Inducibles, expresión de específicas del tipo celular en Arabidopsis thaliana mediada a través de LhGR Trans-activación

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Aquí, describimos la generación y aplicación de un conjunto de transgénicas de Arabidopsis thaliana líneas de expresión inducible, tejidos específicos que en los tres principales meristemos, el meristemo apical de brote, el meristemo apical de raíz y el cambium.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

López-Salmerón, V., Schürholz, A. K., Li, Z., Schlamp, T., Wenzl, C., Lohmann, J. U., Greb, T., Wolf, S. Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation. J. Vis. Exp. (146), e59394, doi:10.3791/59394 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Expresión inducible, tejidos específicos es una herramienta importante y poderosa para el estudio de la dinámica espacio-temporal de la perturbación genética. Combinando el GreenGate flexible y eficiente con el probada y éxitosos LhGR sistema (aquí denominado GR-LhG4) para la expresión inducible de clonación, hemos generado un conjunto de líneas transgénicas de Arabidopsis que puede conducir a la expresión de una unidad de efectos cassette en una gama de tipos específicos de la célula en los meristems planta principal tres. Para ello, elegimos el sistema GR-LhG4 previamente desarrollado basado en un factor de transcripción quimérica y un promotor de cognado pOp tipo garantizando un control estricto sobre una amplia gama de niveles de expresión. Además, para visualizar el dominio de expresión donde está activo el factor de transcripción sintética, un reportero fluorescente mTurquoise2 ER localizada bajo el control del promotor pOp4 o pOp6 está codificado en líneas de controlador. Aquí, describimos los pasos necesarios para generar una línea de conductor o efectoras y demostrar cómo expresión específica de tipo celular puede ser inducida y seguida en el meristemo apical de brote, el meristemo apical de raíz y el cambium de Arabidopsis. Mediante conductor varias o todas las líneas, el efecto específico del contexto de expresar uno o varios factores (efectores) bajo control del promotor sintético pOp puede evaluarse rápidamente, por ejemplo en las plantas de la F1 de un cruce entre un generador de efectos y múltiples líneas de controlador. Este enfoque se ejemplifica por la expresión ectópica de VND7, un factor de transcripción NAC capaces de inducir la deposición de pared de célula secundaria ectópico de manera autónoma de la célula.

Introduction

Una limitación importante en biología en la era postgenómica es descifrar el papel específico del contexto de un determinado factor o perturbación genética. Perturbaciones genéticas constitutivas como los enfoques de la función de pérdida y ganancia de función a menudo sólo permiten el análisis de punto final de los procesos de adaptación permanente, ofuscación de la distinción entre efectos primarios y secundarios. Además, funciones específicas de contexto pueden ser enmascaradas o diluidas por efectos de gran escala en los tejidos distantes o durante otras fases del desarrollo. Por otra parte, en casos extremos, la mortalidad puede impedir cualquier idea mecanicista. Idealmente, para evitar estos problemas, uno podría analizar el efecto de perturbación genética aguda dentro de un contexto específico como un tipo de células específicas de una manera tiempo-resolved. Para lograr esto, herramientas genéticas de expresión inducible, de tipo específico de célula son necesarios1. Para proporcionar un recurso para la evaluación rápida de la dinámica espacio-temporal de una respuesta a un determinado efector, hemos combinado la facilidad de clonación proporcionados por el sistema de GreenGate2 con la eficacia probada de la GR-LhG4 sistema3, 4,5,6. Hemos generado un conjunto de líneas que expresan el factor de transcripción quimérica LhG4 fusionados con el dominio de unión de ligando de la rata por corticoides tópicos del receptor (GR)7 bajo el control de la célula bien caracterizado tipo promotores específicos8. En condiciones de reposo, el factor de transcripción permanece fuera del núcleo, como el dominio GR está limitado por la HSP90 citosólica. Con la adición de dexametasona (Dex) de ligando sintético, se induce translocación nuclear y LhG4 se median la transcripción de las cassettes de expresión bajo control de un promotor de cognado sintético tipo pOp , como un reportero de mTurquoise2 dentro de las líneas piloto para visualizar el dominio de la expresión después de la inducción.  Así, las líneas de conductor técnico también contienen un casete del efector. El cruce de un conjunto de líneas de conductor con una línea con un casete de efectores con, por ejemplo, un gen de interés bajo el control del mismo tipo de pOp promotor así permite la evaluación rápida de las consecuencias agudas o a largo plazo de la expresión de efector en una amplia gama de tipos celulares.

Presentamos un protocolo que describe los procedimientos necesarios para generar las líneas de controlador y generador de efectos y demostrar cómo expresión específica de tipo celular puede ser inducida y seguida en el meristemo apical de brote, el meristemo apical de raíz y el cambium de Arabidopsis. Para ilustrar la destreza y la especificidad de este enfoque, utilizamos el factor de transcripción conocido VND7 que es capaz de conducir ectopically engrosamientos de pared de célula secundaria de xilema como9. Tratamiento de la F1 de un cruce entre la línea de conductor11 pSCR10,y la línea de efectos de pOp6:VND7 conduce a la formación ectópica xilema-como las células de la vaina de almidón células de Arabidopsis del tallo.

