Opsonophagocytic doden Assay te beoordelen van de immunologische reacties tegen bacteriële pathogenen

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Deze opsonophagocytic doden test wordt gebruikt om te vergelijken het vermogen van fagocytische immuuncellen reageren op en doden van de bacteriën op basis van verschillende behandelingen en/of voorwaarden. Klassiek, dient deze bepaling als de gouden standaard voor het beoordelen van effector functies van antilichamen tegen een bacterie als opsonin aan de orde gesteld.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (146), e59400, doi:10.3791/59400 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Een belangrijk aspect van de immune reactie op bacteriële kolonisatie van de host is fagocytose. Een opsonophagocytic doden assay (OPKA) is een experimentele procedure waarin fagocytische cellen mede gekweekte met bacteriële eenheden zijn. De immune cellen zal phagocytose en doden van de bacteriële culturen in een aanvulling-afhankelijke manier. De efficiëntie van het doden van de immuun-gemedieerde cel is afhankelijk van een aantal factoren en kan worden gebruikt om te bepalen hoe verschillende bacteriële culturen vergelijken met betrekking tot resistentie tegen celdood. Op deze manier kan de werkzaamheid van potentiële immuun gebaseerde therapeutics tegen specifieke bacteriestammen en/of serotypen worden beoordeeld. In dit protocol beschrijven we een vereenvoudigde OPKA dat gebruik maakt van fundamentele kweekomstandigheden en cel tellen om te bepalen van de levensvatbaarheid van de bacteriële cellen na co cultuur met behandeling voorwaarden en HL-60 immuuncellen. Deze methode is met succes gebruikt met een aantal verschillende pneumokokken serotypen, kapselvorming en acapsular stammen, en andere bacteriële soorten. De voordelen van dit protocol OPKA zijn zijn eenvoud, veelzijdigheid (zoals deze bepaling niet beperkt tot antilichaam behandelingen als opsonins is), en minimalisering van tijd en reagentia te beoordelen van experimentele basisgroepen.

Introduction

De opsonophagocytic doden assay (OPKA) is een essentiële tool voor wijzigingen in de bacteriële structuur of functie te koppelen aan latere wijzigingen in de immuunrespons en functie. Als zodanig, wordt het vaak gebruikt als een aanvullende test om te bepalen van immuun gebaseerde werkzaamheid van antilichaam behandelingen, vaccin kandidaten, enzym optimalisatie, enz. Terwijl in vivo tests nodig zijn om te bepalen van de effectieve goedkeuring of bescherming in het model van een bacteriële infectie, de OPKA kan worden gebruikt voor het beoordelen van immuun bijdrage tot de bacteriële celdood op het meest elementaire componenten: bacteriën, immune cellen, en experimentele behandelingen. Eerdere studies hebben aangetoond dat OPKAs kan worden bewerkt en voor een verscheidenheid van bacteriën en serotypen gebruikt, met inbegrip van1van de Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Bovendien, deze geoptimaliseerde testen kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de verschillende experimentele behandelingen, met inbegrip van de mogelijkheid van een enzym dat de bacterie meer toegankelijk maken voor aanvulling-gemedieerde immuun cellen4 en antilichaam behandelingen te verbeteren opsonization5. Klassiek, OPKA assay is met succes gebruikt in fundamenteel en klinisch onderzoek instellingen als een krachtige indicator voor bescherming geïnduceerd door pathogeen-specifieke antilichamen6,7,8,9 .

Verschillende soorten immuuncellen kunnen worden gebruikt voor de beoordeling van opsonophagocytic doden. Een veelgebruikte fagocytische bevolking is de HL-60 menselijke leukemische cellijn. Deze cellijn kan worden gehouden als geïnactiveerd promyelocytes in cultuur; ze kunnen echter worden gedifferentieerd in verschillende geactiveerde Staten via verschillende drug behandelingen10,11. Behandeling van HL60 met N, N-dimethylformamide onderscheidt de cellijn in geactiveerde neutrofiele granulocyten met sterke fagocytische activiteit11. Terwijl HL-60-cellen zijn geoptimaliseerd en vaak voor deze fagocytose testen10 gebruikt worden, kunnen de andere primaire polymorfonucleaire leukocyten worden gebruikt als immuun arm van het experiment12.

Daarnaast kunnen deze gehaltebepalingen vereenvoudigde13 of14 te kijken naar meerdere antibiotica-resistente stammen van de bacteriën te beproeven multiplexed. De multiplexed methode geboekt meer haalbaar door de ontwikkeling van de software die efficiënt bacteriële kolonievormende eenheden (CFUs) per plek op een agar plaat15kan rekenen. Hier beschrijven we een gestroomlijnde methode met behulp van een bacteriële stam, HL-60 cellen baby konijn aanvulling en bloed agar platen. Met deze methode kunnen meerdere behandelingen snel worden beoordeeld om specifieke onderzoeksvragen op hoe de ingeboren immune reactie op bacteriële infectie kan worden gedifferentieerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cultuur, differentiatie en validatie van de HL-60-cellen

  1. HL-60 cel cultuurmedia 500 mL RPMI met L-glutamine en 50 mL warmte-geïnactiveerd foetale runderserum verder uit te bereiden. Voeg geen antibiotica als dit van invloed kan zijn op de differentiatie van de HL-60-cellen.
  2. Voor vermeerdering/onderhoud van HL-60-cellen ontlucht cultuur 5 x 106 cellen in 10 mL van de HL-60 cel voedingsbodems in 75 cm,2 kolven op 37 ° C en 5% CO2. Passage cellen de dagen van elke 3−4 te handhaven optimale cel concentraties.
    Opmerking: De cel concentratie mag niet hoger zijn dan 5 x 106/mL.
  3. Genereren werken voorraden HL-60-cellen door aliquoting ongeveer 1 x 106 cellen/mL in HL60 voedingsbodems met 10% dimethylsulfoxide (DMSO) in 1 mL cryogene buizen.
    Opmerking: Werkende voorraden kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C. De master voorraad moet worden opgeslagen bij-120 ° C.
  4. Onderscheiden HL-60-cellen door kweken 1.5 x 107 cellen in HL-60 cel voedingsbodems met 0,6% N, N-dimethylformamide (DMF) 15 mL bij 37 ° C en 5% CO2 in steriele filter-afgetopte 75 cm2 kolven voor 3 dagen vóór de OPKA.
  5. Valideren dat de HL-60-cellen met succes ligt in gedifferentieerde zijn en geschikt voor gebruik in de OPKA test zijn door het testen van de levensvatbaarheid en de oppervlakte markers cel volgens gevestigde stroom cytometry protocollen16,17, 18,19. Na differentiatie, oogst HL-60-cellen en ongeveer 1 x 104 cellen met fluorescently-geconjugeerde antilichamen/vlekken vlek voor CD71, CD35, Annexine V en propidium jodide.
    Opmerking: Gedifferentieerde cellen moet ≥65 levensvatbare, ≥55% CD35+, en ≤20% CD71+ zoals bepaald door de gevestigde validatie protocollen14 (Figuur 1).

2. bereiding van OPKA Buffers en reagentia

  1. Bereid 50 mL steriele opsonization buffer B (OBB) door het mengen van 42,5 mL steriele 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met Ca2 +/Mg2 +5 mL foetale runderserum warmte-geïnactiveerd, en 2,5 mL 0,1% steriele gelatine. Bewaren bij 4 ° C.
  2. Verkrijgen van baby konijn aanvulling en opslaan bij-80 ° C.
  3. Verkrijgen of bereiden bacteriecultuur platen (dat wil zeggen, 15 x 100 mm2 5% schapenmelk bloed agar platen).

3. bereiding van de bacteriële voorraad monsters

  1. Het verkrijgen van een voorraad van de bacteriële strain(s) te beproeven.
    Opmerking: Voor dit protocol, serotype 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, gulle wijze aangeboden door Dr. Moon Nahm) wordt gebruikt.
  2. Groeien de bacteriële stam in een passende Bouillon (dat wil zeggen, Todd-Hewitt Bouillon + 0,5% gistextract voor deze soort WU2) voor ongeveer 2−4 h bij 37 ° C.
    Opmerking: De optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van de cultuur moet tussen 0,6 en 0,8.
  3. De bacteriën door centrifugeren bij 6.000 x g gedurende 2 min pellet en resuspendeer de cellen in de 10−30 mL 15% glycerol in de passende Bouillon. Aliquot de bacteriecultuur (500 µL per aliquot) in steriele 1,5 mL centrifuge buizen en winkel bij-80 ° C.
  4. Één flacon van bacteriële voorraad in een waterbad 37 ° C ontdooien. De bacteriecellen pellet en resuspendeer in 500 µL van OBB onder steriele omstandigheden.
  5. Maak verschillende verdunningen van het bacteriële materieel in OBB (dat wil zeggen, 10 µL van geen verwatering, 10 µL van 1:10, 10 µL van 1:100, enz.). Voert de OPKA assay (secties 4 – 6, inclusief HL-60/aanvulling co cultuur) zoals beschreven hieronder met behulp van verschillende verdunningen van de onbehandelde bacteriële voorraad. Cultuur van de platen 's nachts bij 30 ° C (CO2).
    Opmerking: De temperatuur van 30 ° C is specifiek voor WU2 ter voorkoming van overmatige groei; andere stammen/serotypen kunnen groeien optimaal bij 37 ° C.
  6. Tellen de kolonies voor elke verdunning van onbehandelde bacteriële voorraad samen met HL-60-cellen en aanvulling worden gekweekt. Bepalen welke verdunning van bacteriën levert het optimale aantal aftelbare koloniën (ongeveer 80−120 CFUs voor onbehandelde bacteriën samen gekweekt met HL-60-cellen). Opmerking deze verdunning voor toekomstige OPKAs waarbij deze bacteriële voorraad.

4. bacteriële behandeling en cultuur

  1. Ontdooi een buis van bacteriële voorraad bereid in stap 3.3. Pellet bacteriën (6.000 x g gedurende 2 minuten) en resuspendeer de pellet cel in OBB bij optimale verdunning zoals bepaald in stap 3.6.
  2. Pipetteer 10 µL van de geresuspendeerde bacteriële verdunning per putje in een ronde-onderste 96-Wells cel cultuur plaat.
  3. Voeg 20 µL van passende antilichaam of drug behandeling aan elk experimentele putje in tweevoud.
    Opmerking: In dit protocol, een serotype-specifieke antilichaam gegenereerd in muizen wordt toegevoegd als behandeling X en een glycoside hydrolase enzym bekend te degraderen de serotype 3 polysaccharide capsule is toegevoegd als behandeling204,Y (Figuur 2). Voor controleputjes, gebruikt u 1 x PBS of OBB, afhankelijk van de buffer die wordt gebruikt voor de behandeling putten.
  4. Schud de plaat van de steekproef van ongeveer 90 toeren per minuut gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Pas deze afhankelijk van de optimale temperatuur of schudden van de toestand van de behandelingen wordt getest.

5. HL-60 bacteriecultuur co

  1. HL-60-cellen voor te bereiden door de HL-60 gedifferentieerde cellen die zijn behandeld met DMF drie dagen vooraf (zie stap 1.4) in 15 mL conische buizen te oogsten. Pellet van de cellen (500 x g, 3 min), verwijder het supernatant en wassen met ten minste 10 mL 1 x PBS.
  2. Pellet de gewassen cellen (500 x g, 3 min), verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in de OBB (begin met 1 mL OBB- en aanpassen voor een eindconcentratie van 1 x 107/mL na het tellen van de cel).
  3. Baby konijn aanvulling (steriel, onverdund baby konijnenserum, leeftijd 3−4 weken) toevoegen aan een eindvolume van 1:5.
    Opmerking: De uiteindelijke concentratie van de HL-60-aanvulling mengsel moet 1 x 107/mL. Als aanvulling afhankelijkheid wilt testen, een tweede oplossing met actieve HL-60-cellen met warmte-geïnactiveerd aanvulling kan worden gebruikt (aanvulling kan worden geïnactiveerd door broeden in een waterbad op > 55 ° C gedurende ten minste 30 minuten).
  4. Na 1 h bacteriecultuur is voltooid (stap 4.4), verdeel elk monster (dat wil zeggen, 10 µL van elk 30 µL monster goed in twee nieuwe waterputten) in dubbele putten voor twee groepen (gebruik bijvoorbeeld slechts 20 µL van de oorspronkelijke 30 µL co cultuur ter verantwoording voor pipetting fout) : één set zal mede gekweekte met HL-60-aanvulling en een zal alleen bacteriën bevatten. Voeg 50 µL van het mengsel van de HL-60-aanvulling (uit stap 5.3) op elke experimentele verzameling van putten (gedelegeerde + HL-60); Breng 50 µL van OBB alleen in de putjes van bacteriën slechts (gedelegeerde -HL-60).
    Opmerking: In dit voorbeeld worden ongeveer 800 bacteriële CFUs gebruikt voor de initiële co cultuur met 5 x 105/50 µL HL-60-cellen. Als deze veelheid aan infectie is te hoog of te laag zoals aangegeven door de nummers van de laatste kolonie, past u de eerste bacteriële verdunning in tegenstelling tot de HL-60 cel tellen.
  5. Schud de 96-wells-plaat bij 37 ° C gedurende 1 h (CO2).

6. voorbeeld van Plating en overnachting incubatie

  1. Verdun elk goed 1:5 met OBB, zodat elk monster een volume van minstens 50 µL heeft.
  2. Pipeteer 50 µL van elk monster rechtstreeks naar een aangewezen gebied voor een bacteriecultuur plaat, zorgen voor voldoende ruimte tussen de monsters. Voor 15 x 100 mm ronde2 agar platen, Pipetteer ongeveer 4 monsters op een bord.
  3. Dekken en laat monsters gedurende ongeveer 15 minuten bij kamertemperatuur drogen.
  4. Omkeren platen en cultuur overnachting bij 30 ° C (CO2). U kunt ook cultuur platen in anaërobe potten om te testen of zuurstofvrije omstandigheden de groei van bacteriën beïnvloeden of besturingselement voor morfologie.
  5. Na overnachting cultuur, tellen de kolonies in elke aangewezen voorbeeldgebied. Gegevens analyseren door het vergelijken van het aantal levende cellen in elke set de overeenkomstige controle en/of de monsters die niet co cultuur van de cel van de HL-60 ontvangt (kenmerkend voor de overleving van de cel van de 100%, 0% cel doden).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validatie van de HL-60 differentiatie moet worden uitgevoerd voordat de OPKA. Dit kan worden bereikt met behulp van stroom cytometry om te bepalen van de extracellulaire uitdrukking van CD11b, CD35, CD71 en Annexine V (Figuur 1). Propidium jodide kan ook worden gebruikt als een marker van de levensvatbaarheid. Na behandeld met DMF voor 3 dagen, uitdrukking van CD35 moet worden verhoogd (≥55% van alle cellen) en expressie van CD71 moet worden verlaagd (≤20% van alle cellen). Het percentage Annexine V + en propidium jodide (PI +) cellen samen moet < 35% om voldoende levensvatbaarheid van de cellen. Als deze percentages niet voldoen aan de minimale vereisten, moeten de cultuuromstandigheden worden aangepast zoals wordt beschreven in de discussie.

Het aantal CFUs stap 6.5 verkregen kan worden gebruikt om te vergelijken van de overleving van de bacteriële cel van verschillende groepen in vergelijking met de onbehandelde controlegroep (de overleving van de cel van de 100%), zoals afgebeeld in Figuur 2. Bijvoorbeeld, moet de gemiddelde graven verkregen uit putten die ontvangen geen behandeling maar werden mede gekweekte met HL-60 relatief dicht bij nummer naar de cellen die geen behandeling en geen co cultuur van HL-60, die indicatief voor de overleving van de cel van 100 zijn zou % of 0 de dood van de cel van de %. Met een effectieve behandeling moet het aantal kolonies meer verschillend tussen HL-60 co cultuur en geen HL-60-cellen (Figuur 2 en Figuur 3). Grotere verschillen tussen HL-60 en geen HL-60-sets zijn indicatief voor een efficiëntere fagocytose. De behandeling kan echter daadwerkelijk verbeteren van bacteriële celgroei in de set thats niet mede gekweekte met HL-60-cellen. Dit verschil in monsters van behandelde en onbehandelde dient te worden opgemerkt. Als de bacteriële verdunning niet is geoptimaliseerd (stap 3.6) of de groei van de kolonie niet zorgvuldig wordt nageleefd na plating (stap 6.5 of zie discussie), overmatige groei van de kolonies kan voorkomen nauwkeurig tellen van koloniën (Figuur 4).

Figure 1
Figuur 1 : Validatie van HL-60 celdifferentiatie via stroom cytometry. Gedifferentieerde HL-60-cellen werden geoogst, gewassen en geresuspendeerde in 1 x 105 cellen/mL PBS. Cellen werden vervolgens aliquoted in 12 wells (100 µL per putje) in een 96-wells-plaat. Cellen werden vervolgens gekleurd met fluorescently geconjugeerd anti-CD35, anti-CD71, Annexine V en propidium jodide. Onbevlekt cellen of cellen gekleurd met fluorescently geconjugeerd isotype antilichamen werden gebruikt als besturingselementen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Behandeling Y verbetert HL-60-gemedieerde cel doden van bacteriën. S. pneumoniae monsters werden behandeld met behandeling X (antilichamen) of behandeling Y (enzym). OPKA werd uitgevoerd volgens het protocol en bacteriële CFUs telde in tweevoud. Monsters die niet werden behandeld met HL-60-cellen werden gebruikt als een besturingselement (100% overleving van de cel). Komt te staan, zijn de gemiddelde percentages van bacteriële CFUs in de groepen van de HL-60 behandeld in vergelijking met de overeenkomstige niet-HL-60-behandelde groepen. De staven standaardfout. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Bacteriële CFUs na OPKA en overnachting cultuur. Bacteriële monsters werden behandeld en co gekweekt zonder (A) of (B) HL-60-cellen gedurende 1 uur bij 37 ° C. Monsters waren volgens het protocol verdund en vergulde op bloed agar platen overnachting bij 30 ° C (CO2). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Bacteriële kve begroeiing. Bacteriële monsters werden behandeld en OPKA werd uitgevoerd. Monsters werden verdund en vergulde op bloed agar platen overnachting bij 37 ° C (CO2). Accurate beoordeling van kolonie getallen worden niet bepaald zoals begroeiing van kolonies is weergegeven. Zoals 37 ° C (CO2) tot bacteriële overgroei, de incubatietemperatuur leidde voor toekomstige platen werd verlaagd tot 30 ° C (CO2) om de toerekening van de koloniën. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

OPKAs dienen een essentiële rol bij de beoordeling van antilichaam gemedieerde immuunreacties geïnduceerd door vaccinaties6,8. De belangrijkste betekenis van dit vereenvoudigde OPKA is het aanpassingsvermogen in de voorwaarden te beproeven (dat wil zeggen, antilichamen, enzym behandelingen, enz.). In deze zin, terwijl deze bepaling kan worden gebruikt voor het testen van de bijdrage van opsonins (dat wil zeggen, antistoffen) in fagocytose, kan het ook worden gebruikt voor de beoordeling van manieren om te overwinnen van virulentiefactoren (dat wil zeggen, kapselvorming polysacchariden) die normaal fagocytische trajecten remmen. Minimaliseren van het aantal stappen die meestal in een multiplexed OPKA potentieel gebruikt worden minimaliseert de kans op technische fouten die kunnen invloed hebben op de experimentele resultaten en vermindert de hoeveelheid probleemoplossing en optimalisatie voor het verkrijgen van bruikbare gegevens. Als dit protocol is geschikt voor wijzigingen in de voorwaarden van de behandeling, zorgt het voor een heleboel veelzijdigheid.

Vaststelling vooraf van de bepaling door middel van cultuur van de HL-60 en oprichting van bacteriële voorraden is belangrijk om te voorkomen dat irrelevante optimization stappen bij het uitvoeren van de OPKA. Tijd om ervoor te zorgen dat alle reagentia moet worden gewijd en celtypes zijn klaar en functionele voordat het experiment wordt uitgevoerd. Deze stappen omvatten de HL-60 cellijn in cultuur (ongeveer twee weken), valideren dat specifieke concentraties DMF effectief de HL-60-cellen (ongeveer een week onderscheiden), en vrij van verontreinigingen en geoptimaliseerde bacteriële voorraad tot vaststelling van teeltmateriaal verdunningen (ongeveer twee weken).

Sommige stappen van dit protocol zijn cruciaal voor het verkrijgen van aftelbare kolonies en adequate gegevens. Dit protocol maakt gebruik van HL-60-cellen als fagocyten te wijten aan het gemak van het gebruik van een menselijke cel-lijn die kan worden gehandhaafd in cultuur en gedifferentieerd met relatief weinig stappen. Perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) kunnen ook worden gebruikt; verkrijgen van deze cellen en het optimaliseren van de voorwaarden voor het gebruik ervan kunnen evenwel meer uitdagend. De HL-60-cellen moeten worden gedifferentieerd om te kunnen functioneren als fagocyten tegen de bacteriën. Om te controleren of de differentiatie na de 3-daagse behandeling met DMF, moet stroom cytometry worden gebruikt om te testen voor de expressie van CD11b en CD35 op een meerderheid van de cellen voordat eventuele OPKA wordt geprobeerd, zoals besproken in stap 1.5. Levensvatbaarheid van de cellen moet ook worden gecontroleerd (bij voorkeur met Annexine V en propidium jodide kleuring). Als een groot aantal cellen dood zijn, apoptotic, of gedifferentieerdeproductie zoals waargenomen met stroom cytometry, de 3-daagse differentiatie met 0,6% DMF in RPMI media kan worden gewijzigd (0,4% −0. 8% DMF, 2−6 cultuur dagtijd) totdat de cel levensvatbaarheid en differentiatie markeringen worden verbeterd. Deze differentiatie moet de eerste optimalisatie van de OPKA als functie van de HL-60 essentieel voor effectieve bacteriële doden is. Het is raadzaam valideren HL-60 differentiatie vóór elk OPKA experiment.

Het aantal bacteriële CFUs (stap 3.6) in eerste instantie achterwege gelaten in de 96-wells-plaat (stap 4.2) is ook kritisch: verstrekking van teveel cellen zal tellen moeilijk en onnauwkeurig (stap 6.5) en kan verminderen de celdood waargenomen vanaf HL-60 co cultuur, overwegende dat verstrekking van te weinig cellen kan verhogen de hoeveelheid afwijking tussen duplicaten en mei niet uiterlijk vertoon van elke aftelbare kolonies na HL-60 co cultuur. Optimaliseren van de voorraad verdunning is daarom cruciaal, en met het volledige protocol, met inbegrip van de HL-60/aanvulling co cultuur moet worden getest.

Het belang van aanvulling ook met dit protocol kan worden getest door het opnemen van twee sets van monsters: één met actieve baby konijn aanvulling en één met warmte-geïnactiveerd aanvulling. HL-60-cellen moeten worden mede gekweekt met beide sets, hoewel een alleen-bacteriën set nog opgenomen als een 100% cel overleving basislijn worden moet.

Voor sommige bacteriële serotypen, kan de morfologie van de kolonies maken cel tellen of zichtbaarheid problematisch. Slijmachtig serotypen zoals type 3 Streptococcus pneumoniae, bijvoorbeeld kan, gemakkelijk overwoekeren en verminderen de CFU graven. Dit kan problematisch zijn bij het testen van behandelingen die invloed hebben op de capsule, zoals begroeiing zou worden voorkomen in de behandelde groep maar groter aantal kleinere kolonies zou worden geteld. Om te voorkomen dat deze discrepantie, is controle van celgroei kritisch. Kweken van de vergulde kolonies bij 30 ° C's nachts zal waarschijnlijk zorgen voor verbetering van de controle van de bacteriële groei en de platen kunnen worden verwijderd wanneer alle kolonies te onderscheiden, Telbaar maten bereiken. Daarnaast kunnen verschillende agar platen worden gebruikt ter verbetering van de zichtbaarheid van afzonderlijke kolonies. Op deze manier is dit protocol voordelig als kleine veranderingen voor het optimaliseren van de voorwaarden kan dus worden gebruikt ter verantwoording voor een aantal bacteriestammen of verschillende behandelmogelijkheden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Dr. Moon Nahm (Universiteit van Alabama Birmingham) voor zijn onschatbare hulp bij het vaststellen van OPKA testen in ons laboratorium. Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid Grant 1R01AI123383-01A1 naar FYA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Annexin V (APC conjugated) BioLegend 640919
anti-CD35, human (PE conjugated) BioLegend 333405
anti-CD71, human (PE conjugated) BioLegend 334105
bacterial strain to be used (i.e., Streptococcus pneumoniae, WU2) Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) 
blood agar plates Hardy Diagnostic A10
Fetal Clone serum HyClone SH30080.03
glycerol Sigma G9012-1L
HL-60 cells ATCC CCL-240
IgG Isotype Control (PE conjugated) BioLegend 400907
N,N-dimethylformamide (DMF) Fisher Chemical UN2265
propidium iodide Sigma P4864
RPMI media with L-glutamine Corning 10-040-CV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4, (4), 415-422 (1997).
  2. Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9, (3), 480-487 (2013).
  3. Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155, (6), 2094-2097 (1996).
  4. Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. (2018).
  5. Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, Suppl 4 476-482 (1990).
  6. Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77, (4), 1502-1513 (2009).
  7. Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23, (11), 1407-1416 (2016).
  8. Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36, (5), 606-614 (2018).
  9. Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110, (24), 2209-2218 (2013).
  10. Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12, (1), 19-27 (2005).
  11. Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75, (5), 2458-2462 (1978).
  12. Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16, (6), 806-810 (2009).
  13. Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
  14. Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19, (6), 835-841 (2012).
  15. Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77, (8), 790-797 (2010).
  16. Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).
  17. Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).
  18. Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).
  19. Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7, (2), 171-177 (1986).
  20. Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28, (2), 90-99 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics