Стандартная операционная процедура для lyssavirus наблюдение за популяцией летучих мышей на Тайване

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Этот протокол вводит стандартную лабораторную процедуру для диагностического тестирования лиссавирусных антигенов у летучих мышей на Тайване.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hsu, W. C., Hsu, C. L., Tu, Y. C., Chang, J. C., Tsai, K. R., Lee, F., Hu, S. C. Standard Operating Procedure for Lyssavirus Surveillance of the Bat Population in Taiwan. J. Vis. Exp. (150), e59421, doi:10.3791/59421 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Вирусы в пределах рода Lyssavirus являются зоонозными патогенами, и по крайней мере семь видов лиссавирусов связаны с случаями заболевания человека. Поскольку летучие мыши являются естественными резервуарами большинства лиссавирусов, программа наблюдения за лиссавирусами летучих мышей проводится на Тайване с 2008 года, чтобы понять экологию этих вирусов у летучих мышей. В рамках этой программы неправительственные организации по сохранению летучих мышей и местные центры по борьбе с болезнями животных сотрудничали в сборе мертвых летучих мышей или летучих мышей, умирающих от слабости или болезни. Мозг ткани летучих мышей были получены через некропсию и подвергаются прямому флуоресцентному тесту на антитела (FAT) и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (RT-PCR) для обнаружения лиссавирусных антигенов и нуклеиновых кислот. Для FAT, по крайней мере два различных диагноза бешенства conjugates рекомендуется. Для RT-PCR для усиления частичной последовательности гена нуклеопротеина (JW12/N165-146, N113F/N304R) используются два набора грунтовок. Эта программа наблюдения отслеживает лиссавирусы и другие зоонозные агенты у летучих мышей. Тайваньский лиссавирус летучей мыши обнаружен в двух случаях японского пипитштила(Pipistrellus abramus)в 2016-2017 годах. Эти выводы должны информировать общественность, специалистов в области здравоохранения и ученых о потенциальных рисках контакта с летучими мышами и другими дикими животными.

Introduction

Вирусы в пределах рода Lyssavirus являются зоонозными патогенами. Есть по крайней мере семь видов лиссавирусов, связанных с человеческими случаями1. В дополнение к 16 видов в этом роду1,2,3, Тайвань летучая мышь lyssavirus (TWBLV)4 и Kotalahti летучая мышь lyssavirus5 были недавно определены в летучих мышей, но их таксономические статусы до сих пор быть определены.

Летучие мыши являются естественными хозяевами большинства лиссавирусов, за исключением лиссавируса Mokola и лиссавируса Икома,которые до сих пор не выявлены ни у одной летучей мыши 1,2,3,6. Информация о лиссавирусах у азиатских летучих мышей по-прежнему ограничена. Два нехарактерных лиссавирусов у азиатских летучих мышей (один в Индии, а другой в Таиланде)7,8 были зарегистрированы. Один случай бешенства человека, связанный с укусом летучей мыши в Китае, был зарегистрирован в 2002 году, но диагноз был поставлен только путем клинического наблюдения9. В Центральной Азии, Араван лиссавирус был выявлен в меньшей мыши ушастый летучая мышь (Myotis blythi) в Кыргызстане в 1991 году, и Худжанд лиссавирус был выявлен в усатые летучая мышь (Myotis mystacinus) в Таджикистане в 2001году 10. В южной Азии, Gannoruwa летучая мышь лиссавирус был выявлен в индийской летучей лисы(Pteropus medius) в Шри-Ланке в 20153. В юго-восточной Азии, несколько серологических исследований на летучих мышей на Филиппинах, Таиланде, Бангладеш, Камбодже и Вьетнаме показали переменную серораспространенность11,12,13,14, 15. Хотя иркутский лизсавирус был выявлен в большей трубчатой летучей мыши(Murina leucogaster) в провинции Цзилинь, Китай в 2012 году16, точные виды и места лизавирусов в восточноазиатских популяциях летучих мышей остаются неизвестными.

