Análisis de análogos de ácido Iophenoxico en mangosta India pequeña (Herpestes auropunctatus) sera para usar como marcador biológico de vacunación antirrábica oral

Immunology and Infection

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Berentsen, A. R., Sugihara, R. T., Payne, C. G., Leinbach, I., Volker, S. F., Vos, A., Ortmann, S., Gilbert, A. T. Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker. J. Vis. Exp. (147), e59373, doi:10.3791/59373 (2019).

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Abstract

La pequeña mangosta India (Herpestes auropunctatus) es una reserva de virus de la rabia (RABV) en Puerto Rico y comprende más del 70% de los casos de rabia animal reportados anualmente. El control de la circulación de RABV en los reservorios de vida silvestre se logra típicamente mediante una estrategia de vacunación oral contra la rabia (ORV). Actualmente no existe un programa de vida silvestre ORV en Puerto Rico. Se han llevado a cabo investigaciones sobre vacunas orales contra la rabia y diversos tipos de cebo para mangostas con resultados prometedores. Monitorear el éxito de ORV depende de estimar la captación de cebo por especies objetivo, que típicamente implica evaluar un cambio en los anticuerpos neutralizadores RABV (RVNA) después de la vacunación. Esta estrategia puede ser difícil de interpretar en áreas con un programa activo de ORV de vida silvestre o en áreas donde la RABV es enzoótica y los niveles de fondo de RVNA están presentes en las especies de reservorios. En tales situaciones, un biomarcador incorporado con la vacuna o la matriz de cebo puede ser útil. Le ofrecimos a 16 mangostas cautivos placebo ORV cebos que contenían ácido etil-iophenoxico (et-IPA) en concentraciones de 0,4% y 1% dentro del cebo y 0,14% en la matriz externa de cebo. También ofrecimos a 12 mangostas cautivos ORV cebos que contenían ácido metil-iofenoxico (me-IPA) en concentraciones de 0,035%, 0,07% y 0,14% en la matriz externa de cebo. Recolectamos una muestra de suero antes de la oferta de cebo y luego semanalmente hasta ocho semanas después de la oferta. Extraemos ácidos Iophenoxic de sueros en acetonitrilo y cuantificados utilizando cromatografía líquida/espectrometría de masas. Analizamos sueros para et-IPA o me-IPA mediante espectrometría de masas de cromatografía líquida. Hemos encontrado una capacidad de marcado adecuada durante al menos ocho y cuatro semanas para et y me-IPA, respectivamente. Ambos derivados del IAP podrían ser adecuados para la evaluación de campo de la captación de cebo de ORV en mangostas. Debido a la longevidad del marcador en los sueros mangosta, se debe tener cuidado de no confundir los resultados mediante el uso del mismo derivado del IAP durante las evaluaciones consecutivas.

Introduction

El virus de la rabia (RABV) es un lissavirus de un solo trenzado de sentido negativo, y circula entre las diversas especies de reservorio de vida silvestre dentro de las órdenes Carnivora y Chiroptera. Múltiples especies de mangosta son reservorios de RABV, y la pequeña mangosta India (Herpestes auropunctatus) es el único embalse en Puerto Rico y otras islas del Caribe en el hemisferio occidental1,2,3 . El control de la circulación de RABV en los reservorios de vida silvestre se logra típicamente a través de una estrategia de vacunación oral contra la rabia (ORV). En los Estados Unidos (EE.UU.), esta actividad de gestión está coordinada por el programa nacional de gestión de la rabia (NRMP)4del USDA/APHIS/Wildlife Services. Actualmente no existe un programa de vida silvestre ORV en Puerto Rico. Se han llevado a cabo investigaciones sobre vacunas contra la rabia y diversos tipos de cebo para mangostas con resultados prometedores que sugieren que un programa de ORV para mangostas es posible5,6,7,8.

Monitorear el impacto de la ORV depende de estimar la captación de cebo por especies objetivo, que típicamente implica evaluar un cambio en la seroprevalencia de anticuerpos RV. Sin embargo, esta estrategia puede ser desafiante en áreas con un activo vida silvestre ORV programas o en áreas donde RV es enzoótico y los niveles de fondo de los anticuerpos neutralizadores RABV (RVNA) están presentes en las especies de reservorio. En tales situaciones, un biomarcador incluido en el cebo o la matriz de cebo externo puede ser útil.

Varios marcadores biológicos se han utilizado para monitorear la captación de cebo en numerosas especies, incluyendo mapaches (Procyon lotor)9,10, stoats(Mustela armiño)11,12, tejones europeos ( Meles Meles) 13, jabalíes (sus scrofa)14, pequeños mangostas indios15 y perros de la pradera (cynomysludovicianus)16,17, entre otros. En los Estados Unidos, los ORV operacionales a menudo incluyen un biomarcador de tetraciclina al 1% en la matriz de cebo para monitorear la captación de cebo18,19. Sin embargo, las desventajas del uso de la tetraciclina incluyen una preocupación creciente sobre la distribución de antibióticos en el medio ambiente y que la detección de tetraciclina es típicamente invasiva, requiriendo la extracción dental o la destrucción del animal para obtener hueso muestras20. Rhodamine B se ha evaluado como un marcador en una variedad de tejidos y se puede detectar usando luz ultravioleta (UV) y fluorescencia en el cabello y los bigotes10,21.

El ácido iophenoxic (IPA) es un polvo cristalino blanco que se ha utilizado para evaluar el consumo de cebo en coyotes (Canis latrans)22, zorro ártico (Vulpes lagopus)23, zorro rojo (Vulpes vulpes)24, mapaches 9 , 25, jabalí14, ciervo rojo (Cervus elaphus scoticus)26, tejones europeos12 y hurones (M. Furo)27, entre varias otras especies de mamíferos. Los tiempos de retención del IAP varían según las especies de menos de dos semanas en algunos marsupiales28,29, al menos 26 semanas en ungulados26 y más de 52 semanas en perros domésticos (Canis lupus familiaris)30. Los tiempos de retención también pueden ser dependientes de la dosis31. El ácido iophenoxic se une fuertemente a la albúmina sérica y fue detectado históricamente midiendo los niveles de yodo sanguíneo32. Este enfoque indirecto fue suplantado por métodos de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para medir directamente las concentraciones de ácido iophenoxico con detección UV33, y eventualmente con cromatografía líquida y espectrometría de masas (LCMS) 34,35. Para este estudio, se desarrolló una cromatografía líquida altamente sensible y selectiva con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) que utiliza el control de reacción múltiple (MRM) para cuantificar dos análogos del ácido iophenoxic. Nuestro objetivo era utilizar este método LC-MS/MS para evaluar la capacidad de marcado de 2-(3-hydroxy-2, 4, 6-triiodobenzyl) Ácido propanoico (metil-IPA o me-IPA) y 2-(3-hidroxi-2, 4, 6-triiodobenzyl) ácido butanoico (etil-IPA o et-IPA) y cuando se entregan en un ORV cebo a las mongolas cautivas.

Las mongolas fueron capturadas en vivo en trampas de jaula, con salchichas ahumadas y aceite de pescado disponibles comercialmente. Los mangostas estaban alojados en jaulas individuales de 60 cm x 60 cm x 40 cm de acero inoxidable y alimentaban una ración diaria de ~ 50 g de alimento seco para gatos comerciales, complementado dos veces por semana con un muslo de pollo disponible comercialmente. El agua estaba disponible ad libitum. Se entregaron dos derivados del IAP, el etil-IPA y el metil-IPA a las mongolas en cautiverio en los cebos de placebo ORV. Todos los cebos se componían de un blíster de lámina de 28 mm x 20 mm x 9 mm con recubrimiento externo (en adelante "matriz de cebo") que contenía huevo de pollo en polvo y gelatina (tabla de materiales). Los cebos contenían 0,7 mL de agua o derivado del IAP y pesaban aproximadamente 3 g, de los cuales ~ 2 g era la matriz externa de cebo.

Hemos ofrecido a 16 mangostas en cautiverio et-IPA en tres concentraciones: 0,14% (2,8 mg de et-IPA en ~ 2 g matriz de cebo; 3 machos [m], 3 hembras [f]), 0,4% (2,8 mg et-IPA en 0,7 mL volumen del blíster; 3m, 3F) y 1,0% (7,0 mg de etil-IPA en volumen de blísters de 0,7 mL; 2m , 2F). La dosis total de 2,8 mg corresponde a una tasa de dosis de 5 mg/kg27,36 y se basa en un peso promedio de mangosta de 560 g en Puerto Rico. Seleccionamos el 1% como la concentración más alta ya que la investigación sugiere que el sabor aversión a algunos biomarcadores puede ocurrir en concentraciones > 1% en algunas especies37. Solo ofrecimos la dosis del 1% en el blíster, ya que la floculación impidió que el soluto se disolviese en el disolvente lo suficiente como para incorporarse uniformemente a la matriz de cebo. Un grupo de control (2m, 1F) recibió ceits llenos de agua estéril y sin IPA. Ofrecimos ceits a mangostas por la mañana (~ 8 a.m.) durante o antes de alimentar su ración diaria de mantenimiento. Restos de cebo fueron retirados después de aproximadamente 24 horas. Recolectamos muestras de sangre antes del tratamiento, un día después del tratamiento y luego semanalmente hasta 8 semanas después del tratamiento. Anestesiamos a las mangostas por inhalación de gas isoflurano y recolectamos hasta 1,0 mL de sangre entera por venopunción de la vena craneal como se describe para los hurones38. Centrifugó muestras de sangre enteras, transfirió sueros a criviales y los almacené a-80 ° c hasta el análisis. No todos los animales fueron muestreados durante todos los períodos de tiempo para minimizar los impactos de la sangre repetida se extrae en la salud de los animales. Los animales de control fueron muestreados el día 0, luego semanalmente por hasta 8 semanas después del tratamiento.

Hemos entregado me-IPA en tres concentraciones: 0,035% (0,7 mg), 0,07% (1,4 mg) y 0,14% (2,8 mg), todos incorporados en la matriz de cebo, con 2 machos y 2 hembras por grupo de tratamiento. Dos machos y dos hembras recibieron ceits llenos de agua estéril y sin IPA. Los tiempos de ofrenda de cebo y la anestesia mangosta se describen arriba. Recolectamos muestras de sangre antes del tratamiento el día 1, y luego semanalmente hasta 4 semanas después del tratamiento.

Probamos los datos de la concentración sérica para la normalidad y los medios estimados para las concentraciones séricas de diferentes grupos de tratamiento. Se utilizó un modelo lineal mixto para comparar las concentraciones de suero et-IPA medio agrupadas entre individuos. El tipo de cebo (matriz/blíster) era un efecto fijo además del día experimental, mientras que la identificación animal era un efecto aleatorio. Todos los procedimientos se ejecuto utilizando un software estadístico común (tabla de materiales) y la significación se evaluó en α = 0,05.

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Protocol

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité institucional de cuidado de animales y uso del Centro Nacional de investigación de vida silvestre del USDA bajo el protocolo de investigación aprobado QA-2597.

Nota: el siguiente protocolo describe el procedimiento de análisis para detectar el ácido metil-iophenoxico en el suero de Mangosta. Este método es la versión final de un proceso iterativo que comenzó con el análisis del ácido etil-iophenoxico en el suero de Mangosta. Durante la evaluación inicial de ácido etil-iophenoxico se realizaron modificaciones menores a los métodos, resultando en el protocolo final presentado a continuación. Los resultados representativos incluyen los obtenidos durante ambas iteraciones.

1. elaboración de soluciones y normas

  1. Compre me-IPA y et-IPA.
  2. Para la fase móvil A, preparar 1 L de 0,1% (v/v) ácido fórmico en agua mediante la combinación de 1 mL de ácido fórmico con 1 L de agua ultrapura (≥ 18 MΩ). Para la fase B móvil, preparar 1 L de 0,1% (v/v) ácido fórmico en acetonitrilo (ACN) combinando 1 mL de ácido fórmico con 1 L de ACN.
  3. Para el diluyente, prepare 200 mL de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,5% (v/v) en ACN combinando 1 mL de TFA con 200 mL de ACN.
  4. Preparar soluciones de acción concentradas del IAP de me-IPA y et-IPA en ACN a concentraciones de aproximadamente 1.000 μg/mL.
    1. Pesar aproximadamente 10 mg de me-IPA en un microbalanza y registrar la masa en ± 0,0001 mg. transfiera cuantitativamente el me-IPA a un matraz aforado de 10 ml de clase a utilizando 45 ml de ACN. Sonicar 1 min para disolver todos los sólidos, y luego llevar al volumen con ACN.
    2. Transfiera ~ 8 mL de cada acción a frascos de vidrio ámbar de 8 mL con tapas forradas de poli-tetrafluoroetileno (PTFE). Conservar a temperatura ambiente (RT). Transfiera el stock restante a residuos peligrosos.
  5. Para el stock 25x-7 me-IPA (tabla 1), preparar un stock de me-IPA en ACN a aproximadamente 200 μg/ml. Ejemplo: transferir 1 mL del caldo concentrado me-IPA desde el paso 1.4.2 hasta un matraz aforado de 5 mL de clase A con una jeringa de vidrio de 1.000 μL. Diluir al volumen con ACN. Transfiera la culata a un vial de vidrio ámbar de 8 mL con tapa forrada de PTFE. Almacenar en RT.
  6. Prepare las seis acciones adicionales 25x me-IPA descritas en la tabla 1. Para cada acción, combine los volúmenes indicados utilizando un pipeteador de repetición en un vial de vidrio ámbar de 8 mL ámbar con tapa forrada de PTFE. Almacene cada acción en RT.
  7. Para el stock sustitutivo 25x, prepare un stock sustitutivo de me-IPA en ACN a aproximadamente 10 μg/mL de la culata concentrada preparada en el paso 1.4.2. Transferir 0,100 mL de la acción concentrada me-IPA a un matraz aforado de 10 mL de clase A utilizando una jeringa de vidrio de 100 μL, y luego diluir al volumen con ACN.
    1. Transfiera ~ 8 mL a un vial de vidrio ámbar de 8 mL con tapa forrada de PTFE. Almacenar en RT. transfiera el stock restante a residuos peligrosos.
  8. Prepare 4 acciones que contengan ambos analitos en viales de 2 mL para muestreador automático de vidrio con rosca, como se describe en la tabla 2.
    1. Por ejemplo, para preparar el stock 4x-7, a un vial de 2 mL, Añadir 0,20 mL del stock 25x-7 me-IPA del paso 1,5 utilizando un pipeteador de repetición con una punta de capacidad de 0,5 mL. Añadir 0,20 mL de la culata de 25x et-IPA del paso 1,7 utilizando un pipeteador de repetición con una punta de capacidad de 0,5 mL.
    2. Añadir 0,85 mL de ACN utilizando un pipeteador de repetición con 1 mL de punta de capacidad. Tapa el vial de forma segura e invierte 5x para mezclar.
  9. Prepare la curva estándar en viales de muestreador automático de tornillo de 2 mL como se describe en la tabla 3.
    1. Por ejemplo, para preparar el estándar 7 (STD 7), a un vial de 2 mL, añada 0,20 mL de la culata 4x-7 del paso 1.8.2 utilizando un pipeteador de repetición con una punta de capacidad de 0,5 mL. Añadir 0,60 mL de agua de DI ultrapura utilizando un pipeteador de repetición con una punta de 1 mL de capacidad. Tapa el vial de forma segura e invierte 5x para mezclar.

2. preparación de la muestra

PRECAUCIÓN: el personal que realice este procedimiento debe haber recibido la serie completa de profilaxis previa a la exposición a la rabia y tener un título de anticuerpos contra la rabia documentado por encima de 0,5 UI de una instalación médica federal de salud ocupacional designada. El personal debe usar abrigos de laboratorio y protección ocular en todo momento mientras realiza la extracción. PRECAUCIÓN: realice los pasos 2.3 − 2.6 en un gabinete de bioseguridad de clase II.

  1. Para cada muestra, prepare un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contenga 200 − 300 mg de NaCl. Organice los tubos en un bastidor de plástico de 80 posiciones. Reservar para su uso en el paso 2,6.
    Nota: se recomienda una microcuchara (u otro dispositivo de medición pequeño) para un gran número de muestras.
  2. Para cada muestra, etiquete dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL: uno como "A" y el otro como "B". Coloque los tubos en un bastidor de plástico de 80 posiciones.
  3. Coloque los siguientes materiales y equipos necesarios para la extracción del suero en un gabinete de bioseguridad de clase II: tubos de microcentrífuga (en bastidores) preparados en los pasos 2,1 y 2,2, un mezclador de vórtice, pipeteador de repetición con 0,5 mL y 5 mL de puntas de capacidad, 100 − 1000 μL de desplazamiento de aire pipetas con 1.000 μL de puntas, recipientes con aproximadamente 100 mL cada uno de agua de DI diluyente y ultrapura, y un contenedor de desechos de riesgo biológico.
  4. Retire las muestras de suero del almacenamiento congelado y caliente a RT en el gabinete de bioseguridad. El vórtice mezcla cada muestra de suero antes del muestreo.
  5. Utilizando un pipeteador de repetición con una punta de capacidad de 0,5 mL, dispense 0,050 mL de suero de mangosta en el tubo "A" y añada 0,050 mL de material sustitutivo de 25x. A continuación, Añadir 0,950 mL de diluyente al tubo "a" utilizando un pipeteador de repetición con 5 mL de punta de capacidad. Tapa de forma segura y mezcla de vórtice para 10 − 15 s.
  6. Dispense el NaCl pre-pesado del paso 2,1 en el tubo "A" y la mezcla de vórtice 3x para 8 − 12 s. Limpie las superficies externas del bastidor del vial que contiene el tubo "A" usando el 70% (v/v) isopropanol.
    Nota: el bastidor de muestras ahora puede retirarse del gabinete de bioseguridad de clase II.
  7. Tubo de centrifugación "A" a 12.000 x g durante 1 min para separar las fases acuosas y ACN. Pipetear 0,80 mL de la fase superior de ACN al tubo "B" utilizando una Piera de desplazamiento de aire de 100 − 1000 μL. Transfiera la solución restante en el tubo "a" a los desechos peligrosos y deseche el tubo vacío en un contenedor de desechos biopeligrosos.
  8. Retire ACN y TFA del tubo "B" con un flujo suave de N2 gas en un baño de agua de 45 ° c.
  9. Añadir 0,250 mL de ACN al tubo "B" utilizando un pipeteador de repetición, mezcla de vórtice para 4 − 5 s, y luego centrifugar brevemente (2 − 4 s) a 12.000 x g para recoger el líquido en la parte inferior del tubo.
  10. Añadir 0,750 mL de agua de DI ultrapura al tubo "B" utilizando un pipeteador de repetición con 5 mL de punta de capacidad, mezcla de vórtice para 4 − 5 s, y luego centrifugar durante 1 min a 12.000 x g para aclarar la muestra.
  11. Transferir 0,75 mL del sobrenadante a un vial de muestreador automático utilizando una pipería de desplazamiento de aire de 1.000 μL. Deseche las puntas de pipetas en el contenedor de desechos biológicos.
  12. Cap muestreador automático viales de forma segura y analizar por LC-MS/MS (sección 4). Transfiera la solución restante en el tubo "B" a los desechos peligrosos y deseche el tubo vacío en un contenedor de desechos biopeligrosos. Deseche todos los residuos biopeligrosos mediante la autoclave o la incineración.

3. muestras de control de calidad

PRECAUCIÓN: siga las advertencias descritas en la sección 2.

Nota: el siguiente procedimiento describe el número mínimo de muestras de control de calidad (QC) requeridas para un análisis. Se recomiendan réplicas en cada nivel si hay suficiente suero de mangosta de control disponible.

  1. Prepare cuatro tubos de microcentrífuga de 1,5 mL que contengan 200 − 300 mg de NaCl. Coloque los tubos en un bastidor de plástico de 80 posiciones.
  2. Para cada muestra de QC, etiquete dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL: uno como "A" y el otro como "B". Coloque los tubos en un bastidor de plástico de 80 posiciones.
  3. Repita el paso 2,3.
  4. Retire el suero mangosta de control del almacenamiento congelado y caliente a RT en el gabinete de bioseguridad. Vortex mezclar el suero de control antes del muestreo.
  5. Dispense 0,050 mL de suero de mangosta de control en los cuatro tubos "A" de 1,5 mL usando un pipeteador de repetición con una punta de capacidad de 0,5 mL.
  6. Fortifique cada una de las cuatro muestras de QC especificadas en la tabla 4 utilizando un pipeteador de repetición con una punta de capacidad de 0,5 ml. Tapa cada muestra de QC de forma segura y mezcla de vórtice para 10 − 15 s.
  7. Realice el procedimiento de extracción como se describe en los pasos 2.6 − 2.12.

4. Análisis de LC-MS/MS

  1. Configure el LC-MS/MS con todos los parámetros descritos en la tabla 5. Encienda el LC-MS/MS y permita que la columna alcance 70 ° c antes de ajustar el caudal a 0,800 mL/min.
  2. Configure una secuencia en el software de adquisición de datos (tabla de materiales) para inyectar la curva estándar antes y después de cada lote consistente en muestras de control de calidad y muestras desconocidas.
  3. Inyecte todas las normas y muestras y adquiera cromatogramas de iones MRM utilizando los parámetros enumerados en la tabla 5.
  4. Después de completar la secuencia, apague el LC-MS/MS y deseche todos los viales de muestreador automático como desechos peligrosos.

5. cuantificación

  1. Utilice el software de análisis de datos para generar una curva de calibración de respuestas relativas frente a concentraciones relativas para me-IPA utilizando et-IPA como norma interna. Calcule las respuestas relativas de la transición del cuantificador MRM para me-IPA (556,6 → 428,7) dividido por la transición MRM para et-IPA (570,7 → 442,7). Construya una curva de calibración de 7 niveles usando una función cuadrática de segundo orden que esté ponderada 1/x y ignore el origen.
  2. Calcular la concentración sérica (sueroC) de me-IPA utilizando la siguiente ecuación:
    Equation 1
    donde cinstrumento es la concentración determinada por el instrumento de la curva de calibración en unidades de μg/mL, 1,25 es el factor Equation 2 de dilución, vfinal es el volumen final de la muestra (1,0 ml), y elsuero en v es el volumen sérico en ml ( 0,050 mL nominal).

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile, Optima grade Fisher A996
Analytical balance Mettler Toledo XS204
C18 column, 2.1 x 50 mm, 2.5-µm particle size Waters Corp. 186003085
ESI Source Agilent  G1958-65138
Ethyl-iophenoxic acid, 97 % Sigma Aldrich N/A Lot MKBP5399V
Formic acid, LC/MS grade Fisher A117
LCMS software Agilent MassHunter Data Acquisition and Quantitative Analysis
Methyl-iophenoxic acid, 97 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR0709514717
Microanalytical balance Mettler Toledo XP6U
Microcentrifuge Eppendorf 5415C
MS/MS Agilent G6470A
N-Evap Organomation 115
Oral Rabies Vaccine Baits IDT Biologika, Dessau Rossleau, Germany N/A
Propyl-iophenoxic acid, 99 % (w/w) PR EuroChem Ltd. N/A Lot PR100612108RR
Repeat pipettor Eppendorf M4
Screw-top autosampler vial caps, PTFE-lined Agilent 5190-7024
Sodium chloride, Certified ACS grade Fisher S271
Statistical Software Package SAS Institute, Cary, North Carolina, USA N/A
Trifluoroacetic acid, 99 % Alfa Aesar L06374
UPLC Agilent 1290 Series
Vortex Mixer Glas-Col 099A PV6
0.2-mL pipettor tips Eppendorf 30089.413
0.5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.421
1.5-mL microcentrifuge tubes Fisher 14-666-325
1250-µL capacity pipette tips GeneMate P-1233-1250
1-mL pipettor tips Eppendorf 30089.43
2-mL amber screw-top autosampler vials Agilent 5182-0716
5-mL pipettor tips Eppendorf 30089.456
80-position microcentrifuge tube rack Fisher 05-541-2
8-mL amber vials with PTFE-lined caps Wheaton 224754
70 % (v/v) isopropanol Fisher A459
100-1000 µL air displacement pipette Eppendorf ES-100

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References

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