自己免疫の混合キメラ モデルの光活性化によって個々 の自己反応性濾胞を尋問

Immunology and Infection
 

Summary

このプロトコルでは、どの自己反応性のリンパ球を運ぶ活性型緑色蛍光タンパク質 (GFP-PA) 記者自発的な自己免疫性の濾胞と混合骨髄キメラの生成について説明します。これは下流の分子・機能解析と組織の細胞の場所にリンクする機能を提供します。

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Wittenborn, T. R., Hagert, C., Degn, S. E. Interrogating Individual Autoreactive Germinal Centers by Photoactivation in a Mixed Chimeric Model of Autoimmunity. J. Vis. Exp. (146), e59397, doi:10.3791/59397 (2019).

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Abstract

自己免疫疾患は、重大な健康負担を提示します。開発および自己免疫疾患の進行に関する基本的な質問は未解答に残る。根本的な病気のメカニズムと細胞動態の理解の進歩のための要件として、下流分子または機能解析と細胞のサブセットの microanatomical の場所の正確な結合伝統的に達成することは困難されている目標。安定した活性型生物 fluorophores のレポーターへの統合開発最近正確な microanatomical ラベルとマウスモデルでの細胞のサブセットの追跡を可能に。ここで述べる単一胚中心から自己反応性リンパ球を分析する能力が、自己免疫に新しい洞察力を提供するために役立つことがありますどのように例として活性型記者と自己免疫疾患の新規のキメラのモデルの組み合わせを使用して.混合キメラを生成するためのプロシージャ自発的な自己反応性濾胞の活性型緑色蛍光タンパク質レポーターを運ぶリンパ球移入を紹介します。生体内でのラベリング戦略を使用して、単一胚中心で視覚化すること explanted リンパ系組織とその細胞成分センサー 2 光子顕微鏡による。単一胚中心からセンサー リンパ球を分析できます単一セルまたは一括で細胞の並べ替えや追加下流分子・機能解析を受けることがあります。このアプローチは、自己免疫の分野に新たな洞察を提供する直接適用可能性がありますが、骨髄キメラと photoactivation の手順を生成するための手順は、感染症研究の広範なアプリケーションを見つけるかもしれないまた、腫瘍の転移。

Introduction

自己免疫疾患の発症率は、過去数十年の西部の社会で特に急速に上昇しています。今日、西部の世界1死亡率と罹患率の最も一般的な原因の一覧で第 3 ランク付けする自己免疫疾患です。開発および自己免疫疾患の進行に関する基本的な質問は未解答に残る。病機構と細胞動態の理解の進歩のための 1 つの要件は、下流の分子または機能解析と細胞のサブセットの microanatomical の場所の正確な結合です。正確な microanatomical ラベル付けと追跡携帯の過去 10 年間で安定した蛍光、活性型、またはスイッチング生物 fluorophores と記者系統への統合の数の開発が有効になってマウスモデルでのサブセット。

楓、イシサンゴ, 発蛍光蛍光タンパク質は、紫や紫外線ライト2への露出に赤い蛍光グリーン蛍光から不可逆的な光電を経る。脊髄脳スライス3の開発に個々 の細胞の動的挙動に従う採用当初、ノックアウトのマウスはその後、生体内で細胞の動きを監視許可楓とシステムの生成は分析に適用しました。免疫細胞の移動してリンパ節4から。このアプローチは、その後第二世代記者5洗練されました。似たような記者は Dendra6、最近 vivo7でリンパ節転移の追跡に使用されました。

開発最初の活性型タンパク質は、緑色蛍光タンパク質 (GFP) 単一の点突然変異 (T203H)、設計波長域で非常に低い吸光度に 550 nm8450 からのリードだった。紫外光による光後、この活性型緑色蛍光タンパク質 (PA-GFP) スイッチ 〜 400 から最大吸収 〜 500 nm、おおよそ 100 強さを降伏を高める波長 488 の興奮すると nm。トランスジェニック マウスすべての造血細胞が PA GFP を表現の生成は最初の時間のため、胚中心9の解剖学的定義の明るい部分と暗いゾーンで B 細胞の選択の詳細な分析を許可しました。

スイッチング タンパク質が両方の条件10 間シャトルに対し、光は蛍光状態に非蛍光状態から不可逆変換、光電は別の 1 つの波長からの一方向移行、.この後者の能力は最近蛋白質活動11の光制御のエンジニアに活かされました。

PA GFP レポーターを活用し、我々 は最近の自発のループスのような自己免疫12の新しいモデルの 1 つの胚中心 B 細胞レパートリーを特徴付けられます。このモデルは 1部骨髄、自己反応性 B 細胞受容体ノックアウトの ribonuclear 蛋白質複合体 (14564Igi13,) に特異的な 2 つの部分から骨髄の併用をかくまっていると混合キメラに基づく目的ドナー。約 6 週間ポスト再構成する自発的な自己反応性濾胞脾臓とリンパ節の皮膚に存在している恒常性の条件が達成します。特に、胚中心 B 細胞の人口はほとんど専ら (~ 95%)非 564Igi コンパートメント由来の細胞から成る、これら野生型派生の B 細胞は、自己反応性をなっています。したがって、モデル、様々 な遺伝子があり、ノックアウト、記者を用いた自己反応性胚中心 B 細胞の解析に「プラグ アンド プレイ」のアプローチです。ここでは、自発的な自己反応性濾胞 PA GFP レポーターを運ぶリンパ球移入と混合キメラを生成するための手順をについて説明します。体内のラベリング方法を使用すると、単一胚中心は explanted リンパ系組織と 2 光子顕微鏡を用いた、細胞成分センサーで視覚化できます。その後この単一胚中心からセンサー リンパ球できますフローサイトメトリーで分析したまたは螢光色素アクティブ セル (FACS) を並べ替えで並べ替えられ、下流解析分子と機能追加を受けます。単一の胚中心から自己反応性リンパ球を分析する能力は、自己免疫の分野に新たな洞察を提供する直接適用可能性がありますが、技術や手法の説明はさらに、研究に関連するアプリケーションを検索感染症、腫瘍の転移。

Protocol

すべての動物の使用は、欧州共同体ガイドラインに適合し、デンマークの動物研究官 (2017-15-0201-01348) によって承認されました。

1. 一般的なマウス飼育およびバッファーおよびツールの準備

  1. 家マウスの標準的なガイドラインによると健康状態の定期的なモニタリングと特定病原体無料 (SPF) の条件下での行。
  2. (省略可能) 非監視不定感染症による素朴なマウスの自発の胚中心の不在を確認してください。これは蛍光顕微鏡 (胚中心構造の存在) で行うことができます。 またはフローサイトメトリー (胚中心 B 細胞の頻度) 前述12として。
    注: いずれかの女性または男性を使用することができます。一般的に、男性 Y 抗原に向かって alloreactivity する女性受信者/ドナー15セックスの不一致に理論的になるためのセックス一致ドナーと受信者、理想的です。
  3. 使用 CD45.1 受信者 (B6。SJL -Ptprc Pepcbの/BoyJ) 時代の 6-10 週頃。564Igi を使用 (B6。Cg-Ightm1 (Igh564) TikIgktm1 (Igk564) Tik/J) と PA GFP (6-12 週齢で B6.Cg-Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J) ドナー。
  4. オートクレーブ滅菌手術器具 (微細直線はさみ・ デュモン鉗子 #5 と #7) 日常的滅菌ガイドラインに従ってそれら。
  5. 500 mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、2% 胎仔ウシ血清 (FBS)、pH 7.4 で 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を含む骨髄 (BM) バッファーを準備します。BM のバッファーを準備するには、追加の熱不活化 (1 時間、補体を不活化する 56 ° C の水浴中) 10 mL FBS と 1.25 mL をよく混ぜる、pH 7.4 では、PBS の 500 mL 400 mM EDTA の溶液 (pH 7.4 に調整)。0.2 μ m フィルター フラスコを使用してバッファーをフィルター処理します。
  6. 試薬グレードの水総量の 10 mL に 10 x の在庫の 1 mL を希釈して 10 mL の赤血球 (RBC) 換散バッファー (155 mM NH4Cl、12 mM NaHCO3、0.1 ミリメートルの EDTA) を準備します。5 ミリメートルの EDTA、pH 7.4 と PBS の 50 mL を準備します。

2. 混合骨髄キメラの確立

  1. 受信者 (0 日目) の照射
    1. 適切な照射容器内 CD45.1 骨髄の受信者を置き、1,100 と照射ガンマ照射で Rad。
      注: 代替の照射源が使用できます。ソースにかかわらず用量/タイミングは動物に最小限の巻き添え組織の損傷と最大破壊的効果をもたらす最適化するようにしました。
    2. 抗生物質の場所水奏 (sulfadiazin とトリメトプリム/mL の飲料水の 0.2 mg 1 mg となる)。
  2. 骨 (1 日) の抽出
    1. 564Igi 骨髄ドナーを空気中で 4% イソフルランの連続的な流れによって麻酔し、頚部転位によって安楽死させます。エタノールとドナーをスプレーし、流フードで滅菌手術用パッドの上に置きます。滅菌バッファーおよび機器を使用、無菌状態を維持する作業に進みます。
    2. 大腿骨と脛骨を抽出するには、まず足首の周り切開し、微細直線はさみを使って腰に上向きに拡張します。頑丈な鉗子または親指と人差し指を使用して、引き上げて皮膚、体に向かって足を。足と同様に皮膚を引っ張ってください。
    3. ヒップで脚をつかんで足を強制的に引っ張ってくる膝と足首の関節をポップします。足首の関節を破るし、脛骨、それにより腱と脛骨を筋肉を除去、体に向かって足を引っ張るに進みます。
    4. 膝の脛骨を解放する共同を破るし、同様にそれにより腱と大腿骨を筋肉を除去、大腿骨を保持しながらこの体の方へ引っ張る。股関節に切開を作るし、腱を切って、大腿骨の股関節ソケットから引き出します。2.2.2-側の 2.2.4 の手順を繰り返します。
    5. すべての残りの筋肉や結合組織を除去するために粗いペーパー タオルで擦ることで骨を慎重にきれい。最後にデュモン #7 ピンセットのペアを使用して氷の上で新鮮な冷たい BM バッファーへ転送する前に、冷たい BM バッファーでリンスします。ステップ 2.2 PA GFP ドナーに対して繰り返します。
      メモ: 単一のドナーから骨髄細胞数は、性別と年齢によって異なります。目的の入力骨髄比と数字によるとドナーの数と必要な受信者数をスケールします。ドナーが不足している、フロント手足が骨髄抽出に含まれてすることができます。これは通常、後肢から得られる細胞の 1/2 に追加 1/3 を生成します。通常、どこでも 5000 万の細胞からリカバリ可能なドナーは、年齢、性別、背景、唯一後肢両方ハインドやフロント手足が含まれているかどうかに応じてあたり。
  3. 骨髄細胞抽出
    1. 冷たい BM バッファーで洗浄して、モルタルを準備します。洗浄バッファーをドレインし、10 mL の血清ピペットで 10 mL の新鮮な冷たい BM バッファーを追加する電動ピペット コント ローラーを使用します。
    2. デュモン #7 ピンセットのペアを使用してモルタルを 564Igi ドナーから骨を転送し、粉砕し、骨髄を解放する骨を挽く杵を使用します。10 mL の血清ピペット骨髄エキスを吸引し、氷の上 50 mL のチューブに 70 μ m セル ストレーナー渡します。
    3. モルタルに新鮮な冷たい BM バッファーの追加の 10 mL を追加し、細胞の完全な回復を確実に繰り返します。ペーパー タオルでモルタルから骨素材を削除、適切に破棄し、BM バッファーに続いて、70% エタノールで慎重にモルタルをすすいでください。PA GFP 骨髄ドナー グループの 2.3 の手順を繰り返します。
  4. 骨髄細胞を数える
    1. マイクロ ピペットを使用して、プラスチックのパラフィン膜の部分を RBC 換散バッファーの 40 μ L を含む液滴を配置します。564Igi 骨髄管に数回を反転し、10 μ L を分注ピペットを使用して取る。RBC 換散バッファー ドロップの 40 μ L でそれをミックスします。
    2. その後ドロップにトリパン ブルー (水溶液中で 0.4%) の 50 μ L を追加します。Burker トゥルク検定と顕微鏡下でカウント結果ミックスの 10 μ L をすぐにロードします。合計希釈倍率 × 10 を使用して mL あたりのセル数を計算します。確認十分な細胞生存率 > 90%。PA GFP 骨髄ドナー グループの 2.4 のステップを繰り返します。
  5. ドナーの懸濁液の準備
    1. ステップ 2.4 と受信者の希望の数で得られたカウントに基づいて、ドナー骨髄ドナー ミックス チューブに混合する 2 つのドナー グループの量を計算します。
      注: たとえば、1:2 の混合 564Igi:PA の 1 つのグループを設定する-6 CD45.1 受信者と GFP キメラ: 各受信者必要 20 x 106ドナー細胞の合計、1 の一部 564Igi と 2 つの部分ペンシルバニア GFP。したがって、この 6 x 1/10 x 20 x 3 を必要があります6 40 × 106 564Igi ドナー細胞および 10 x 20 x 6 x 2/3 =6 = 80 x 106 PA GFP ドナー細胞。
    2. PA GFP および 564lgi 50 mL の円錐管に骨髄ドナーの適切な量を混ぜます。スイング バケツの回転子を使用して 10 分の 200 x gと 4 ° C で骨髄の混合物を遠心分離機します。
    3. 上清をデカントし、1 mL あたり 1 x 10 の8セルの密度で冷たい BM バッファー内細胞を再懸濁します。氷の上の冷却の 1.5 mL 遠心チューブに転送します。
  6. 骨髄骨髄ドナーと受信者を再構成
    1. 4% イソフルラン 3.75% でメンテナンスに続いて、空気中の連続的な流れを誘導を使用して受信者を麻酔します。つま先ピンチ反射の不在によって麻酔の適切な面を確認します。
    2. 慎重にはじく骨髄骨髄細胞の適切な再懸濁後骨髄ミックス (~ 10 の6セル × 20)、0.3 mL の吸引 200 μ l 添加するのにミックスを含む、30 ゲージのインスリン注射器。
    3. その側に受信者を置き、ゆっくりと少し 'の pop に目を目の上下の皮膚を伸ばす、ゆっくり目と周囲の組織を避けるために世話をする目のソケットの前面に約 30 ° の角度で注射器の先端を挿入します。目のソケットに下線を引く骨に触れる針の先端を感じたら、少し撤回 (~0.5 mm) とゆっくり着実に圧力を使用してドナーの骨髄を注入します。
      注: 必要がありますない出血、注射時に目の非常にマイナーな隆起してない流体の漏れ無し。
    4. アドリブ抗生物質水でケージに戻すには即座に復旧手順を確認してください。受信者ごとに 2.6 のステップを繰り返します。
      注: 尾静脈注射は、retroorbital 注射と同様の結果の代わりに使用することができます、しかし、私たちの手でかなり遅い多数の受信者グループを操作するときの懸念があります。誤嚥や窒息のリスクをもたらすと、小径の寝具に直接麻酔動物の回復を避ける必要があります。
  7. 抗菌水切り (14 日)
    1. Cage(s) から抗生物質の水分を取り除き、新鮮な定期的な飲料水に置き換えます。

3. 成功溶解確認、キメリズム (週 6) の適切な学位を確認

  1. Retroorbital キメラとコントロールの出血
    1. 採血管を準備するには、受信者の耳タグ番号によると遠心チューブ 1.5 mL のラベルと 5 mM EDTA を含む PBS の 50 μ L を追加します。
      注: 9 11 (イディオ) および CD45.2, CD45.1 PA GFP 適切なコントロールが含まれます。1 を含めることによってこれを行うことができます PA-GFP + マウス、1 CD45.1 マウス、1 B6 マウスおよび 1 564Igi マウス。
    2. マウスを麻酔し、ステップ 2.6.1 のように麻酔の適切な面を確認します。ゆっくりと少し 'の pop に目を目の上下の皮膚を伸ばす、その側にキメラを配置します。
    3. 目のソケットは、目および周囲の組織の損傷を避けるために世話の前面約 40 ° の角度で BoPET ラップのヘパリン キャピラリー チューブ (60 μ L 内部ボリューム) そっと挿入します。優しくひねり/チューブを回転させてそれが血液でいっぱいに開始されるまで。
    4. 受動的までほぼ完全に満ちて, 毛管によって管を埋めるために血液をできるように、チューブを撤回し、すぐにグリップに目を許可するように目の周りをリラックス同時にしながら、対応する事前ラベル コレクションの管にそれを置く元の位置に落ち着きます。出血はすぐに停止する必要があります。
    5. コレクションの管にキャピラリー チューブを空にすることを確認し、鋭利な容器に廃棄します。管を閉じて PBS/EDTA との完全な混合を確実に 3 回を反転します。
    6. ケージに戻すには即座に復旧手順を確認してください。各実験的マウスおよび適切なコントロールの 3.1 の手順を繰り返します。
      注: このメソッドが不定症照射受信者の大きなリスクをもたらす可能性がありますこれらは完全に再構成された前に、顎下静脈穿刺を使用するとき注意してください。さらに、私たちの経験で、血液量の収集、出血多量による失われた血液量はより多くの変数を見つけます。として、骨髄キメラは再構成段階で敏感な新しい骨髄が完全にしみ込んで、造血が正常なレベルを再開する前に、これらの考慮事項の両方は重要です。
  2. 末梢血単核球 (PBMC) の浄化
    1. 簡単に採血が完了した後 (10 s) 低速でチューブを遠心分離機 (< 200 x g) チューブの下部に血液を安定化、希釈を収集します。
    2. リンパ球分離培地 10 mL 注射器を埋める、18 G 針を取り付けます。最初の管の底に針を挿入し、リンパ球分離培地 1 mL の血液サンプルを下地層します。慎重に針を撤回、次のサンプルのクロスコンタミネーションを防ぐためにペーパー タオルで拭いてください。
    3. すべてのサンプルを続行し、低/オフ設定ブレーキと 800 × g、室温スイング バケツの遠心分離機で 25 分間遠心します。
    4. マイクロ遠心チューブ用 BM バッファーを冷たいの 1 mL を含む対応ラベル付きの 1.5 mL のセットを準備します。
    5. 遠心分離の各サンプルでは、次の 200 μ L ピペットで上層 (プラズマ) を入力し、インターフェイス上だけ単核細胞 (MNC) 層を吸引します。1 mL の BM バッファーを含む対応ラベル付きのチューブにセルを転送します。蓋を閉めるし、ミックスに反転します。リンパ球分離培地を含む管を破棄します。
    6. すべてのサンプルを進み 5 分、スイング バケツ ローターで 4 ° C の 200 x gで遠心分離します。吸引し、上澄みを廃棄し、冷たい BM バッファーの 200 μ L でペレットを再懸濁します。サンプルは、抗体染色やフローサイトメトリーによる解析の準備が整いました。
  3. 染色の流れフローサイト メーター評価
    メモ: 提案パネル: CD45.1 FITC、9 D 11 A568、CD45.2 APC B220-PerCP-Cy5.5。太平洋のオレンジ (または同等) チャネルで非アクティブ PA GFP が検出されました。リンパ球分離取得角質を取り除くと、生存性色素は不要です。
    1. マイクロ ピペットを使用して、96 ウェル プレートに各キメラとコントロールのサンプルでは、ウェルあたり細胞懸濁液を 100 μ l 添加を追加します。
    2. 3 非 PA GFP コントロール サンプルの各サンプル (合計 300 μ L) の残りの 100 μ L をプールします。無染色のコントロールと 1 つのステンド グラス コントロール井戸のこの材料の 50 μ L を追加します。PA GFP 単一染色コントロール無染色 PA GFP サンプルの 50 μ L をさらに追加します。
    3. 各ウェルにバッファー (無染色) を 100 μ l 添加、単一の抗体 (単一染色補正のコントロール、PA GFP 補償制御を除いて) または抗体ミックス (サンプル)。氷の上 20 分間インキュベートします。
    4. 4 ° C で 5 分間 200 × gで遠心します。バッファーをフリックします。各ウェルに BM バッファーの 200 μ L を追加し、洗って再度遠心。バッファーをフリックし、BM のバッファーを 200 μ l 添加の各ウェルの細胞を再懸濁します。サンプルは、流れの cytometer (図 1) の分析の準備が整いました。
      注: キメラ胚中心の応答は、6 週間以降から任意の時点で分析できます。

4. 体内単一胚中心の識別を支援するためにマージナル ゾーン/被膜下洞のラベリング

メモ: この議定書は足蹠/ホック (膝窩リンパ節) と (静脈、脾臓) の静脈注射のために示されるがターゲット サイトによると変えることができます。

  1. 膝窩リンパ節の分類のための二国間の足蹠注射
    1. ステップ 2.6.1 のようにマウスを麻酔します。
    2. 1.5 mL 遠心チューブに 18 μ L の PBS、pH 7.4 で PE 標識ラット抗マウス CD169 抗体の 2 μ L を希釈します。プラスチック パラフィン フィルムの部分に混合物の 10 μ の 2 滴を配置します。30 ゲージ針で 0.3 mL インスリン注射器を用いた各液滴を吸い出しなさい。
    3. 分類のいずれかの組合せ、足蹠の 10 μ L を注入 (足蹠、つま先の初めから近位部に 5-10 ° の角度で針を入力し、かかとに向かって約中間の針を挿入) や飛節 (5-針と入力します。10 ° の角度のかかとのすぐ上と全体について挿入膝に向かう方向でアキレス腱の軸の長さの半分)。檻にマウスを戻り、手順 5 に進む前に約 15 分待ちます。
  2. 脾臓の分類のための静脈内注射
    1. ポイント 2.6.1 のようにマウスを麻酔します。
    2. 1.5 mL 遠心チューブに PE 標識ラット抗マウス CD169 抗体 90 μ L の PBS で 10 μ L を希釈します。0.3 mL インスリン注射器で混合物を吸引します。
    3. 2.6 の手順に従って retroorbital 注射液を実行します。檻にマウスを戻り、手順 5 に進む前に約 15 分待ちます。
      注: イソフルラン、注射麻酔薬ケタミン ・ キシラジンのミックスを使用するように別の方法としてただし、これは一般的に回復が遅くに します。リンパ排液は一般的に骨格筋の動きによって影響を受け、これにつながる排水に時間かかります期待されます。

5. explanting 脾臓とリンパ節と photoactivation のための準備

  1. 両面のイメージングと光室の準備
    1. 20 mL の注射器からプランジャーを取り外し、背面負荷それ真空用グリース封入真空用グリースのチューブのノズルを挿入。5 mL シリンジのプランジャーを削除し、真空グリースで背中の読み込みに 20 mL の注射器を使用します。
    2. 真空グリース ロード 5 mL シリンジを使用して平らな面に正方形 coverslip を置き、真空グリース (約 1-2 mm の端から)、カバーガラスのエッジに沿ってトレース イメージングと光室を準備します。
      注: 微小油滴中の浸漬水で乳化真空グリースは、レンズを汚染できる真空グリースその後顕微鏡レンズと接触する任意およびすべての表面の汚染を避けるために注意してください。
    3. 冷たい BM バッファーとカバー スリップ真空グリース溜まりを埋めるし、冷たい平らな面に置きます。
  2. リンパ節と脾臓の収穫
    1. 生体内で 2.2.1 の手順に従って分析されるキメラマウスをラベルを安楽死させます。70% エタノールで枝肉をスプレーします。
    2. 膝窩リンパ節微細直線はさみを使用して、ちょうど膝ピット下の皮膚に切開を行い、股関節までほぼハムスト リング ラインに沿って上向きにカットを拡張します。デュモン #5 または #7 鉗子を使って皮膚外側、膝窩 (図 2 a) で組織を公開するための公開されたフラップのそれぞれを引き出します。
    3. 慎重に膝窩静脈にちょうど内側膝窩を入力し、解剖・ デュモン #5 ピンセットのペアを使用して、基になる膝窩リンパ節を公開するために、脚の軸に沿って鉗子を挿入して開いたり閉じたりして脂肪を開きます。
    4. フロント側の親指と人差し指 (図 2 b) を使って膝に近位の大腿四頭筋をつまんで窩のリンパ節を開きます。リンパ節を周囲の組織 (図 2) からそれを解放して、5.1 準備した真空グリース溜まりに配置する鉗子で下からつかみます。
    5. 5.2.2-側の 5.2.4 の手順を繰り返します。複数のリンパ節は、必要な場合単室で合うことができます。
    6. 最後に真空用グリースの縁の上に 2 番目の coverslip を配置し、すべての気泡を押し出すように注意しながら、そっと押す商工会議所を閉じます。
      注: バッファーのいくつかは同様に、押し出されることがありますが、真空グリースは、(図 2 D) 流体の漏れを防止する、タイトなシールを形作るべきであります。リンパ節は、両面のイメージング商工会議所にされます。
    7. マウス、前内側線に近位の左側腹壁切開微細直線はさみ作るのペアを使用して、脾臓胸郭の真下、後腋窩線を体の周りにそれを拡張します。脾臓のヒントが表示されます (図 3 a) をする必要があります。
    8. デュモン #7 鉗子のペアで脾臓を抜くし、それを解放する下側の癒着をカットします。~ 2 ミリメートルの厚さ、断面、スライスを削減するのに微細直線のはさみのペアを使用します。
    9. 5.1 準備した真空グリース溜まりにスライスを配置します。複数の脾臓スライスは、必要な場合単室で合うことができます。
    10. 最後に真空用グリースの縁の上に 2 番目の coverslip を配置し、すべての気泡を押し出すように注意しながら、そっと押す商工会議所を閉じます。イメージングと光の間を除いてすべての回で氷の上すべてのイメージング室を保ちます。
      注: バッファーのいくつかは同様に、押し出されることがありますが、真空グリースは流体の漏れを防止する、タイトなシールを形作るべきであります。脾臓のスライスが両面のイメージング室 (図 3 b) です。

6. 光

  1. 単一の胚中心を識別します。
    メモ: このプロトコルについては, 脾臓が、リンパ節を完全に似ています。
    1. 顕微鏡ステージ上イメージングのチャンバーを配置します。3.5 mL プラスチック転送ピペットを使用して、上部の coverslip の上に水の滴を配置し、の接点まで目的を下げます。透過光を使用してティッシュの上に焦点を当てます。
    2. 暗いモードと 2 光子励起に切り替えるし、940 にレーザーを調整 nm。
      注: 適切なフィルター セットを持つこの波長励起と許可 4.2 の手順で注入 CD169 PE と同様、主要な船舶や構造要素に関連付けられたコラーゲンを含む構造の第二高調波発生の検出を辺縁帯を識別します。しかし、940 nm 励起はない photoactivate PA GFP をしません。
    3. 組織の表面の近くの (CD169 PE の汚損によって区切られた) 個々 の白いパルプ領域をローカライズし、中央動脈に関連付けられている第 2 高調波発生による periarteriolar リンパ鞘 (仲間、T 細胞ゾーン) を識別します。仲間と辺縁帯のゾーンで見て高い蛍光の存在有効な核体マクロファージ (すべてのチャンネルで強い蛍光信号、暗い空胞を持つ blob のような外観) (図 4 a)。
      注: 必要に応じて、組織の望ましくない方向のため、イメージングの商工会議所を反転することができ、イメージングを他の方向から実行できます。
    4. 6.1.3 の手順で特定の特徴に基づいて。、単一胚中心領域の特定の関心の領域を描画します。周りの Z スタックを設定 100-150 μ m 深さ、〜 3 μ m のステップ サイズを使用して、組織の面から開始。
    5. 励起波長 830 nm に切り替えます。オフにシャット ダウンまたは探知器に光損傷を防ぐためにすべてのチャンネルを暗く (としてレーザー電源と出力蛍光がこの波長で劇的に高い通常) し、スタックを '画像'。
      注: レーザー パワーとピクセル滞留時間など、特定の設定は、組織、特定の組織が使用すると、イメージング システムの深さに依存します。各アプリケーションは、使用される特定のイメージング システムの最適化するようにしました。スタック全体の効率的な光を得るために不可欠ですが、注意が必要に光損傷セル。
    6. 励起波長 940 nm に戻り、チャンネルを再度開きます。(図 4 b) を通して効率的な光と光損傷 (びまん性、非セル限定 PA gfp、暗い斑点やセンサー領域で高度蛍光) の不在を確認するスタックをスキャンできます。
    7. イメージング室ですべての関連する組織 photoactivate に進みますし、速やかにさらなる処理まで氷にそれを返します。追加撮像室の photoactivation を続行します。
      注: 組織 explanting、取付および特に photoactivation、時間のかかるプロセスが、合計所要時間が 4-6 時間、細胞生存率の劇的な減少を防ぐために制限されます。

7. 回復とセンサー細胞の解析

  1. リンパ球のリンパ節および脾臓から抽出
    1. 各センサーのサンプルでは、氷の上 BM バッファーの 500 μ L を含むそれに応じてラベル付き 1.5 mL 遠心チューブを準備します。非 PA GFP コントロールと非活性化 PA GFP マウスのサンプルが含まれます。B6 コントロールは 1 つと 1 つの PA GFP コントロール マウスを含めることによってこれを実現できます。
    2. イメージングの商工会議所は、(存在する場合は、複数のサンプルが単一の商工会議所の存在)、サンプルの位置を維持し、それぞれのサンプル チューブに各サンプルの世話から上部のカバー スリップを慎重に取り外します。
    3. 杵ホモジナイザーを使用すると、組織を絞るし、リンパ球をリリースする管で杵をねじる。マイクロ ピペットを使用して、ライセートを吸引し、新鮮な予冷 1.5 mL 遠心チューブに 70 μ m セル ストレーナー フィルターします。リンパ節のサンプル手順 7.1.5 に進みます。
    4. 脾臓サンプル 200 x gスイング バケツ ローターの 4 ° C で 5 分間遠心します。上澄みを廃棄し、RBC 換散バッファーの 200 μ L でペレットを再懸濁します。、室温で 5 分間インキュベートし、冷えた BM バッファーの 800 μ l 添加し 7.1.5 のステップへ進みます。
    5. 200 x gスイング バケツ ローターの 4 ° C で 5 分間遠心します。上澄みを廃棄し、冷えた BM バッファーの 200 μ L で再懸濁します。必要な場合にも、サンプルは流れフローサイトメトリー評価のために汚れると並べ替えの準備が整いました。
  2. 染色の流れフローサイト メーター評価
    注: パネルを提案した: CD169 PE, B220 PerCP Cy5.5, 9 D 11-A647、CD38 PE Cy7、修正可能性色素 Efluor-780、GL7 パシフィック ブルー。太平洋のオレンジ (または同等) チャネルで非アクティブ PA GFP が検出されました。GFP チャネルでセンサー PA GFP が検出されました。(これは可能性がありますまたは可能性がありますされていない体内 CD169 PE の付いた) 任意の共同精製マクロファージは、CD169 PE で染色とダンプ ゲートとしてこれを使用して除外できます。
    1. マイクロ ピペットを使用して、96 ウェル プレートでの各キメラとコントロールのサンプルでは、ウェルあたり細胞懸濁液 100 μ L を追加します。
    2. B6 コントロールのサンプル、この素材無染色のコントロールと 1 つのステンド グラス コントロール井戸を 50 μ L を追加します。アクティブ化されていない PA GFP 単一染色コントロール無染色非アクティブ PA GFP サンプルの 50 μ L をさらに追加します。アクティブ PA GFP の単一染色のコントロールを使用すると、すべてのセンサーのサンプルの残りの材料をプールします。
    3. 各さて、バッファー (無染色し、PA GFP 補償制御) を 100 μ l 添加、単一の抗体 (単一染色補正コントロール) または抗体ミックス (センサーのサンプル)。氷の上 20 分間インキュベートします。
    4. 200 × gで遠心分離機の 4 ° C で 5 分間バッファーをフリックします。各ウェルに BM バッファーの 200 μ L を追加し、洗って再度遠心。バッファーをフリックし、BM のバッファーを 200 μ l 添加の各ウェルの細胞を再懸濁します。サンプルは、流れの cytometer またはソーター (図 5に代表的な結果) の分析の準備が整いました。

Representative Results

混合骨髄キメラの生成

この議定書は頑健 (統計的有意性は、 12を参照してください) の代表的な結果が図 1に示すように、B 細胞コンパートメントの完全に近いキメリズムと混合骨髄キメラを実現します。血清型検査を明らかに正規化された B セル番号は 6 週間でポスト 9 11 (イディオ) の低頻度の再構成 (図 1 a)、正循環 B 細胞 564Igi コンパートメント (図 1 b) に由来します。総リンパ球ゲート内残留受信者由来細胞、~ 6% の低周波がある CD45.1 (Q1) ~ 94% (図 1) のキメリズムの全体的な程度を示します。ドナー内コンパートメント (CD45.1-、第 4 四半期 + Q3) 564Igi の比 (第 4 四半期) PA gfp (Q3) は約 23% から 77%。これは入力の 33% から 66% 率は B 細胞の重い負の淘汰によって説明されるよりもわずかに低く 564Igi コンパートメント12から派生します。B 細胞コンパートメントの実質的完全キメリズムがある図 1に見られるように (99.9 %cd45.1-) と 564Igi 由来 B 細胞の重い負の淘汰の結果である PA GFP 骨髄由来 B 細胞 (第 3 四半期) の優位性。

組織、加工および流れフローサイトメトリー評価の収穫

図 2図 3の手順を示すし、explanting の結果は新鮮なリンパ節と脾臓のスライスを分離します。図 4は、体内標識と explanted 脾臓スライスで単一胚中心エリアの photoactivation のため代表的な結果を示す.見ることができる (図 4 a) CD169 PE と生体内での分類がしっかりラベル辺縁帯 (赤は"MZ"によって示される)。コラーゲンを含む構造要素と periarteriolar リンパ鞘 (仲間) の中央動脈を含む主要な血管 (青)、感じ取ることが第 2 高調波信号。高蛍光、マクロファージ体核は胚中心活動 (矢印) に関連付けられます。一緒に取られて、辺縁帯、仲間、および核体マクロファージの同定はおそらく単一胚中心を含む関心領域の同定をことができます。関心の領域は、図 4 bに示すようにセンサーです。示すように、光は microanatomically 正確な9、活性化の定義済み領域を降伏です。これらの結果はさらに PA の高密度の確認として-GFP 陽性リンパ球再構成されたキメラと自発的な胚中心の存在。下流の流れフローサイトメトリー評価さらに正規化された B 細胞コンパートメント番号 (図 5)、自発的な胚中心の人口 (図 5E) とされている胚中心 B 細胞のサブセットの存在を確認します。センサー (図 5 階)。

したがって、議定書を呈する堅牢なメソッド混合骨髄キメラの生成のため自発的な自己反応性濾胞、主に活性型記者を運ぶ野生型派生の B 細胞から成る。これにより個々 の濾胞 (図 6のグラフィカルな概要) の下流解析のため。

Figure 1
図 1:564Igi の血のキメリズムの程度のフローサイト メーター評価 (CD45.1-、PA - GFP-): PA GFP (CD45.1、PA-GFP +) 致死的照射 CD45.1 受信者 (CD45.1 +、PA - GFP-) でキメラを混合すると、6 週間ポスト再構成します。B220 + B 細胞、一重項リンパ球にゲート前のゲートを示すA) プロット。プロット表示 9 11 + (イディオ) 周波数 B 細胞集団内で A からB) Subgate。C) プロットの PA-GFP CD45.1、一重項リンパ球にゲート事前対。D) プロットの PA-GFP CD45.1 A. のプロットから B 細胞 subgate の対この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2:収穫およびイメージングの photoactivation 膝窩リンパ節を取り付け手順ですA) 切開を膝の下に作られ、股関節まで延長し、エッジが膝窩 (矢印) を公開するために、両側に収縮されています。B) 覆う緩むが開き、膝窩リンパ節は公開されている (矢印)。C) 膝窩リンパ節は、窩から取得されます。対側のD) の手順を繰り返し、両方のノードが BM バッファーでいっぱい両面 coverslip/真空グリース溜まりでマウントされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 収穫とイメージングの photoactivation 脾臓をマウントする手順。) 切開の胸部の真下前方内側線で作られ、後腋窩線を体の周りに拡張および端は脾臓 (矢印) の先端を露出に収縮されています。B) 脾臓は撤回し、BM バッファーでいっぱい両面 coverslip/真空グリース溜まりにマウントが薄い (1-2 mm) スライスにカットします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4:PhotoactivationA) 2 光子光前に脾臓に胚中心の顕微鏡写真。脾辺縁帯のラベルに収穫前に行ったアンチ CD169 PE を生体内でラベリング (赤は"MZ"によって示される)。第 2 高調波信号を感じ取ることが、コラーゲンを含む構造外皮と主要な血管 (青) に関連付けられています。矢印が識別される、胚中心の活動に伴う核体マクロファージ高い。イメージングは、940 nm 励起で行われました。左上のスケールバーを示す 200 μ m. B) a が、830 の photoactivation 後 nm。センサー細胞は、辺縁帯、以前に識別された核体マクロファージを包括的な関心有界の定義済みの領域に (緑) を表示をされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5:センサー胚中心 B 細胞のフローサイトメトリーします。サイドゲート散布とリンパ球と前方のA) プロット。B) リンパ球ゲート、および結果の一重項ゲート内前方散乱の高さの機能として前方散乱領域のプロット。C) 生存率を染める一重項ゲートと結果の生きているセル ゲート内にある除外プロット。D) B220 陽性 B 細胞のゲーティング。E) B220 + ゲート内 CD38lo GL7hi 細胞として識別される胚中心 B 細胞のゲーティング。F) 非活性化の共発現細胞とセンサー PA GFP のサブセットとして識別される GC B 細胞集団内のセンサー細胞のゲーティング。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: プロトコルの概要がグラフィカルこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Discussion

自己免疫疾患モデルマウスの数が多い、自然濾胞16多くの提示があります。ただし、利用可能なモデルの多くを抱く複雑な遺伝的背景やリンパ球の増殖や活性化、悪い記者ラインと正常リンパ球挙動の研究と地域に適したそれらをレンダリングの中央のレギュレータの変異自己免疫疾患のそれぞれ。現在のモデルでは、それどころか、自己反応性野生由来型胚中心 B 細胞によって表される現在の場合遺伝子ノックアウト、記者、必要な組み合わせを使用しての詳細な分析に「プラグ アンド プレイ」アプローチも可能します。活性型 GFP。体内のラベリング方法を使用すると、単一胚中心は explanted リンパ系組織と 2 光子顕微鏡を用いた、細胞成分センサーで視覚化できます。単一胚中心からセンサー リンパ球は、単一のセル、または一括で、分析または並べ替えられた細胞をすることができます。これらの細胞は、自己免疫の分野に新たな洞察を提供する追加の下流分子・機能解析後に受ける場合が。

このプロシージャの成功したパフォーマンスのいくつかの重要なステップがあります。代表的な結果、照射によって示されるように (1,100 Rad) ドナー骨髄再構築が正常に降伏 B 細胞コンパートメントのキメリズムのほぼ完全な受信者骨髄コンパートメントを置き換えるとします。これは重要なポイント、残留受信者由来 B 細胞が '暗い' 胚中心の人口のサブセットをレンダリングします。照射用ソースに関係なく照射の線量/タイミングは動物に最小限の巻き添え組織の損傷と最大破壊的効果をもたらす最適化するようにしました。再構成、高い溶解度を確実に屈する骨粉砕プロトコルと 2000 万合計ドナー細胞の再構成を発見されています。骨髄を抽出するため生殖不能および風邪の氷を作業骨髄ドナーの高生存率が保証されます。必要なドナー骨髄の比率に達すると、細胞は、それ自身をカウントするため、カウントするため骨髄のサブサンプルを取り出すときの因数をカウントする場合は、細心の注意を行使する必要です。混合の共同遠心分離と別々 に再混合し、代わりに、ドナーの骨髄をペレット化をドナーの比率は次の細胞数任意の傾斜を防ぐために提供しています。

混合骨髄キメラ世代のプロトコルは、単独で立つことができるし、希望の記者や遺伝子ノックアウトと自己反応性濾胞とキメラを生成できます。しかし、この 1 つの制限は留まらずドナーを使用する必要です。564Igi ひずみが c57bl/6 j コンジェニック背景あり結果として、他の寄付および受信者 2b コンジェニック背景があるべきである (または 564Igi ひずみが目印して、目的のひずみと自己免疫表現型にも新しいバック グラウンドで確認)。照射プロシージャは免疫寛容環境17を好む傾向がある、いくつかのマイナーな組織適合性の抗原不一致が容認されるかもしれない。しかし、この側面徹底的に場合考慮するべき、特に男性と女性ドナーおよび/または女性男性限定 Y 抗原反応性の可能性があるのため、受信者を混合します。

同様に、プロトコルの photoactivation の側面は、単独で立つことができるし、多くの異なった文脈で使用することがあります。ただし、PA GFP レポーターは現在では間質細胞ですがのすべての造血系統の細胞で活発である UBC プロモーターを利用ではのみ。導入で述べたように、他の活性型、スイッチング、または蛍光レポーター系統利用と実験条件の適切な調整と PA-GFP に代えることができます。

900 を上回るレーザーを維持することによって望ましくないエリアの不注意の photoactivation を避けることが重要です nm イメージング、この波長は photoactivate PA GFP いないとき。自体 photoactivation、レーザー パワーとピクセル滞留時間など、特定の設定によって異なります組織、特定の組織が使用すると、イメージング システムの深さと各アプリケーションが使用される特定のイメージング システムの最適化するようにしました。注意が必要しないように光損傷細胞が同時に下流解析の活性化細胞の十分な表現を得るために、スタック全体の効率的な光を得るために不可欠です。胚中心 B 細胞一般に構成するどこでも 0.5% から脾または皮膚リンパ節 B 細胞の ~ 2% に、センサー単一胚中心 B 細胞全体の ~ 1% を構成する (図 5) の代表の結果からわかるように、人口単一脾臓スライス内に存在します。したがって、解析に成功または細胞のかなりの数の並べ替えは、多数のイベントを処理する必要があります。

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

SE デーグンは仲間の Lundbeckfonden とカールスバーグ財団上席研究員です。この仕事の一部また、NNF 医グラント (SE デーグン) によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody, 9D11-A568 In-house generated 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Biotium 92255
Antibody, 9D11-A647 In-house generated 9D11 hybridoma, kindly provided by MC Carroll, labeled with kit: Nordic Biosite ABD-1031
Antibody, FITC anti-mouse CD45.1 Biolegend 110705
Antibody, Pacific Blue anti-mouse/human GL7 Antigen (T and B cell Activation Marker) Biolegend 144613
Antibody, PE anti-mouse CD169 (Siglec-1) Biolegend 142403
Antibody, PE/Cy7 anti-mouse CD38 Biolegend 102717
Antibody, PerCP/Cy5.5 anti-mouse/human CD45R/B220 Biolegend 103235
Capillary tube, Mylar-wrapped, heparinized Fisher Scientific 211766
Cell strainer, 70 µm Falcon 352350
Conical tubes, 50 mL Falcon 352235
Cover slip, square, 22x22 mm, 0.13-0.17 mm Thermo Fisher Scientific 22X22-1
EDTA Merck 1,084,180,250
Ethanol, 70% VWR 8301.360
Fetal bovine serum Life Technologies 10270106
Flow cytometer, FACS Canto II BD Biosciences 338962
Flow cytometer, LSRFortessa SORP BD Biosciences - Special order product with 4 lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm and 640 nm)
Grease, high vacuum, Dow Corning VWR DOWC1597418
Hemocytometer, Burker-Türk VWR 630-1544
Isoflurane, IsoFlo vet. Orion Pharma 9658
Lymphocyte separation medium (Lympholyte-M Cell Separation Media) Cedarlane CL5035
Microcentrifuge tube, 1.5 mL (Eppendorf) Sarstedt 72.690.550
Microscope, Two-photon Prairie Technologies (now Bruker) - Special order Ultima In Vivo Two Photon Microscope
Mortar w. lip, unglazed, 75 ml VWR 410-0110
NaHCO3 Merck 1063290500
Needle, 18 gauge BD Medical 304622
NH4Cl VWR 87,769,290
PBS Sigma d8537
Pestle homogenizer VWR 47747-358
Pestle, unglazed, 175 mm VWR 410-0122
Pipette, Serological, 10 ml VWR 612-3700
Pipette, transfer, plastic Sarstedt 861,172,001
Plastic paraffin film (Parafilm M) Bemis PM996
Plate, 96-well Falcon 353910
Surgical forceps, Student Dumont #5 Forceps FST - Fine Science Tools 91150-20
Surgical forceps, Student Dumont #7 Forceps FST - Fine Science Tools 91197-00
Surgical scissors, Student Fine Scissors, Straight FST - Fine Science Tools 91460-11
Syringe, 10 mL Terumo SS-10ES1
Syringe, 20 mL Terumo SS-20ES1
Syringe, 5 mL Terumo SS-05S1
Syringe, Insulin, 0.3 cc BD Medical 324827
Tribrissen vet. 24% inj., containing 200 mg sulfadiazin and 40 mg trimethoprim/ml MSD Animal health 431577
Trypan blue solution, 0.4% VWR K940-100ML
Viability dye, eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 Thermo Fisher Scientific 65-0865-14

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