Для оценки присутствия лиссавируса в популяциях тайваньских летучих мышей была начата программа эпиднадзора, в рамках которой использовались как прямые FAT, так и RT-PCR. Тайваньский лиссавирус летучей мыши был выявлен в двух случаях японского pipistrelle(Pipistrellus abramus)4 в 2016-2017 годах. В настоящей статье вводится лабораторная стандартная процедура эксплуатации для лиссавирусного наблюдения за популяцией летучих мышей на Тайване. Диаграмма потока лиссавирусной диагностики летучих мышей в нашей лаборатории представлена на рисунке 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Меры предосторожности при обращении с лиссавирусами

  1. Убедитесь, что все работники лаборатории обработки летучих мышей получают предэкспозиционную профилактику бешенства17. Мониторинг уровня антител бешенства работников заранее и повторно изучить их каждые 6 месяцев17. Последующая вакцинация против бешенства необходима тем, укого антитела которых ниже 0,5 МЕ/мл17.
  2. В зависимости от правил биобезопасности в стране, где расположена лаборатория, убедитесь, что следующие процедуры выполняются в подходящих лабораториях уровня биобезопасности (например, лаборатории BSL-2 на Тайване и лаборатории BSL-3 в Австралии), и что работники в настоящее время квалифицированы и носить надлежащее индивидуальное защитное оборудование18.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вакцинация против бешенства практически не обеспечивает никакой защиты от лиссавирусов, принадлежащих к филогруппам II и III18. Рабочие должны быть проинформированы о том, что у летучих мышей19 было выявлено несколько зоонозных патогенов, и они должны обрабатывать образцы в подходящих лабораторных условиях уровня биобезопасности с надлежащим оборудованием для индивидуальной защиты.

2. Коллекция образцов

  1. Использование найдено слабых или больных летучих мышей или туш.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слабые или больные летучие мыши доставляются в Общество сохранения летучих мышей Тайбэя для ветеринарной помощи или исследований, в то время как туши подаются непосредственно в Научно-исследовательский институт здоровья животных. В этой программе наблюдения не было усыплено ни одно здоровое летучее мыши.
  2. Поиметь летучую мышь эколог определить летучих мышей видов через морфологические характеристики20.
  3. Выполните ДНК-баркодирование видов летучих мышей при диагностировании лиссавируса, используя ранее опубликованные процедуры21.
  4. Отправить информационный лист каждой туши летучей мыши (место сбора, виды, клинические признаки и т.д.).

3. Некропсия летучих мышей

  1. Подготовка материалов.
    1. Подготовьте чистую доску для вскрытия и поместите стерильную абсорбциентную площадку для некропсии.
    2. Подготовьте трубки для сбора органов летучих мышей.
    3. Подготовка одноразовых пинцета и скальпелей для некропсии. Изменение инструментов между некропсией каждой летучей мыши. Приготовьте ватные шарики, смоченные 70% этанолом для очистки пинцета и скальпелей во время отбора проб.
    4. Подготовьте два слайда микроскопа для FAT. Соберите свежие образцы и зафиксите их в формально-растворе для гистопатологического обследования.
  2. Изучите все внешние нористы перед некропсией. Фотографируй внешние особенности летучей мыши, особенно головы, уши и крылья, для дифференциации видов.
  3. Соберите устный образец тампона. Поместите летучую мышь в вентральный recumbency на доске и исправить голову летучей мыши с пинцетом. Вырежьте кожу вдоль средней линии кальварии скальпелем и потяните кожу до боковых сторон. Разрежьте череп вдоль средней линии кальварии скальпелем и откройте его пинцетом, чтобы разоблачить ткани мозга.
  4. Удалить ткани мозга из черепа и поместить его на стерильный язык депрессор, и сделать впечатление мазки из ткани мозга (см. шаг 4.2). Соберите небольшой кусочек свежей ткани мозга и зафиксировать его в формалине для гистопатологического обследования. Содержите оставшуюся ткань мозга в трубке для извлечения нуклеиновой кислоты.
  5. Чистый пинцет и скальпель с ватными шариками, увлажненные 70% этанолом, чтобы удалить сохранившихся тканей между сбором образцов.
  6. Поместите летучую мышь на доске в подошве лежачих и исправить его на доске с иглами по обе стороны от аксиллы и хвостпят.
  7. Разрезать кожу вдоль средней линии тела от челюсти до ануса. Поднимите и отделите кожу и лежащие в основе мышечные ткани с помощью пинцета. Соберите слюнные железы, которые находятся рядом с нижнечелюстной костью.
  8. Поднимите грудину слегка пинцетом, и вырезать грудины и брюшной стенки вдоль средней линии скальпелем. Вырезать ключицы скальпелем. Закрепите левую и правую грудные клетки к доске с помощью игл, чтобы открыть грудную полость.
  9. Запись грубых поражений и степени посмертных изменений.
  10. Удалить висцеральные ткани (наведок сердца, легких, печени, почек, кишечника) из туши с помощью пинцета и скальпеля. Соберите висцеральные образцы по мере необходимости для будущих исследований.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сбор дубликатов образцов. Одно должно быть собрано для молекулярного диагноза, и другое должно быть заморожено на -80 qC с или без вирусного средства перехода для вирусной культуры22.

4. Прямой флуоресцентный тест на антитела (FAT)

  1. Сделать впечатление мазки ткани мозга для FAT. Выполните FAT, как описано ранее18,23 со следующими изменениями.
  2. Аккуратно отделить ткани мозга от подключенной нервной ткани с пинцетом и передать ткани мозга стерильного языка депрессор. Вырезать поперечное сечение мозга, в том числе ствола мозга и мозжечка18,23. Сделать впечатление мазки ткани мозга, слегка касаясь вырезанной поверхности ткани мозга, и нажмите слайд на ткани хрусталика, чтобы удалить избыток ткани.
  3. Исправьте слайды с ацетоном при -20 градусов в течение 30 мин. Высушите проверенные горки и положительные и отрицательные элементы управления перед окрашиванием конъюгированными.
  4. Использование каждого из двух коммерчески доступных FITC-конъюгированных антител против бешенства для окрашивания лиссавирус антигена настоятельно рекомендуется23. Определить рабочую концентрацию коммерческого конъюгирования до первого окрашивания. Бросьте разбавленные конъюги через фильтр шприца 0,45 мкм на слайды и инкубировать слайды при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут в мокрой камере.
  5. Слейте избыток конъюгированных со слайдов и мыть слайды с фосфат-буфером солей (PBS) после инкубации.
  6. Падение небольшое количество 10% глицерола на слайдах и крышка с крышкой слайдов.
  7. Изучите слайды с помощью флуоресцентного микроскопа.

5. Добыча нуклеиновой кислоты

  1. Добавьте надлежащий объем MEM-10 (минимальная необходимая среда, дополненная 10% сыворотки плода) в ткани мозга (10% w/v).
  2. Гомогенировать ткани мозга с 5 мм стальной бисер в инструменте гомогенизатора и центрифуги на 825 х г в течение 10 мин.
  3. Извлеките нуклеиновой кислоты, конечный объем которой составляет 50 зл,, в пределах 200 л супернатанта, используя коммерчески доступный общий комплект для извлечения нуклеиновой кислоты с инструментом.

6. РТ-ПЦР и филогенетический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько наборов грунтовки были опубликованы для обнаружения всех известных лиссавирусов или конкретных лиссавирусов. Описанный здесь протокол является примером того, что наша лаборатория использует и может не соответствовать всем экспериментальным потребностям. Выбирайте подходящие грунтовки в соответствии с лабораторными потребностями.

  1. Подготовьте одноступенчатый реагент RT-PCR следующим образом: добавьте 5 qL извлеченной нуклеиновой кислоты в реакционную смесь, содержащую 2,5 л 10x реакционного буфера, 0,5 л форварда и обратного грунтовки (10 мкм каждого), 4 л 1,25 мМ dNTP, 0,3 л ингибитора RNase (40 мЛ/л) , 0,3 л обратной транскриптазы (10 U/Л), 0,4 л полимеразы ДНК (5 U/L) и 11,5 л очищенной от ДЕПК воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Грунтовые наборы, используемые в этом протоколе JW12 (5'-ATGTAACACTACAATG-3') и N165-146 (5'-GCAGGGTAYTRTACTCATCATA-3')24. Изменение подготовки реагентов и условий езды на велосипеде в соответствии с используемыми наборами грунтовки.
  2. Выполните велопробег при следующих условиях: инкубация при 42 градусах по Цельсию в течение 40 мин; первоначальная денатурация при 94 градусах по Цельсию в течение 10 мин; 35 циклов 94 градусов по Цельсию на 30 с, 55 градусов по Цельсию на 30 с и 72 градуса по Цельсию на 30 с; и, наконец, дальнейшее расширение при 72 градусах по Цельсию в течение 10 мин.
  3. Используйте еще один или несколько наборов грунтовки для повышения чувствительности к диагностике.
    1. Используйте N113F (5'-GTAGGATGCATTATGGG-3') и N304R (5'-TTGACGAGATCTTGCTCAT-3')25,26 для подготовки одноступенчатого реагента RT-PCR следующим образом: добавьте 5 qL извлеченной нуклеиновой кислоты в реакционную смесь, содержащую 5 qL 10x буфера 10x, 5 л буфера 10x, 5 л буфера 10x, 5 л буфера 10x, 5 qR l буфера 10x, 5 qR l буфера 10x, 5 qL буфера 10x, 5 qL буфера 10x, 5 qR. вперед и обратной грунтовки (4 мкм каждого), 5 л 1,25 мМ dNTP, 0,5 л ингибитора RNase (40 U /L), 0,2 л обратной транскриптазы (10 U/L), 1 л полимеразы ДНК (5 U/l) и 23,3 л очищенной от ДЭП воды.
    2. Выполните велопробег при следующих условиях: инкубация при 42 градусах по Цельсию в течение 40 мин; начальная денатурация при 95 градусах по Цельсию в течение 5 мин; 35 циклов по 95 градусов по Цельсию в течение 1 мин, 55 градусов по Цельсию в течение 1 мин и 20 с и 72 градусов по Цельсию в течение 1 мин; и, наконец, дальнейшее расширение при 72 градусах по Цельсию в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от лабораторных потребностей, выберите подходящие грунтовки для диагностики. N113F был первоначально разработан для усиления вируса бешенства, но он не может хорошо работать для других лиссавирусов. Набор N113F и N304R хорошо работает для вируса бешенства (тайваньский вариант барсука хорька) и тайваньских лиссавирусов летучей мыши. Это будет легче получить целые нуклеопроиновые последовательности с помощью набора JW12 и N304R грунтовки, если лиссавирус усиливается как из вышеуказанных двух наборов грунтовки.
  4. Проанализируйте продукт ПЦР на 2% электрофореза агарозного геля и визуализировать с помощью ультрафиолетового освещения.
  5. Секвенирование продукта ПЦР коммерческим сервисом секвенирования.
  6. Введите или загрузите последовательность на веб-страницу Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Выберите базу данных "другие (nr и т.д.)" и введите организм в качестве лиссавируса. Выберите алгоритм MegaBlast и запустите BLAST.

7. Вирусная изоляция

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните изоляцию вируса, когда либо 1) FAT или 2) RT-PCR указывает на положительность.

