Procedimento de funcionamento padrão para a vigilância do Lyssavirus da população do bastão em Formosa

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Summary

Este protocolo introduz um procedimento de funcionamento padrão do laboratório para o teste diagnóstico de antígenos do lyssavirus nos bastões em Formosa.

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Hsu, W. C., Hsu, C. L., Tu, Y. C., Chang, J. C., Tsai, K. R., Lee, F., Hu, S. C. Standard Operating Procedure for Lyssavirus Surveillance of the Bat Population in Taiwan. J. Vis. Exp. (150), e59421, doi:10.3791/59421 (2019).

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Abstract

Vírus dentro do gênero lyssavirus são patógenos zoonóticos, e pelo menos sete espécies de lyssavirus estão associadas a casos humanos. Porque os morcegos são reservatórios naturais da maioria dos lissavírus, um programa de vigilância de lyssavirus de morcegos tem sido conduzido em Taiwan desde 2008 para entender a ecologia desses vírus em morcegos. Neste programa, organizações não-governamentais de conservação de morcegos e centros de controle de doenças animais locais cooperaram para coletar morcegos mortos ou morcegos morrendo de fraqueza ou doença. Os tecidos cerebrais dos morcegos foram obtidos por necropsia e submetidos ao teste de anticorpo fluorescente direto (FAT) e reação em cadeia da polimerase reversa (RT-PCR) para detecção de antígenos de lyssavirus e ácidos nucleicos. Para a FAT, recomenda-se pelo menos dois conjugados de diagnóstico de raiva diferentes. Para o RT-PCR, dois conjuntos de primers (JW12/N165-146, N113F/N304R) são usados para amplificar uma sequência parcial do gene da nucleoproteína do lyssavirus. Este programa de vigilância monitora os lissavírus e outros agentes zoonóticos em morcegos. O lyssavirus do bastão de Formosa é encontrado em dois casos do pipistrelle japonês (ABRAMUS de Pipistrellus) em 2016 – 2017. Esses achados devem informar o público, os profissionais de saúde e os cientistas sobre os potenciais riscos de contato com morcegos e outros animais selvagens.

Introduction

Vírus dentro do gênero lyssavirus são patógenos zoonóticos. Há pelo menos sete espécies de lyssavirus associadas a casos humanos1. Além das 16 espécies deste gênero1,2,3, Taiwan bat lyssavirus (twblv)4 e Kotalahti bat lyssavirus5 foram recentemente identificados em morcegos, mas seus status taxonômicos ainda não ser determinado.

Os morcegos são os hospedeiros naturais da maioria dos lissavírus, com exceção de Mokola lyssavirus e Ikoma lyssavirus, que ainda não foram identificados em nenhum morcego1,2,3,6. A informação sobre os lyssavirus em morcegos asiáticos ainda é limitada. Dois lyssavirus não caracterizados em morcegos asiáticos (um na Índia e outro na Tailândia)7,8foram relatados . Um caso humano da raiva associou com uma mordida de bastão em China foi relatado em 2002, mas o diagnóstico foi feito somente pela observação clínica9. Em Ásia Central, o lyssavirus de Aravan foi identificado no morcego rato-eared menor (Myotis blythi) em quirguistão em 1991, e o lyssavirus de Khujand foi identificado no morcego whiskered (Myotis mystacinus) em tajikistan em 200110. Em Ásia Sul, o lyssavirus do bastão de Gomes foi identificado na raposa Indian do vôo (medius de Pteropus) em Sri Lanka em 20153. No sudeste asiático, vários estudos sorológicos sobre morcegos nas Filipinas, Tailândia, Bangladesh, Camboja e Vietnã mostraram soroprevalência variável11,12,13,14, quinze anos. Embora o lyssavirus de Irkut fosse identificado no bastão tubo-cheirado maior (leucogaster de Murina) na província de Jilin, China em 201216, as espécies exatas e as posições de lyssavirus em populações asiáticas orientais do bastão permanecem desconhecidas.

Para avaliar a presença de lyssavirus em populações de morcegos taiwaneses, iniciou-se um programa de vigilância empregando tanto a FAT direta como a RT-PCR. O lyssavirus do bastão de Formosa foi identificado em dois casos do pipistrelle japonês (ABRAMUS de Pipistrellus)4 em 2016 – 2017. No artigo atual, um procedimento de funcionamento padrão do laboratório é introduzido para a fiscalização do Lyssavirus da população do bastão em Formosa. O fluxograma do diagnóstico do lyssavirus do bastão em nosso laboratório é apresentado em Figura 1.

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Protocol

1. precauções de segurança ao manusear lissavírus

  1. Assegure-se de que todos os trabalhadores laboratoriais que manuseiam espécimes de morcego recebam profilaxia antirrábica17. Monitore os níveis de anticorpos da raiva dos trabalhadores de antemão e reexamine-os a cada 6 meses17. A vacinação antirrábica de seguimento é necessária para aqueles cujos níveis de anticorpos são inferiores a 0,5 UI/mL17.
  2. Dependendo dos regulamentos de biossegurança do país em que o laboratório está localizado, assegure-se de que os seguintes procedimentos sejam realizados em laboratórios de nível de biossegurança adequados (por exemplo, laboratórios BSL-2 em Taiwan e em laboratórios BSL-3 na Austrália), e que trabalhadores são atualmente qualificados e usam equipamento de proteção pessoal adequado18.
    Nota: a vacinação contra a raiva fornece pouca ou nenhuma proteção contra os lissavírus pertencentes aos fitógrupos II e III18. Os trabalhadores devem ser informados de que vários patógenos zoonóticos foram identificados em morcegos19 e devem manipular amostras condições adequadas de laboratório de nível de biossegurança com equipamento de proteção pessoal adequado.

2. coleta de amostra

  1. Use encontrado morcegos fracos ou doentes ou carcaças.
    Nota: morcegos fracos ou doentes são entregues à sociedade de conservação de morcego de Taipei para cuidados veterinários ou pesquisa, enquanto as carcaças são submetidas diretamente ao Instituto de pesquisa em saúde animal. Nenhum morcego saudável foi eutanasiado neste programa de vigilância.
  2. Ter um ecologista morcego identificar espécies de morcegos através de características morfológicas20.
  3. Executar o DNA código barras da espécie de morcego quando o lyssavirus positivo é diagnosticado, usando procedimentos publicados anteriormente21.
  4. Submeter uma ficha informativa de cada carcaça de morcego (local de recolha, espécie, sinais clínicos, etc.).

