,8 g K2HPO4• 3H2O içinde 100 ml steril distile su.
  2. Çözünür 6,8 g KH2Po4 in 50 ml steril damıtılmış su.
  3. 1 M K2HPO4-KH2Po4 tampon (pH 6,0, 150 mL toplam) hazırlamak için adımlar 2,1 ve 2,2, mix çözümleri.
  4. Hazırlamak 1,0 M MgSO4 mgso41,232 g çözünerek • 7h2O 5 ml steril damıtılmış su, ve sterilizasyon bir 0,22 μm steril tek kullanımlık membran filtre aracılığıyla steril bir kap içine solüsyonu filtreleme.
  5. 1 M CaCl2 ' ye 0,554 g CAcl2 ' de 5 ml steril damıtılmış suda çözünerek hazırlayın ve çözümleri 0,22 μm steril tek kullanımlık membran filtresi ile steril bir kabın içine filtreleyerek sterilize edin.
  6. 5 mL mutlak etanol içinde 0,025 g kolesterol çözünerek 1 M kolesterol çözeltisi hazırlayın ve sterilizasyon bir konteyner içine 0,22 μm steril tek kullanımlık membran filtre aracılığıyla solüsyonu filtreleme tarafından sterilize.
  7. Nematod büyüme orta (NGM) agar ekleyerek hazırlayın 17 agar toz g, 2,5 g pepton ve 3 gr sodyum klorür 1 l konik Flask içeren 1 l ultra saf su. Ekleme 25 mL K2HPO4-KH2Po4 adım 2,3 çözüm.
  8. NGM agar 'dan 121 °C ' de adım 2,7, 20 dakika boyunca 0,105 MPa ile sterilize edin.
  9. NGM agar 'a yaklaşık 50 °C ' ye kadar serin, 1 mL 1 M MgSO4, 1 m CAcl2ve 5 mg/ml kolesterol-etanol çözümünü 2,4 ile 2,6 arasında orta ve iyice karıştırın.
  10. 100 steril Petri yemekleri (6,0 cm çapı) içine çanak başına ~ 10 mL NGM agar orta dökün. Katı agar oluşturmak için oda sıcaklığına Petri yemekleri orta serin.
  11. Pipet 170, adım 1,7 ' den gelen bakteriyel süspansiyonların μL 'i ile yukarıda belirtilen NGM agar 'a steril bir uç kullanarak. NGM agar yüzeyi üzerinde eşit olarak LB orta dağıtmak için biraz TMT agar sallayın.
  12. 8-12 h için 37 °C ' de üst tarafla birlikte NGM agar 'a bakteriyel çim oluşturmak için inoculate.
  13. Adım 2,15 veya 2,19 yılında Kültür nematdes için adım 2,12 bakteriyel çim ile agar çoğunu kullanın.
  14. 4 °c ' de buzdolabında su buharlaşma ve kontaminasyonu önlemek için 1 veya 2 Agarlar aşağı yukarı-yan aşağı muhafaza böylece kontaminasyonun bakterileri sürdürmek için.
  15. Ne zaman çorap NGM Agarlar üzerinde 2.000 az nematdes (önceki deneyler veya diğer laboratuarları yetenekli), bir steril ucu ile C. elegans içeren NGM agar altıncı kesim ve yeni hazırlanan NGM Agarlar üzerine bakteri ile transfer (adım 2,13). NGM Agarlar 'tan sonraki kültür için 22 °c ' lik kuluçside aşağı doğru tutun.
  16. Eğer çorap NGM agar üzerinde 2.000 ' den fazla nematdes varsa, santrifüjler içine 2 mL steril su ile NGM agar nematid floş. 2 mL su girişi yaklaşık 1,5 mL çıktıya neden olacaktır.
  17. Nematlerin santrifüjlere 30 dakika boyunca yerleşmesine izin verin. pipetleme ile süpernatanlarında 1 ml atın ve Pelet yıkamak için her tüp içine 1 ml steril su ekleyin (yani, nematdes).
  18. Santrifüj tüplerinde nematlerin 30 dakika boyunca yerleşin. pipetleme ile süpernatanlarında 1 ml atın. Nematdes pelletini her tüp içine steril su 1 ml ekleyin.
  19. Nematod süspansiyonları (yaklaşık 1,5 ml toplam), her yeni NGM agar 'da (adım 2,13), toplam olarak 8-10 yeni NGM Agarlar yapımında 150 μL pipetleme ile dağıtın.
  20. NGM Agarlar 'ı adım 2,19 ' dan sonraki kültür için 20 °c ' lik kuluçside ve sonra yukarı tarafı aşağı doğru tutun.
  21. Her üç günde bir adım 2,15 veya adım 2.16-2.20 yineleyin.

3. senkronize yumurta ve L3 larvaları C. elegans hazırlayın

  1. Her NGM agar 'da 2 ml steril su ile yaklaşık 1,5 ml 'lik bir çıktı elde ederek, Nm Agarlar 'dan steril santrifüjler içine Gravid nematdes ve yeni üretilen yumurtaları temizleyin.
  2. Santrifüj tüplerinde nematdes 30 dakika boyunca yerleşin ve sonra pipetleme ile süpernatanlarında% 85 atın.
  3. NaOH 0,6 g ve NaOCl 5 mL (% 4-6 aktif degradeler, Ayrıntılar için malzeme tablosuna bakın) Ile 25 ml su ile% 1 ve NaOCl için nna0,5 Oh getirmek için sodyum hipoklorit solüsyonları hazırlayın.
  4. 7 kat V0 ' dan (adım 3,3, yani 1:7 hacim oranı)19' dan gelen sodyum hipoklorit çözeltileri ile adım 3,2 (hacmi v0olarak işaretle) ile Pelletlerin karışımı.
  5. Santrifüjler her 2 dk için 10-15 dk larvaları ve yetişkin nematdes Lyse için sallayın; nematod süspansiyonların rengi bulanıklığını temizlemek için dönecek.
  6. Tüpleri 20 °C ' de 3 dakika 700 x g 'de Santrifüjden çıkarın ve sonra süper natantları pipetleme ile atın.
  7. Yaş senkronize yumurta yıkamak için steril su 5 kat V0 Pellet resuspend. 700 x g 'de 20 °c ' de 3 dakika Santrifüjden sonra süper natantları atın.
  8. 3,7 adım iki kez yineleyin.
  9. Yaş senkronize yumurta yeniden pelletini tüpler içine 1 kat V0 steril su ekleyin.
  10. Yumurta süspansiyonları, 2,13 adımda bakteriyel çim ile her yeni NGM Agarlar üzerine pipetleme 50 μL tarafından dağıtın. NGM Agarlar 'ı 30 dakika boyunca 20 °c ' lik inküyörün üst tarafında tutun, su buharlaştırıcı veya bakteriyel çim tarafından adsoryat sağlar. Sonra, NGM Agarlar yukarı-yan aşağı sonraki kültür için olun. Zaman yumurta zaman olarak işaretle (Tyumurta).
  11. 1 L su içinde 3 gr NaCl ve 2,36 g KCl çözünerek K-orta hazırlayın. Orta 121 °C ve 0,105 MPa 'da 20 dakika sterilize edin ve oda sıcaklığına kadar soğutur.
  12. TEgg'den sonra 36 h 'ye ulaştığında, nematdes L3 larva aşamasına (L3 nematdes)20' ye ulaşacaktır. Her NGM agar üzerinde 2 ml steril su ile, yaklaşık 1,5 ml çıktı elde ederek, NGM Agarlar 'dan santrifüjler içine nematid temizleyin.
  13. 30 dakika için bir yerleşme sonra,% 85 yerine süper natants (pipetleme tarafından) K-Orta 2 h cesaret3gıda sindirmek için.
  14. Süpernatantları atın. K-Orta (adım 3,11) kullanarak nematod süspansiyonları 100 μL başına yaklaşık 200 nematodlar için sonraki deneyler için ayarlayın.

