ताइवान में चमगादड़ जनसंख्या के Lyssavirus निगरानी के लिए मानक संचालन प्रक्रिया

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Summary

इस प्रोटोकॉल ताइवान में चमगादड़ में lysavirus प्रतिजनों के नैदानिक परीक्षण के लिए एक मानक प्रयोगशाला संचालन प्रक्रिया का परिचय.

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Hsu, W. C., Hsu, C. L., Tu, Y. C., Chang, J. C., Tsai, K. R., Lee, F., Hu, S. C. Standard Operating Procedure for Lyssavirus Surveillance of the Bat Population in Taiwan. J. Vis. Exp. (150), e59421, doi:10.3791/59421 (2019).

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Abstract

जीनस लिसावायरस के भीतर वायरस जूनोटिक रोगजनक हैं, और कम से कम सात lyssavirus प्रजातियों मानव मामलों के साथ जुड़े रहे हैं। क्योंकि चमगादड़ सबसे lyssaviruses के प्राकृतिक जलाशय हैं, चमगादड़ के एक lyssavirus निगरानी कार्यक्रम 2008 के बाद से ताइवान में आयोजित किया गया है चमगादड़ में इन वायरस की पारिस्थितिकी को समझने के लिए. इस कार्यक्रम में, गैर सरकारी चमगादड़ संरक्षण संगठनों और स्थानीय पशु रोग नियंत्रण केन्द्रों मृत चमगादड़ या चमगादड़ कमजोरी या बीमारी से मर इकट्ठा करने के लिए सहयोग किया. चमगादड़ के मस्तिष्क के ऊतकों को नेक्रोप्सी के माध्यम से प्राप्त किया गया था और प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी परीक्षण (एफएटी) और lysavirus एंटीजन और न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए रिवर्स प्रतिलेखन पॉलिमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) के अधीन किया गया था। वसा के लिए, कम से कम दो अलग रेबीज निदान संयुग्मी की सिफारिश की जाती है। आरटी-पीसीआर के लिए, प्राइमर के दो सेट (JW12/N165-146, N113F/N304R) का उपयोग lyssavirus न्यूक्लिओप्रोटीन जीन के आंशिक अनुक्रम को बढ़ाना है। इस निगरानी कार्यक्रम के चमगादड़ में lysaviruses और अन्य zoonotic एजेंटों पर नज़र रखता है. ताइवान बल्लेबाजी lysavirus 2016-2017 में जापानी pipistrelle (Pipistrellus abramus) के दो मामलों में पाया जाता है। इन निष्कर्षों चमगादड़ और अन्य वन्य जीवन से संपर्क करने के संभावित जोखिम के जनता, स्वास्थ्य पेशेवरों, और वैज्ञानिकों को सूचित करना चाहिए.

Introduction

Lyssavirus जीनस के भीतर वायरस zoonotic रोगजनक हैं. मानव मामलों से जुड़ी कम से कम सात लाइसावायरस प्रजातियांहैं . इसजीनस1,2,3, ताइवान बल्लेबाजी lysavirus (TWBLV)4 और Kotalahti बल्ले lysavirus5 में 16 प्रजातियों के अलावा हाल ही में चमगादड़ में पहचान की गई है, लेकिन उनके वर्गीकरण स्थितियों अभी तक निर्धारित किया जा सकता है.

चमगादड़ सबसे lyssaviruses के प्राकृतिक मेजबान हैं, मोकोला lyssavirus और Ikoma lysavirus के अपवाद के साथ, जो अभी तक किसी भी चमगादड़1,2,3,6में पहचान नहीं की गई है . एशियाई चमगादड़ में lyssaviruses पर जानकारी अभी भी सीमित है. एशियाई चमगादड़ में दो असामान्य lyssaviruses (एक भारत में और थाईलैंड में अन्य)7,8 की सूचना दी गई है. चीन में बल्ले के काटने से जुड़ा एक मानव रेबीज मामला 2002 में सूचित किया गया था, लेकिन निदान केवल नैदानिक अवलोकन9द्वारा किया गया था . मध्य एशिया में, 1991 में किर्गिस्तान में कम माउस-कान वाले बल्ले (मायोटिस ब्लीथी) में अरवन लाइसावायरस की पहचानकी गई थी और 2001 10 मेंताजिकिस्तान में खुजानंद लिसवायरस की पहचान की गई थी . दक्षिण एशिया में, 20153में श्रीलंका में भारतीय उड़ान लोमड़ी (पीटीरोपस मेडिस) में गन्नूरूवा बैट लिसावायरस की पहचान की गई थी . दक्षिण पूर्व एशिया में, फिलीपींस, थाईलैंड, बांग्लादेश, कंबोडिया, और वियतनाम में चमगादड़ पर कई serological अध्ययन चर serprevalence11,12,13,14दिखाया, 15. हालांकि Irkut lysavirus अधिक से अधिक ट्यूब नाक बल्ले में पहचान की गई थी (Murina ल्यूकोगैस्टर) जिलिन प्रांत, चीन में 201216में , सटीक प्रजातियों और पूर्वी एशियाई चमगादड़ आबादी में lysaviruses के स्थानों अज्ञात रहते हैं.

ताइवान बल्ले आबादी में lyssavirus की उपस्थिति का आकलन करने के लिए, एक निगरानी कार्यक्रम दोनों प्रत्यक्ष FAT और RT-PCR रोजगार शुरू किया गया था. ताइवान बल्लेबाजी lysavirus जापानी pipistrelle के दो मामलों में पहचान की गई थी (Pipistrellus abramus)4 में 2016-2017. वर्तमान लेख में, ताइवान में चमगादड़ की आबादी के lysavirus निगरानी के लिए एक प्रयोगशाला मानक संचालन प्रक्रिया शुरू की है. हमारी प्रयोगशाला में चमगादड़ lysavirus निदान का प्रवाह चार्ट चित्र 1में प्रस्तुत किया गया है.

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Protocol

1. lysaviruses से निपटने के दौरान सुरक्षा सावधानियों

  1. यह सुनिश्चित करें कि चमगादड़ के नमूनों को संभालने वाले सभी प्रयोगशाला कामगारों को प्री-एक्सपोजर रेबीज प्रोफिलैक्सिस17प्राप्त हो। श्रमिकों के रेबीज एंटीबॉडी स्तर की पहले से निगरानी करें और हर 6 महीने17में उनकी पुन: जांच करें. फॉलो-अप रेबीज टीकाकरण उन लोगों के लिए आवश्यक है जिनके एंटीबॉडी स्तर 0.5 IU/mL17से कम हैं।
  2. देश के जैव सुरक्षा विनियमों के आधार पर जहां प्रयोगशाला स्थित है, यह सुनिश्चित करें कि निम्नलिखित प्रक्रियाएं उपयुक्त जैव सुरक्षा स्तर प्रयोगशालाओं (उदा., ताइवान में बीएसएल-2 प्रयोगशालाओं और ऑस्ट्रेलिया में बीएसएल-3 प्रयोगशालाओं) में की जाती हैं, और यह कि श्रमिक वर्तमान में योग्य हैं और उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनते हैं.
    नोट: रेबीज टीकाकरण फाइलोग्रुप द्वितीय और III18से संबंधित lyssaviruses से कोई सुरक्षा प्रदान करता है. श्रमिकों को सूचित किया जाना चाहिए कि चमगादड़19 में कई चिड़ियाघररोगजनक रोगजनकों की पहचान की गई है और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ उपयुक्त जैव सुरक्षा स्तर प्रयोगशाला स्थितियों के तहत नमूनों को संभालना चाहिए।

2. नमूना संग्रह

  1. उपयोग कमजोर या बीमार चमगादड़ या शव पाया.
    नोट: कमजोर या बीमार चमगादड़ पशु चिकित्सा देखभाल या अनुसंधान के लिए ताइपे के चमगादड़ संरक्षण सोसायटी को दिया जाता है, जबकि शव सीधे पशु स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान को प्रस्तुत कर रहे हैं. कोई स्वस्थ चमगादड़ इस निगरानी कार्यक्रम में ethanized किया गया है.
  2. एक चमगादड़ पारिस्थितिकी विज्ञानी आकृतिविज्ञान विशेषताओं20के माध्यम से चमगादड़ प्रजातियों की पहचान है .
  3. जब lyssavirus सकारात्मक का निदान किया जाता है, पहले प्रकाशित प्रक्रियाओं21का उपयोग कर चमगादड़ प्रजातियों के डीएनए barcoding प्रदर्शन करते हैं।
  4. प्रत्येक चमगादड़ शव (संग्रह स्थल, प्रजातियों, नैदानिक लक्षण, आदि) की एक सूचना पत्र जमा करें।

3. चमगादड़ नमूनों की शवों की जांच

  1. सामग्री तैयार करें।
    1. एक साफ विच्छेदन बोर्ड तैयार करें और नेक्रोप्सी के लिए एक बाँझ शोषक पैड रखें।
    2. बल्ले अंगों को इकट्ठा करने के लिए संग्रह ट्यूब तैयार करें।
    3. नेक्रोप्सी के लिए डिस्पोजेबल च्जीज और स्कैल्पल्स तैयार करें। प्रत्येक बल्ले की नेक्रोप्सी के बीच उपकरण बदलें। कपास गेंदों नमूना के दौरान tweezers और scalpels सफाई के लिए 70% इथेनॉल के साथ गीला तैयार करें।
    4. वसा के लिए दो माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करें। नए नमूने एकत्र करें और उन्हें हिस्टोपैथोलॉजिकल परीक्षा के लिए औपचारिक समाधान में ठीक करें।
  2. शवपरीक्षण से पहले सभी बाहरी छिद्रों की जांच करें। प्रजातियों के भेदभाव के लिए बल्ले की बाहरी विशेषताओं, विशेष रूप से सिर, कान, और पंखों की तस्वीर।
  3. एक मौखिक झाड़ू नमूना ले लीजिए. बोर्ड पर अधर recumbency में बल्ले प्लेस और छनयक के साथ बल्ले के सिर को ठीक. एक स्केलपेल के साथ कालवरिया के मिडलाइन के साथ त्वचा को काटें और त्वचा को पार्श्व पक्षों में खींचें। खोपड़ी के साथ कालवरिया की मिडलाइन के साथ खोपड़ी को काटें और मस्तिष्क के ऊतकों को बेनकाब करने के लिए इसे चने के साथ खोलें।
  4. खोपड़ी से मस्तिष्क के ऊतकों को निकालें और इसे बाँझ जीभ अवसादक पर रखें, और मस्तिष्क के ऊतकों से इंप्रेशन स्मीयर बनाएं (चरण 4.2 देखें)। ताजा मस्तिष्क ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा ले लीजिए और हिस्टोपैथोलॉजिकल परीक्षा के लिए औपचारिक रूप में इसे ठीक करें। न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए एक ट्यूब में शेष मस्तिष्क ऊतक होते हैं।
  5. नमूना संग्रह के बीच बनाए रखा ऊतकों को दूर करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ गीला कपास गेंदों के साथ स्वच्छ चट्तेज और स्केलपेल।
  6. पृष्ठीय भार में बोर्ड पर बल्ले रखें और यह एक्सिला और पूंछ एड़ी के दोनों ओर सुइयों के साथ बोर्ड पर तय.
  7. शरीर की मध्य रेखा के साथ त्वचा को मैन्डिबल से गुदा तक उत्तेजित करें। लिफ्ट और चने के साथ त्वचा और अंतर्निहित मांसपेशियों के ऊतकों को अलग. लार ग्रंथियों, जो mandibular हड्डी के पास हैं ले लीजिए.
  8. चमने के साथ स्टर्नम थोड़ा लिफ्ट, और एक स्केलपेल के साथ मिडलाइन के साथ स्टर्नम और पेट की दीवार में कटौती. स्कैल्पल के साथ क्लैविकल्स को काटें। वक्ष गुहा खोलने के लिए सुइयों के साथ बोर्ड के लिए छोड़ दिया और सही रिब पिंजरों को ठीक करें।
  9. सकल घावों और पोस्टमार्टम परिवर्तन की डिग्री रिकॉर्ड.
  10. मलक्ष ऊतकों को निकालें (यानी, दिल, फेफड़े, जिगर, गुर्दे, आंतों) मलन और एक स्केलपेल का उपयोग कर के शव से. भविष्य के अनुसंधान के लिए आवश्यक के रूप में आंत नमूनों लीजिए.
    नोट: डुप्लिकेट नमूनों का संग्रह की सिफारिश की है. एक आणविक निदान के लिए एकत्र किया जाना चाहिए, और अन्य वायरल संस्कृति22के लिए वायरल परिवहन माध्यम के साथ या बिना -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जाना चाहिए।

4. प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी परीक्षण (एफएटी)