Para facilitar la generación de grandes conjuntos de ADN necesaria para la construcción de plásmidos de expresión controlador y generador de efectos, utilizamos la rápida y eficiente GreenGate clonación método2. Clonación de GreenGate es basado en enzimas de restricción tipo II S como Eco31I o su isoschizomer Bsay2. Estas enzimas cortan río abajo de sus sitios de reconocimiento asimétrica produciendo proyecciones con diferentes composición de base. Mediante la incorporación de Eco31I /Bsasitios de restricción en oligonucleótidos y asignar secuencias de proyección específica para elementos de ADN, clonación modular se obtiene, facilitando la generación de grandes ensamblajes. En el marco de GreenGate, módulos de ADN se dividen en categorías A-F basado en proyección de la secuencia que sirven como adaptadores y se montan en ese orden. Por lo tanto, los cebadores diseñados para amplificar el producto deseado deben ser según el módulo seleccionado2 (figura 1A). Si hay una interna Eco31IBsadel sitio y la secuencia no es compatible con los módulos de entrada y destino de GreenGate, puede continuar sin mutagenizing, pero con menor eficiencia. Como alternativa, utilice mutagénesis sitio-dirigida para quitar Eco31I /Bsasitios de restricción teniendo cuidado de no para cambiar los aminoácidos en los productos del gene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Vectores y módulos pueden obtenerse desde el repositorio sin fines de lucro, Addgene (https://www.addgene.org).

1. clonación usando GreenGate

  1. Cartillas de diseño utilizando los voladizos enumerados en la tabla 1, reemplazando 'NNNN' con secuencias específicas del tipo adaptador de módulo listados abajo: adelante: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + 3´ de secuencia específica, invertir: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + reversa complemento de secuencia específica 3´. Añadir las bases subrayadas para garantizar el mantenimiento del marco de lectura.
    Voladizos de módulo:
    Nota: en el marco predeterminado de GreenGate, seis módulos, A-F, vienen ensamblados con un esqueleto de planta transformación vector plásmido de una expresión (figura 1). Por lo general, un módulo albergan secuencias de promotor, módulo B un N-terminal etiqueta o "dummy" secuencia6, un módulo de C un CD, una etiqueta D-módulo C-terminal o dummy, un módulo de E un adaptador y un módulo de F una cinta de resistencia para la selección de transgénicos plantas. Adaptador para la conexión con otras unidades de Confecciones están disponibles para su uso en lugar de la F módulo2.
  2. Amplificación por PCR
    1. Amplificar la secuencia de interés con los cebadores diseñados por reacción en cadena de polimerasa (PCR) según protocolos estándar.
    2. Separar el producto PCR en un gel de agarosa. Impuestos y columna purifican el fragmento correcto usando un comercial kit (véase Tabla de materiales) según las instrucciones del fabricante.
  3. Creación de módulo de entrada
    1. Digerir por separado el vector de módulo y el fragmento de la polimerización en cadena (paso 1.2). (Figura 1 A, B) con Eco31I/Bsautilizando de 100-500 ng de ADN (vectores o fragmento), 3 μl de 10 x buffer de digestión y 5-10 U Eco31I en un tubo y llevar el volumen a 30 μL con ddH2O.
    2. Mezcla suavemente por pipeteo arriba y abajo y girar hacia abajo brevemente a 1.000 x g. Incubar a 37 ° C en un bloque de calor durante 15 min (o siguiendo la recomendación de tiempo de la enzima de restricción de compra).
    3. Después de la digestión, columna purificar cada muestra usando un comercial kit (véase Tabla de materiales) y cuantificar el ADN obtenido mediante la determinación de la densidad óptica a 260 nm (OD260) utilizando un espectrofotómetro.
    4. Mezcla el 30 – 100 ng digerido inserto y el vector de 10 – 50 ng digerido mediante pipeteo arriba y abajo varias veces e incubar con 1 μl de T4 ligasa (5 U/μl y 3 μl 10 x buffer de la ligadura de T4 en un volumen total de 30 μl a temperatura ambiente durante 1 hora (siguiendo las recomendaciones de los proveedores de la ligasa de T4) (véase Tabla de materiales).
      Nota: Calcular el vector de módulo: destino de entrada deseado cociente molar (por ejemplo, 3:1) para la ligadura dependiendo de la concentración y la duración de los rellenos de módulo de entrada.
    5. Para aumentar la eficiencia de transformación, Inactive por calor la ligasa de T4 por incubando la reacción a 65 ° C por 20 min.
    6. Uso el producto de la ligadura para transformar competentes de e. coli las células según los protocolos de laboratorio estándar y propagación de las bacterias en placas de agar suplidas con ampicilina (100 μg/mL)
    7. Incube la placa con bacterias a 37 ° C durante la noche a la mañana.
    8. Pantalla de colonias con el módulo de entrada deseada por Colonia PCR utilizando los cebadores 86A1 (5-GTTGTGTGGAATTGTGAGC-3 ') y 86A2 (5-GTTTTCCCAGTCACGACG-3 ') y condiciones PCR estándar.
      Nota: Esta combinación de la cartilla es válida para todos los módulos de entrada como los cebadores se unen a la columna vertebral de vector de entrada.
    9. Seleccione colonias solo para el aislamiento de plásmidos. Uso de cultivo líquido 2 mL LB con ampicilina (100 μg/mL) e incubar durante una noche en un agitador de 37 ° C.
    10. Plásmidos aislados de la cultura de líquido durante la noche con un mini-Prep Kit o la extracción deseada protocolo (véase Tabla de materiales).
    11. Para identificar los plásmidos con el inserto correcto, realizar análisis de enzima de la restricción, por ejemplo seleccionando dos enzimas que cortan únicamente en su dispositivo mediante la mezcla de 200 ng de plásmido, 2 μl de 10 x buffer de digestión, 5-10 U de seleccionar enzimas de restricción y ddH2 O a 20 μl.
    12. La secuencia de la plásmidos seleccionada utilizando los cebadores 86A1 y 86A2 (ver paso 1.3.9.).
  4. Creación de módulo de destino:
    Nota: Para el plásmido de destino utilice el destino deseado módulo pGGZ001, pGGZ002 o pGGZ0032 (figura 1).
    1. En un tubo de añadir y mezclar vector de destino vacía de 50 – 150 ng (pGGZ003, por ejemplo), lleno de 50-300 ng de cada módulo de entrada, 2 μl de 10 x buffer de buffer de digestión, 1,5 μl de 10 mM ATP, 1 μl de T4 ligasa (30 U/μL), 5-10 μl de U Eco31I y dH2O hasta un volumen total de 20 μl.
      Nota: Calcular el vector de módulo: destino de entrada deseado cociente molar (p. ej. 3:1) para la ligación dependiendo de la concentración y la duración de los rellenos de módulo de entrada.
    2. Mezclar y llevar a cabo la reacción de GreenGate2 utilizando un termociclador PCR alternando 30 veces entre 37 ° C por 5 min y 16 ° C por 2 min, seguido de pasos individuales de 5 minutos a 50 ° C y a 5 minutos a 80 ° C.
    3. Para aumentar la eficiencia, añadir 1 μl de T4 ligasa (30 U/μL) y 1,5 μl de 10 mM ATP a la reacción e incubar 1 h a temperatura ambiente, seguido de calor-inactivación de T4 ADN ligasa a 65 ° C por 20 min.
    4. Utilizar la reacción de la ligadura para transformar competentes de e. coli y trasmitir las bacterias en placas de agar suplidas con la espectinomicina agente selectivo apropiado (50 μg/mL).
    5. Incubar la transformada e. coli de la placa a 37 ° C durante la noche.
    6. Para confirmar la transformación, raya a cada una de las colonias solo seleccionadas de espectinomicina (50 μg/mL) y ampicilina (100 μg/mL) que contiene las placas, respectivamente. Utilice sólo las colonias que crecen en espectinomicina pero no en las placas de la ampicilina.
    7. Incubar las colonias de e. coli durante la noche a 37 ° C.
    8. Seleccione colonias solo para el aislamiento del plásmido. Uso de cultivo líquido 2 mL LB suplementado con espectinomicina (50 μg/mL) e incubar durante una noche en un agitador de 37 ° C.
    9. Aislar la plásmidos correspondiente con un Kit de mini-Prep (véase Tabla de materiales).
    10. Comprobar por análisis de enzima de restricción (ver 1.3.12.) y secuencia positivas construcciones utilizando primers 88 3 (5-ACCTCTCGGGCTTCTGG-3 '), 88 4 (5-CCTTTTTACGGTTCCTG-3 '). Si el inserto no puede ser completamente secuenciado con estos iniciadores, diseño internos iniciadores para la secuenciación.
      Nota: Para identificar los clones con el número correcto de pOp secuencias de la repetición (ver discusión), los primers pOp6 (_FpOp6, 5-TGCATATGTCGAGCTCAAGAA-3 '; y _R pOp6, 5-CTTATATAGAGGAAGGGTCTT-3 ') que se unen en la definitiva que flanquean las secuencias puede utilizarse para que la amplificación por PCR y posterior electroforesis para discriminar por tamaño.
  5. Creación de supermodule intermedio
    1. Combinar dos conjuntos independientes de módulos de entrada, según sea necesario para generar las GR-LhG4 controlador líneas con cassette integrado reportero-efector, primera construcción dos plásmidos intermedios, llamadas supermodules2, antes de montar la expresión final plásmido en pGGZ001 o pGGZ003.
    2. Asegúrese de añadir adaptador F-H al final de la primera supermodule y adaptador de H A en el principio de la segunda supermodule (ésos sirven como conexiones entre dos constructos) como describe2.
      Nota: Sólo el módulo intermedio pGGN000 lleva la cinta de resistencia. Para generar el plásmido de expresión, realizar la reacción de GreenGate con el vector de destino y las supermodules intermedias pGGN000 y pGGM000. Alternativamente, mezclar vector destino supermodule intermedia pGGN000 y los restantes módulos para llevar a cabo la reacción de GreenGate2. Este último método es menos eficiente que el anterior pero puede ser más rápido.
    3. Para crear un pGGM000/pGGN000 supermodule, mezclar 1,5 μl (100-300 ng/μL) de cada uno de los módulos de entrada con 1 vector intermedio vacío μl (30 ng/μL) (pGGM000 o pGGN000), 2 μl de tampón de digestión 10 x, 1,5 μl de 10 mM ATP, 1 μl de T4 ligasa (30 U/μL) y 5-10 U Eco31I en un volumen total de 20 μl.
      Nota: Calcular el vector de módulo: destino de entrada deseado cociente molar (por ejemplo, 3:1) para la ligadura dependiendo de la concentración y la duración de los rellenos de módulo de entrada
    4. Mezclar y llevar a cabo la reacción de GreenGate en paso 1.4.2
    5. Para aumentar la eficiencia, añadir 1 μl de T4 ligasa y 1,5 μl ATP (10 mM) e incubar 1 h a temperatura ambiente, seguido de calor-inactivación a 65 ° C por 20 min.
    6. Utilice 10 μl de la reacción de la ligadura para transformar competentes de e. coli y raya de las placas que contiene kanamicina (50 μg/mL).
    7. Realizar la incubación de la transformada de e. coli de la placa a 37 ° C.
    8. Volver a raya cada una de las colonias seleccionadas solo kanamicina (50 μg/mL) y ampicilina (100 μg/mL) que contiene las placas, respectivamente.
    9. Realizar la incubación de las colonias de e. coli de la placa a 37 ° C.
    10. Seleccionadas solo las colonias que crecen sólo en kanamicina pero no en ampicilina para el aislamiento del plásmido. Uso de cultivos líquidos de 2 mL LB con kanamicina (50 μg/mL) e incubar durante una noche en un agitador de 37 ° C.
    11. Aislar la plásmidos correspondiente mediante un mini-prep kit (véase Tabla de materiales).
    12. Compruebe la plásmidos por análisis de enzima de restricción (ver 1.3.12). y para confirmar la secuencia utilizando iniciadores 87E2 (5´-AGGCATCAAACTAAGCAGAAG-3´) y 87E3 (5´-CGTTTCCCGTTGAATATGGC-3´) recocido al backbone de pGGM000/pGGN000. Si el inserto no puede ser completamente secuenciado con estos iniciadores, diseño internos iniciadores para la secuenciación.
      Nota: Si no funciona la reproducción en los vectores pGGM000 o pGGN000, una posible solución es digerir el pGGM000 o pGGN000 con Eco31I, correr en un gel y purificar del gel el fragmento de columna vertebral (aproximadamente 2000 bp) pGGM000 o pGGN000 sin la ccdB cassette (aproximadamente 1400 bp). Luego proceder normalmente con la reacción de ligadura.
  6. Transformar una cepa pSOUP+ de a. tumefaciens (e.g. ASE), como el pSa origen de replicación (ori A. tum.) en los vectores de destino requieren la presencia del plásmido helper pSOUP12. Raya a las bacterias en placas de LB con cloranfenicol (34 μg/mL), espectinomicina (50 μg/mL) y kanamicina (50 μg/mL), tetraciclina (12,5 μg/mL). Incubar el transformado de a. tumefaciens en la placa en una incubadora de 28 ° C durante dos a tres días.

2. generación de plantas transgénicas de Arabidopsis

  1. Transformación de Arabidopsis thaliana.
    Nota: Transformar plantas de a. thaliana según Zhang et al., 200613.
  2. Selección de líneas transgénicas.
    1. Para seleccionar las plantas transformadas, utilice el esquema de selección utilizado en el GABI-Kat14 para resistencia a sulfadiazina15.
    2. Para seleccionar líneas estables con un evento de integración individual posible, elegirlos de la generación T2, que muestran la relación de segregación 3:1 en el marcador de resistencia. Propagar estas líneas T3 generación y seleccione las plantas homocigóticas para el gen de resistencia. Por otra parte, realizar un análisis de Southern Blot o una norma cuantitativa en tiempo real PCR (SA-qPCR)16 para seleccionar líneas de inserción único.

3. inducción de la trans-activación en líneas de controlador de Arabidopsis

  1. Raíz
    1. Para probar la expresión de reportera en a. thaliana conductor líneas generadas a través de los pasos 1 y 2, esterilizar las semillas como se describe a continuación.
      1. Agregar 0.5-1.0 mL de 70% etanol + detergente no iónico de 0.01% a aproximadamente 100 semillas (20 mg) en un tubo de reacción de 1,5 ml e invertir el tubo varias veces. Desactivación a 1000 x g por 15 s y aspirar el sobrenadante.
      2. Agregar 0.5-1.0 mL de etanol absoluto. Invertir el tubo varias veces, desactivación de 1.000 x g durante 15 s y descartar el sobrenadante.
      3. Agregar 0.5-1.0 mL de etanol absoluto e invertir el tubo t unas cuantas veces, luego girar hacia abajo a 1.000 x g durante 15 s y descartar el sobrenadante.
      4. Permitir que las semillas se sequen dentro de la campana. Si las semillas van a ser estratificado en tubos continúe con el paso 3.1.1.6.
      5. Agregar 0.5-1.0 mL de agua estéril e invertir el tubo varias veces. Desactivación a 1.000 x g durante 15 s y descartar el sobrenadante.
      6. Agregar 0.5-1.0 mL de agua estéril e invertir el tubo varias veces. Desactivación a 1.000 x g durante 15 s y descartar el sobrenadante.
      7. Agregar 0.5-1.0 mL de agua estéril.
    2. Preparar fuerza medio Murashige y Skoog mediano, pH 5.8 y agregar 0,9% planta agar y 1% de sacarosa. Después de autoclavar agregar dexametasona (Dex), disuelto en DMSO, a una concentración final de 10-30 μm para placas de inducción y una cantidad igual de DMSO a placas de control, respectivamente.
    3. Poner las semillas para la proyección de imagen de raíz en las placas y les estratificar durante 48 h en la oscuridad y frío (4 ° C).
    4. Poner las placas en posición vertical en una incubadora de plantas (jornada (16/8 h), 22 ° C, humedad 65%) y crecer durante cinco días.
    5. Cinco días después de la germinación (dag), imágenes de las plántulas mediante microscopía de láser confocal.
  2. Tallo
    1. Esterilizar las semillas como se ha descrito en 2.1.1. y semillas de ½ MS, agar de planta de 0.9% y 1% sacarosa placas. Estratificar durante 48 h en la oscuridad y frío (4 ° C).
    2. La transferencia de seis a siete días después de la germinación, las plántulas al suelo, cada planta en una sola olla (jornada (16/8 h), 22 ° C, humedad 65%).
    3. Inducir la trans-activación en tallos por riego con una solución falsa o Dex, o por inmersión de las plantas de Dex o soluciones simuladas, respectivamente.
    4. Para riego, utilice una solución de Dex μm 25 en agua preparado a partir de un stock de 25 mM Dex disuelto en etanol. De agua cada 2-3 días hasta el tiempo deseado de la inducción.
    5. Para mojar, preparar un vaso de precipitados de 1 L, 750 mL de agua que contenía 0.02% silwet L-77 con 25 μm de Dex o cantidad equivalente de DMSO para el Dex y el tratamiento simulado, respectivamente. Sumerja las plantas solo para 30 s en la inducción o en la falsa solución. Repetir cada 2-3 días hasta el tiempo deseado de la imagen.
      Nota: Después de la inmersión, las plantas deben mantenerse en la humedad alta durante una hora.
  3. Meristemo Apical de brote (SAM)
    1. Esterilizar las semillas como se ha descrito en 2.1.1. Preparar las placas con MS ½, agar de planta de 0.9% y 1% sacarosa medio y poner las semillas en las placas. Almacenar las placas durante dos días en la oscuridad y frío para la estratificación.
    2. Poner las placas en posición vertical en una incubadora de plantas. Seis a siete días después de la germinación, transferencia de las plantas de semillero al suelo, cada planta en una sola olla (jornada (16/8 h), 22 ° C, humedad 65%).
    3. Cuando el vástago es alrededor de 1 cm de largo (25-30 dag), rocíe la inflorescencia SAM con 10-50 μm Dex en H20, con una máscara de cara. Para la inducción y la proyección de imagen en etapas posteriores del desarrollo, inducir a SAMs de más tallos o brotes laterales.
      Nota: Sam también pueden ser inducida por brochabilidad la solución Dex para prevenir las gotitas de aerosol. Usar una máscara cuando Dex se aplica por aspersión.
    4. 24-48 h después de la inducción, diseccionar el SAMs y proceder a la proyección de imagen (véase 4.3).
      Nota: Solamente las plantas no inducidas fueron utilizadas para la propagación para reducir la probabilidad de silenciamiento génico. Plantas en T2, T3 fueron utilizadas para la proyección de imagen.

4. la proyección de imagen de la expresión de reportero en líneas de controlador de Arabidopsis .

  1. Raíz
    1. Transferir las plántulas de placa a una solución de yodo (PI) 10 μg/mL propidio y contra los mancha durante 5 minutos.
    2. Coloque las raíces en un microscopio de cámara (cámara de cultivo de tejidos 1-bien en cristal II, véase Tabla de materiales) y de la imagen usando un láser confocal de barrido microscopio con 63 x objetivo de inmersión de agua (véase Tabla de materiales).
    3. Para visualizar la fluorescencia PI, utilizar una longitud de onda de excitación de 488 nm y recoger la emisión entre 590 y 660 nm. Para mTurquoise2 fluorescencia utilice 458 excitación nm y recoger la emisión entre 615 y 460 nm.
  2. Tallo
    1. Realizar horizontal mano cortar secciones de tallos de la planta con una hoja de afeitar, extirpando un segmento de aproximadamente 3 cm. fijar el vástago con el dedo en el lado opuesto de la sección deseada para cortar. Realizar varios cortes finos secuencialmente pero tenga en cuenta que se deben comparar sólo las secciones de una posición similar en el tallo.
    2. Después de cada corte, sumerja la razorblade en una placa Petri con agua del grifo y recoger las secciones de tallo. Secciones de la mancha en este punto o directamente montar en portaobjetos de microscopio.
    3. Para la tinción, preparar 1 mL de 250 μg/mL de solución al PI de agua en un pequeño plato de petri (véase Tabla de materiales). Sumerja las secciones de 5 minutos y enjuagar en agua. Transferir al portaobjetos con unas pinzas finas o un pincel fino. Tenga cuidado de no apretar las muestras con el cubreobjetos.
    4. Imagen de muestras usando un láser confocal de barrido microscopio 25 x inmersión lente de inmersión de agua (véase Tabla de materiales). Uso 561 nm luz de láser para excitar la fluorescencia de PI y recopilar de 570 a 620 nm. Uso de 405 nm para excitar el efector de fluoróforo mTurquoise2 codificado por el controlador de línea construcciones y recoger la emisión de 425 a 475 nm.
  3. Meristemo Apical de brote
    1. Corte el tallo 2 cm debajo de la punta del brote con fórceps. Sostenga la espiga en una mano y usar pinzas finas para eliminar los brotes de flor y primordios grandes. Para quitar pequeños primordios, fijar el SAM en una posición vertical en una placa Petri que contenga agarosa al 3%. Use un binocular y pinzas para quitar pequeños primordios cerca SAM. Como alternativa, utilice una cánula de inyección (véase Tabla de materiales) para cortar estos primordios.
    2. El SAM disecado en una solución de 250 μg/mL PI durante 5-10 minutos realizar tinción o directamente transfiriendo algunas gotas de solución en la parte superior del SAM preparada la coloración de la mancha o transferir la muestra a un tubo que contenga solución de tinción. Mantenga el SAM totalmente sumergido durante el procedimiento de tinción.
    3. Coloque el SAM manchado en una placa Petri pequeña (véase Tabla de materiales) con medio de agarosa al 3% y el SAM con ddH2O.
    4. Imagen disecado SAMs usando un láser confocal de barrido microscopio equipado con una 25 x inmersión lente de inmersión de agua (véase Tabla de materiales).
    5. Uso 561 nm luz de láser para excitar la fluorescencia de PI y recopilar de 570 a 620 nm. Uso de 405 nm para excitar la emisión de fluoróforo y recoge mTurquoise2 de 425 a 475 nm.
      Grabar imagen pilas que abarca 50 μm en dirección z con un tamaño de paso de 0,5 μm.
      Nota: SAM la proyección de imagen según lo descrito aquí requiere un vertical láser confocal de barrido microscopio y una lente (aquí, un lente de inmersión de agua) con distancia de trabajo larga.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generación de líneas de controlador y efectoras a través de clonación de GreenGate

GreenGate sistema de clonación se basa en GoldenGate la clonación y el uso del endonuclease de la restricción de tipo IIS BsaI o su isoschizomer Eco31I. Como los enzima produce voladizos distante desde su sitio de reconocimiento asimétrico, la composición base de los voladizos pueden ser libremente elegido, que es la base forma la modularidad del sistema. Cada elemento generado por el PCR, por ejemplo, una secuencia del promotor, CDS o terminator, primero se inserta en un vector de entrada designado con voladizos producidos por digestión de restricción para generar un módulo a juego. Después de subcloning, un número de módulos correspondientes, generalmente seis, se utiliza para la reacción de la ligadura de GreenGate resultantes en el conjunto de la construcción en un vector de destino de planta binaria.

Para líneas de controlador, módulos que contienen las secuencias de ADN de promotor específico de tejido (pTS), el factor de transcripción GR-LHG4, el promotor de pOp6 y el reportero de mTurquoise2 unido a un péptido N-terminal de señal y una señal de retención ER C-terminal fusionada como terminadores y varios módulos de adaptador y un módulo para la selección de transgénico como se describió anteriormente 2,8 (figura 2). Líneas efectoras fueron construidas con pOp6 promotor y un casete de efector, consistente por ejemplo en un gen de interés y terminator, así como un módulo de codificación de un gen de resistencia para la selección de la planta transgénica (figura 2).

Inducción de líneas piloto y visualización de la fluorescencia del reportero

Inducción con Dex conduce a la expresión de mTurquoise2 específica de tipo celular en la endodermis de la raíz (pSCR>> SP-mTurquoise2-HDEL, Figura 3A), precursores de floema y cambium (pSMXL5>> SP-mTurquoise2-HDEL 17, Figura 3B) y las células en el meristemo apical de brote (pCLV3>> SP-mTurquoise2-HDEL 18, figura 3).

Trans-activación de VND7 en células de la vaina del almidón del cambium

Como un caso de prueba para la activación de trans, generamos una codificación de línea efector el factor de transcripción maestro de pared de célula secundaria VND7 fusionados con el dominio de activación VP16, que se ha demostrado para inducir células de formación de pared de célula secundaria autónoma cuando misexpressed 8,9,19,20.

Después de 5 días de un solo tratamiento con μm 15 de Dex o DMSO para el inducido o las falsa plantas respectivamente, secciones de tallo se prepararon para la visualización de lignificación ectópica en la envoltura de almidón. Yoduro de propidio muestra en el tallo fuerte afinidad al tejido lignificado. Inducida de las células de la vaina de almidón en muestras de Dex, pero no en el mock mostró una fuerte señal para el canal de PI y algunas células muestran el engrosamiento reticular típico de la pared celular en células del xilema (figura 4).

Figure 1
Figura 1. El principio de la clonación de GreenGate. A) endonucleasas de restricción tipo IIS como BsaEco31I, reconocen secuencias no palindrómico (rojo) y corte asimétrico en una distancia definida independientemente de la secuencia (azul). Eco31I reconoce 'GGTCTC', desde el segundo nucleótido aguas abajo del sitio de reconocimiento y crea una proyección de cuatro base 5'. B) el GreenGate sistema de clonación se basa en un sistema modular con seis diferentes entrada vectores pGGA000-pGGF000. Estos vectores contienen una cinta de resistencia a ampicilina (AmpR) y un cassette ccdB flanqueado por los adaptadores específicos para cada vector de entrada (por ejemplo pGGA000 vector de entrada) y el reconocimiento de 'GGTCTC' Eco31I sitios. Eco31I digestión de pGGA000 libera ccdB y crea los voladizos de nucleótido cuatro pGGA000-específico (azul oscuro). Insert1 es amplificada por cartillas que 'GGTCTC' y pGGA000 adaptadores específicos y después de la digestión ligada a pGGA000. Se sigue el mismo procedimiento con los otros módulos. C) la reacción final de GreenGate combina la digestión Eco31I de la pGGZ001 del vector de destino y los vectores de seis entrada pGGA000-pGGF000 y la ligadura simultánea de todos los módulos en el vector de destino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Resumen del sistema inducible por Dex LhGR/pOp con líneas de controlador y generador de efectos. En líneas del conductor, promotores específicos de tejido (pTS) controlan de la expresión del factor de transcripción sintética LhG4, que es fundida forma el dominio de unión de ligando del receptor de glucocorticoides de la rata (GR) y así se evita que, en ausencia de Dex, la translocación nuclear. La línea de efector alberga un cassette transcripcional conducido por un elemento pOp y una caja TATA con un promotor 35S de mínima. Cruzado con una línea de conductor y con inducción de Dex, GR-LhG4 se une a los elementos de tipo pOp en el cassette de reportero y que en el módulo generador de efectos, induciendo la transcripción de mTurquoise2 y el efector. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Líneas de conductor inducido en raíz, tallo y SAM. A) línea de conductor Dex-inducida pSCR >>SP-mTurquoise2-HDEL (germinó en el μm 50 Dex) en la raíz y el tratamiento simulado. El promotor de espantapájaros (pSCR) media centro quiescente (QC) y expresión en el endodermis, corteza/endodermis inicial (CEI). Las células son en tinción con ioduro de propidio (PI). Barras de escala = 20 μm. B) línea de conductor Dex-inducida pSMXL5 >>SP-mTurquoise2-HDEL (sumergido en una solución de Dex de 50 μm y visualizado después de 3 días) en el tallo y el tratamiento simulado. Promotor de SMXL5 (pSMXL5) media expresión en los precursores de células madre dominio y floema cambium. Las células son en tinción con ioduro de propidio (PI). Barras de escala = 100 μm. C) línea de conductor Dex-inducida pCLV3 >>SP-mTurquoise2-HDEL (10 μm, 48 h), en el SAM. El promotor CLAVATA3 (pCLV3) media expresión en el dominio de la célula de vástago. Cuadros en la parte inferior muestran cortes transversales de XZ y YZ, Dex-inducida y simulacros trataron, respectivamente. Las células son en tinción con ioduro de propidio (PI). Barras de escala = 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Lignificación ectópica en la envoltura de almidón de tallo. A) lignificación ectópica es vistos cinco días después de la inducción de Dex de la línea driver pSCR >> VND7-VP16 en el tallo. El promotor de espantapájaros (pSCR) media expresión en las células de la vaina de almidón en el tallo. Imagen de la izquierda muestra fusión de canal PI y campo claro, derecha imagen muestra sólo el canal de PI. B) el control simulacro no muestra ninguna señal en las células de la vaina de almidón. Las células son en tinción con ioduro de propidio (PI). Barras de escala = 100 μm. PI fluorescencia es falso-color verde mientras que el cloroplasto auto fluorescencia es roja en todas las imágenes. Puntas de flecha blancas punto de almidón de las células de la vaina. Imagen de la izquierda muestra fusión de canal PI y campo claro, derecha imagen muestra sólo el canal de PI.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Módulo de 5' de la proyección generalmente se utilizan para 3' de la proyección
A ACCT promotor AACA
B AACA Etiqueta del N-terminal GGCT
C GGCT Secuencia de codificación TCAG
D TCAG Etiqueta C-terminal CTGC
E CTGC Terminator ACTA
F ACTA cassettes de resistencia GTAT

Tabla 1: Proyecciones utilizados para el diseño de la cartilla

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aquí, describimos los pasos necesarios para generar y aplicar una herramienta versátil y completa de células inducibles, tipo específico trans-activación. Cruzando líneas llevar casetes efector bajo control del promotor pOp con líneas controlador permite estudiar los efectos de la expresión errónea en la generación F1, lo que permite la evaluación rápida de perturbación genética en una amplia gama de tipos celulares. Alternativamente, construcciones efector pueden utilizarse para transformar líneas de conductor o, adaptando la estrategia de clonación, controlador y efectoras construcción también se puede combinar en una T-DNA. Aplicaciones para esta gama de sistema de espacial y temporalmente controlan estudios de expresión errónea a dominio-específicas de la precipitación o complementación específica edición y tipo de la célula de gene.

Ninguno de los procedimientos descritos aquí deben plantear un desafío a laboratorios equipados para técnicas de biología molecular. El sistema de expresión LhG4 ha sido completamente probado y asegura la expresión no agujereado y armonioso que puede conducir al alto nivel8, aunque advertimos que el rango dinámico de concentración del inductor debe determinarse empíricamente para cada conductor y efectoras línea combinación combinando este sistema probado con clonación de GreenGate modular ofrece una manera rápida y sencilla expresión inducible en cualquier tipo de célula para que un promotor específico está disponible. Nos dimos cuenta de que eventos pueden ocurrir durante la amplificación de la plásmidos que contienen secuencias repetitivas del tipo pOp promotor la recombinación. A menudo éstos resultan en tener menos repeticiones de la secuencia de la OP, que pueden ser evaluadas por PCR. Construcciones finales deben confirmarse siempre por secuenciación en Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens. Sin embargo, los eventos de recombinación ocasionales fueron detectados sólo en e. coli.

Limitar la aplicación de esta técnica por lo tanto es el momento para generar plantas transgénicas.  Es de vital importancia para probar el silenciamiento del gen a partir de la generación T2 y a sólo mantener líneas estables. Para minimizar la posibilidad de silenciar, aconsejamos recoger semillas única forma no inducida por las plantas.

La técnica descrita aquí es complementaria a otros sistemas de trans-activación21,22, ya que proporciona un recurso integral y combina la especificidad de tejido con expresión inducible. Un posible desarrollo futuro de este método es la incorporación de más promotores específicos del tipo celular coche GR-LhG4, por ejemplo en los tejidos fuera de los principales meristemos. En cuanto a efectores, una emocionante expansión posible es la adaptación de gene muy eficiente herramientas para permitir que células específicas del tipo knock outs23de edición.

Las líneas de conductor descritas en Schürholz et al 20188 de NASC (http://arabidopsis.info/), construcciones de ADN describen en Lampropoulos et al., 20132 y Schürholz et al., 20188 contáctese con Addgene (https://www.addgene.org/).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Trabajo en nuestros laboratorios es apoyado por la Fundación de investigación alemana (DFG) subvenciones WO 1660/6-1 (S.W.) y GR 2104/4-1 (T.G.) y SFB1101 (a T.G. y J.U.L) y por un Consejo de investigación europeo consolidator grant (PLANTSTEMS 647148) a T.G.  S.W. es apoyado a través de la beca de Noether del Premio Emmy del DFG a través de subvención WO 1660/2.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin Carl Roth GmbH + Co. KG K029.1
ATP Sigma-Aldrich A9187
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919
Column purification Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (250)
Culture chamber for imaging Sarstedt AG & Co. KG 1-well tissue culture chamber, on cover glass II
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4903
DMSO Fisher Scientific, UK D139-1
Eco31I Thermo Fisher Scientific FD0294
injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) Sterican, Braun
Kanamycin Carl Roth GmbH + Co. KG T832.2
Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv Leica, Wetzlar, Germany
MS medium Duchefa, Haarlem, Netherlands M0221.0050
Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x  1.1 NA water immersion objective Nikon, Minato, Tokyo, Japan
Petri dish 35/10 mm Greiner Bio-One GmbH, Germany 627102
Petri dish 60/150 mm Greiner Bio-One GmbH, Germany 628102
Petri dish 120/120/17 Greiner Bio-One GmbH, Germany 688102
Plant agar Duchefa, Haarlem, Netherlands P1001
Plasmid extraction Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit
Propidium iodide (PI) Sigma-Aldrich P4170
Razorblade Classic, Wilkinson Sword GmbH 7005115E
Reaction tubes Sarstedt AG & Co. KG 72.690.001
Silwet L-77 Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany
Spectinomycin AppliChem GmbH 3834.001
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific NanoDrop 2000c
Sucrose Carl Roth GmbH + Co. KG 4621.1
Sulfadiazine Sigma-Aldrich S6387
Tetracycline AppliChem GmbH 2228.0025
T4 Ligase 5 U/µl Thermo Fisher Scientific EL0011
T4 Ligase 30 U/µl Thermo Fisher Scientific EL0013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45, (4), 651-683 (2006).
  2. Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8, (12), e83043 (2013).
  3. Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3, (1), 91-101 (2005).
  4. Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41, (6), 899-918 (2005).
  5. Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, (1), 376-381 (1998).
  6. Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41, (6), 919-935 (2005).
  7. Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3, (8), 278-280 (1993).
  8. Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178, (1), 40-53 (2018).
  9. Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19, (16), 1855-1860 (2005).
  10. Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86, (3), 423-433 (1996).
  11. Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127, (3), 595-603 (2000).
  12. Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42, (6), 819-832 (2000).
  13. Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1, (2), 641-646 (2006).
  14. Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40, (Database issue), D1211-D1215 (2012).
  15. GABI KAT. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine. Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018).
  16. Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8, (1), e53489 (2013).
  17. Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27, (8), 1241-1247 (2017).
  18. Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283, (5409), 1911-1914 (1999).
  19. Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350, (6257), 198-203 (2015).
  20. Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153, (3), 906-914 (2010).
  21. Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).
  22. Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11, (3), 605-612 (1997).
  23. Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics