病原性細菌に対する免疫学的応答を評価するための Opsonophagocytic 殺害アッセイ

Immunology and Infection

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Summary

この opsonophagocytic 殺害の試金を使用してに対応し、さまざまな治療法や条件に基づいている細菌を殺す免疫細胞の貪食能力を比較します。クラシック、この試金はオプソニンとして細菌に対する抗体のエフェクターの機能を評価するためのゴールド スタンダードとして提供しています。

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Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (146), e59400, doi:10.3791/59400 (2019).

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Abstract

ホストの細菌の定着に対する免疫応答の重要な側面は、貪食能です。Opsonophagocytic 殺害アッセイ (OPKA) は、貪食細胞が細菌の単位との共培養実験手順です。免疫細胞が貪食し、補体依存的に細菌文化を殺します。免疫細胞の殺害の効率はいくつかの要因に依存して、どのように異なる細菌を決定する使用ことができます細胞死への抵抗についての文化を比較します。この方法では、血清型および/または特定の菌株に対して潜在的な免疫治療の有効性を評価できます。このプロトコルでは基本的な培養条件と細胞治療条件および HL 60 免疫細胞との共培養後細菌の細胞の生存率を決定するカウントを利用して簡易 OPKA をについて説明します。このメソッドは、正常に数の異なる肺炎球菌血清型、被膜と acapsular 株と他の細菌種に利用されています。この OPKA プロトコルの利点は、そのシンプルさ、汎用性 (このアッセイは、オプソニンとして抗体治療に限定されない)、時間および基本的な実験グループを評価するために試薬の最小化。

Introduction

試金 (OPKA) を殺す opsonophagocytic は細菌の構造や機能の変化を免疫反応と機能の後の変化にリンクするための重要なツールです。など、それは頻繁に相補的なアッセイとして抗体治療、ワクチン候補、酵素の最適化などの免疫系の有効性を判断する使用されます。細菌の細胞死への免疫の最も基本的なコンポーネントを評価するために、OPKA を使用できます in vivo アッセイは効果的なクリアランスや細菌感染症モデルの保護を確認する必要が、: 細菌、免疫細胞、および実験トリートメント。前の研究は、OPKAs の変更および様々 な細菌と肺炎球菌12黄色ブドウ球菌緑膿菌3を含む血清型に使用できることを示しています。さらに、これらの最適化されたアッセイは細菌を改善するために免疫細胞の補体を介した4と抗体治療をよりアクセシブルにする酵素の機能を含むさまざまな実験的治療法を評価するために使用できます。オプソニン化5。古典的な OPKA のアッセイは正常に基礎および臨床研究で使用されている病原体特異的抗体6,7,8,9による保護のための強力な指標として設定.

免疫細胞の種類は、opsonophagocytic の殺害の評価のために使えます。1 つの一般的に使用される貪食人口は HL 60 ひと白血病細胞株である.この細胞株は文化で不活化前骨髄球として保つことができます。しかし、彼らは、異なる薬物治療10,11を介してさまざまな活性化状態に区別できます。N HL60 の治療、ジメチルホルムアミドは、強い貪食能11活性化好中球に細胞を区別します。HL ‐ 60 細胞に最適化されている、これらの食作用の試金10によく使用されますが、他のプライマリの多形核白血球は免疫実験12の腕として使用できます。

さらに、これらの試簡体字13または14を見てテストする細菌の抗生物質耐性菌の複数を多重化します。多重はより効率的に寒天プレート15スポットあたり単位 (CFUs) を形成する細菌のコロニーを数えることができるソフトウェアの開発を可能にしました。ここでは、1 つの菌株、HL 60 細胞、赤ちゃんウサギ補完、血液寒天培地プレートを使用して合理化された手法について述べる。この方法では、複数の治療法を特定細菌感染に対する自然免疫応答を変調することができますどのように疑問に対処するため迅速に評価できます。

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Protocol

1. 文化、差別化、および HL ‐ 60 細胞の検証

  1. HL 60 細胞培養媒体 500 mL RPMI L-グルタミンと 50 mL の熱不活化牛胎児血清との構成を準備します。HL ‐ 60 細胞の分化に影響を与える可能性がありますこれとは、抗生物質を追加しないでください。
  2. 伝搬/HL ‐ 60 細胞の維持のため 75 cm2 HL 60 細胞培地 10 mL に 5 x 10 の文化6セルは 37 ° C、5% CO2でフラスコ ベント。最適な細胞濃度を維持するためにセルごとに 3−4 日間の通路します。
    注:細胞濃度が 5 × 106/mL を超えない。
  3. 1 mL クライオ チューブに 10% ジメチルスルホキシド (DMSO) HL60 文化メディアで早かった約 1 × 106セル/ml で HL ‐ 60 細胞の株式を働いているを生成します。
    注:株式を働いているは-80 ° C で保存されるかもしれないマスター ストック-120 ° C で保存します。
  4. OPKA の前に 3 日間の無菌フィルター キャップ 75 cm2フラスコで CO2を 37 ° C、5% で養殖の 1.5 倍の 0.6 %n, n-ジメチルホルムアミド (DMF) と HL 60 細胞の培養基の 15 mL の 10 の7セルで HL ‐ 60 細胞を区別するため。
  5. HL ‐ 60 細胞正常に分化されている生存率および確立された流れ cytometry のプロトコル16,17によるとセル表面のマーカーをテストすることによって OPKA の試金で使用に適していることを確認します。 18,19。分化後 HL ‐ 60 細胞を収穫し、CD71、CD35、アネキシン V propidium ヨウ化物に約 1 × 104細胞蛍光標識抗体/汚れを染色します。
    注:分化した細胞は、≥65%、≥55 %cd35 をする必要があります+、および CD71 引時間: 20%+によって決定された確立検証プロトコル14 (図 1)。

2. OPKA バッファーおよび試薬の調製

  1. 滅菌ゼラチン Ca2 +/Mg2 +、熱不活化牛胎児血清の 5 mL、0.1% の 2.5 mL 滅菌 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 42.5 mL を混合することによって滅菌オプソニン化バッファー B (OBB) の 50 mL を準備します。4 ° C でのストア
  2. 赤ちゃんウサギの補数を取得し、-80 ° C で保存
  3. 取得または細菌の培養皿 (すなわち、15 × 100 mm2 5% 羊血液寒天培地プレート) を準備します。

3. 細菌の在庫の準備をサンプルします。

  1. テストする細菌の系統の株式を取得します。
    注:このプロトコルでは、血清型の肺炎球菌3 (WU2、博士月 Nahm が提供する豊富) を使用します。
  2. 約 2−4 37 ° C で h を適切なスープ (すなわち、トッド ・ ヒューイット スープ + この WU2 株の 0.5% 酵母エキス) の細菌株を成長します。
    注:600 の光学濃度 0.6、0.8 の間文化の nm (外径600) 必要があります。
  3. 2 分間 6,000 × gで遠心分離によって細菌をペレットし、適切なスープで 15% のグリセロールの 10−30 mL の細胞を再懸濁します。因数滅菌 1.5 mL 遠心チューブにストア-80 ° C で培養 (因数あたり 500 μ L)
  4. 37 ° C の水浴中細菌の在庫の 1 つのバイアルを解凍します。細菌細胞のペレットし、無菌条件下で OBB の 500 μ L で再懸濁します。
  5. OBB (すなわち、10 μ L の希釈、1:10 の 10 μ、10 μ L の 1: 100 など) で細菌の在庫の異なる希釈液を準備します。未処理の細菌の在庫の様々 な希釈液を使用して下記のとおり OPKA の試金 (セクション 4-6 HL-60/補完共培養を含む) を実行します。一晩で 30 ° C (CO2) 板の文化.
    注:温度 30 ° C; 増殖を防ぐために WU2 に固有のものその他の系統/血清型は 37 ° C で最適な成長可能性があります。
  6. HL ‐ 60 細胞や補体と共培養未処理の細菌の在庫の各希釈のコロニーをカウントします。細菌のどの希釈生成可算コロニー (HL ‐ 60 細胞と共培養未処理の細菌の約 80−120 CFUs) の最適な数を決定します。この細菌の在庫を含む将来の OPKAs のこの希釈に注意してください。

4. 細菌治療と文化

  1. 3.3 準備した細菌の在庫の 1 つの管を解凍します。細菌 (6,000 x gを 2 分間) をペレットし、3.6 の手順で決定したとおり最適な希釈で OBB で細胞ペレットを再懸濁します。
  2. 丸底 96 ウェル細胞培養プレートのウェルあたりの再懸濁の細菌希釈の 10 μ L をピペットします。
  3. 複製の実験も適切な抗体や薬物治療の 20 μ L を追加します。
    注:このプロトコルでは、マウスで生成された血清型特異的抗体が治療 X として追加され、血清型 3 多糖類のカプセルを低下させる知られている配糖体の加水分解酵素酵素は Y (図 2)4,20治療として追加されます。コントロールの井戸、井戸をトリートメントに使用するバッファーによって PBS または OBB、× 1 を使用します。
  4. サンプル プレートは、室温で 1 時間約 90 rpm で横に振る。最適温度に応じてこれらの条件またはテストされている治療法の振動条件を調整します。

5. HL 60 細菌培養

  1. HL ‐ 60 細胞を準備するには、15 mL の円錐管に DMF で 3 日前に (手順 1.4 参照) を治療している区別 HL ‐ 60 細胞を収穫します。Cells (500 × g, 3 分) をペレット、上澄みを廃棄し、少なくとも 10 mL の 1x PBS で洗浄します。
  2. ペレット洗浄セル (500 × g、3 分)、上澄みを廃棄し、OBB の細胞を再懸濁します (1 ml OBB 開始し、細胞数後 1 x 107/mL の最終濃度の調整)。
  3. 1:5 の最終巻で赤ちゃんウサギ補完 (滅菌、原液の赤ちゃんウサギ血清、年齢 3−4 週間) を追加します。
    注:HL 60 補完混合物の最終濃度は、1 x 107/mL をする必要があります。補完の熱不活化とアクティブな HL ‐ 60 細胞を含む 2 番目のソリューション可能性があります使用する補体依存関係をテストする場合 (補完で水浴に培養されると不活性化が > 少なくとも 30 分の 55 の ° C)。
  4. 1 h の細菌培養が完了 (手順 4.4) と、2 つのグループ (すなわち、使用のみ 20 μ L ピペット誤差を考慮する元 30 μ L 培養) の重複する井戸に各サンプル (すなわち、2 つの新しい井戸にも各 30 μ L のサンプルの 10 μ L) を分割します。: 1 セットは HL 60 補数との共培養になり、1 つ細菌のみが含まれます。井戸の各実験セット (ステップ 5.3) から HL 60 補完混合物の 50 μ L を追加 (委任された + HL 60);細菌のみ (代理 -HL-60) の井戸に単独で OBB の 50 μ L を追加します。
    注:この例では、約 800 の細菌 CFUs は 5 x 10550 μ L HL ‐ 60 細胞の初期培養に使用されます。感染症の多様性が高すぎるか低すぎる最終コロニー数によって示されるように場合、は、HL 60 細胞の数ではなく初期の細菌の希釈を調整します。
  5. 96 ウェル プレートは、1 h (CO2) 37 ° C で横に振る。

6. サンプルめっきと一晩インキュベート

  1. OBB でもそれぞれ 1:5 を希釈すると、各サンプルは、少なくとも 50 μ L のボリュームを持っています。
  2. サンプル間の十分な間隔を確保する細菌培養プレートの指定された領域に直接各サンプルの 50 μ L をピペットします。15 × 100 mm2の寒天版、1 つのプレートにピペットで移しなさい約 4 サンプルのラウンドします。
  3. カバーし、室温で約 15 分間乾燥するサンプルを許可します。
  4. プレートと一晩で 30 ° C (CO2) 文化を反転します。また、文化プレート嫌気細菌の成長に影響するかどうかをテストするのには嫌気性の瓶または形態の制御に。
  5. 一晩培養後各指定サンプル領域のコロニーをカウントします。それぞれに対応するコントロールおよび/またはサンプル HL 60 細胞共培養を受信しない設定の生きているセルの数を比較することによってデータを分析 (0% 100% 細胞の存続を示すセル殺害)。

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Representative Results

HL 60 分化の検証が、OPKA を開始する前に実行する必要があります。フローサイトメトリーを使用して細胞外アネキシン V (図 1)、CD71、CD35 CD11b 発現を決定するこの行うことができます。Propidium ヨウ化は生存率のマーカーとしても使用できます。CD35 発現の増加 3 日間 DMF で治療された後 (すべてのセルの ≥55%) CD71 の式を減少する必要があります (すべてのセルの引時間: 20%)。アネキシン V + と一緒に propidium ヨウ化 (π +) 細胞の割合にする必要があります < 十分なことを確認する 35% 細胞生存率。これらのパーセンテージは、最小要件を満たしていない場合の議論で説明されているよう培養条件を調整する必要があります。

6.5 のステップから得られる CFUs の数は、図 2に示すように、コントロール群 (100% 細胞生存率) と比較して異なるグループの細菌の細胞生存率を比較する使用できます。たとえば、井戸をトリートメントを受け取らなかったが、HL 60 との共培養から得られた平均のカウントは無治療と HL 60、100% 細胞生存率の指標になるのない培養または 0 を受け取った細胞数に比較的近いする必要があります。% 細胞死。効果的な治療、コロニー数より HL 60 共培養と (図 2および図 3) ない HL ‐ 60 細胞間で異なるはずです。HL 60 と HL 60 セットなしの大きな違いより効率的な貪食能を示しています。ただし、治療は実際に HL ‐ 60 細胞との共培養ではない一連の細菌細胞の成長を向上可能性があります。この処理と未処理のサンプルの違いを注意してください。細菌の希釈ではない場合 (ステップ 3.6) を最適化または植民地成長を (ステップ 6.5 またはディスカッションを参照してください) をめっき後慎重に守らない、植民地の増殖は植民地 (図 4) の正確なカウントを防ぐことができます。

Figure 1
図 1: フローサイトメトリーによる HL 60 細胞分化の検証します。HL ‐ 60 細胞の分化された収穫、洗浄し、1 x 105セル/mL の PBS で再停止されます。セル、96 ウェル プレートの 12 の井戸 (100 μ L/ウェル) に検体であった。細胞蛍光共役アンチ CD35、アンチ CD71、アネキシン V propidium ヨウ化と染色し、.無染色の細胞や細胞蛍光共役アイソタイプの抗体で染色は、コントロールとして使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: Y の治療向上細菌の HL 60 介する細胞殺害S. pneumoniaeサンプルが X の治療と扱われた (抗体) やトリートメント Y (酵素)。プロトコルに従って OPKA を行い細菌 CFUs の重複で数えられました。HL ‐ 60 細胞と扱われなかったサンプル コントロール (100% セル存続) として使用されました。対応する HL-60-無処置群と比較して HL 60 治療グループの細菌 CFUs の平均パーセンテージを示します。バーは、標準のエラーを表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: OPKA と一晩かけて培養後バクテリア CFUs 。細菌性のサンプルが扱われ、(A) なし共培養、37 ° C で 1 時間 (B) HL ‐ 60 細胞サンプルは、プロトコルに従って希釈、血液寒天培地プレートは 30 ° c (CO2) 一晩でめっきされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 細菌 CFU 増殖します。細菌性のサンプルが扱われ、OPKA が行われました。サンプルが希釈し、血液寒天培地プレートが 37 ° c (CO2) 一晩でめっきされます。コロニーの増殖を示すように、コロニー数の正確な評価はできません。将来プレートがコロニーの可算性を維持するために 30 の ° C (CO2) に引き下げられたため細菌の増殖、培養温度を 37 ° C (CO2) が主導。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

OPKAs は、予防接種6,8抗体による免疫反応を評価する上で重要な役割を果たします。この簡略化された OPKA の主要な意義はテストされる条件の適応性 (すなわち、抗体、酵素治療、等)。この意味で、このアッセイは、貪食、オプソニン (すなわち、抗体) の貢献をテストする使用できますがそれも使えます通常貪食経路を阻害する病原因子 (すなわち、莢膜多糖類) を克服する方法を評価します。潜在的多重 OPKA で使用される通常の手順の数を最小限に抑える実験の結果に影響を与えることができる、トラブルシューティングや使用可能なデータを取得するための最適化の量を減らす技術的なエラーの可能性を最小限に抑えます。このプロトコルは、処理条件のバリエーションに適していますと汎用性の偉大な取引が可能です。

HL 60 の文化と細菌の在庫の確立を通じてアッセイを予め、OPKA を実行するとき、余分な最適化の手順を防ぐために重要です。時間はすべての試薬を確認し専用する必要があり、細胞の種類は準備ができている実験前に機能が実行されます。文化 (約 2 週間) で HL 60 細胞ライン DMF の特定濃度が HL ‐ 60 細胞 (約 1 週間) を効果的に区別することを検証してコンタミ フリーと最適化された細菌の在庫の確立を反映する手順を含める希釈 (約 2 週間)。

このプロトコルのいくつかの手順は、可算植民地と適切なデータを取得するために重要です。このプロトコルは、食文化の維持および区別できるひと細胞ラインを使用して比較的少数のステップの使いやすさのためとして、HL ‐ 60 細胞を使用します。ひと末梢血単核球 (PBMCs) も使用できます。ただし、これらのセルを取得し、それらの使用のための条件を最適化することによりより困難かもしれない。HL ‐ 60 細胞は細菌に対して食細胞として機能するために区別されなければなりません。DMF で 3 日間の治療後の分化を確認するには、フローサイトメトリーは、1.5 のステップで説明したように任意の OPKA を試す前にセルの大半での CD11b と CD35 式をテストする使わなければなりません。細胞生存率は、(できればとアネキシン V と propidium ヨウ化染色) も確認してください。多数のセルが死んでいる場合アポトーシス、フローサイトメトリー、RPMI メディアで DMF を変更ことができます 0.6% と 3 日間分化と未分化または (0.4% − 0 8% DMF、2−6 日の培養時間) 細胞の生存と分化のマーカーと、。向上しました。この分化は、HL 60 関数は有効な細菌殺害の重要な OPKA の最初の最適化をする必要があります。OPKA 実験の前に HL 60 分化の検証をお勧めします。

細菌 CFUs (ステップ 3.6) 96 ウェル プレート (ステップ 4.2) に分配される最初の数も重要です: セルが多すぎますを調剤難しく、不正確な (ステップ 6.5) をカウントになるし、HL 60 共培養からみた細胞死が低下するのに対しあまりにも少数の細胞を調剤重複間の偏差の量を増やすことがあります、HL 60 共培養後任意の可算コロニーを示さないかもしれない。株式の希薄化の最適化が重要なため、HL 60/補体共同文化を含む、完全なプロトコルでテストする必要があります。

補完の重要性は、2 種類のサンプルをこのプロトコルではテストも可能性があります: アクティブな赤ちゃんウサギの補完と補完の熱不活化 1 つ 1 つ。細菌のみのセットは、まだ 100% 細胞生存基準として含まれているはず、HL ‐ 60 細胞は両方のセットとの共培養する必要があります。

いくつかの細菌の血清型のコロニーの形態、セルカウントまたは可視性問題が発生します。ムコイドの血清型の種類など 3肺炎球菌、例えば、ことができます簡単にはびこる、CFU の数を減らします。カプセル、治療群の増殖を阻止だろうが小さいコロニーの大きい数は算入される影響を与える治療法をテストするとき、これは特に問題となる証明するかもしれない。この不一致を防ぐためには、細胞増殖のコントロールが重要です。30 ° C でめっきのコロニーを培養して、一晩は細菌の増殖のモニタリングを強化し、可能性が高い、すべての植民地区別の数えられるサイズに達するとき、プレートを削除ことができます。また、異なる寒天は、個々 のコロニーの可視性を改善するために使用可能性があります。この方法でこのプロトコルには、有利な条件を最適化する小さな変更は菌株や様々 な治療オプションの値を設定するため使用ことができます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

当研究室の OPKA 試金の確立に彼の非常に貴重な援助ありがとう博士月 Nahm (アラバマ大学バーミンガム)。この作品は、FYA を国内機関の健康の付与 1R01AI123383 01A1 によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Annexin V (APC conjugated) BioLegend 640919
anti-CD35, human (PE conjugated) BioLegend 333405
anti-CD71, human (PE conjugated) BioLegend 334105
bacterial strain to be used (i.e., Streptococcus pneumoniae, WU2) Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) 
blood agar plates Hardy Diagnostic A10
Fetal Clone serum HyClone SH30080.03
glycerol Sigma G9012-1L
HL-60 cells ATCC CCL-240
IgG Isotype Control (PE conjugated) BioLegend 400907
N,N-dimethylformamide (DMF) Fisher Chemical UN2265
propidium iodide Sigma P4864
RPMI media with L-glutamine Corning 10-040-CV

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References

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