4. Trans-jenerasyonel efekt çalışması için C. elegans kullanın

  1. 5 konsantrasyon seviyesi ve bir solvent veya mutlak kontrol, yani toplam 6 grup ile kimyasal çözümler hazırlayın.
  2. Kenar efektlerini önlemek için her grupta (örneğin, toplam 60 kuyu) bir 96-iyi steril mikroplakanın orta alanına çoğaltır olarak 10 kuyu ile 100 μL kontrol veya kimyasal çözeltiler ekleyin.
  3. Adım 3,14 ile K-orta adım 3,11 ile 10 kat tarafından nematod süspansiyonları seyreltilmeli. 60 kuyuların her biri için adım 4,2 100 μL nematod süspansiyonları ekleyin. Saati t0olarak işaretle.
  4. Zaman ulaştığında 24 h sonra t0, Kont yaşam ve ölü nematdes kuyular içinde. Median ölümcül konsantrasyonu hesaplayın (LC50).
  5. LC50 değerlerinin% 10 ' unda 5 konsantrasyonda bir dizi hazırlayın.
  6. 100 μL kontrol veya kimyasal çözümler (adım 4,5) ile 10 kuyularla (örneğin, toplam 60 kuyuları) her grupta çoğaltır olarak, bir 96-iyi steril mikroplakanın orta alanına kenar efektlerini önlemek için ekleyin.
  7. Yaklaşık 200 L3 nematid (adım 3,14) içeren K-orta 100 μL 'yi, adım 4,6 ' den her 60 kuyuya ekleyin. Saati T0olarak işaretle.
  8. T0' dan bu yana 24 ila 96 h pozlama gerçekleştirin.
  9. Maruz kaldıktan sonra, her grupta beş kuyudan nematid toplamak, pipetleme (örn. Toplam 6 tüp) ile 1,5 mL santrifüjli borular haline gelmiştir.
  10. 30 dakika nematdes yerleşmek, pipetleme ile süpernatanlarında atmak, ve pelletini ve sterilize su 1 ml altında nematdes yıkayın.
  11. Nematdes 30 dakika için yerleşmek, pipetleme ile süpernatanlarında atmak ve gösterge ölçümleri için alt nematodlar kullanın (Bölüm 7) F0 olarak işaretlenmiş maruz ebeveyn nesil bakın.
  12. Toplamak, yerleşmek ve yıkayın (resuspending tarafından) adım 4,10 göre 4,9 adımda her grupta kalan beş kuyudan nematdes.
  13. 30 dakika için 4,12 adım nematdes yerleşmek pipetleme ile süpernatanlarında atmak ve nematdes yeniden pelletini için 100 μL steril su ekleyin. Nematod süspansiyonları, adım 2,13 ' dan gelen bakteriyel çim ile yeni hazırlanan üç NGM Agarlar üzerine eşit olarak aktarın.
  14. 36 h için nematinleri yerçekimi haline getirmek ve 3.1-3.9 adımlarına göre yaş senkronizasyonu gerçekleştirme. 36 h için adım 2,13 ' dan gelen bakteriyel çim ile ilgili NGM Agarlar üzerinde senkronize yumurta inkük.
  15. Adım 4,14 ' dan NGM Agarlar üzerindeki nematozları altı santrifüj tüplere boşaltın.
  16. Nematdes 30 dakika için yerleşmek ve pipetleme ile süpernatanlarında atın. Resuspend ve sterilize su 1 mL ile Pellet yıkayın.
  17. Nematdes 30 dakika için yerleşmek ve pipetleme ile süpernatanlarında atın. T1 olarak işaretlenmiş yavru nesil (bkz. Bölüm 7) gösterge ölçümleri için altta nematdes kullanın.

5. çoklu jenerasyonel pozlama (MGE) efekt çalışması için C. elegans kullanın

  1. Mix 99,0 ml NGM Agarlar (adım 2,9) ile 1 ml kontrol veya kimyasal çözeltiler (mevcut protokolde düşük ve yüksek konsantrasyonlarda örnek olarak, yani toplam üç grup).
  2. Yaklaşık 10 mL NGM agar orta yemek başına adım 5,1 içine 100 steril Petri yemekleri (6,0 cm çap) içine dökün. Katı agar oluşturmak için oda sıcaklığına Petri yemekleri orta serin.
  3. Adım 2,11 olarak agar üzerinde pipet bakteriyel süspansiyonlar.
  4. Petri yemeklerinden üst kapakları bir kenara bırakın ve bakteriyel çim UV ışığa maruz (145 μW/cm2) Biyogüvenlik kabine 15 dakika.
  5. Bir Birmanya döngü kullanarak küçük bir koloni seçin, adım 1,4 Agarlar gelen lb orta yerleştirin. 37 °C ' de 150 RPM hızda sallayarak LB orta inküye 24 h ihmalkâr bakteriyel büyümesini onaylamak için, öldürme adım 5,4 doğrulama.
  6. Adım 3,9 ' dan Agarlar üzerine yaş senkronize yumurta pipet (adım 5,4). Üst nesil F0 pozlama başlangıcın işaretle ve gün 0 (D0) olarak işaretleyin.
  7. 20 °c ' de 3 d için Agarlar 'ın kulyası. Sonra (yani, D3), F0 etkileri ölçmek için olgun nematdes kullanın (Bölüm 7 bakın).
  8. Ayrıca D3, yeni NGM Agarlar üzerine F0 olgun nematdes Pick (adım 5,4) bir cam çubuk kullanarak, kimin sonu bir halka içine bükülmüş bir insan yapımı Fiber Tel ile donatılmıştır.
  9. D4 üzerinde, seçin ve NGM agars olgun F0 nematdes atın. İkinci nesil pozlama deneyimi için F1 olarak bu 24 h (D3 dan D4) içinde yeni yumurtadan yavru nematodlar işaretle.
  10. D6 üzerinde, 3 gün boyunca pozlama yaşadı F1 olgun nematdes, ölçü Endeksleri (Bölüm 7 bakın).
  11. D9 üzerinde, 5.8-5.10 adımlarını yineleyin, F2 solucanlarını çoğaltmak ve F2 nematdes üzerindeki efektleri ölçmek için F1 nematodlar kullanın.
  12. D12 üzerinde, adım 5,11 yineleyin, F3 solucanları çoğaltmak ve F3 nematdes üzerindeki efektleri ölçmek için F2 nematodlar kullanın. Aynı şekilde, yavru çoğaltmak ve nTH yavru nesil (fn) üzerinde MGE etkileri ölçmek.

6. Multi-jenerasyonel kalıntı (MGR) efekt çalışması için C. elegans kullanın

  1. 5.1-5.7 arasındaki adımları yineleyin. D3 üzerinde, ilave kimyasallar olmadan yeni NGM Agarlar üzerine F0 olgun nematdes Pick (adım 2,13).
  2. D4 üzerinde, seçin ve olgun F0 nematdes atın. Bu 24 saat içinde T1 nematdes olarak yeni yumurtadan yavru nematdes işaretle.
  3. D6 üzerinde, 3 gün boyunca yetiştirilen T1 olgun nematid 'in (Bölüm 7 ' ye bakın) endeksini ölçer.
  4. D9 üzerinde, 6.2-6.3 adımları yineleyin, T1 nematdes T2 nematodlar çoğaltmak ve T1 nematodlar etkilerini ölçmek için kullanın.
  5. D12 üzerinde, 6,4 adımları yineleyin, T2 nematdes çoğaltmak ve T2 nematodlar etkileri ölçmek için T2 nem kullanıcılar kullanın. Aynı şekilde, yavrularını çoğaltmak ve nTH yavru nesil üzerinde MGR etkilerini ölçmek (TN) F0 nematdes, ya da nTH yavru (TN ') FN nematodlar adım 5,12.

7. ölçme göstergeleri

  1. Lokomotif davranışını ölçmek.
    1. Steril su kullanarak NGM Agarlar kapalı nematid Flush ve santrifüj tüpler içine toplamak. 30 dakika boyunca nematdes yerleşmek, süpernatanlarında atmak ve efekt ölçümü için PELLETLER nematdes kullanın.
    2. 1 ml steril su ile Pelet içinde nematdes resuspend ve adım 2,10 gelen bakteriyel çim olmadan NGM Agarlar üzerine pipet.
    3. (Sayısı) vücut bükme frekansı (BBF) bir 60 s aralığı içinde seyahat yolunun dikey yönü boyunca farinks arka ampulün yönünü değiştirir zaman anlamına gelir için nematdes puan için bir diseksiyon mikroskop kullanın.
    4. Geri dönüşler ve Omega dönüş (OT) 60 s aralığında dahil olmak üzere 90 üzerinde seyahat yönü değiştiğinde zaman anlamına gelir ters hareket (RM) puan için diseksiyon mikroskop kullanın. OT, nematod 'un kafası dokunduğunda ya da neredeyse kuyruğuna dokunduğu zaman, Yunan harfi Omega (Ω) gibi Nematot şeklini alma hareketini ifade eder.
      Not: her deneysel çoğaltılan her tedavi için en az 6 nematid incelenmiştir.
MGE (F0-F3) için örnekler, 3 Grup (bir kontrol ve iki pozlama tedavisi) ile üreme ve ömür üzerinde etkiler.
Gün MGE çalışması için NGM agar numarası Açıklama
Ömrü Üreme
0 30 (F0 pozlama) Her grup için 10 çoğaltır, F0-1-1-0 için F0-3-10-0 olarak işaretlenmiş, son basamak ile hayatta kalma günlerini göstermek için.
1 30 (F0 1 d hayatta) F0-1-1-0-F0-3-10-0 için F0-1-1-1 için F0-3-10-1 olarak değiştirilmesi gerekir.
2 30 (F0 2 d hayatta) F0-1-1-1-F0-3-10-1 için F0-1-1-2-F0-3-10-2 arasında değiştirilmelidir.
3 d 'ye kadar F0 nematdes transferine gerek yok.
3 30 (F0 hayatta 3 d, nematdes transfer ve toplama sonra temizlenmiş) 3 d sonra, F0 nematdes olgun ve 36 yeni NGM Agarlar (her agar 2 nematid ile) onların hayatta kalma ve üreme gözlemlemek için kullanılır.
36 (F0-1-1-3-F0-3-12-3) F0 nematid sayısını ayarlamak için ön deneyler yapılmalıdır, en az 200 çok jenerasyonel operasyonlar başarılı için yavru güvence.
Özellikle, MGR etkileri incelenir, F0 nematid kimyasal pozlama olmadan net NGM Agarlar üzerine transfer edilmelidir, ve T1 başlangıç olarak belirtilmelidir.
F0 nematlerin çoğu kimyasal ve genetik endeksleri ölçmek için toplanır ve F0 'deki 30 Agarlar temizlenir.
4 36 (F0-1-1-4-F0-3-12-4) 36 (F1-1-1-1-F1-3-12-1) Kullanım ömrü ve üreme üzerinde ölçüm her gün transfer gerektirir.
F0-1-1-3-F0-3-12-3 arasındaki üst nematdes, F0-1-1-4-F0-3-12-4 olarak işaretlenmiş yeni NGM Agarlar üzerine çekilecektir.
F0-1-1-3-F0-3-12-3 Agarlar içinde kalan yavru nematdes (örn., MGE 'de F1, veya MGR T1) 1 d için büyüdü ve işaretçiler F1-1-1-1 için F1-3-12-1 olarak değiştirilir. Bu Agarlar da günlük transfer ile F1 ömrünü izlemek için kullanılır.
5 36 (F0-1-1-5-F0-3-12-5) 36 (F1-1-1-2-F1-3-12-2) F1-1-1-1-F1-3-12-1 Agarlar üzerinde nematdes 2 d için büyüdü ve kolayca gözlemlenebilir hale gelir ve Nematodlar sayılır, ve işaretçileri F1-1-1-2 için F1-3-12-2 olarak değiştirilir.
36 (F0-1-1-4-F0-3-12-4) F0-1-1-4-F0-3-12-4 arasında bulunan yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
6 36 (F0-1-1-6-F0-3-12-6) 36 (F0-1-1-4 için F0-3-12-4, sayılan sonra temizlenmiş) F1-1-1-2-F1-3-12-2 Agarlar üzerinde nematodes 3 d 'de büyüdü ve işaretçiler F1-1-1-3 ' e F1-3-12-3 ' e değiştirildi. Özellikle, F1 nematdes bu gün F2 çoğaltmak başlar, F1 nematdes yeni NGM Agarlar üzerinde F2-1-1-0 için F1-3-12-0 yapmak transfer edilmelidir. MGR çalışmaları için T2 bugün başlayın.
36 (F1-1-1-3-F1-3-12-3) 36 (F0-1-1-5-F0-3-12-5) Bu kimyasal pozlama ile gecikebilir ve bu nedenle daha sonraki nesiller için yeterli nematit sağlamak için her denemede esnek değişiklikler yapılmalıdır.
36 (F2-1-1-0-F1-3-12-0) F0-1-1-4-F0-3-12-4 Agarlar üzerinde bulunan yavru nematler 2 d için büyüdü ve nematlerin sayılması sonrasında Agarlar temizlenir.
F0-1-1-5-F0-3-12-5 arasında bulunan yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
7 36 (F0-1-1-7-F0-3-12-7) 36 (F0-1-1-5 için F0-3-12-5, sayılan sonra temizlenmiş) F0-1-1-5-F0-3-12-5 Agarlar üzerindeki yavru nematler 2 d için büyüdü ve nematdes saydıktan sonra Agarlar temizlenir.
36 (F1-1-1-4-F1-3-12-4) 36 (F0-1-1-6-F0-3-12-6) F1-1-1-1 ' e F1-3-12-1 Agarlar, F0-1-1-4-F0-3-12-4 Agarlar ve F0-1-1-5 ' e F0-3-12-5 arasında toplam nematod numarası F0 ilk üreme hesaplamak için kullanılır.
36 (F2-1-1-1-F2-3-12-1) F0-1-1-6-F0-3-12-6 arasında bulunan yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
F2-1-1-0-F1-3-12-0 arasında F2 nematdes 1 d için büyüdü ve işaretçileri F2-1-1-1 ' e F2-3-12-1 olarak değiştirilir.
8 36 (F0-1-1-8-F0-3-12-8) 36 (F0-1-1-6 için F0-3-12-6, sayılan sonra temizlenmiş) F0-1-1-6-F0-3-12-6 Agarlar üzerinde bulunan yavru nematler 2 d için büyüdü ve nematlerin sayılması sonrasında Agarlar temizlenir.
36 (F1-1-1-5-F1-3-12-5) 36 (F0-1-1-7-F0-3-12-7) F0, F0-1-1-7 ' d e F0-3-12
36 (F2-1-1-2-F2-3-12-2) 36 (F1-1-1-4-F1-3-12-4) F1-1-1-4, F1-3-12-4 Agarlar üzerinde F1 yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F2-1-1-1-F2-3-12-1, F2-1-1-2 için F2-3-12-2 ' den sonra sayılan) değiştirildi F2-1-1-1-F2-3-12-1 için F2 nematdes 2 d için büyüdü, nematodlar sayılır ve işaretçileri F2-1-1-2 için F2-3-12-2 değiştirilir.
9 36 (F0-1-1-9-F0-3-12-9) 36 (F0-1-1-7 için F0-3-12-7, sayılan sonra temizlenmiş) F0, F0-1-1-7 ' d e F0-3-12-7 Agarlar 'a kadar olan yavru nematid 2 ' ye büyüdü ve Agarlar nematdes sayıldığı andan sonra temizlenir.
36 (F1-1-1-6-F1-3-12-6) 36 (F1-1-1-4-F1-3-12-4 için, sayılan sonra temizlenmiş) F1-1-1-4 ' e F1-3-12-4 Agarlar üzerinde F1 yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F2-1-1-3-F2-3-12-3) 36 (F0-1-1-8-F0-3-12-8) F0 ' in F0-1-1-8 ' e F0-3-12-8 Agarlar 'ın yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F3-1-1-0-F3-3-12-0) 36 (F1-1-1-5-F1-3-12-5) F1-1-1-5 ' e F1-3-12-5 Agarlar üzerinde F1 'in yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
F2-1-1-2-F2-3-12-2 arasında F2 nematdes 3 gün boyunca büyüdü ve işaretçileri F2-1-1-3 ' e F2-3-12-3 ' e değiştirilir. F2 nematdes bugün yeniden başlar ve 36 yeni NGM Agarlar 'a aktarılır ve F3-1-1-0 ile F3-3-12-0 arasında işaretlenir. MGR çalışmaları için T3 bugün başlar.
10 36 (F0-1-1-10-F0-3-12-10) 36 (F0-1-1-8 için F0-3-12-8, sayılan sonra temizlenmiş) F0 ' in F0-1-1-8 ' e F0-3-12-8 Agarlar 'ın yavru nematozları 2 d için büyüdü ve nematdes saydıktan sonra Agarlar temizlenir.
36 (F1-1-1-7-F1-3-12-7) 36 (F1-1-1-5-F1-3-12-5 için, sayılan sonra temizlenmiş) F1-1-1-5-F1-3-12-5 Agarlar üzerinde F1 yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F2-1-1-4-F2-3-12-4) 36 (F0-1-1-9-F0-3-12-9) F2-1-1-1-F2-3-12-1, F1-1-1-4-F1-3-12-4 Agarlar ve F1-1-1-5-F1-3-12-5 arasında toplam nematod numarası F1 'in ilk çoğaltılması hesaplanmasında kullanılır.
36 (F3-1-1-1-F3-3-12-1) 36 (F1-1-1-6-F1-3-12-6) F0-1-1-9 ' a F0-3-12-9 ' a kadar olan F0 'in yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
F1-1-1-6-F1-3-12-6 Agarlar üzerinde F1 yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
F3-1-1-0-F3-3-12-0 Agarlar 'da bulunan yavru nematod 1 d için büyüdü ve işaretçiler F3-1-1-1 ' e F3-3-12-1 olarak değiştirilir.
Özellikle, F0 nematid üreme ilk birkaç gün sonra önemli ölçüde azalır. Bu nedenle, nematod transferinin D10 sonrası günlük olması kesinlikle gerekmez ve her 2 günde bir gerçekleştirilebilir. Yine de, hayatta kalma hala günlük gözlem gerektirir.
Aynı kural F1 (T1, T1 '), F2 (T2, T2 ') ve F3 (T3, T3 ') de geçerlidir.
11 36 (F0-1-1-11-F0-3-12-11) 36 (F0-1-1-9-F0-3-12-9, sayılan sonra temizlenmiş) F0-1-1-9 ila F0-3-12-9 arasında F0 Agarlar 'ın yavru nematleri 2 d için büyüdü ve nematit sayıldıktan sonra Agarlar temizlenir.
36 (F1-1-1-8-F1-3-12-8) 36 (F1-1-1-6-F1-3-12-6 için, sayılan sonra temizlenmiş) F1-1-1-6-F1-3-12-6 Agarlar üzerinde F1 yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F2-1-1-5-F2-3-12-5) 36 (F0-1-1-10-F0-3-12-10) F0 ' in F0-1-1-10 ' a F0-3-12-10 Agarlar 'a kadar olan yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F3-1-1-2-F3-3-12-2) 36 (F1-1-1-7-F1-3-12-7) F1-1-1-7 için F1-3-12-7 Agarlar F1 yavru nematodlar 1 d büyüdü.
36 (F2-1-1-4-F2-3-12-4) F2-1-1-4-F2-3-12-4 Agarlar üzerinde F2 'nin yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F3-1-1-1-F3-3-12-1 için F3-1-1-2 için F3-3-12-2 saydıktan sonra değiştirildi) F3-1-1-1-F3-3-12-1 Agarlar üzerinde nematdes 2 d için büyüdü, nematodlar sayılır ve işaretçileri F3-1-1-2 için F3-3-12-2 olarak değiştirilir.
12 36 (F0-1-1-12-F0-3-12-12) 36 (F0-1-1-10 için F0-3-12-10, sayılan sonra temizlenmiş) F0 ' in F0-1-1-10 ' a F0-3-12-10 ' a kadar olan yavru nematdes 2 d için büyüdü ve nematdes saydıktan sonra Agarlar temizlenir.
36 (F1-1-1-9-F1-3-12-9) 36 (F1-1-1-7-F1-3-12-7 için, sayılan sonra temizlenmiş) F1-1-1-7-F1-3-12-7 Agarlar üzerinde F1 yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F2-1-1-6-F2-3-12-6) 36 (F2-1-1-4 için F2-3-12-4, sayılan sonra temizlenmiş) F2-1-1-4 için F2-3-12-4 Agarlar üzerinde F2 yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F3-1-1-3-F3-3-12-3) 36 (F0-1-1-11-F0-3-12-11) F0 ' in F0-1-1-11 ' e F0-3-12-11 Agarlar 'a kadar olan yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F4-1-1-0-F4-3-12-0) 36 (F1-1-1-8-F1-3-12-8) F1-1-1-8 ' e F1-3-12-8 Agarlar üzerinde F1 'in yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F2-1-1-5-F2-3-12-5) F2-1-1-5-F2-3-12-5 Agarlar üzerinde F2 'nin yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
F3-1-1-2-F3-3-12-2 Agarlar üzerinde nematdes 3 d için büyüdü ve işaretçileri F3-1-1-3 ' e F3-3-12-3 olarak değiştirilir. F3 nematdes bugün yeniden oluşturmaya başlar ve 36 yeni NGM Agarlar 'a aktarılır ve F4-1-1-0-F4-3-12-0 olarak işaretlenir. MGR çalışmaları için, F3 yavrularının (i.e., T1 ') bugün başlar.
13 36 (F0-1-1-13-F0-3-12-13) 36 (F0-1-1-11-F0-3-12-11, sayılan sonra temizlenmiş) F0 ' in F0-1-1-11 ' e F0-3-12-11 Agarlar 'a kadar olan yavru nematdes 2 d için büyüdü ve nematdes saydıktan sonra Agarlar temizlenir.
36 (F1-1-1-10-F1-3-12-10) 36 (F1-1-1-8-F1-3-12-8 için, sayılan sonra temizlenmiş) F1-1-1-8-F1-3-12-8 Agarlar üzerinde F1 yavru nematid 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F2-1-1-7-F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-5 için F2-3-12-5, sayılan sonra temizlenmiş) F2-1-1-5-F2-3-12-5 Agarlar üzerinde F2 'nin yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F3-1-1-4-F3-3-12-4) 36 (F0-1-1-12-F0-3-12-12) F3-1-1-1-F3-3-12-1, F2-1-1-4-F2-3-12-4 Agarlar ve F2-1-1-5-F2-3-12-5 arasında toplam nematod numarası F2 'nin ilk çoğaltılması hesaplanmasında kullanılır.
36 (F4-1-1-1-F4-3-12-1) 36 (F1-1-1-9-F1-3-12-9) F0 ' in F0-1-1-12 ' d e F0-3-12-12 Agarlar 'a ait yavru nematodlar 1 b için büyüdü.
36 (F2-1-1-6-F2-3-12-6) F1-1-1-9-F1-3-12-9 Agarlar üzerinde F1 yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
F2-1-1-6-F2-3-12-6 Agarlar üzerinde F2 'nin yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
F4-1-1-0-F4-3-12-0 için F3 yavru nematdes 1 d için büyüdü ve işaretçileri F4-1-1-1 F4-3-12-1 olarak değiştirilir.
14 36 (F0-1-1-14-F0-3-12-14) 36 (F0-1-1-12-F0-3-12-12, sayılan sonra temizlenmiş) F0 ' in F0-1-1-12 ' d e F0-3-12-12 Agarlar 'a ait yavru nematdes 2 b için büyüdü ve nematdes saydıktan sonra Agarlar temizlenir.
36 (F1-1-1-11-F1-3-12-11) 36 (F1-1-1-9-F1-3-12-9, sayılan sonra temizlenmiş) F1-1-1-9 ' a F1-3-12-9 Agarlar üzerinde F1 yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F2-1-1-8-F2-3-12-8) 36 (F2-1-1-6-F2-3-12-6 için, sayılan sonra temizlenmiş) F2-1-1-6-F2-3-12-6 Agarlar üzerinde F2 'nin yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F3-1-1-5-F3-3-12-5) 36 (F4-1-1-1-F4-3-12-1 için, sayılan sonra temizlenmiş) F4-1-1-1 ' e F4-3-12-1 üzerinde F3 'ün yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir. MGR çalışmaları için, T1 ' nematid 2 d için büyüdü, ve sonraki gün (D15) T2 ' yeniden başlatacak ve T2 ' D18 üzerinde T3 ' yeniden başlayacak. Vahşi tip C. elegans ömrü 15 gün olarak determinantı olduğunu. Sonra, T3 ' ömrünün sonu D33 olacaktır.
36 (F0-1-1-13-F0-3-12-13) F0 ' in F0-1-1-13 ' e F0-3-12-13 Agarlar 'a kadar olan yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F1-1-1-10-F1-3-12-10) F1-1-1-10-F1-3-12-10 Agarlar üzerinde F1 'in yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F2-1-1-7-F2-3-12-7) F2-1-1-7-F2-3-12-7 Agarlar üzerinde F2 'nin yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F3-1-1-4-F3-3-12-4) F3-1-1-4-F2-3-12-4 Agarlar üzerinde F3 yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
15 36 (F0-1-1-15-F0-3-12-15) 36 (F0-1-1-13-F0-3-12-13, sayılan sonra temizlenmiş) F0 ' in F0-1-1-13 ' e F0-3-12-13 ' a kadar olan yavru nematdes 2 d için büyüdü ve nematdes saydıktan sonra Agarlar temizlenir.
36 (F1-1-1-12-F1-3-12-12) 36 (F1-1-1-10-F1-3-12-10 için, sayılan sonra temizlenmiş) F1-1-1-10-F1-3-12-10 Agarlar için F1 'in yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F2-1-1-9-F2-3-12-9) 36 (F2-1-1-7 için F2-3-12-7, sayılan sonra temizlenmiş) F2-1-1-7 için F2-3-12-7 Agarlar üzerinde F2 yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F3-1-1-6-F3-3-12-6) 36 (F3-1-1-4 için F3-3-12-4, sayılan sonra temizlenmiş) F3-1-1-4 için F3-3-12-4 Agarlar üzerinde F3 yavru nematodlar 2D için büyüdü ve nematdes sayılır sonra Agarlar temizlenir.
36 (F0-1-1-14-F0-3-12-14) F0 ' in F0-1-1-14 ' e F0-3-12-14 Agarlar 'a kadar olan yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F1-1-1-11-F1-3-12-11) F1-1-1-11-F1-3-12-11 Agarlar üzerinde F1 'in yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F2-1-1-8-F2-3-12-8) F2-1-1-8-F2-3-12-8 Agarlar üzerinde F2 'nin yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F3-1-1-5-F3-3-12-5) F3-1-1-5-F2-3-12-5 Agarlar üzerinde F3 yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
16 36 (F0-1-1-15-F0-3-12-15, üzeri) 36 (F0-1-1-14-F0-3-12-14, sayılan sonra temizlenmiş) Vahşi tip C. elegans ömrü 15 gün olarak determinantı olduğunu. Bu nedenle, F0 tüm gün önce 16 pozlama beri öldü olmalıdır.
36 (F1-1-1-13-F1-3-12-13) 36 (F1-1-1-11-F1-3-12-11, sayılan sonra temizlenmiş) F0 ' in F0-1-1-14 ' e F0-3-12-14 Agarlar 'a kadar olan yavru nematdes 2 d için büyüdü ve nematdes saydıktan sonra Agarlar temizlenir.
36 (F2-1-1-10-F2-3-12-10) 36 (F2-1-1-8-F2-3-12-8, sayılan sonra temizlenmiş) F1-1-1-11-F1-3-12-11 Agarlar üzerinde F1 'in yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F3-1-1-7-F3-3-12-7) 36 (F3-1-1-5-F3-3-12-5 için, sayılan sonra temizlenmiş) F2-1-1-8-F2-3-12-8 Agarlar üzerinde F2 'nin yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F0-1-1-15-F0-3-12-15) F3-1-1-5-F3-3-12-5 Agarlar üzerinde F3 yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F1-1-1-12-F1-3-12-12) F4-1-1-1-F4-3-12-1, F3-1-1-4 için F3-3-12-4 Agarlar ve F3-1-1-5 için F3-3-12-5 için genel nematod numarası F3 ilk çoğaltılması hesaplamak için kullanılır.
36 (F2-1-1-9-F2-3-12-9) F0 ' in F0-1-1-15 ' e F0-3-12-15 Agarlar 'a kadar olan yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F3-1-1-6-F3-3-12-6) F1-1-1-12 ' d e F1-3-12-12 Agarlar 'da F1 'in yavru nematodlar 1 b için büyüdü.
F2-1-1-9-F2-3-12-9 Agarlar üzerinde F2 'nin yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
F3-1-1-6-F2-3-12-6 Agarlar üzerinde F3 yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
17 36 (F1-1-1-14-F1-3-12-14) 36 (F0-1-1-15 için F0-3-12-15, sayılan sonra temizlenmiş, üzerinde) F0 ' in F0-1-1-15 ' e F0-3-12-15 Agarlar 'a kadar olan yavru nematdes 2 d için büyüdü ve nematdes saydıktan sonra Agarlar temizlenir. Artık F0 yavru olmayacak.
36 (F2-1-1-11-F2-3-12-11) 36 (F1-1-1-12-F1-3-12-12 için, sayılan sonra temizlenmiş) F1-1-1-12-F1-3-12-12 Agarlar üzerinde F1 yavru nematodlar 2 d için büyüdü ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F3-1-1-8-F3-3-12-8) 36 (F2-1-1-9-F2-3-12-9, sayılan sonra temizlenmiş) F2-1-1-9-F2-3-12-9 Agarlar üzerinde F2 'nin yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F3-1-1-6-F3-3-12-6 için, sayılan sonra temizlenmiş) F3-1-1-6-F3-3-12-6 Agarlar üzerinde F3 yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F1-1-1-13-F1-3-12-13) F1-1-1-13-F1-3-12-13 arasında F1 'in yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F2-1-1-10-F2-3-12-10) F2-1-1-10-F2-3-12-10 Agarlar üzerinde F2 'nin yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F3-1-1-7-F3-3-12-7) F3-1-1-7-F2-3-12-7 Agarlar üzerinde F3 yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
18 36 (F1-1-1-15-F1-3-12-15) 36 (F1-1-1-13-F1-3-12-13 için, sayılan sonra temizlenmiş) F1-1-1-13-F1-3-12-13 arasında F1 'in yavru nematodlar 2 d için büyüdü ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F2-1-1-12-F2-3-12-12) 36 (F2-1-1-10-F2-3-12-10, sayılan sonra temizlenmiş) F2-1-1-10-F2-3-12-10 Agarlar üzerinde F2 'nin yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F3-1-1-9-F3-3-12-9) 36 (F3-1-1-7 için F3-3-12-7, sayılan sonra temizlenmiş) F3-1-1-7-F3-3-12-7 Agarlar üzerinde F3 yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F1-1-1-14-F1-3-12-14) F1-1-1-14 ' e F1-3-12-14 Agarlar 'da F1 'in yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F2-1-1-11-F2-3-12-11) F2-1-1-11-F2-3-12-11 Agarlar üzerinde F2 'nin yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F3-1-1-8-F3-3-12-8) F3-1-1-8-F2-3-12-8 Agarlar üzerinde F3 yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
MGR çalışmalarında, T2 ' bugün T3 ' çoğaltmak başlayacaktır. Vahşi tip C. elegans ömrü 15 gün olarak determinantı olduğunu. Sonra, T3 ' ömrünün sonu D33 olacaktır.
19 36 (F1-1-1-15-F1-3-12-15, üzeri) 36 (F1-1-1-14-F1-3-12-14, sayılan sonra temizlenmiş) F1-1-1-14-F1-3-12-14 Agarlar üzerinde F1 'in yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F2-1-1-13-F2-3-12-13) 36 (F2-1-1-11-F2-3-12-11, sayılan sonra temizlenmiş) F2-1-1-11-F2-3-12-11 Agarlar üzerinde F2 'nin yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F3-1-1-10-F3-3-12-10) 36 (F3-1-1-8-F3-3-12-8 için, sayılan sonra temizlenmiş) F3-1-1-8-F3-3-12-8 Agarlar üzerinde F3 yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F1-1-1-15-F1-3-12-15) F1-1-1-15 ' e F1-3-12-15 Agarlar üzerinde F1 'in yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F2-1-1-12-F2-3-12-12) F2-1-1-12-F2-3-12-12 Agarlar üzerinde F2 'nin yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F3-1-1-9-F3-3-12-9) F3-1-1-9-F2-3-12-9 Agarlar üzerinde F3 yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
20 36 (F2-1-1-14-F2-3-12-14) 36 (F1-1-1-15-F1-3-12-15, sayılan sonra temizlenmiş) F1-1-1-14-F1-3-12-14 Agarlar üzerinde F1 'in yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir. Artık F1 yavrusu olmayacak.
36 (F3-1-1-11-F3-3-12-11) 36 (F2-1-1-12-F2-3-12-12, sayılan sonra temizlenmiş) F2-1-1-12-F2-3-12-12 Agarlar üzerinde F2 'nin yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F3-1-1-9-F3-3-12-9, sayılan sonra temizlenmiş) F3-1-1-9-F3-3-12-9 Agarlar üzerinde F3 yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F2-1-1-13-F2-3-12-13) F2-1-1-13-F2-3-12-13 arasında F2 'nin yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F3-1-1-10-F3-3-12-10) F3-1-1-10-F2-3-12-10 Agarlar üzerinde F3 'in yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
21 36 (F2-1-1-15-F2-3-12-15) 36 (F2-1-1-13-F2-3-12-13, sayılan sonra temizlenmiş) F2-1-1-13 ile F2-3-12-13 arasında F2 'nin yavru nematodlar 2 d için büyüdü ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F3-1-1-12-F3-3-12-12) 36 (F3-1-1-10-F3-3-12-10 için, sayılan sonra temizlenmiş) F3-1-1-10-F3-3-12-10 Agarlar için F3 'in yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F2-1-1-14-F2-3-12-14) F2-1-1-14-F2-3-12-14 Agarlar üzerinde F2 'nin yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
36 (F3-1-1-11-F3-3-12-11) F3-1-1-11-F2-3-12-11 Agarlar 'da F3 'in yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
22 36 (F2-1-1-15-F2-3-12-15, üzeri) 36 (F2-1-1-14-F2-3-12-14, sayılan sonra temizlenmiş) F2-1-1-14 ' e F2-3-12-14 Agarlar 'a doğru 2, 2D, Agarlar ise nematdes ve ağarların temizlenmiştir.
36 (F3-1-1-13-F3-3-12-13) 36 (F3-1-1-11-F3-3-12-11 için, sayılan sonra temizlenmiş) F3-1-1-11-F3-3-12-11 Agarlar için F3 'in yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F3-1-1-12-F3-3-12-12) F3-1-1-12-F2-3-12-12 Agarlar üzerinde F3 'in yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
23 36 (F3-1-1-14-F3-3-12-14) 36 (F2-1-1-15-F2-3-12-15, sayılan sonra temizlenmiş) F2-1-1-15-F2-3-12-15 Agarlar üzerinde F2 'nin yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir. Artık F2 yavrusu olmayacak.
36 (F3-1-1-12-F3-3-12-12 için, sayılan sonra temizlenmiş) F3-1-1-12 ile F3-3-12-12 arasında F3 'in yavru nematozları 2 d için büyüdü ve nematdes saydıktan sonra Agarlar temizlenir.
36 (F3-1-1-13-F3-3-12-13) F3-1-1-13-F2-3-12-13 arasında F3 'in yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
24 36 (F3-1-1-15-F3-3-12-15) 36 (F3-1-1-13-F3-3-12-13 için, sayılan sonra temizlenmiş) F3-1-1-13 ile F3-3-12-13 arasında F3 'in yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F3-1-1-14-F3-3-12-14) F3-1-1-14-F2-3-12-14 Agarlar üzerinde F3 yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
25 36 (F3-1-1-15-F3-3-12-15, üzeri) 36 (F3-1-1-14-F3-3-12-14, sayılan sonra temizlenmiş) F3-1-1-14-F3-3-12-14 Agarlar üzerinde F3 yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
36 (F3-1-1-15-F3-3-12-15) F3-1-1-15-F2-3-12-15 Agarlar üzerinde F3 yavru nematodlar 1 d için büyüdü.
26 36 (F3-1-1-15 için F3-3-12-15, sayılan sonra temizlenmiş) F3-1-1-15-F3-3-12-15 Agarlar üzerinde F3 yavru nematodlar 2 d için büyüdü, ve Agarlar nematdes sayılır sonra temizlenir.
Özellikle, MGR çalışmalarda, F3 ilk olmayan maruz yavru (yani, T3 ') D18 tarihinde doğmuş olacaktır. Vahşi tip C. elegans ömrü 15 gün olarak determinantı olduğunu. Sonra, T3 ' ömrünün sonu D33 olacaktır.
Hem MGE hem de MGR çalışmaları nematod ömrü daha uzun olduğunda daha fazla gün kapsar.

Tablo 1: işaretçileri ve tanımları listesi.

  1. MGE efekt çalışmalarından çoğaltılması ve ömrünü ölçün.
    1. D0 üzerinde adım 5,6 yineleyin. Agarlar işaretle (3 grup ile 10 çoğaltır her) Fx-a-b-colarak, burada x nesil numarasına başvurur, bir grup numarası (kontrol için 1, düşük konsantrasyon için 2 ve yüksek konsantrasyon için 3 ); b 1 ' den 10 ' a kadar çoğaltmayı ifade eder; ve c pozlama süresini ifade eder (0 başlangıcı gösterir). D0 için, Agarlar 'ı F0-1-1-0 ile F0-3-10-0 arasında işaretler. Okuyucular, ayrıntılı bilgi için Tablo 1 ' e başvurabilirsiniz.
    2. D1 'de, agars üzerindeki nematod büyümesini kontrol edin ve işaretçileri F0-1-1-0 ' a F0-3-10-0 ' a F0-1-1-1 ' e F0-3-10-1 arasında değiştirin.
    3. D2 'de, agars üzerindeki nematod büyümesini kontrol edin ve F0-1-1-2 için F0-3-10-2 işaretleyicilerini değiştirin.
    4. D3 üzerinde, adım 5,4 iki NGM agar ile 12 yeni NGM Agarlar üzerine her gruptan 24 F0 nematodlar seçin. F0-1-1-3 için F0-3-12-3 olarak Agarlar işaretle.
    5. D4 üzerinde, adım 5,4 yeni NGM Agarlar üzerine alarak F0-1-1-3 için F0-3-12-3 iki ebeveyn nematodlar aktarın. Yeni NGM Agarlar 'ı F0-1-1-4 ' e F0-3-12-4 olarak işaretleyin. F0-1-1-3 ' ü F0-3-12-3 ' ü F1-1-1-1 ' e F1-3-12-1' e F0 (yani, F1), F0 yeniden oluşturmaya başladığından bu yana ilk gün içinde temsil edecek şekilde değiştirin.
    6. D5 'de bir Diseksiyon mikroskobu kullanarak F1-1-1-1 ' i ndeki nematid 'lerden F1-3-12-1 Agarlar ' a kadar 2 gün uzamış. F1-1-1-1 ' e F1-3-12-1 Agarlar 'a izin verin, art arda nesiller için F2 yeniden oluşturun.
    7. F0-1-1-4 ' den F0-3-12-4 ' e kadar iki ebeveyn nematini, adım 5,4 ' dan yeni NGM Agarlar üzerine seçerek aktarın. Mark NGM Agarlar olarak F0-1-1-5 için F0-3-12-5. F0-1-1-4 için F0-3-12-4 ' ü F1-1-1-2 ' i F1-3-12-2' e F0 (yani F1), F0 yeniden oluşturmaya başladığından bu yana ikinci gün içinde temsil etmek için işaretleri değiştirin.
    8. D6 üzerinde, F1-1-1-2 için F1-3-12-2 agars üzerinde nematodlar saymak. F0-1-1-5 için F0-3-12-5 Agarlar için F0-1-1-6-F0-3-12-6 arasında ebeveyn nematodlar transfer. F0-1-1-5 belirteçleri F0-3-12-5 ' e F1-1-1-3 ' e F1-3-12-3 olarak F0 (yani, F1) ' in yavrularını temsil etmek için F0 yeniden başlatılından bu yana üçüncü gün içinde değiştirin.
    9. F1-1-1-1 ' e F1-3-12-1 Agarlar üzerindeki nematodlar 3 gün boyunca büyüdü. MGE etkisi çalışmaları izleyen F2 yeniden oluşturmak için bunları kullanın. Aynı şekilde, F2 nematdes kullanın F3 çoğaltmak için MGE etkisi çalışmaları devam etmek.
    10. Aynı şekilde, her gün iki ebeveyn nematodlar transfer ve yavru nematdes ertesi gün saymak, 6 NGM Agarlar içinde ebeveyn nematodlar kadar (yani, her grupta toplam Agarlar yarısı) üreme durdurun.
    11. Toplam yavru numarayı tüm üreme süresi boyunca Total damızlık boyutu olarak hesaplayın. Ebeveynlerin ilk üreme temsil etmek için ilk 3 gün içinde yavru numarasını kullanın.
    12. Ebeveyn nematod üreme süresi 6 NGM Agarlar içinde üretim süresini tahmin etmek için durur gün kullanın. Her bir ebeveynin yaşam süresi olarak hayatta kalan günlerini kullanın.
    13. F0 için yapılan aynı şekilde ilk üreme, üreme süresi, Total damızlık boyutu ve F1 ömrü elde. Benzer şekilde, yukarıda bahsedilen prosedürü tekrarlayarak, F2 'nin (fn) çoğaltılması ve yaşam süresi bilgileri elde edilebilir.
  2. MGR efekt çalışmalarından çoğaltılması ve ömrünü ölçün.
    1. Adım 5,4 NGM Agarlar ile adım 7.2.4 Bu adım 2,13 değiştirildi gerçekleştirin.
  3. Biyokimyasal endeksleri ölçün.
    1. Nematleri NGM Agarlar 'dan steril suyla boşaltın ve santrifüjler içine toplayın. 30 dakika nematdes yerleşmek ve süper natants atın. Efekt ölçümü için Pelletlerin içinde nematid kullanın.
    2. 1 ml buz-soğuk fosfat tamponlu tuz ekleyin (PBS, pH 7,0) nematdes içine (Pelet) 1,5 ml santrifüjler içinde nematodlar yıkayın.
    3. 10.000 x g 'de 4 °c ' de 5 dakika santrifüjün ve süper natantları bir pipet ile dikkatlice atın.
    4. Sıvı nitrojen veya a-80 °C dondurucu ile pelletin yapış dondurulması.
    5. Bir buz banyosunda böcek kullanarak Pellet homojenize. Pestil almadan önce santrifüj tüpüne havaneli üzerinde kalan sıvılar yıkamak için 200 μL buz soğuk PBS kullanın.
    6. 4 °c ' de 5 dakika 10.000 x g 'de santrifüjler tekrar, ve ticari kitleri ile biyokimyasal faaliyetleri veya miktarları belirlemek için süpernatanlarında kullanın (detay için malzeme tablosuna bakın).
    7. Numunelerde toplam protein (TP) miktarlarını ölçün ve sonuçları diğer biyokimyasal göstergeleri temsil eden payda olarak kullanın, böylece numuneler arasında nematod numaraları arasındaki fark ortadan kaldırılabilir.
  4. Gen ifadesini ölçün.
    1. 7.4.4 için 7.4.1 adımları yineleyin. Üreticinin yönergelerine göre (Ayrıntılar için malzeme tablosuna bakın) ticari RNA ekstraksiyon kiti kullanarak nematod örneklerinden toplam RNA 'ya izole et.
    2. RNA 'yı üreticinin talimatlarına göre cDNA sentezlemek için kullanın21.
    3. CDNA örneğini, üreticinin talimatlarına göre SYBR yeşil RT-PCR kitleri kullanarak gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile analiz edin (bkz. malzeme tablosu)21.
    4. 2-δδct yöntemi22tarafından seçilen genlerin göreli ifade düzeylerini ölçmek ve GSYİH-2 (veya diğer referans geni) ifade düzeylerini negatif referans olarak tedavi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada, Trans-jenerasyonel (TG), çok jenerasyonel pozlama (MGE) ve çok jenerasyonel kalıntı (MGR) efekt çalışmalarından C. elegans kullanarak kimyasal maddelerin nesiller boyunca etkilerinin incelenmesi için protokoller açıklanmaktadır. Kendi Araştırma sonuçlarımız örnek olarak sunulmuştur. Bir çalışmada lokomotif davranış3AĞıR metaller TG etkileri sunar. Diğer iki çalışmada, sulfomethoxazole ve Lindane 'in üreme ve biyokimyasal ve genetik endekslerin ölçümleri4,14' te MGE ve MGR etkileri mevcut.

Ağır metallerin lokomotif davranışlarında TG etkileri C. elegans

Vücut bükme sıklığı (BBF) üzerinde kadmiyum (CD), bakır (cu), kurşun (Pb) ve çinko (Zn) TG etkileri, maternal pozlama ve onların Döl (T1)3sonra nematod ebeveyn (F0) incelenmiştir. Metallerin BBF üzerindeki etkileri, T1 'deki engellemelerin F0 ' den daha büyük olduğunu gösterdi ve embriyo maruz kalan yavruların lokomotif davranışlarında ağır metallerin daha şiddetli toksisitlerini doğrudan maruz kalan ebeveynlere göre gösteriyordu. Ağır metallerin çevresel anlamda gerçekçi konsantrasyonlarda TG efektleri, maternal maruz kalmanın başarılı nesiller boyunca ağır metal kirliliğinin tehlikelerini çarpabilir olduğunu göstermiştir. Bkz. Şekil 1.

Figure 1
Şekil 1 : Kadmiyum (CD), bakır (cu), kurşun (Pb) ve çinko (Zn) nematod ebeveynin vücut bükme frekansında (F0, boş) prenatal pozlama ve onların Döl (T1, gölgeli) sonra etkileri. Hata çubuğu = standart hata; * = kontrolden önemli ölçüde farklı, p < 0,05; # = düşük konsantrasyondan önemli ölçüde farklı, p < 0,05; + F0, p < 0,05 daha F1 önemli ölçüde farklı efektler anlamına gelir. Bu rakam izin ile yu ve al.3 değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Nematod ömrü ve üreme üzerinde sülfametokazol (SMX) MGR etkileri

Sulfametoksazol (SMX) nematod ömrü ve üreme14 MGR etkileri hamile ebeveyn (F0), embriyo maruz yavru (T1), germline-maruz yavru (T2), ilk maruz olmayan yavru (T3) ve üç incelenmiştir Aşağıdaki nesiller (T4-T6). Sonuçlar, germline pozlama (T2) ' de (% 49 olarak toplam bir damızlık boyutu) üreme ve mikroplar, T3-T6 nesiller (Şekil 2) ' den maruz kalmayan nesillerde kalıcı olarak etkilendiğini göstermiştir. Bulgularımız, antibiyotiklerin uzun vadeli etkileri ile ilgili olarak antibiyotik direnci üzerindeki etkilerine ek olarak yeni endişeler kaldırdı.

Figure 2
Şekil 2 : Brood boyutu (içinde (A), kontrol yüzdesi olarak ifade) ve ilk üreme (içinde (B)) C. elegans maruz ebeveyn ve onun yavru (F0, T1 için T6, soldan sağa her konsantrasyon). Hata çubuğu = standart hata; a = ANOVA ile kontrolden önemli ölçüde farklıdır (p < 0,05); b = kontrolden ve aynı konsantrasyonda önceki nesilden önemli ölçüde farklı (p < 0,05); c = kontrolden ve aynı nesil alt konsantrasyondan önemli ölçüde farklı (p < 0,05); d = aynı konsantrasyon ve aynı nesildeki daha düşük konsantrasyonda kontrol ve önceki nesilden önemli ölçüde farklı (p < 0,05); e = aynı konsantrasyonda önceki nesilden ve aynı nesildeki daha düşük konsantrasyonda önemli ölçüde farklı (p < 0,05); f = aynı konsantrasyonda önceki nesilden önemli ölçüde farklı (p < 0,05). Bu rakam izin ile yu ve al.14 değiştirildi.

MGE ve MGR nematod biyokimyasal ve genetik endeksleri üzerindeki etkileri

Lindane (kalıcı bir organik kirletici [POP]) MGE ve MGR etkileri lipid metabolizasyonlarının anahtar biyokimyasaları ve ilgili insülin benzeri yolların genetik ifade değişiklikleri üzerinde incelenmiştir4. Sonuçlar, Lindane 'in insülin sinyal yönetmeliğinde rahatsızlıklarla obesojen etkileri gösterdiğini gösterdi (Şekil 3). Dahası, SGK-1 (F0, F3, T1 ' ve T3 ') ve akt-1 (T1 ve T3) sinyalizasyon arasındaki değişiklikler farklı pozlama nesillerinden nematilerin tolerans ve kaçınma için farklı tepki stratejileri gösterdiğini belirttiler.

Figure 3
Şekil 3 : Farklı pozlama deneyimleri ile nematdes içinde insülin benzeri sinyal yolu anahtar genler ifade seviyeleri değişiklikleri. →: pozitif düzenleme; symbol : negatif yönetmelik; : ifade yukarı-düzenleme; : ifade aşağı-düzenleme. Bu rakam al.4 ' teki Chen 'den izniyle değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Açıklanan protokolü başarıyla yürütmek için aşağıdaki öneriler dikkate alınmalıdır. Genel deneysel işlemleri steril bir ortamda gerçekleştirin. Uygunsuz çalışma, E. coli suşlarının kontaminasyonuna neden olabilir, örneğin, mantar ve akarları C. eleganların normal büyümesini engelleyebilir ve bu nedenle deneysel sonuçları etkileyebilir. C. elegans yetiştirmeyi anlatan bölümde, NGM Agarlar üzerindeki c. elegans 'ın büyüme ölçeğini çıplak gözler veya mikroskoplar ile gözlemlemek. Agar üzerinde c. elegans ölçeği bölgede% 75 ' ü aştığında ya da kültür süresi bir haftası aşıyor, c. elegansaşırı büyüme veya nüfus düşüşünden kaçınmak için yeni bir aşı turu gerçekleştirin. Senkronizasyon işleminden önce, C. elegansbüyümesini gözlemlemek için bir mikroskop kullanın ve nematod yumurta yaygın agar dağıtılır sürecine devam. Buna ek olarak, solvent (örneğin, dimetil sülventid [DMSO]) kullanıldığında, stok çözümlerindeki konsantrasyonları% 1 ' den düşük olmalıdır, son konsantrasyonlarının çözücülerin kendilerini olumsuz etkilerinden kaçınmak için% 0,5 (v/v) ' yı aşmaması gerekmektedir. TG etkisi çalışmalarda, üzerinde pozlama süresi 24 h pozlama süresi yeni nesil embriyo oluşumu kapsar sağlamak için gereklidir, ve süre içinde olmalıdır 96 sonraki nesil ayrımı kolaylaştırmak için h. Ömür ve üreme ölçmek için küçük miktarlarda nematid (genellikle 20 içinde) kullanın. Öte yandan, biyokimyasal ve genetik düzenleme indekslerini ölçmek için büyük miktarlarda nematid (genellikle 500 ' den fazla) kullanın. Bu nedenle, numune yeterli sayıda sağlamak için, kabaca kaç yavru olgun F0 nematdes ilk içinde çoğaltmak tahmin etmek için ön deneyler yapmak 24 saat onlar üreme başlar beri. Daha sonra F0 nematdes sayısını belirlemek için en az 200 yavru devam çok jenerasyonel çalışmalar olduğundan emin olmak için gerekli.

C. elegansile TG çalışmalarının önceki raporları ile karşılaştırıldığında, mevcut deneysel protokol yaşam aşaması seçimi daha düşünceli oldu. C. elegans'da, daha sonraki biçimlendirilmiş oosit23' ü döllemek için L4 aşamasında spermlar oluşur. Buna göre, spermiogenesis ve oocytogenesis dönemi kapsayan pozlama yavrularını TG etkilerini incelemek için belirli bir pencere sağlayacaktır. Yaş eşitlenmiş yumurta, pozlama her yaşam döngüsünün başından itibaren genel dönemi kapsar sağlamak için çok jenerasyonel etki çalışmaları için kullanılır. Daha önceki çok jenerasyonel çalışmalar ile karşılaştırıldığında, mevcut deneysel protokol sadece 1-2 nesiller yerine birden fazla nesiller üzerinde etkileri ölçümünü kolaylaştırmış. Dahası, mevcut protokol sadece MGE veya MGR etkileri ölçülen önceki çalışmalarda daha sistematik olan MGE ve MGR etkileri, kabul.

Özellikle, mevcut deneysel protokolde dikkate alınacak bazı sorunlar hala vardır. Mevcut protokol, nesil süresi 60 h ve ömrü 20 gündür olan vahşi tip C. elegans kullanır. Bu, denemenin genel süresini oldukça uzun yapar (örn. 3 nesilden fazla yaşam süresi üzerinde MGE etkileri çalışması en az 30 gün gerektirir). Zaman kısaltmak için, araştırmacılar mutant C. elegans seçebilirsiniz, kısa ömürlü mutant nematdes gibi. Başka bir sorun bakteri üzerinde öldürme tedavisi, canlı durumu nematdes sağlıklı tutmak için gerekli olan 24. Ayrıca, UV öldürme süreci kimyasalların değişiklikleri tanıtmak olabilir25. Bu nedenle, bakteri üzerindeki diğer tedaviler dikkate alınmalıdır, ve hazırlık veya pozlama işlemi sırasında kimyasal değişiklikler üzerinde dikkatli izleme özellikle kararsız bileşikler için, gerekli olabilir. Aynı zamanda, toksik etkilere cinsiyet farklılıkları eğitim sınırlamaları vardır çünkü C. elegans hermafrodit olduğu gerçeğini çoğu. TG, MGE veya MGR etkileri cinsiyet katkısı araştırmak için daha fazla iyileştirmeler gereklidir. Özetle, önerilen protokolün, toksizarların TG, MGE ve MGR etkilerini incelemek için C. elegans kullanmanın büyük önemi olacağını tahmin ediyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, Ulusal Bilim ve teknoloji büyük proje su kirliliği kontrol ve tedavi (2017ZX07201004) ve uluslararası bilim & Teknoloji Işbirliği programı Çin (No. 2016YFE0123700) tarafından finansal destek için minnettar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 agar powder OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 9002-18-0
79nnHT Fast Real-Time PCR System  Applied Biosystems 
96-well sterile microplate Costar?Corning?America
Autoclave sterilizer Tomy, Tomy Digital Biology, Japan
Biosafety cabinet LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China
calcium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10043-52-4
centrifuge  5417R Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Centrifuge tubes Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America
cholesterol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 57-88-5
Dimethyl sulfoxide VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America 67-68-5
disodium hydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7558-79-4
ethanol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 64-17-5
Filter Thermo, Thermo Fisher Scientific, America
incubator YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China
inoculating loop
K2HPO4•3H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 16788-57-1
kraft paper
Mcroplate Reader Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America
MgSO4•7H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10034-99-8
Microscopes XTL-BM-9TD BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China 
Petri dishes
Pipette Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Potassium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7447-40-7
potassium dihydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7778-77-0
Qiagen RNeasy kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States
sodium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7647-14-5
sodium hydroxide Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 1310-73-2
sodium hypochlorite solution Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China 7681-52-9
tryptone OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 73049-73-7
yeast extract OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 119-44-8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
  2. Li, W., et al. Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells. Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).
  3. Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny. Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).
  4. Chen, R., Yu, Z., Yin, D. Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway. Chemosphere. 210, 607-614 (2018).
  5. Van Norman, G. A. A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation. International Anesthesiology Clinics. 53, (3), 63-78 (2015).
  6. Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, (7), 1877-1888 (2018).
  7. Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 13, 20160966 (2017).
  8. Coimbra, A. M., et al. Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study. Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).
  9. Sugi, T. Genome editing in C. elegans and other nematode species. International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).
  10. Leung, M. C. K., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Science. 106, (1), 5-28 (2008).
  11. Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration. Journal of Environmental Sciences-China. 23, (2), 294-300 (2011).
  12. Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure. Environmental Science & Technology. 47, 5393-5399 (2013).
  13. Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans. Science. 356, 320 (2017).
  14. Yu, Z. Y., et al. Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).
  15. Buisset-Goussen, A., et al. Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans. Radioactivity. 137, 190-197 (2014).
  16. Zhao, F., et al. Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice. Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).
  17. Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans. Asian Journal of Ecotoxicology. 11, (4), 61-68 (2016).
  18. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis dlegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  19. Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).
  20. Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, (38), 13496-13501 (2005).
  21. Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).
  22. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, (4), 402-408 (2001).
  23. Hill, R., et al. Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes. Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).
  24. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).
  25. Breider, F., von Gunten, U. Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide. Analytical Chemistry. 89, (3), 1574-1582 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics