Visualização do Germinosomes e a membrana interna em esporos de Bacillus subtilis

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Bioengineering

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Summary

Cluster de proteínas do receptor germinant em 'germinosomes' na membrana interna dos esporos de Bacillus subtilis . Descreveremos um protocolo usando proteínas de repórter de microscopia e fluorescente super resolução para visualizar germinosomes. O protocolo também identifica domínios de membrana interna de esporo que preferencialmente são corados com o corante de membrana FM4-64.

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Wen, J., Pasman, R., Manders, E. M., Setlow, P., Brul, S. Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores. J. Vis. Exp. (146), e59388, doi:10.3791/59388 (2019).

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Abstract

O pequeno tamanho dos esporos e a relativamente baixa abundância de proteínas de germinação, causar dificuldades em suas análises microscópicas usando microscopia de epifluorescência. Super-resolução tridimensional estruturada iluminação microscopia (3D-SIM) é uma ferramenta promissora para superar este obstáculo e revelar os detalhes moleculares do processo de germinação de esporos de Bacillus subtilis (b. subtilis). Aqui, descrevemos o uso de um SIMcheck modificado (ImageJ)-processo de imagem 3D assistente e proteínas fluorescentes repórter para microscopia SIM de germinosomes dos esporos de b. subtilis , clusters de proteínas de germinação. Apresentamos também um procedimento de imagem 3D-SIM (padrão) para FM4-64 coloração das membranas de esporos de b. subtilis . Usando estes procedimentos, obteve resolução insuperável para a localização de germinosome e mostrar que > 80% de b. subtilis KGB80 esporos dormentes obtidos após esporulação no meio de MOPS mínimo definido têm um ou dois GerD-GFP e GerKB-mCherry focos. Focos luminosos também foram observados em FM4-64 manchado imagens de 3D-SIM dos esporos sugerindo que domínios de lipídios de membrana interna de fluidez diferente provável existirem. Mais estudos que usam dupla rotulagem procedimentos com corantes de membrana e germinosome proteínas repórter para avaliar localização co e, assim, obter uma óptima visão geral da organização das proteínas de germinação de Bacillus na membrana interna dos esporos são possível.

Introduction

Esporos das ordens Bacillales e Clostridiales são metabolicamente inativo e extraordinariamente resistente aos regimes de descontaminação dura, mas a menos que germinam, não podem causar efeitos deletérios em seres humanos1. Em nutriente germinant desencadeada germinação dos esporos de Bacillus subtilis (b. subtilis), o evento de iniciação é germinant ligação a receptores germinant (GRs), localizado na membrana interna do spore (IM). Posteriormente, as GRs transduce sinais à proteína de canal SpoVA também localizado no IM. Isso resulta no início da troca de esporo núcleo piridina-2,6-de ácido dicarboxílico (ácido dipicolínico; DPA; composto por 20% dos esporos núcleo seco wt) para a água através do canal SpoVA. Posteriormente, o lançamento DPA desencadeia a ativação da hidrólise de peptidoglicano do córtex, e absorção de água adicionais segue2,3,4. Esses eventos levam ao estresse mecânico sobre as camadas de revestimento, sua ruptura subsequente, o aparecimento de consequência e, finalmente, crescimento vegetativo. No entanto, os detalhes exatos moleculares do processo de germinação são ainda longe de resolvida.

Uma grande questão sobre a germinação dos esporos diz respeito as propriedades biofísicas dos lipídeos em torno das proteínas de germinação de IM, bem como as proteínas de canal SpoVA IM. Este imóvel em grande parte lipídica IM é a barreira de permeabilidade principal para muitas moléculas pequenas, incluindo preservativos químicos tóxicos, alguns dos quais exercem sua ação no núcleo do esporo ou no citoplasma de células vegetativas5,6. A bicapa lipídica IM é provável que em um estado de gel, embora haja uma fração significativa de lipídios móveis no IM5. IM do esporo também tem o potencial de expansão significativa5. Assim, aumenta a área de superfície do IM 1.6-fold sobre a germinação sem síntese de membrana adicional e é acompanhada pela perda de característico baixa permeabilidade e lipídios imobilidade5,6 de uma membrana.

Enquanto os detalhes moleculares da ativação de proteínas germinação e organização dos lipídios IM em esporos são temas atraentes para estudo, o tamanho pequeno de esporos de b. subtilis e a relativamente baixa abundância de proteínas de germinação, representam um desafio para análises microscópicas. Griffiths et al. evidências de microscópio de epifluorescência convincentes, usando fluorescentes repórteres fundidos às proteínas de germinação, sugere que em esporos de b. subtilis a proteína de andaime GerD organiza três subunidades GR (A, B e C) de GerA, B e K GRs, em um cluster7. Eles cunhou o termo 'germinosome' para este cluster de proteínas germinação e descreveu as estruturas como ~ 300 nm grande IM proteína focos8. Ao iniciar a germinação dos esporos, germinosome fluorescente focos, finalmente, transformar em maior dispersar padrões fluorescentes, com > 75% das populações esporo exibindo este padrão em esporos germinados para 1 h com L-valina8. Observe que o livro mencionado acima usado em média imagens de dezenas de fotos fluorescentes consecutivas, para ganhar poder estatístico e superar o obstáculo da baixos sinais fluorescentes observados durante a imagem latente. Esta visualização destas estruturas em esporos bacterianos foi no limite do que é tecnicamente viável com ferramentas microscópicas clássicas e nem uma avaliação da quantidade de focos em um único esporo nem foi sua localização subcellular mais detalhada possível com esta abordagem.

Aqui, vamos demonstrar o uso de estruturada iluminação microscopia (SIM) para obter uma visualização detalhada e quantificação do germinosome(s) em esporos de b. subtilis, bem como de seus IM lipídico domínios9. O protocolo também contém instruções para a esporulação, slide preparação e análise de imagens por SIMcheck (v 1.0, um plugin do imageJ) bem como ImageJ10,11,12.

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Protocol

1. b. subtillis esporulação (tempo: 7 dias antes da observação microscópica)

  1. Dia 1
    1. Marcam uma cultura bacteriana em um caldo de Luria-Bertani (LB) ágar placa (triptona 1%, extrato de levedura 0,5%, 1% de NaCl, 1% de ágar)13 e incubar durante uma noite a 37 ° C para obter colônias única. Use o KGB80 de b. subtilis (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry gato, kan de gerD-gfp) tensão e sua estirpe de fundo PS4150 de b. subtilis (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) conforme descrito anteriormente,7.
      Nota: O uso de esporos com o fundo de ΔcotEΔgerE é essencial na visualização de germinosome, a fim de minimizar a autofluorescência do esporo casaco camadas7.
    2. Esterilize todos os meios, tubos, pipetas e outros materiais de cultura a ser usado com métodos apropriados.
  2. Dia 2
    1. Inocular uma colônia única em 5 mL de meio LB de manhã cedo e incubar a cultura sob agitação contínua em um tubo de tampa de rosca a 200 rpm/min e 37 ° C até que o OD600 atinge 0.3-0.4 (aproximadamente 7 h).
    2. Fazer 500 mL do meio de MOPS (pH 7,5) contendo 3 nM (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0,4 μM H3BO3, 30 nM CoCl2·6H2O, 10 nM CuSO4·5H2O, 10 nM ZnSO4·7H2O, 1,32 mM K2HPO4, 0,4 mM MgCl2·6H2O, 0,276 mM K2então4, Filipa de 0,01 mM4·7H2O, 0,14 mM CaCl2·2H2O, 80mm MOPS, 4mm Tricine, O de22·2H MnCl 0,1 mM, 10 mM D-glicose-mono-hidratado e 10 mM NH4Cl.
    3. Prepare o MOPS médio cada na tampa de rosca tubos 10-1- 10-7 diluições em série da cultura LB em 5 mL e incubar as culturas durante a noite, sob agitação contínua em 200 rpm/min e 37 ° C.
      Nota: As diluições de série preparadas aqui visam obter uma diluição na fase exponencial cedo na manhã seguinte. Esta etapa e o próximo passo são necessárias para permitir que as células para se adaptar ao meio de crescimento no buffer de MOPS.
  3. Dia 3
    1. Selecione uma das diluições MOPS com uma OD600 de 0,3 a 0,4. Inocular 0,2 mL da cultura previamente aquecido (37 ° c) 20 mL de meio de MOPS num balão de Erlenmeyer de 250 mL e incubá-los sob agitação contínua até que o OD600 atinge 0.3-0.4 (~ 7 h).
    2. Inocular o meio de esporulação com base de MOPS (250 mL) com 1% (v/v) pré-cultura da etapa 1.3.1 e incubar durante 3 dias a 37 ° C num balão cónico litro sob agitação contínua. Para FM4-64 coloração de esporos PS4150, adicionar 2 µ g/mL FM4-64 ponta de prova (ver Tabela de materiais) a esporulação média 1 ou 2 h após atingir o pico, o valor de600 OD do crescimento vegetativo (geralmente aproximadamente 2) e permitir que a cultura de posteriormente esporular enquanto protegendo-o de luz5.
  4. Dia 7: Colheita de esporos
    1. Determine o rendimento de esporulação (esporos vs as células vegetativas) usando o microscópio de contraste de fase em ampliação de 100 X para distinguir os esporos brilhante fase de células em fase escura e esporos possivelmente não-maduras. Espera-se um rendimento de esporo brilhante fase de 90%.
    2. Granule os esporos a 4.270 x g durante 15 min a 4 ° C em tubos de centrífuga fundo redondo. Lave o pellet de esporo 2 - 3 vezes com 40 mL de água estéril de tipo 1 desmineralizada ultrapura em tubos de centrifuga conico de 50 mL (ver Tabela de materiais). Desativação da rotação em cada lavagem a 4.270 x g durante 15 min (4 ° C).
  5. Dia 7: Purificação de Spore
    1. Purificação de esporos: suspender o sedimento de esporos em 750 µ l de meio gradiente de densidade não iônico de 20% (ver tabela de materiais) e carregar até 800 µ l de 50% médio gradiente de densidade não iónico em tubos microcentrifuga esterilizado. Centrífuga para 60 min a 21.500 x g. O pellet obtido contém os esporos livre. Suspender o sedimento de esporos em 200 µ l de 20% médio gradiente de densidade não iônico e carregar em 1 mL de 50% médio gradiente de densidade não iónico em um tubo de microcentrifugadora e centrifugar por 15 min a 21.500 x g.
    2. Lavagem final esporo preparação e armazenamento: A pelota obtida contém os esporos dormentes purificados. Lave o pellet de esporo 2 - 3 vezes com 1,5 mL de ultra-pura estéril tipo 1 água (ver Tabela de materiais) e desativação da rotação entre a 9.560 x g durante 15 min a 4 ° C. Finalmente, suspenda o sedimento em água ultra-pura estéril do tipo 1 a um final OD600 de aproximadamente 30. Alíquotas dos esporos podem ser armazenadas a-80 ° C durante 8 semanas14.

2. remoção de camadas

  1. Tratar PS4150 esporos com 0,1 M NaCl/0.1 M NaOH/1% de sódio Dodecil sulfato (SDS) / 0.1 M ditiotreitol (DTT) a 70 ° C, durante 1 h. lavagem os esporos 10 vezes com esterilizado ultra-pura tipo 1 água15,16. Ao fazê-lo, qualquer adsorvido FM4-64 sonda na membrana exterior do spore e camadas externas serão removidas.

3. lamela e preparação de Slide11 (tempo: 1 H antes de observação)

  1. Lamelas previamente limpo de alta precisão (ver tabela de materiais) com 1 M HCl por 30 min em um banho de água agitando suavemente. Lavar as lamínulas duas vezes em água ultra pura do tipo 1 e armazená-los em 100% (vol/vol) EtOH. Deixe-os secar e verifique se a sua clareza antes do uso. Pre-limpar as lâminas de vidro em 70% EtOH. Deixe-os secar e verifique se a sua clareza antes do uso.

4. amostragem microesferas fluorescentes ou esporos no quadro Gene Slide10 (tempo de 15 Min)

  1. Pré-aquecer dois 70% EtOH limpos e corrediças de vidro seco (veja a tabela de materiais) do ar por alguns segundos em um bloco de aquecimento de 70 ° C, soltar 65 μL de esterilizado agarose 2%, mantido a 70 ° C, em cima de um vidro slide e colocar a outra lâmina de vidro em cima para espalhar a agarose b ntre os slides. O patch de agarose vai secar em cerca de 5 min.
  2. Corte o patch de agarose em uma seção de 1 x 1cm depois de remover um das lâminas de vidro, adicionar 0,4 μL da amostra (microesferas fluorescentes ou esporos de ~ 108/mL) e transferir o patch no sentido do lamela de alta precisão, colocando a lamela sobre o patch e deslizando-a fora.
  3. Corrigi um Gene Frame (1.5 x 1.6 cm2, 65 µ l) para o slide secado, no qual a lamela é colocada fechando todos os cantos da moldura, completando assim o slide para uso em microscopia.

5. imagem11,17(tempo: 1 H)

  1. Capturar as imagens de transmissão e fluorescência de esporos, bem como uma mistura de vermelho e verde-amarelo carboxilato-modificado microesferas fluorescentes em um microscópio de iluminação estruturada (ver tabela de materiais) equipado com um 100x (objetiva de óleo Abertura numérica = 1,49), um software de análise de imagem e câmera CCD (veja a tabela de materiais). Gere todas as imagens na temperatura de quarto sem a perturbação da luz ambiente. Certifique-se de limpar sempre a 100 x objetivo e o slide com 75% de etanol antes de imagem.
  2. Focar 100 nm (diâmetro) de microesferas fluorescentes e otimizar a função de ponto de espalhar (psf), ajustando o anel de correção no objectivo 100 x até à obtenção de um psf simétrico, minimizando assim o embaçamento da imagem. O psf é a resposta de impulso ou a resposta de um sistema de imageamento para um objeto de ponto ou ponto de origem.
  3. Selecione um campo de visão, com aproximadamente 10 rodadas microesferas fluorescentes. Aplicar uma grade foco ajuste para ambos 561 nm e 488 comprimentos de onda de excitação de nm como o guia para o software de análise de imagem.
  4. Concentrar os esporos com a luz de transmissão e capturar uma imagem de luz de transmissão no modo médio de 16 × com exposições de 200 ms para cada imagem.
  5. Capture imagens fluorescentes cru de 3D-SIM dos esporos com o modo de iluminação "3D-SIM", as configurações da câmera para o modo de leitura multiplicação de elétron (EM) ganho 10MHz em 14 bits e EM ganho no 175. Excite a sonda FM4-64 PS4150 esporos com 561 nm laser luz em 20% da potência do laser e um tempo de iluminação de 400 ms.
  6. Excitar o GerKB-mCherry e GerD-GFP em KGB80 esporos com, respectivamente, 561 nm laser luz no poder do laser de 30% para 1 s e 488 nm luz laser em 60% poder do laser para s. 3 Z-pilha configurações estão na parte superior para baixo modo, 0,2 µm / etapa, 7 passos e 20 passos para germinosome e Análise IM, respectivamente.
    Nota: Estes parâmetros foram aplicados a fim de garantir um valor de brilho máximo da janela de histograma de cerca de 4.000.

6. reconstruir imagens Raw 3D-SIM de FM4-64 manchado PS4150 esporos

  1. Realize a reconstrução de fatia N-SIM para o FM4-64 manchado dados brutos dos esporos PS4150. Clique no botão Param para Reconstruir a fatia na folha guia N-SIM almofada para abrir a janela de reconstrução de fatia N-SIM.
  2. Defina os parâmetros de reconstrução na janela de Reconstrução de fatia N-SIM . Para obter imagens reconstruídas perfeitas, siga a sugestão das instruções N-SIM e clique sobre os controles apropriados na janela de Reconstrução de fatia N-SIM para definir o Contraste de modulação de iluminação (IMC) para Auto, alta Supressão de ruído de resolução (HRNS) 1.00 e Fora de foco Blur supressão (OFBS) -0,05 como pontos de partida.
  3. Clique no botão Reconstruir fatia na janela de Reconstrução de fatia N-SIM para reconstruir a imagem. Avalie a qualidade das imagens reconstruídas pelas imagens de Fast Fourier transforma (FFT) e escore de reconstrução, que exibem após reconstrução12.
  4. Ajustar o HRNS de 0,10 a 5,00 e OFBS de 0,01 para 0,50 clicando sobre os controles apropriados na janela de Reconstrução de fatia N-SIM , até as melhores configurações de parâmetro são obtidas.
  5. Clique no botão aplicar na janela N-SIM fatia Reconstuction aplicar parâmetros alterados. Clique em fechar para fechar a janela.
  6. Fazer um FM4-64 manchada imagem crua de esporos de PS4150 ativa e clique no botão Reconstruir fatia na folha guia N-SIM Pad para executar a Reconstrução de fatia. Salve a imagem reconstruída.

7. análise de imagens

  1. Converter imagens de Pseudo-Widefield de germinosome a KGB80
    1. Converta imagens raw 3D-SIM de KGB80 em imagens de Pseudo-Widefield ativando com um clique esquerdo o ImageJ plugin SIMcheck utilitário SI de dados Raw para Pseudo-Widefield12. Pseudo-Widefield médias imagens a partir de dados brutos de SIM e monta, para comparação, uma imagem equivalente a widefield convencional iluminação12. Para ImageJ propriamente dito, consulte https://imagej.net/Welcome. Selecione aleatoriamente ~ 25 esporos em cada imagem invertida de transmissão para análise posterior de germinosome nas imagens de Pseudo-Widefield fluorescentes.
    2. Selecione em esporos de KGB80 total de aproximadamente 350 (no exemplo, 346) em 14 campos de visão de dois slides. Os números de focos fluorescentes GerD-GFP e GerKB-mCherry em esporos de KGB80 selecionados devem ser contados independentemente por dois pesquisadores. O pesquisador pode referir-se volta para as imagens raw de 3D-SIM, sempre que em dúvida da presença de focos de germinosome fluorescentes separadas em esporos.
    3. Avalie as intensidades máximas de cada foco de GerD-GFP e GerKB-mCherry e a intensidade integrada de imagem 3D de cada KGB80 do spore com ImageJ.
  2. Analisar imagens de Pseudo-Widefield de germinosome a KGB80
    1. Use o valor de média intensidade integrada de 7 pilhas como a intensidade de sinal integrado do spore da KGB80. Determine intensidades de plano de fundo da imagem latente da estirpe de fundo PS4150 usando configurações idênticas. Consideram pontos fluorescentes individuais KGB80 esporos de focos germinosome quando eles são claramente distinguíveis do fundo.
    2. Aplique One-Way ANOVA-testes para determinação de significância com software 9.0 de origem. Considerando valores P < 0,05 como estatisticamente significativo. Use o coeficiente de correlação de Spearman, o18 para avaliar a correlação do número de focos de GerD-GFP e GerKB-mCherry e as medições da intensidade de sinal integrado.

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Representative Results

O protocolo atual apresenta um procedimento de imagem de microscópio SIM por esporos bacterianos. Os procedimentos de preparação de esporulação e slide foram realizados conforme mostrado na Figura 1 antes de imagem. Mais tarde, os procedimentos de imagem e análise foram aplicados tanto para dim (proteína fluorescente etiquetada proteínas germinação) e brilhante esporo (sonda lipofílicos manchado IM) amostras conforme mostrado no texto a seguir.

Localização de germinosomes em esporos de b. subtilis

Níveis de DRGE e GerKB são relatados para ser moléculas 3.500 ~ e ~ 700 por esporos, respectivamente, com base nas análises de borrão ocidental dos extratos de esporos preparados em um médio rico esporulação19. Genes de gerD-gfp e gerKB-mCherry na estirpe de KGB80 estão sob o controle de seu promotor nativo. A baixa abundância relativa de proteínas da fusão levou a um sinal fluorescente baixo durante a imagem latente, por isso era difícil reconstruir tais imagens raw ofuscante do SIM pelo algoritmo de reconstrução SIM. No entanto, o microscópio SIM ainda foi aplicado para a aquisição de imagem de germinosome, embora as imagens raw de SIM foram convertidas em imagens de Pseudo-Widefield por SIMcheck (ImageJ plugin). Além disso, uma imagem em 3D sete pilha foi implementada para obter uma melhor visão de foco este IM. Como mostrado no painel da esquerda da Figura 2, dois focos de GerD-GFP apareceram em pilhas diferentes. O, no total, três focos de GerD-GFP são indicados pelas setas brancas na pilha de Z3 compositive da coluna. O painel da direita da Figura 2 mostra um esporo com apenas um ponto focal de GerD-PIB no spore como evidenciado pela seta branca na pilha de composto da coluna Z4. No total, cerca de 40% e 50% dos esporos tinham dois ou cluster um GerD-GFP e GerKB-mCherry, respectivamente (tabela 1). Entre os 346 esporos examinados, dois tinham 4 focos de GerD-GFP, e um esporo sequer tinha 5 focos de GerD-GFP. Visivelmente, nas nossas mãos, o número de focos de GerD-GFP e GerKB-mCherry no spore da mesmo não eram sempre os mesmos18. Como o microscópio SIM não tinha nenhuma opção de contraste de fase, usamos a microscopia de luz de transmissão para localização de esporos. Assim, os esporos aparecem com um escuro e denso núcleo cercado por um halo mais brilhante.

A intensidade de fluorescência integrado de esporos KGB80 foi medida pelo ImageJ. Esporos, que tinham 0, 4 ou 5 focos não foram incluídos em nossa análise estatística devido a sua baixa frequência. Houve uma alta correlação positiva entre a DRGE-GFP e intensidades integrado GerKB-mCherry (coeficiente de correlação de Spearman = 0,73). Enquanto a intensidade integrada da proteína GFP-GerD andaime foi diferente entre diferentes populações (Figura 3), a intensidade integrada de GerKB-mCherry era o mesmo em diferentes populações (Figura 3D). A intensidade de fluorescência máxima de GerD-GFP e GerKB-mCherry focos tende a diminuir, quando o esporo tinha vários focos (Figura 3A, B). A fluorescência máxima de todos os pontos brilhantes, considerados como focos de germinosome, era maior do que a autofluorescência máxima de esporos PS4150 (esporos da estirpe fundo KGB80; Figura 3A B).

Organização da membrana interna

Como mencionado na introdução, germinosome proteínas localizam-se no IM do spore. No entanto, poucos detalhes são conhecidos sobre as propriedades biofísicas desta membrana largamente imóvel. Explorar mais detalhes, tais como a organização local do IM, iria promover a compreensão da organização das proteínas IM, em particulares GRs e proteínas de canal. Esporos de b. subtilis têm uma estrutura composta por várias camadas concêntricas, e uma sonda lipofílica não pode facilmente passar por estas várias camadas para manchar o IM em torno do núcleo do esporo. A passagem de tais sondas provavelmente é dificultada pelas camadas de revestimento rico em proteínas e talvez também a membrana externa de20,21. Para superar este problema, o corante lipofílico membrana FM4-64 foi adicionado a uma cultura de PS4150 durante a esporulação. Ao fazê-lo, membrana da célula vegetativa de PS4150 foi manchada por FM4-64, e assim, membranas em forespores obtidas desta cultura na esporulação assimétrica a divisão celular e com a duração de forespore subsequentes são bem manchadas5. Consequentemente, as membranas do esporo maduro podem ser visualizadas. Um estudo anterior indicou que a maioria se não todos o FM4-64 no IM em esporos limpos5. Durante um período de cerca de 2 semanas de incubação e tratamentos de purificação de esporos, os procedimentos de lavagem aplicados retire qualquer FM4-64 a membrana externa, o último efetivamente sendo removido após o tratamento de emulsão e extensa de etapas de lavagem 5. no entanto, o procedimento de emulsão remove o IM não FM4-64, nem tem qualquer efeito sobre os focos de germinosome5,6. O animado nos é que mais brilhante FM4-64 pontos semelhantes aos focos de germinosome apareceram em ambos intactos (Figura 4A, B) e decoated de esporos (Figura 4, D) de esporos PS4150. Essas manchas FM4-64 mais brilhantes podem estar envolvidas no agrupamento de germinosome proteínas no IM.

Figure 1
Figura 1: visão geral de preparação de esporulação e slide. Uma visão geral exibindo os passos iniciais necessários antes de imagem. Informações detalhadas é dada no protocolo. Médio (A), o esquema do processo de esporulação em MOPS mínimos definidos. Um PS4150 de b. subtilis (PS832 ΔgerE::spc Δcosta::tet) ou KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat kan gerD-gfp) única colônia foi cultivada em 5 mL de meio rico LB e adaptado em 5 mL e 20 mL de MOPS médio, por sua vez e finalmente esporulada em 250 mL de MOPS médio. Uma cultura de início fase exponencial (OD600, 0.3-0.4) é usada em todas as culturas intermediárias. FM4-64 (2 µ g/mL) foi adicionado ao meio de esporulação de PS4150 para a membrana do esporo coloração 1 ou 2 h após atingir o valor de600 de OD de pico. (B) método de colheita de esporos de cultura de esporulação MOPS e purifying esporos por centrifugação gradiente de densidade. (C) procedimento de estabilização esporos na almofada de agarose 1% em uma câmara de quadro de gene. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Pseudo-Widefield representativa (PWF) 3D imagens de GerD-GFP e GerKB-mCherry focos em imagens raw dos dois KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat kan gerD-gfp) dormente esporos 3D-SIM foram tiradas com excitação de canal duplo (561nm, poder do laser de 30%, 1 s e 488nm, 60% do poder, 3 s) usando 7 passos de cima para baixo de pilhas de Z. Posteriormente, as imagens raw de SIM foram convertidas em imagens 3D de Pseudo-Widefield pelo ImageJ plugin SIMcheck. Da esquerda para a direita, 3D imagens (Z2-Z5) de GerD-GFP (verde), GerKB-mCherry (vermelho) e as correspondentes imagens compostas de dois KGB80 esporos (i e ii) são mostradas no painel. Imagens de luz de transmissão (Trans) de dois esporos (i e ii) indicaram a localização dos esporos que aparecem como imagens densas trevas rodeadas por um halo mais brilhante. Barra de escala = 1 µm e todos os painéis são a mesma ampliação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: a intensidade de fluorescência máxima de GerD-GFP em KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat kan gerD-gfp) de esporos dormentes e a máxima autointensidade da fluorescência de esporos PS4150 em unidades arbitrárias. Todos os esporos foram iluminados pelas configurações indicaram no protocolo. Painéis (A) e (B) mostram a intensidade de fluorescência máxima dos focos de GerD-GFP e GerKB-mCherry, respectivamente, em KGB80 esporos dormentes, bem como em ambos os casos a intensidade máxima autofluorescência dos esporos pai PS4150. Painéis (C) e (D) mostrar a intensidade de fluorescência integrado dos focos de GerD-GFP e a intensidade de fluorescência integrado dos focos de GerKB-mCherry, respectivamente, em b. subtilis KGB80 esporos dormentes. Usamos o One-Way ANOVA-testes para determinação de significância das diferenças na intensidade máxima ponto focal e intensidades de fluorescência esporo integrado com software de origem 9.0 considerando valores P < 0,05 como significativos. Esporos com 4 ou 5 focos foram excluídos da análise por causa de sua baixa abundância. Os dados são representados em boxplots entalhado. Os entalhes nas tramas são em torno dos valores de mediana observados com sua largura proporcionais ao intervalo interquartil (IQR). Os bigodes mostrados representam um máximo de 1,5 a IQR. Asteriscos indicam uma diferença significativa de valores medianos. GerD-GFP e intensidades de fluorescência integrado GerKB-mCherry têm uma forte correlação positiva (coeficiente de correlação de Spearman = 0,73)18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Pseudo-Widefield representativa (PWF) imagens (A e C) e reconstruído SIM (B e D) do FM4-64 manchado IM de PS4150 de b. subtilis (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) esporos. FM-464 de esporos foi incorporado durante a esporulação. Imagens raw 3D-SIM de esporos intactos (A e B) e decoated esporos (C e D) foram tiradas com a excitação de um canal (561 nm laser, poder do laser de 20%, 400 ms) usando uma 25 passo de cima para baixo Z-pilha. Posteriormente, os dados brutos do SIM foi reconstruídos por microscópio software de imagem (consulte a Tabela de materiais) em imagens 3D-SIM, ou convertido em PWF por SIMcheck (ImageJ plugin). As setas ciana apontam para FM4-64 focos no IM em painel B e D. Barra de escala = 1 μm e todos os painéis são a mesma ampliação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estirpe Esporos contados Focos Focos por esporos (%)
0 1 2 3 4 5
KGB80 346 GerD-GFP 2 46 40 11 1 0
GerKB-mCherry 2 53 40 5 0 0

Tabela 1: Presença de focos em esporos KGB80. O número de focos de germinosome por esporos em uma população de dual rotulado KGB80 de b. subtilis (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry gato gerD-gfp kan) esporos dormentes. Fluorescência em esporos foi contabilizada como focos de germinosome quando a intensidade máxima de um focus foi maior do que a intensidade de fluorescência-auto, que era a intensidade máxima de PS4150 (PS832 ΔgerE::spc Δcosta::tet) animado com as mesmas configurações de iluminação como os esporos de KGB80 de esporos dormentes.

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Discussion

O protocolo apresentado contém um procedimento padrão do 3D-SIM para análise de FM4-64 manchadas de esporos de b. subtilis que inclui esporulação, preparação de slide e processos de imagem. Além disso, o protocolo descreve um SIMcheck modificado (ImageJ)-assistida de processo para microscopia SIM de b. subtilis esporo germinosomes rotulado com fluorescentes repórteres de imagem 3D. O último procedimento nos permitiu observar esta subestrutura ofuscante com contraste aprimorado. Pelo acoplamento de dois procedimentos de imagem, é possível visualizar discretas sub estruturas em spore da mesma com o microscópio SIM mesmo, melhorando assim a nossa base para uma compreensão mecanicista do processo de germinação. Observe que o procedimento opera com uma resolução lateral de ~ 100 nm e uma resolução axial de ~ 200-250 nm. Isto é melhor do que a abordagem de campo amplo microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) usada por Griffith7. Tempo resolvidos análise de germinosome aparência ao iniciar a germinação seria um próximo passo desejado. Infelizmente, embora SIM microscopia é em princípio compatível com live-imaging, devido à sua natureza fraca a germinosome sinais tal SIM tempo-resolvido, as análises não são viáveis por causa descoramento rápido das amostras durante a aquisição de imagens. A fim de obter suficientes esporos para análise, é crucial certificar-se que esporulação eficientemente está ocorrendo. Pesquisadores, portanto, devem verificar a eficiência de esporulação meticulosamente com 90% de eficiência como o destino. Nos resultados do representante, em esporos dormentes, respectivamente ~ 50% e 40% de todos os esporos têm um ou dois GerD-GFP e focos de GerKB-mCherry (tabela 1). A percentagem de esporos com dois focos é muito maior do que o relatado por Griffiths anteriormente7. Há várias razões que podem explicar o resultado diferente no trabalho atual. Em primeiro lugar, o processo de geração de imagens em 3D poderia facilitar a detecção de focos mais. Diferentes focos no spore da mesmo estão localizados em locais diferentes na direção vertical, conforme mostrado na Figura 1. Em segundo lugar, a câmera do CCD (Tabela de materiais) e a unidade de laser equipado para o microscópio SIM contribuam significativamente para os resultados de imagem. Terceiro, semelhante ao abordagem7 a médias dezenas de imagens consecutivas para melhor análise de imagem de Griffiths, a imagem de Pseudo-Widefield do germinosome era também uma imagem média de imagens raw de SIM (5 fases e 3 orientações de imagens). Finalmente, o meio de esporulação e esporulação condições, uma variável importante na determinação de propriedades de esporos, são diferentes no nosso trabalho do utilizado anteriormente. Griffiths et al7 usado 2 rico x de Schaeffer-glicose (2 x SG) médio para esporulação, enquanto um MOPS mínimo definido no buffer médio foi empregado aqui. Vários trabalhos têm demonstrado que as condições e meio de esporulação têm efeitos significativos sobre a composição da proteína, resistência, e germinação de b. subtilis esporos22,23,24 , 25. com efeito, tem sido demonstrado que os níveis de subunidades GR são 3 - a 8 vezes menor em esporos obtidos num meio pobre contra aqueles obtidos na rica e médias. GerD níveis também foram cerca 3.5-fold menores no pobres médios esporos, e estes esporos levaram mais tempo para iniciar a germinação de esporos26. No entanto, isso não está claro se condições de esporulação também influenciam o número de focos observados germinosome.

Ramirez-Peralta et al..' s resultados26 indicado que taxas de nutriente germinação dos esporos nos níveis de população são influenciadas significativamente os níveis de proteínas germinação e DRGE. Se as intensidades fluorescentes integradas por esporos de repórteres fluorescentes são diretamente proporcionais aos níveis de proteínas da fusão GerD e GerKB, níveis de ambas as proteínas da fusão diferem amplamente em esporos KGB80, que está de acordo com trabalhos anteriores 7. Esta heterogeneidade de nível de proteína pode estar relacionada à heterogeneidade de germinação de esporos observada a nível único esporo, e o número de focos de germinosome pode ser um outro fator que contribui para a heterogeneidade de germinação dos esporos. Mais experimentos incidirá sobre uma análise dos possíveis efeitos que germinosome o número de focos e composição de proteína de germinação focos (nem todos os germinosomes podem ser iguais na composição de proteína de germinação) poderia ter na heterogeneidade de germinação. Os dados deram origem a uma série de perguntas de pesquisa atual incluindo: eu) qual é o papel da DRGE no agrupamento de GRs no IM; e ii) são como os dois outros GRs, GerA e GerB, organizado em spore da IM?

O protocolo apresentado para amostras de esporos escuros e brilhantes torna possível visualizar discretas sub estruturas no spore mesmo pela microscopia SIM. As manchas brilhantes FM4-64 que foram observadas em esporos podem ser devido à extensa de dobramento da IM27. Alternativamente, nós hypothesize que estas regiões são áreas do IM onde o corante mais facilmente poderia ter acesso ao devido à maior fluidez IM local. Tais regiões de fluidez aumentada (RIFs) podem ser organizados pelo homólogo do citoesqueleto de actina MreB, conhecido pela sua concentração de fluido acila curta cadeia lipídios28,29. Visivelmente, aplicando o mesmo procedimento para o selvagem-tipo b. subtilis spores também leva a um padrão semelhante de pontos brilhantes de FM4-64 (nossas observações não publicadas). Nas células vegetativas de b. subtilis , um potencial de membrana recolhido resulta no agrupamento de MreB e RIFs29. A membrana interna de esporos dormentes provavelmente tem uma relativa baixa membrana potencial20,21 e contém níveis detectáveis de MreB30 que poderiam nos levar para o agrupamento de RIFs em maiores domínios de alta fluidez29 . Se tais domínios poderiam coincidir com a presença de germinosomes está atualmente sob investigação.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Os autores agradecer Christiaan Zeelenberg por sua assistência durante a imagem SIM. JW reconhece Conselho de bolsa da China para uma bolsa de doutorado e obrigado Irene Stellingwerf por sua ajuda durante a fase primária da imagem.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air dried glass slides Menzel Gläser 630-2870
APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
Erlenmeyer flasks 1 L Sigma-Aldrich Z567868
Erlenmeyer flasks 250 mL Sigma-Aldrich Z723088
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres Invitrogen, 0.1 μm F8803
FM4-64 Thermo Fisher Scientific F34653
Histodenz nonionic density gradient medium Sigma-Aldrich D2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera Andor Technology https://imagej.net/Welcome
LB Agar Sigma-Aldrich L2897
Microfuge tubes 1.5 mL Thermo Fisher Scientific 3451PK
Microscope imaging software Nikon, Japan NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water Millipore Milli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti microscope
Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL Thermo Fisher Scientific 75003800
Precision Coverslips Paul Marienfeld 117650
Round Bottom tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific Nunc TM
Screw cap tubes 50 mL Thermo Fisher Scientific Nunc TM

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References

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