3. necropsia de espécimes de morcego

  1. Prepare materiais.
    1. Prepare uma placa de dissecção limpa e coloque uma almofada absorvente estéril para necropsia.
    2. Prepare tubos de coleta para coletar órgãos de morcegos.
    3. Prepare pinças descartáveis e bipels para necropsia. Troque as ferramentas entre a necropsia de cada morcego. Prepare bolas de algodão umedecidas com etanol a 70% para a limpeza de pinças e bipéis durante a amostragem.
    4. Prepare duas lâminas de microscópio para a FAT. Colete espécimes frescos e corrigi-los em solução de formalina para exame histopatológico.
  2. Examine todos os orifícios externos antes da necropsia. Fotografe as características externas do morcego, especialmente a cabeça, orelhas e asas, para diferenciação de espécies.
  3. Colete uma amostra de swab oral. Coloque o bastão em decúbito ventral no tabuleiro e fixar a cabeça do morcego com pinças. Corte a pele ao longo da linha média da Calvaria com um bisturi e puxe a pele para os lados laterais. Corte o crânio ao longo da linha média da Calvaria com um bisturi e abra-o com uma pinça para expor o tecido cerebral.
  4. Retire o tecido cerebral do crânio e coloque-o sobre um depressor de língua estéril, e fazer manchas de impressão do tecido cerebral (ver passo 4,2). Colete um pequeno pedaço de tecido cerebral fresco e corrigi-lo em formalina para exame histopatológico. Contenha o tecido cerebral remanescente em um tubo para extração de ácido nucleico.
  5. Limpe pinças e bisturi com bolas de algodão umedecidas com etanol a 70% para remover os tecidos retidos entre a coleta de amostras.
  6. Coloque o bastão no tabuleiro em decúbito dorsal e corrigi-lo na placa com agulhas em ambos os lados da axila e calcanhar da cauda.
  7. Incise a pele ao longo da linha média do corpo da mandíbula ao ânus. Levante e separe a pele e os tecidos musculares subjacentes com pinças. Colete as glândulas salivares, que estão perto do osso mandibular.
  8. Levante ligeiramente o esterno com pinças e corte o esterno e a parede abdominal ao longo da linha média com um bisturi. Corte as clavículas com um bisturi. Fixar as gaiolas de costela esquerda e direita para a placa com agulhas para abrir a cavidade torácica.
  9. Registre as lesões brutas e o grau de mudança post-mortem.
  10. Retire os tecidos viscerais (i.e., coração, pulmões, fígado, rins, intestinos) da carcaça usando pinças e um bisturi. Colete os espécimes viscerais conforme necessário para futuras pesquisas.
    Observação: a coleção de amostras duplicadas é recomendada. Um deve ser coletado para o diagnóstico molecular, e o outro deve ser congelado em-80 ° c com ou sem meio de transporte viral para a cultura viral22.

4. teste de anticorpo fluorescente direto (FAT)

  1. Faça esfregaços de impressão do tecido cerebral para a FAT. Execute o Fat como descrito anteriormente18,23 com as seguintes modificações.
  2. Separe suavemente o tecido cerebral do tecido nervoso conectado com pinças e transfira o tecido cerebral para um depressor de língua estéril. Corte a seção transversal do cérebro, incluindo o tronco cerebral e cerebelo18,23. Faça manchas de impressão do tecido cerebral, tocando levemente a superfície cortada do tecido cerebral, e pressione o slide no tecido da lente para remover o excesso de tecido.
  3. Fixar as lâminas com acetona a-20 ° c durante 30 min. seque as lâminas testadas e os controlos positivos e negativos antes de se manchar com o conjugado.
  4. Usando cada um dos dois comercialmente disponíveis FITC-conjugated anti-raiva anticorpos para coloração de antígeno de lissavirus é altamente recomendado23. Determine a concentração de trabalho do conjugado comercial antes da primeira coloração. Soltar os conjugados diluídos através de um filtro de seringa de 0,45 μM nas lâminas e incubar as lâminas a 37 ° c durante 30 min dentro de uma câmara húmida.
  5. Drenar o excesso de conjugado das lâminas e lavar as lâminas com tampão fosfato salina (PBS) após a incubação.
  6. Solte uma pequena quantidade de 10% de glicerol nas lâminas e cubra com lâminas de cobertura.
  7. Examine as lâminas com um microscópio fluorescente.

5. extração de ácido nucleico

  1. Adicione o volume apropriado de MEM-10 (meio essencial mínimo suplementado com o soro bovino fetal de 10%) ao tecido de cérebro (10% w/v).
  2. Homogeneate o tecido cerebral com um grânulo de aço de 5 milímetros em um instrumento do homogeneizador e centrifugue em 825 x g por 10 minutos.
  3. Extraia o ácido nucleico, cujo volume final é de 50 μL, dentro de 200 μL do sobrenadante utilizando o kit de extração de ácido nucleico total disponível comercialmente com instrumento.

6. RT-PCR e análise filogenética

Nota: vários conjuntos de primers foram publicados para detectar todos os lyssavirus conhecidos ou lyssavirus específicos. O protocolo descrito aqui é um exemplo que nosso laboratório usa e pode não caber todas as necessidades experimentais. Selecione primers adequados de acordo com as necessidades laboratoriais.

  1. Prepare o reagente RT-PCR de uma etapa da seguinte forma: Adicionar 5 μL de ácido nucleico extraído à mistura de reacção contendo 2,5 μL de tampão de reacção 10x, 0,5 μL de primers para a frente e para trás (10 μM de cada), 4 μL de dNTP de 1,25 mM, 0,3 μL de inibidor de RNase (40 U/μL) , 0,3 μL de transcriptase reversa (10 U/μL), 0,4 μL de DNA polimerase (5 U/μL) e 11,5 μL de água tratada com DEPC.
    Nota: o conjunto primário utilizado neste protocolo é JW12 (5 '-ATGTAACACCYCTACAATG-3 ') e N165-146 (5 '-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3 ')24. Modificar a preparação de reagentes e condições de ciclismo de acordo com os conjuntos de primer utilizados.
  2. Realize a ciclagem as seguintes condições: incubação a 42 ° c por 40 min; desnaturação inicial a 94 ° c por 10 min; 35 ciclos de 94 ° c para 30 s, 55 ° c para 30 s e 72 ° c para 30 s; e finalmente, mais extensão em 72 ° c por 10 min.
  3. Use um ou mais conjuntos de primer para aumentar a sensibilidade diagnóstica.
    1. Use N113F (5 '-gtaggatgctatatggg-3 ') e N304R (5 '-ttgacgaagatcttgctcat-3 ')25,26 para preparar o reagente de RT-PCR de um passo da seguinte forma: Adicionar 5 μL de ácido nucleico extraído a uma mistura de reacção contendo 5 μL de tampão 10x, 5 μL de primers de avanço e reverso (4 μM de cada), 5 μL de dNTP de 1,25 mM, 0,5 μL de inibidor de RNase (40 U/μL), 0,2 μL de transcriptase reversa (10 U/μL), 1 μL de DNA polimerase (5 U/μL) e 23,3 μL de água tratada com DEPC.
    2. Realize a ciclagem as seguintes condições: incubação a 42 ° c por 40 min; desnaturação inicial a 95 ° c por 5 min; 35 ciclos de 95 ° c por 1 min, 55 ° c por 1 min e 20 s, e 72 ° c por 1 min; e finalmente, mais extensão em 72 ° c por 10 min.
      Nota: dependendo das necessidades laboratoriais, escolha primers adequados para o diagnóstico. N113F foi originalmente projetado para a amplificação do vírus da raiva, mas pode não funcionar bem para outros lyssavirus. O conjunto de N113F e N304R funciona bem para o vírus da raiva (variante de texugo de Taiwan) e o lyssavirus de morcego de Taiwan. Será mais fácil obter sequências inteiras de nucleoproteínas usando o conjunto de primers JW12 e N304R se o lyssavirus for amplificado por ambos os dois conjuntos de primer acima.
  4. Analise o produto do PCR na electroforese do gel do agarose de 2% e visualize pela iluminação da luz UV.
  5. Sequencia o produto do PCR pelo serviço de sequenciamento comercial.
  6. Insira ou carregue a sequência na página da Web da ferramenta de pesquisa de alinhamento local básica nucleotídeo (BLAST). Selecione o "outros (NR etc.)" banco de dados e entrar no organismo como lyssavirus. Selecione o algoritmo MegaBlast e execute o BLAST.

7. isolamento de vírus

Nota: execute o isolamento de vírus quando 1) a FAT ou 2) o RT-PCR indica positividade.

  1. Homogeneize o espécime do cérebro em uma suspensão de 10% (w/v) em MEM-10. Centrifugador a 825 x g durante 10 min.
  2. Inocular 200 μL de sobrenadante com uma suspensão de 3 x 106 Mna (rato neuroblastoma) células em 1 ml de mem-10 para 1 h a 37 ° c com 1% Co2. Transfira a suspensão do homogeneato de células cerebrais para um balão de 25 cm2 e adicione 6 ml de mem-10.
  3. Cultive 1 mL da suspensão de células de homogeneatos cerebrais em uma corrediça de vidro revestida com Teflon de 4 poços com 6 mm de diâmetro ao mesmo tempo.
  4. Após 3 – 4 dias de incubação a 37 ° c com 1% de CO2, fixar as células na corrediça de 4 poços com 100% de acetona (v/v).
  5. Manchar as lâminas com dois anticorpos anti-raiva conjugados FITC seguindo os passos 4.4 – 4.7. As células estão infectadas quando as inclusões intracitoplasmicas são investigadas. Registre a porcentagem de células infectadas.
  6. Executar tripsinização e subcultura da cultura de célula inoculada quando as lâminas são manchadas como negativas:
    1. Retire o meio e enxague o balão com 5 mL de PBS.
    2. Adicione 1 mL de tripsina ao balão e bata firmemente no fundo do balão.
    3. Adicionar 6 mL de MEM-10 e ressuspender as células.
    4. Coloque a suspensão celular em um novo balão de tecido (6 mL) e em uma corrediça de 4 poços (1 mL).
  7. Repita os passos 7.4 – 7.6 até 100% de infectividade ser atingida.
  8. Colete o sobrenadante após 24 h de incubação.

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Representative Results

De 2014 a maio de 2017, foram coletadas 332 carcaças de morcegos de 13 espécies para vigilância. Dois positivos testados. No primeiro caso de morcego, a impressão cerebral testou negativamente usando a FAT com um dos anticorpos antirrábico FITC-conjugados comerciais (Figura 2), enquanto o RT-PCRs empregando cada um dos dois conjuntos de primer (JW12/N165-146, N113F/N304R) rendeu resultados positivos (Figura 3). Uma seqüência de 428 BP do amplicon (amplificada com N113F/N304R e que contem o gene parcial do nucleoprotein) foi obtida. Sua seqüência foi submetida a BLAST consultando pelo banco de dados GenBank. O resultado mostrou que a seqüência foi semelhante ao lissavirus com identidades inferiores a 79% (Figura 4), suportando as identidades dos lissavírus detectados.

Mais tarde, dois lyssavirus foram isolados com sucesso destes dois cérebros, e os vírus foram confirmados pelo FAT (Figura 5) e em arranjar em seqüência. O lyssavirus identificado foi designado como o lyssavirus do bastão de Formosa (TWBLV) baseado na análise da seqüência4. No segundo caso, os resultados obtidos a partir das gorduras empregando cada um dos dois anticorpos antirábico FITC-conjugados comerciais foram inconsistentes, como descrito para o primeiro caso.

Figure 1
Figura 1: gráfico de fluxo do diagnóstico do lyssavirus do bastão.
Fluxograma mostrando o processo atual e métodos de diagnóstico que o nosso laboratório utilizado agora. A isolação do vírus deve ser executada quando o teste de anticorpo fluorescente direto ou a reacção em cadeia reversa da polimerase da transcrição são positivos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: gordura direta com dois anticorpos antirrábico FITC-conjugados comerciais de compressão cerebral total de um morcego infectado por TWBLV produzindo resultados inconsistentes.
Número do processo: 2016-2300: (a) a gordura com reagente A (diluição 5x), demonstrando sinais positivos de maçã verde. (B) a FAT com Reagente B, mostrando um resultado negativo (20x diluição). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: produtos de RT-PCRs empregando dois conjuntos de primer.
O conjunto de primers utilizado nas faixas 1 a 3 foi JW12/N165-146, e o tamanho do produto esperado foi de 111 pares de base. O conjunto de primers utilizado nas faixas 4 a 6 foi de N113F/N304R, e o tamanho do produto esperado foi de 521 pares de bases. Ambos os testes da amostra (faixas 1 e 4) foram positivos. M = 100 BP escada de DNA; faixas 1 e 4 = amostra testada; faixas 2 e 5 = controles positivos; faixas 3 e 6 = controles negativos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: resultado da explosão do produto N113F/N304R do morcego infectado TWBLV.
Os resultados da BLAST mostraram que o caso foi mais semelhante ao do lyssavirus, mas a identidade com o lyssavirus na base de dados foi de apenas 79%. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: comparação da distribuição do antígeno de lyssavirus do isolamento do vírus de TWBLV com dois conjugados anti-raiva conjugado com FITC.
A emulsão do cérebro do bastão de 10% (TWBLV Infected) foi inoculada em pilhas do neuroblastoma do rato para o isolamento do vírus. As gorduras foram executadas na décima passagem e coradas com dois anticorpos antirábica FITC-conjugados. A distribuição do antígeno de pilhas do neuroblastoma do rato com dois conjugados da raiva mostrou diferenças significativas. (A) a gordura com reagente A (diluição 5x). (B) a FAT com Reagente B (diluição de 5x). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este procedimento de funcionamento padrão do laboratório (SOP) fornece um processo de série para testar amostras do bastão para a presença de antígenos do lyssavirus em Formosa. Os passos principais incluem o emprego de FAT e RT-PCR. A seleção de amostras apropriadas e o isolamento bem-sucedido do vírus também são importantes. Adicionalmente, alguma solução de problemas foi conduzida durante a monitoração de lyssavirus do bastão. A diferença principal era os animais do alvo. Inicialmente (2008 – 2009), os animais-alvo da vigilância do lyssavirus do bastão eram bastões vivos, que foram prendidos na ilha de Kinmen em Formosa testado então para o lyssavirus após o euthanasia. A maioria dos morcegos presos eram saudáveis e improvável para transportar o lyssavirus, e essa abordagem de monitoramento não era humana. Portanto, no terceiro ano, apenas morcegos mortos ou moribundos foram coletados e ampliaram a área de vigilância de regional para nacional. Após oito anos de monitoração contínua, o primeiro caso do lyssavirus do bastão foi detectado finalmente em Formosa.

Embora a gordura seja o método mais utilizado para o diagnóstico da raiva e recomendado pelo OIE e que18, poucos estudos demonstraram resultados inconsistentes quando diferentes conjugados foram utilizados na gordura5,27. Resultados inconsistentes semelhantes também apareceram em casos infectados com TWBLV. Nas células MNA infectadas pelo TWBLV, os resultados da FAT mostraram diferenças significativas em 2 conjugados (Figura 5). Um dos anticorpos antirrábica conjugados com FITC não reagiu bem, mesmo em concentrações mais elevadas. Por causa da variação do antígeno do lyssavirus nas amostras e da variação da avidez e da afinidade do anticorpo dos anticorpos nos conjugados, recomenda-se que dois conjugados diferentes sejam usados no Fat para impedir resultados negativos falsos no lyssavirus diagnóstico23,28,29.

RT-PCR pode fornecer o diagnóstico confirmatório para resultados inconsistentes de FAT. Devido à alta diversidade genética de lyssavirus, recomenda-se que mais de um primer definido em RT-PCR seja usado para aumentar a acurácia da triagem de lissavirus29,30. Um conjunto de primer projetado a partir de genes de nucleoproteínas altamente conservadas é o conjunto mais comumente usado na detecção de lissavirus29. RT-PCR pode igualmente ser usado para o diagnóstico em amostras putrefactive quando a gordura não pode ser executada31,32. Para evitar a falsa negatividade impedindo a descoberta de um novo lyssavirus, mais ferramentas são recomendadas para detecção. Dois lyssavirus novos4, o lyssavírus do bastão de Formosa, foram identificados durante esta pesquisa que emprega o SOP.

Adicionalmente, uma cepa TWBLV altamente diversificada e uma nova espécie de lyssavirus foram encontradas em morcegos em Taiwan em 2018 (dados não publicados). Os resultados provaram que o emprego do FAT e do RT-PCR para detectar lyssavirus nos bastões é útil. Algumas limitações do conjunto de primers RT-PCR utilizadas neste SOP devem ser observadas. No primer conjunto de N113F/N304R, N113F foi originalmente projetado para a amplificação do vírus da raiva, mas pode não funcionar bem para outros lyssavirus. Vários primers para detecção de lissavirus foram publicados por outros pesquisadores29,30 e podem ser escolhidos de acordo com as necessidades laboratoriais.

Este artigo é uma introdução passo a passo para a vigilância do lyssavirus do bastão em Formosa. Espera-se que este SOP será útil para os pesquisadores que estão interessados na vigilância do lyssavirus bat. À medida que mais pesquisadores realizam pesquisas de morcegos, mais lissavírus serão identificados no futuro. Este SOP monitora não só lyssavirus, mas também outros agentes de zoonoses em morcegos. Tais achados podem informar o público, os profissionais de saúde e os cientistas dos potenciais riscos de contato com morcegos e outros animais selvagens. Também vai ajudar a aumentar a compreensão da evolução e origens do lyssavirus e levar a progressos substanciais na investigação científica.

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Disclosures

Nenhum conflito de interesses é declarado.

Acknowledgments

Agradecemos a Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-jung Tsai e Ya-LAN li por sua assistência durante este estudo. Este estudo foi apoiado por Grant no. 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) do Bureau de inspeção e quarentena de saúde animal e vegetal, Conselho de agricultura, executivo Yuan, Taiwan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5% Trypsin (10x) Gibco 15090046 Trypsin
25 cm2 flask Greiner bio-one 690160
Acetone Honeywell 32201-1L
Agarose I VWR Life Science 97062-250
Alcohol NIHON SHIYAKU REAGENT NS-32294
AMV Reverse Transcriptase Promega M5101
Antibiotic-Antimycotic(100X)  Gibco 15240-062 MEM-10
Blade Braun BA215
Centrifuge eppendorf 5424R
Chemilumineance system TOP BIO CO. MGIS-21-C2-1M
Collection tube Qiagen 990381
Collection tube SSI 2341-SO
Cover slide Muto Pure chemical Co., LTD. 24505
DNA analyzer Applied Biosystems 3700XL
Fetal bovine serum Gibco 10437028 MEM-10
FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin Fujirebio Diagnostic Inc. 800-092 FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B
Four-well Teflon-coating glass slide Thermo Fisher Scientific 30-86H-WHITE
Gel Electrophoresis System Major Science MJ-105-R
HBSS (1x) Gibco 14175095 Trypsin
Incubator ASTEC SCA-165DS
Inverted Microscope Olympus IX71
L-Glutamine 200 mM (100x) Gibco A2916801 MEM-10
LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent EMD Millipore Corporation 5100 FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A
MagNA Pure Compact Instrument Roche 03731146001
MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 Roche 03730964001
MEM (10x) Gibco 11430030 MEM-10
MEM NEAA (100x) Gibco 11140050 MEM-10
MEM vitamin solution Gibco 11120052 MEM-10
NaHCO3 Merck 1.06329.0500 MEM-10
Needle Terumo NN*2332R9
PBS Medicago 09-8912-100
Primer synthesis Mission Biotech
RNasin ribonuclease inhibitor Promega N2111
Sequencing service Mission Biotech
Slide Thermo Scientific AA00008032E00MNT10
Sodium Pyruvate (100 mM) Gibco 11360070 MEM-10
Stainless Steel Beads QIAGEN 69989
Sterile absorbent pad 3M 1604T-2
Syringe filter Nalgene 171-0045
Taq polymerase JMR Holdings JMR-801
Thermal cycler Applied Biosystems 2720
TissueLyser II QIAGEN 85300
Tongue depressor HONJER CO., LTD. 122246
Tweezer Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. A0601
Tylosin Tartrate Sigma T6271-10G MEM-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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