  1. वसा के लिए मस्तिष्क के ऊतकों की छाप स्मीयर बनाओ. FAT को पहलेबताए 18,23 के रूप में निम्न संशोधनों के साथ निष्पादित करें.
  2. धीरे से चने के साथ जुड़े तंत्रिका ऊतक से मस्तिष्क के ऊतकों को अलग और एक बाँझ जीभ अवसादके लिए मस्तिष्क के ऊतकों को स्थानांतरित. मस्तिष्क स्टेम और सेरिबैलम18,23सहित मस्तिष्क के क्रॉस-सेक्शन को काटें। मस्तिष्क के ऊतकों की कट सतह को हल्के से छूकर मस्तिष्क के ऊतकों की छाप स्मीयर बनाएं, और अतिरिक्त ऊतक को हटाने के लिए लेंस के ऊतकों पर स्लाइड दबाएं।
  3. 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर एसीटोन के साथ स्लाइडकोन को ठीक करें। परीक्षण की गई स्लाइड्स और सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रणको संयुग्मी के साथ धुंधला करने से पहले ड्रा करें।
  4. दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध FITC-संयुग्मी एंटी रेबीज एंटीबॉडी के प्रत्येक का उपयोग कर के लिए धुंधला lysavirus प्रतिजन अत्यधिक की सिफारिश की है23. पहले धुंधला करने से पहले वाणिज्यिक संयुग्मी के काम एकाग्रता का निर्धारण. स्लाइड पर 0.45 डिग्री सेल्सियस सिरिंज फिल्टर के माध्यम से पतला संयुग्मी गिराएं और स्लाइड को एक गीले कक्ष के भीतर 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. स्लाइड से अतिरिक्त संयुग्मी को छान लें और ऊष्मायन के बाद फॉस्फेट-बफर्ड नमकीन (पीबीएस) के साथ स्लाइड को धो लें।
  6. स्लाइड पर 10% ग्लिसरोल की एक छोटी राशि ड्रॉप और कवर स्लाइड के साथ कवर करें।
  7. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ स्लाइड की जांच करें।

5. न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण

  1. मस्तिष्क-10 की उचित मात्रा जोड़ें (न्यूनतम आवश्यक मध्यम मस्तिष्क के ऊतकों के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक) (10% w/
  2. एक homogenizer साधन में एक 5 मिमी इस्पात मनका और 10 मिनट के लिए 825 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र के साथ मस्तिष्क के ऊतकों Homogenate.
  3. न्यूक्लिक एसिड निकालें, जो की अंतिम मात्रा है 50 डिग्री सेल्सियस, के भीतर 200 $L supernatant के साधन के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कुल न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण किट का उपयोग कर.

6. आरटी-पीसीआर और जातिवृत् तीय विश्लेषण

नोट: कई प्राइमर सेट सभी ज्ञात lyssaviruses या विशिष्ट lyssaviruses का पता लगाने के लिए प्रकाशित किया गया है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक उदाहरण है कि हमारी प्रयोगशाला का उपयोग करता है और सभी प्रयोगात्मक जरूरतों फिट नहीं हो सकता है. प्रयोगशाला की जरूरतों के अनुसार उपयुक्त प्राइमर का चयन करें।

  1. एक कदम आरटी-पीसीआर अभिकर्मक को इस प्रकार तैयार करें: 10x प्रतिक्रिया बफर के 2.5 डिग्री सेल्सियस, आगे और रिवर्स प्राइमर के 0.5 डिग्री एल (प्रत्येक के 10 लाख), 1.25 एमएम डीएनटीपी के 4 डिग्री एल, आरनेस अवरोधक के 0.3 डिग्री एल (40 यू/एल) के प्रतिक्रिया मिश्रण में 5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। , 0.3 रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (10 उ/जेडएल), 0.4 डिग्री सेल्सियस डीएनए पॉलिमरेज (5 उ/
    नोट: प्राइमर सेट इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया JW12 (5'-ATGTAACCYCAATG-3') और N165-146 (5'-GCAGGGTAYTTATCATATATA-3')24है . अभिकर्मकों और साइकिल चालन की स्थिति की तैयारी को संशोधित प्राइमर सेट के अनुसार संशोधित करें।
  2. निम्नलिखित शर्तों के तहत साइकिल चालन प्रदर्शन: 40 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन; 10 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण; 30 s के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 30 s के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, और 30 s के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; और अंत में, 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर आगे विस्तार।
  3. नैदानिक संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए किसी अन्य या अधिक प्राइमर सेट का उपयोग करें।
    1. N113F (5'-GTAGGATGTG-3') और N304R (5'-TTGACGAGATCTTCTCAT-3')25,26 का उपयोग करें एक कदम आरटी-पीसीआर अभिकर्मक तैयार करने के लिए इस प्रकार है: निकाले गए न्यूक्लिक एसिड के 5 $L जोड़ें जिसमें 10x का 5 $L, बफर के 5 $L शामिल हैं, 5 ]L आगे और रिवर्स प्राइमर (4 $M प्रत्येक के), 1.25 एम एम डीएनटीपी के 5 डिग्री एल, आरएनसे अवरोधक के 0.5 डिग्री एल (40 यू/जेडएल), रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज के 0.2 डिग्री एल (10 यू/जेडएल), डीएनए पॉलिमरेज के 1 $L (5 यू/जेडएल), और डीपीसी के इलाज के पानी के 23.3 डिग्री एल।
    2. निम्नलिखित शर्तों के तहत साइकिल चालन प्रदर्शन: 40 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन; 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण; 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 1 मिनट और 20 के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, और 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; और अंत में, 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर आगे विस्तार।
      नोट: प्रयोगशाला की जरूरत के आधार पर, निदान के लिए उपयुक्त प्राइमर चुनें। N113F मूल रूप से रेबीज वायरस प्रवर्धन के लिए डिजाइन किया गया था, लेकिन यह अन्य lyssaviruses के लिए अच्छी तरह से काम नहीं कर सकते. N113F और N304R का सेट रेबीज वायरस (ताइवान फेरेट बिज्जू संस्करण) और ताइवान बल्ले lyssavirus के लिए अच्छी तरह से काम करता है। यह JW12 और N304R प्राइमर के सेट का उपयोग करके पूरे न्यूक्लिओप्रोटीन दृश्यों को प्राप्त करने के लिए आसान हो जाएगा अगर lyssavirus ऊपर दो प्राइमर सेट के दोनों द्वारा परिलक्षित होता है.
  4. 2% agarose जेल electrophoresis पर पीसीआर उत्पाद का विश्लेषण करें और यूवी प्रकाश रोशनी द्वारा कल्पना।
  5. वाणिज्यिक अनुक्रमण सेवा द्वारा पीसीआर उत्पाद अनुक्रम।
  6. Enter या Nucleotide मूल स्थानीय संरेखण खोज उपकरण (BLAST) के वेब पेज पर अनुक्रम अपलोड करें. "अन्य (एन आर आदि)" डेटाबेस का चयन करें और Lyssavirusके रूप में जीव दर्ज करें। MegaBlast एल्गोरिथ्म का चयन करें और ब्लास्ट चलाएँ.

7. वायरस अलगाव

नोट: जब या तो 1) FAT या 2) RT-PCR सकारात्मकता इंगित करता है, तो वायरस आइसोलेशन निष्पादित करें।

  1. एमईएम-10 में 10% (w/v) निलंबन में मस्तिष्क के नमूने को Homogenize. 10 मिनट के लिए 825 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  2. 3 x 106 MNA (माउस neuroblastoma) कोशिकाओं के निलंबन के साथ supernatant के 200 $L inoculate 1 एमईएम-10 के 1 एमएल में 1 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के साथ 1% सीओ2के साथ । मस्तिष्क homogenate-सेल निलंबन एक 25 सेमी2 फ्लास्क के लिए स्थानांतरण और एमईएम-10 के 6 एमएल जोड़ें।
  3. एक ही समय में 6 मिमी व्यास के साथ एक 4 अच्छी तरह से Teflon लेपित ग्लास स्लाइड में मस्तिष्क homogenate-सेल निलंबन के 1 एमएल खेती।
  4. 1% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के 3-4 दिनों के बाद, 100% एसीटोन (v/v) के साथ 4 अच्छी स्लाइड पर कोशिकाओं को ठीक करें।
  5. आगे की स्लाइड्स में 4.4-4.7 के बाद दो FITC-कंजुटेड एंटी रेबीज एंटीबॉडी के साथ स्लाइड पर रखें। कोशिकाओं को संक्रमित कर रहे हैं जब intracytoplasmic inclusions की जांच कर रहे हैं. संक्रमित कोशिकाओं का प्रतिशत रिकॉर्ड करें.
  6. जब स्लाइड नकारात्मक के रूप में दाग रहे हैं inoculated सेल संस्कृति के trypsinization और subculture प्रदर्शन:
    1. मध्यम निकालें और पीबीएस के 5 एमएल के साथ फ्लास्क कुल्ला.
    2. फ्लास्क में ट्रिप्सिन का 1 एमएल जोड़ें और फ्लास्क के नीचे मजबूती से प्रहार करें।
    3. एमईएम-10 के 6 एमएल जोड़ें और कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    4. एक नया ऊतक फ्लास्क (6 एमएल) में सेल निलंबन रखो और एक 4 अच्छी तरह से स्लाइड (1 एमएल) पर.
  7. 7-4-7.6 जब तक 100% संक्रमितता तक पहुँच जाता है चरणों को दोहराएँ.
  8. 24 एच इनक्यूबेशन के बाद सुपरनेंट लीजिए।

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Representative Results

2014 से मई 2017 तक, निगरानी के लिए 13 प्रजातियों से 332 चमगादड़ शव एकत्र किए गए थे। दो परीक्षण सकारात्मक. पहले बल्ले के मामले में, मस्तिष्क छाप नकारात्मक वाणिज्यिक FITC-कंजुटेड एंटी रेबीज एंटीबॉडी में से एक के साथ वसा का उपयोग कर परीक्षण किया (चित्र2) , जबकि आरटी-पीसीआर दो प्राइमर सेट में से प्रत्येक को रोजगार (JW12/N165-146, N113F/N304R) उपज धनात्मक परिणाम (चित्र 3)। एम्प्लिकॉन का 428 बीपी अनुक्रम (N113F/N304R के साथ और जिसमें आंशिक न्यूक्लिओप्रोटीन जीन होता है) प्राप्त किया गया था। इसके अनुक्रम GenBank डेटाबेस द्वारा BLAST क्वेरी के अधीन किया गया था. परिणाम से पता चला कि अनुक्रम 79% से कम की पहचान के साथ lyssaviruses के समान था (चित्र4), पता चला lyssaviruses की पहचान का समर्थन.

बाद में, दो lysaviruses सफलतापूर्वक इन दो दिमाग से अलग कर दिया गया, और वायरस FAT द्वारा पुष्टि की गई (चित्र 5) और अनुक्रमण. पहचान की lyssavirus ताइवान बल्ले lyssavirus के रूप में नामित किया गया था (TWBLV) अनुक्रम विश्लेषण के आधार पर4. दूसरे मामले में, दो वाणिज्यिक FITC-कंजुगेटेड एंटी रेबीज एंटीबॉडी में से प्रत्येक को रोजगार एफएटी से प्राप्त परिणाम असंगत थे, जैसा कि पहले मामले के लिए वर्णित है।

Figure 1
चित्रा 1: चमगादड़ lysavirus निदान प्रवाह चार्ट.
फ्लोचार्ट वर्तमान प्रक्रिया और नैदानिक विधियों को दिखा रहा है जो हमारी प्रयोगशाला ने अब उपयोग किया है। वायरस अलगाव किया जाना चाहिए जब या तो प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी परीक्षण या रिवर्स प्रतिलेखन polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया सकारात्मक है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एक TWBLV संक्रमित बल्ले से पूरे मस्तिष्क संपीड़न के दो वाणिज्यिक FITC-कंजुटेड विरोधी रेबीज एंटीबॉडी के साथ प्रत्यक्ष वसा असंगत परिणाम उपज.
केस नंबर: 2016-2300: (ए) अभिकर्मक ए (5x कमजोर पड़ने के साथ वसा), सेब हरे सकारात्मक संकेतों का प्रदर्शन. (बी) अभिकर्मक बी के साथ वसा, एक नकारात्मक परिणाम दिखा (20x तहलका). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: आरटी-पीसीआर के उत्पाद जिसमें दो प्राइमर सेट काम करते हैं।
1 से 3 गलियों में इस्तेमाल प्राइमर सेट JW12/N165-146 था, और अपेक्षित उत्पाद आकार 111 आधार जोड़े थे। 4 से 6 गलियों में इस्तेमाल प्राइमर सेट N113F /N304R था, और अपेक्षित उत्पाद का आकार 521 आधार जोड़े थे। नमूने के दोनों परीक्षण (लेन 1 और 4) सकारात्मक थे. एम $ 100 बीपी डीएनए सीढ़ी; गलियों 1 और 4 ] परीक्षण नमूना; गलियों 2 और 5 - सकारात्मक नियंत्रण; गलियों 3 और 6 - नकारात्मक नियंत्रण. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: TWBLV संक्रमित चमगादड़ के N113F/N304R उत्पाद का विस्फोट परिणाम।
BLAST परिणाम से पता चला कि मामला सबसे lyssavirus के समान था, लेकिन डेटाबेस में lyssavirus के साथ पहचान केवल 79% था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: दो FITC-संयुग्मी एंटी रेबीज संयुग्मी के साथ TWBLV के वायरस अलगाव के lysavirus प्रतिजन वितरण की तुलना.
10% चमगादड़ मस्तिष्क पायस (TWBLV संक्रमित) वायरस अलगाव के लिए माउस neuroblastoma कोशिकाओं में inoculated था. एफटीएस दसवें मार्ग पर प्रदर्शन किया गया और दो FITC-कंजुटेड एंटी रेबीज एंटीबॉडी के साथ दाग. दो रेबीज संयुग्मी के साथ माउस neuroblastoma कोशिकाओं के एंटीजन वितरण महत्वपूर्ण मतभेद दिखाया. (क) अभिकर्मक ए (5x तनुता) के साथ वसा। (बी) अभिकर्मक बी (5x तनुकरण) के साथ वसा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रयोगशाला मानक संचालन प्रक्रिया (SOP) ताइवान में lysavirus प्रतिजनों की उपस्थिति के लिए बल्ले के नमूने के परीक्षण के लिए एक सीरियल प्रक्रिया प्रदान करता है. महत्वपूर्ण कदमों में एफएटी और आरटी-पीसीआर का रोजगार शामिल है। उपयुक्त नमूनों और वायरस के सफल अलगाव का चयन भी महत्वपूर्ण हैं। इसके अतिरिक्त, कुछ समस्या निवारण बल्ले lysaviruses की निगरानी के दौरान आयोजित किया गया था. मुख्य अंतर लक्ष्य जानवरों था. शुरू में (2008-2009), बल्ले lyssavirus निगरानी के लक्ष्य जानवरों लाइव चमगादड़, जो ताइवान में Kinmen द्वीप में फंस गए थे तो इच्छामृत्यु के बाद lysavirus के लिए परीक्षण किया गया. फंस चमगादड़ के अधिकांश स्वस्थ और lyssavirus ले जाने की संभावना नहीं थे, और निगरानी के लिए इस दृष्टिकोण मानवीय नहीं था. इसलिए, तीसरे वर्ष में, केवल मृत या मर चमगादड़ एकत्र किए गए थे और क्षेत्रीय से राष्ट्रीय के लिए निगरानी क्षेत्र का विस्तार. लगातार निगरानी के आठ साल के बाद, पहले बल्ले lyssavirus मामले अंततः ताइवान में पाया गया था.

हालांकि एफएटी रेबीज के निदान के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली विधि है और ओआईई और डब्ल्यूएचओद्वारा 18की सिफारिश की गई है , लेकिन कुछ अध्ययनों ने असंगत परिणामों का प्रदर्शन किया है जब एफएटी5,27में विभिन्न संयुग्मी का उपयोग किया गया था . इसी तरह के असंगत परिणाम भी TWBLV-संक्रमित मामलों में दिखाई दिया. TWBLV-संक्रमित MNA कोशिकाओं में, FAT के परिणाम2 संयुग्मी में महत्वपूर्ण अंतर दिखाया (चित्र5)। FITC-कंजुटेड एंटी-रेबीज एंटीबॉडी में से एक ने अच्छी तरह से प्रतिक्रिया नहीं की, यहां तक कि उच्च सांद्रता पर भी। नमूनों में lysavirus प्रतिजन की भिन्नता और conzugates में एंटीबॉडी avidity और एंटीबॉडी की समानता की भिन्नता के कारण, यह अनुशंसा की जाती है कि दो अलग-अलग संयुग्मी वसा में इस्तेमाल किया जा करने के लिए lysavirus में झूठी नकारात्मक परिणाम को रोकने के निदान23,28,29.

RT-PCR FAT के असंगत परिणामों के लिए पुष्टिकारक निदान प्रदान कर सकता है. lysavirus की उच्च आनुवंशिक विविधता के कारण, यह अनुशंसा की जाती है कि आरटी-पीसीआर में एक से अधिक प्राइमर सेट का उपयोग lysavirus स्क्रीनिंग29,30की सटीकता को बढ़ाने के लिए किया जाए। अत्यधिक संरक्षित न्यूक्लिओप्रोटीन जीनों से बनाया गया एक प्राइमर सेट लसावायरस का पता लगाने29में सबसे अधिक प्रयोग किया जाने वाला सेट है . आरटी-पीसीआर का उपयोग putrefactive नमूनों में निदान के लिए भी किया जा सकता है जब FAT31,32नहीं किया जा सकता है। झूठी नकारात्मकता एक उपन्यास lyssavirus की खोज को रोकने से बचने के लिए, और अधिक उपकरण का पता लगाने के लिए सिफारिश कर रहे हैं. दो उपन्यास lysaviruses4, ताइवान बल्लेबाजी lysavirus, इस सर्वेक्षण के दौरान एसओपी रोजगार की पहचान की गई.

इसके अतिरिक्त, एक अत्यधिक विविध TWBLV तनाव और lyssavirus के एक उपन्यास नई प्रजाति में ताइवान में चमगादड़ में पाए गए 2018 (अप्रकाशित डेटा). निष्कर्षों ने साबित कर दिया कि चमगादड़ों में lyssaviruses का पता लगाने के लिए एफएटी और आरटी-पीसीआर दोनों का रोजगार उपयोगी है। इस SOP में उपयोग किए गए RT-PCR प्राइमर सेट की कुछ सीमाएँ नोट की जानी चाहिए. N113F/N304R के प्राइमर सेट में, N113F मूल रूप से रेबीज वायरस प्रवर्धन के लिए डिजाइन किया गया था, लेकिन यह अन्य lyssaviruses के लिए अच्छी तरह से काम नहीं कर सकते. lysavirus का पता लगाने के लिए कई प्राइमर अन्य शोधकर्ताओं द्वारा प्रकाशित किया गया है29,30 और प्रयोगशाला की जरूरत के अनुसार चुना जा सकता है.

यह लेख ताइवान में lysavirus निगरानी बल्लेबाजी करने के लिए एक कदम दर कदम परिचय है. यह आशा की जाती है कि यह एसओपी उन शोधकर्ताओं के लिए सहायक होगा जो बल्लेबाजी lyssavirus निगरानी में रुचि रखते हैं। के रूप में और अधिक शोधकर्ताओं चमगादड़ के सर्वेक्षण के बाहर ले, और अधिक lyssaviruses भविष्य में पहचान की जाएगी. यह एसओपी न केवल lyssaviruses पर नज़र रखता है, लेकिन यह भी चमगादड़ में अन्य zoonoses एजेंटों. इस तरह के निष्कर्ष चमगादड़ और अन्य वन्य जीवन के साथ संपर्क के संभावित खतरों के जनता, स्वास्थ्य पेशेवरों, और वैज्ञानिकों को सूचित कर सकते हैं। यह भी lyssavirus के विकास और मूल की समझ को बढ़ाने में मदद मिलेगी और वैज्ञानिक अनुसंधान में पर्याप्त प्रगति के लिए नेतृत्व.

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Disclosures

हितों के कोई टकराव घोषित नहीं किए जाते हैं।

Acknowledgments

हम इस अध्ययन के दौरान उनकी सहायता के लिए तिएन-चेंग ली, यी-टांग लिन, चिया-जंग त्साई और या-लेन ली को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन अनुदान संख्या 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) पशु और संयंत्र स्वास्थ्य निरीक्षण और संगरोध, कृषि परिषद, कार्यकारी युआन, ताइवान से समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5% Trypsin (10x) Gibco 15090046 Trypsin
25 cm2 flask Greiner bio-one 690160
Acetone Honeywell 32201-1L
Agarose I VWR Life Science 97062-250
Alcohol NIHON SHIYAKU REAGENT NS-32294
AMV Reverse Transcriptase Promega M5101
Antibiotic-Antimycotic(100X)  Gibco 15240-062 MEM-10
Blade Braun BA215
Centrifuge eppendorf 5424R
Chemilumineance system TOP BIO CO. MGIS-21-C2-1M
Collection tube Qiagen 990381
Collection tube SSI 2341-SO
Cover slide Muto Pure chemical Co., LTD. 24505
DNA analyzer Applied Biosystems 3700XL
Fetal bovine serum Gibco 10437028 MEM-10
FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin Fujirebio Diagnostic Inc. 800-092 FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B
Four-well Teflon-coating glass slide Thermo Fisher Scientific 30-86H-WHITE
Gel Electrophoresis System Major Science MJ-105-R
HBSS (1x) Gibco 14175095 Trypsin
Incubator ASTEC SCA-165DS
Inverted Microscope Olympus IX71
L-Glutamine 200 mM (100x) Gibco A2916801 MEM-10
LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent EMD Millipore Corporation 5100 FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A
MagNA Pure Compact Instrument Roche 03731146001
MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 Roche 03730964001
MEM (10x) Gibco 11430030 MEM-10
MEM NEAA (100x) Gibco 11140050 MEM-10
MEM vitamin solution Gibco 11120052 MEM-10
NaHCO3 Merck 1.06329.0500 MEM-10
Needle Terumo NN*2332R9
PBS Medicago 09-8912-100
Primer synthesis Mission Biotech
RNasin ribonuclease inhibitor Promega N2111
Sequencing service Mission Biotech
Slide Thermo Scientific AA00008032E00MNT10
Sodium Pyruvate (100 mM) Gibco 11360070 MEM-10
Stainless Steel Beads QIAGEN 69989
Sterile absorbent pad 3M 1604T-2
Syringe filter Nalgene 171-0045
Taq polymerase JMR Holdings JMR-801
Thermal cycler Applied Biosystems 2720
TissueLyser II QIAGEN 85300
Tongue depressor HONJER CO., LTD. 122246
Tweezer Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. A0601
Tylosin Tartrate Sigma T6271-10G MEM-10

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References

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