  1. Гомогенизировать образец мозга в 10% (w/v) подвеске в MEM-10. Центрифуга при 825 х г в течение 10 мин.
  2. Прививать 200 зл супернатанта с подвеской 3 х 106 MNA (нейробластома мышки) в 1 мл MEM-10 на 1 ч при 37 C с 1% CO2. Перенесите суспензию мозга на 25 см2 колбы и добавьте 6 мл МЕМ-10.
  3. Культивировать 1 мл мозга гоменат-клеточной подвески в 4 хорошо тефлоновые покрытием стеклянной слайд с диаметром 6 мм в то же время.
  4. После 3-4 дней инкубации при 37 градусах Цельсия с 1% CO2,зафиксировать клетки на 4 хорошо слайд со 100% ацетон (v/v).
  5. Пятно слайды с двумя FITC-конъюгированных антител борьбы с бешенством следующие шаги 4.4-4.7. Клетки заражаются при изучении интрацитоплазмических включений. Запись процент инфицированных клеток.
  6. Выполните трипсинизацию и субкультуру привитой клеточной культуры, когда слайды окрашены как отрицательные:
    1. Удалите средний и промыть колбу с 5 мл PBS.
    2. Добавьте 1 мл трипсина в колбу и твердо ударяйте дно колбы.
    3. Добавьте 6 мл MEM-10 и переприостановите клетки.
    4. Положите суспензию клетки в новую тканевую колбу (6 мл) и на 4 хорошо слайд (1 мл).
  7. Повторите шаги 7.4-7.6 до достижения 100% инфекционности.
  8. Соберите супернатант после 24 ч инкубации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

С 2014 года по май 2017 года для наблюдения было собрано 332 туши летучих мышей из 13 видов. Два положительных результатов. В первом случае летучая мышь, впечатление мозга испытания отрицательным с помощью FAT с одним из коммерческих FITC-конъюгированных антител против бешенства (Рисунок 2), в то время как RT-PCRs, используя каждый из двух наборов грунтовки (JW12/N165-146, N113F/N304R) дали положительные результаты(рисунок 3). Была получена последовательность ампликона 428 б.п. (усиленная N113F/N304R и содержащая частичный ген нуклеопротеина). Его последовательность была подвергнута BLAST запроса по базе данных GenBank. Результат показал, что последовательность была похожа на лиссавирусы с идентичностями менее 79%(Рисунок 4), поддерживая идентичности обнаруженных лиссавирусов.

Позже два лиссавируса были успешно изолированы от этих двух мозгов, и вирусы были подтверждены FAT(Рисунок 5) и секвенирования. Идентифицированный лиссавирус был назначен тайваньским лиссавирусом летучей мыши (TWBLV) на основе анализа последовательности4. Во втором случае результаты, полученные от ФАТо, использующих каждый из двух коммерческих антител, связанных с срабатыванием против бешенства, были несовместимыми, как это было описано в первом случае.

Figure 1
Рисунок 1: Диаграмма потока лиссавируса летучей мыши.
Flowchart показывает текущий процесс и методы диагностики, которые наша лаборатория использовала сейчас. Вирус изоляции должны быть выполнены, когда либо прямой флуоресцентный тест антитела или обратной транскрипции полимеразы цепной реакции является положительным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Прямая FAT с двумя коммерческими FITC-конъюгированных антител против бешенства всего мозга сжатия от TWBLV-инфицированных летучих мышей, что дает противоречивые результаты.
Номер корпуса: 2016-2300: (A) FAT с реагентом A (5x разбавления), демонстрируя яблочный зеленый положительные сигналы. (B) FAT с реагентом B, показывающий отрицательный результат (20x разбавления). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Продукты RT-PCR, использующие два грунтовых набора.
Набор грунтовок, используемый в полосах от 1 до 3, был JW12/N165-146, а ожидаемый размер продукта составил 111 базовых пар. Набор грунтовок, используемый в полосах от 4 до 6, был N113F /N304R, а ожидаемый размер продукта составил 521 базовую пару. Оба теста выборки (полосы 1 и 4) были положительными. M й 100 bp ДНК лестница; полосы движения 1 и 4 - проверенный образец; полосы движения 2 и 5 - положительные элементы управления; полосы 3 и 6 - отрицательные элементы управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: BLAST результат N113F/N304R продукт TWBLV инфицированных летучих мышей.
РЕЗУЛЬТАТы BLAST показали, что случай был наиболее похож на лиссавирус, но идентичность с лиссавирусом в базе данных была только 79%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Сравнение распределения лиссавирусного антигена вирусной изоляции TWBLV с двумя спряжеными противбечевыми спряжениями FITC.
Эмульсия мозга летучей мыши 10% (TWBLV заражена) была привитана в клетки нейробластомы мыши для изоляции вируса. FATs были выполнены на десятом проходе и окрашены двумя FITC-конъюгированных антител борьбы с бешенством. Распределение антигенов клеток нейробластомы мыши с двумя конъюгетами бешенства показало значительные различия. (A) FAT с реагентом A (5x разбавление). (B) FAT с реагентом B (5x разбавление). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эта лабораторная стандартная операционная процедура (SOP) обеспечивает серийный процесс для тестирования образцов летучих мышей на наличие лиссавирусных антигенов на Тайване. Ключевыми шагами являются занятость FAT и RT-PCR. Важное значение имеет также выбор подходящих образцов и успешная изоляция вируса. Кроме того, в ходе мониторинга лиссавирусов летучих мышей была проведена определенная неполадка. Основным отличием были целевые животные. Первоначально (2008-2009), целевыми животными лиссавирусной слежки летучих мышей были живые летучие мыши, которые оказались в ловушке на острове Кинмен на Тайване, а затем протестированы на лиссавирус после эвтаназии. Большинство пойманных в ловушку летучих мышей были здоровыми и вряд ли переносили лиссавирус, и такой подход к мониторингу не был гуманным. Поэтому в течение третьего года были собраны только мертвые или умирающие летучие мыши, которые расширяли зону наблюдения с регионального на национальное. После восьми лет непрерывного мониторинга, первый случай лиссавируса летучей мыши был, наконец, обнаружен на Тайване.

Хотя FAT является наиболее широко используемым методом для диагностики бешенства и рекомендован МЭЭ и ВОЗ18, несколько исследований показали противоречивые результаты, когда различные конъюги были использованы в FAT5,27. Аналогичные противоречивые результаты также появились в случаях, связанных с TWBLV. В TWBLV-инфицированных клеток MNA, результаты FAT показали значительные различия в 2 конъюги(рисунок 5). Один из FITC-конъюгированных антител против бешенства не реагировать хорошо, даже при более высоких концентрациях. Из-за изменения лиссавирусного антигена в образцах и вариации алктела жадность и сродство антител в конъюгированных, рекомендуется, чтобы два различных конъюгатов быть использованы в FAT для предотвращения ложных отрицательных результатов в лиссавирус диагноз23,28,29.

RT-PCR может дать подтверждающий диагноз на несовместимые результаты FAT. В связи с высоким генетическим разнообразием лиссавируса, рекомендуется, чтобы более одного грунтового набора в РТ-ПЦР быть использованы для повышения точности скрининга лиссавируса29,30. Грунтовые набор, разработанный из высоко сохранимых генов нуклеопротеинов является наиболее часто используемым набором в обнаружении лизавируса29. RT-PCR также может быть использован для диагностики в putrefactive образцов, когда FAT не может быть выполнена31,32. Чтобы избежать ложного негатива, предотвращающего открытие нового лиссавируса, рекомендуется больше инструментов для обнаружения. Два новых лиссавирусов4, Тайвань летучая мышь lyssavirus, были выявлены в ходе этого обследования с использованием SOP.

Кроме того, один очень разнообразный штамм TWBLV и новый новый вид лиссавируса были обнаружены у летучих мышей на Тайване в 2018 году (неопубликованные данные). Полученные результаты доказали, что использование как FAT, так и РТ-ПЦР для обнаружения лиссавирусов у летучих мышей полезно. Следует отметить некоторые ограничения сета праймера RT-PCR, используемого в этом SOP. В грунтовом наборе N113F/N304R, N113F был первоначально разработан для усиления вируса бешенства, но он не может хорошо работать для других лиссавирусов. Несколько праймеров для обнаружения лиссавируса были опубликованы другими исследователями29,30 и могут быть выбраны в соответствии с лабораторными потребностями.

Эта статья является пошагонным введением в лиссавирусную слежку летучей мыши на Тайване. Есть надежда, что этот SOP будет полезен для исследователей, которые заинтересованы в лиссавирусной слежке летучих мышей. По мере того как больше исследователей уносят обзоры летучих мышей, больше lyssaviruses будут определены в будущем. Этот SOP отслеживает не только лиссавирусы, но и другие зоонозные агенты у летучих мышей. Такие выводы могут информировать общественность, специалистов в области здравоохранения и ученых о потенциальных рисках контакта с летучими мышами и другими дикими животными. Это также поможет лучше понять эволюцию и происхождение лиссавируса и приведет к значительному прогрессу в научных исследованиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Конфликт интересов не декларируются.

Acknowledgments

Мы благодарим Тянь-Чэн Ли, И-Тан Глин, Чиа-Чжун Цай и Я-Лан Ли за помощь в этом исследовании. Это исследование было поддержано грантом No 107AS-8.7.1-B'B2 (1) от Бюро инспекции здоровья животных и растений и карантина, Совета по сельскому хозяйству, Исполнительный юань, Тайвань.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5% Trypsin (10x) Gibco 15090046 Trypsin
25 cm2 flask Greiner bio-one 690160
Acetone Honeywell 32201-1L
Agarose I VWR Life Science 97062-250
Alcohol NIHON SHIYAKU REAGENT NS-32294
AMV Reverse Transcriptase Promega M5101
Antibiotic-Antimycotic(100X)  Gibco 15240-062 MEM-10
Blade Braun BA215
Centrifuge eppendorf 5424R
Chemilumineance system TOP BIO CO. MGIS-21-C2-1M
Collection tube Qiagen 990381
Collection tube SSI 2341-SO
Cover slide Muto Pure chemical Co., LTD. 24505
DNA analyzer Applied Biosystems 3700XL
Fetal bovine serum Gibco 10437028 MEM-10
FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin Fujirebio Diagnostic Inc. 800-092 FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B
Four-well Teflon-coating glass slide Thermo Fisher Scientific 30-86H-WHITE
Gel Electrophoresis System Major Science MJ-105-R
HBSS (1x) Gibco 14175095 Trypsin
Incubator ASTEC SCA-165DS
Inverted Microscope Olympus IX71
L-Glutamine 200 mM (100x) Gibco A2916801 MEM-10
LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent EMD Millipore Corporation 5100 FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A
MagNA Pure Compact Instrument Roche 03731146001
MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 Roche 03730964001
MEM (10x) Gibco 11430030 MEM-10
MEM NEAA (100x) Gibco 11140050 MEM-10
MEM vitamin solution Gibco 11120052 MEM-10
NaHCO3 Merck 1.06329.0500 MEM-10
Needle Terumo NN*2332R9
PBS Medicago 09-8912-100
Primer synthesis Mission Biotech
RNasin ribonuclease inhibitor Promega N2111
Sequencing service Mission Biotech
Slide Thermo Scientific AA00008032E00MNT10
Sodium Pyruvate (100 mM) Gibco 11360070 MEM-10
Stainless Steel Beads QIAGEN 69989
Sterile absorbent pad 3M 1604T-2
Syringe filter Nalgene 171-0045
Taq polymerase JMR Holdings JMR-801
Thermal cycler Applied Biosystems 2720
TissueLyser II QIAGEN 85300
Tongue depressor HONJER CO., LTD. 122246
Tweezer Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. A0601
Tylosin Tartrate Sigma T6271-10G MEM-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuzmin, I. V. Basic facts about lyssavirus. Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1. Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. Elsevier. California. 3-21 (2014).
  2. Aréchiga Ceballos, N., et al. Novel lyssavirus in bat, Spain. Emerging Infectious Diseases. 19, (5), 793-795 (2013).
  3. Gunawardena, P. S., et al. Lyssavirus in Indian Flying Foxes, Sri Lanka. Emerging Infectious Diseases. 22, (8), 1456-1459 (2016).
  4. Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24, (4), 782-785 (2018).
  5. Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. -M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary Emerging Diseases. 65, (3), 593-596 (2018).
  6. Banyard, A. C., Evans, J. S., Luo, T. R., Fooks, A. R. Lyssaviruses and bats: emergence and zoonotic threat. Viruses. 6, (8), 2974-2990 (2014).
  7. Pal, S. R., et al. Rabies virus infection of a flying fox bat, Pteropus policephalus in Chandigarh, Northern India. Tropical and Geographical Medicine. 32, (3), 265-267 (1980).
  8. Smith, P. C., Lawhaswasdi, K., Vick, W. E., Stanton, J. S. Isolation of rabies virus from fruit bats in Thailand. Nature. 216, (5113), 384 (1967).
  9. Tang, X. Pivotal role of dogs in rabies transmission, China. Emerging Infectious Diseases. 11, (12), 1970-1972 (2005).
  10. Kuzmin, I. V., et al. Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences. Virus Research. 97, (2), 65-79 (2003).
  11. Arguin, P. M., et al. Serologic evidence of Lyssavirus infections among bats, the Philippines. Emerging Infectious Diseases. 8, (3), 258-262 (2002).
  12. Lumlertdacha, B., et al. Survey for bat lyssaviruses, Thailand. Emerging Infectious Diseases. 11, (2), 232-236 (2005).
  13. Kuzmin, I. V., et al. Lyssavirus surveillance in bats, Bangladesh. Emerging Infectious Diseases. 12, (3), 486-488 (2006).
  14. Reynes, J. -M., et al. Serologic evidence of lyssavirus infection in bats, Cambodia. Emerging Infectious Diseases. 10, (12), 2231-2234 (2004).
  15. Nguyen, A. T., et al. Bat lyssaviruses, northern Vietnam. Emerging Infectious Diseases. 20, (1), 161-163 (2014).
  16. Liu, Y., Zhang, S., Zhao, J., Zhang, F., Hu, R. Isolation of Irkut virus from a Murina leucogaster bat in China. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, (3), 2097 (2013).
  17. Kaplan, M. M. Safety precautions in handling rabies virus. Laboratory Techniques in Rabies, 4th Ed. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Kiprowski, H. World Health Organization. Geneva. 3-8 (1996).
  18. World Organization for Animal Health (OIE). Rabies (infection with rabies and other lyssavirus. Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf (2019).
  19. Smith, I., Wang, L. F. Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans. Current Opinion in Virology. 3, (1), 84-91 (2013).
  20. Corbet, G. B., Hill, J. E. The mammals of the Indomalayan region: a systematic review. Oxford University Press. Oxford, New York. (1992).
  21. Mayer, F., von Helversen, O. Cryptic diversity in European bats. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 268, (1478), 1825-1832 (2001).
  22. Epstein, J. H., Field, H. E. Anthropogenic epidemics: the ecology of bat-borne viruses and our role in their emergence. Bats and viruses: a new frontier of emerging infectious diseases. Wang, L. F., Cowled, C. John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. 249-280 (2016).
  23. Centers for Disease Control and Prevention. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing. Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2019).
  24. Hayman, D. T. S., et al. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. Journal of Virological Methods. 177, (1), 87-93 (2011).
  25. Franka, R., et al. A new phylogenetic lineage of rabies virus associated with western pipistrelle bats (Pipistrellus hesperus). Journal of General Virology. 87, (8), 2309-2321 (2006).
  26. Trimarchi, C. V., Smith, J. S. Diagnostic evaluation. Rabies, 1st ed. Press, A., Jackson, A. C., Wunner, W. H. Academic Press. San Diego, CA. 307-349 (2002).
  27. Moldal, T., et al. First detection of European bat lyssavirus type 2 (EBLV-2) in Norway. BMC Veterinary Research. 13, 216 (2017).
  28. Robardet, E., et al. Comparative assay of fluorescent antibody test results among twelve European National Reference Laboratories using various anti-rabies conjugates. Journal of Virological Methods. 191, (1), 88-94 (2013).
  29. Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A. Laboratory diagnosis of rabies. Rabies, 3rd ed. Jackson, A. C. Academic Press. San Diego, CA. 409-459 (2013).
  30. Fischer, M., et al. A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses--results of a ring trial among European laboratories. PLoS ONE. 8, (3), 58372 (2013).
  31. David, D., et al. Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains. Veterinary Microbiology. 87, (2), 111-118 (2002).
  32. Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques. Journal of Virological Methods. 177, (1), 15-25 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics