Un modelo in vitro para estudiar la agregación de Tau utilizando la transducción de neuronas humanas mediada por lentivirales

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Neuroscience

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Summary

Este protocolo detalla un procedimiento en el que las culturas neuronales humanas son transducidas con construcciones lentivirales codificando para tau humano mutante. Las culturas transducadas muestran agregados Tau y patologías asociadas.

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Aulston, B., Liu, Q., Reilly, P., Yuan, S. H. An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons. J. Vis. Exp. (147), e59433, doi:10.3791/59433 (2019).

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Abstract

La agregación aberrante de la proteína tau está implicada patogénicamente en una serie de enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer (AD). Aunque los modelos de tauopatía de ratón han proporcionado un recurso valioso para la investigación de los mecanismos neurotóxicos de la Tau agregada, es cada vez más evidente que, debido a las diferencias interespecies en Neurofisiología, el cerebro del ratón es inadecuado para modelar la condición humana. Los avances en los métodos de cultivo celular han hecho que las culturas neuronales humanas sean accesibles para uso experimental in vitro y han ayudado en el desarrollo de neuroterapias. Sin embargo, a pesar de la adaptación de las culturas celulares neuronales humanas, los modelos in vitro de la tauopatía humana aún no están ampliamente disponibles. Este protocolo describe un modelo celular de agregación de tau en el que las neuronas humanas son transducadas con vectores de origen lentiviral que codifica para tau mutado patógeno fusionado a un reportero de proteína fluorescente amarilla (YFP). Las culturas transducadas producen agregados tau que se mancha positivamente para la tioflavina y muestran marcadores de neurotoxicidad, como la longitud axonal disminuida y el aumento del volumen lisosomal. Este procedimiento puede ser un modelo útil y rentable para el estudio de las tauopatías humanas.

Introduction

La agregación patológica de la proteína tau asociada a un microtúbulo es una característica definitoria de muchas enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la AD, la demencia frontotemporal (FTD), la enfermedad de Pick y la parálisis la supranuclear progresiva (PSP)1. En un estado no enfermo, Tau se une y estabiliza los filamentos de microtúbulo en axones neuronales2. Sin embargo, la hiperfosforilación asociada a la enfermedad de Tau promueve la agregación de TAU, la disociación de los microtúbulos y la toxicidad neuronal3. Los efectos tóxicos de Tau agregada pueden implicar la activación aberrante de colinérgicos4 y los receptores glutamatérgicos5 resultando en la desregulación del calcio intracelular y, eventualmente, la muerte celular. En modelos animales, la reducción de Tau cerebral mejora la patología en ratones AD6 y en modelos de ratón de lesión cerebral traumática leve repetitiva7.

La evidencia de montaje demuestra que la estructura y la afinidad de unión de Tau derivado del ratón son distintas de Tau derivado del humano y que Tau de ratón es inadecuado para modelar Tauopatías humanas8. Sin embargo, los modelos de tauopatía celular humana no están ampliamente disponibles comercialmente. El objetivo general de este trabajo es describir un modelo in vitro de agregación tau en el que las neuronas humanas son transducidas con vectores de origen lentiviral que contienen construcciones tau humanas mutantes9. El agregado de tau que hace que las construcciones lentivirales se codifiquen para el dominio de repetición tau P301L y V337M mutaciones fusionadas con un reportero de YFP (tau-RDLM-YFP) mientras que el control construye el código para el dominio de repetición de Tau (WT) de tipo salvaje fusionado con un reportero de YFP (tau-WT-YFP). Los cultivos neuronales transducidas usando este método expresan aproximadamente nueve veces más tau que las culturas no transducadas. Aunque la cantidad de expresión de Tau expresada en exceso es aproximadamente igual entre las células de Tau-RdlM-YFP y tau-WT-YFP-transducidas, solo las neuronas transducidas con agregados de visualización tau-RdlM-YFP. Las culturas transladadas con tau-RDLM-YFP se mancha positivamente para tioflavina y muestran reducciones en la longitud axonal y la densidad sináptica. Por lo tanto, este modelo celular puede ser una herramienta útil para estudiar la agregación de Tau in vitro.

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Protocol

1. preparación de medios y reactivos

  1. Descongelar el recubrimiento de matriz de membrana del sótano para placas de cultivo a 4 ° c (no permita que la matriz de membrana del sótano se caliente o se solidifique). Hacer alícuts de 1 mL y almacenarlos a-20 ° c o-70 ° c.
  2. Reconstituir el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) en solución salina estéril amortiguada por fosfato (PBS) a 10 μg/mL y hacer alícuas de 10 μL. Guárdela a 4 ° c.
  3. A una botella nueva, sin abrir, de 500 mL de DMEM/F12 con glutamina, añadir B27 (10 mL), N2 (5 mL) y penicilina-streptomicina (5 mL). Colocar 50 mL de este medio de la célula madre neural (NSC) en un tubo cónico y añadir 10 μL de 10 μg/μL (2 μg/mL final) bFGF. Almacene los medios NSC (+) bFGF a 4 ° c.
  4. Para hacer (-) los medios bFGF, utilice la misma receta que se describe en el paso 1,3 pero no agregue bFGF. Estos medios se utilizarán para diferenciar los NSCs a las neuronas y para mantener las culturas neuronales después de la diferenciación.

2. construcciones lentivirales

Nota: Antes de comenzar a trabajar con construcciones lentivirales, asegúrese de que el laboratorio ha sido aprobado para usar agentes de bioseguridad nivel 2 (BSL-2). Además, se deben utilizar campanas de cultivo BSL-2, equipo de protección personal (EPP) y métodos de eliminación cuando se trabaja con vectores lentivirales.

  1. Obtenga construcciones tau empaquetadas en lentivirus de una fuente preferida (véase Sanders et al.10 para construir información).

3. cultivo de células madre neuronales humanas

Nota: Los NSCs son típicamente sembrados en 100000 – 150000 células/cm2 y la mayoría de los NSCs disponibles comercialmente se venden como 1 x 106 células/vial. Este protocolo se ha optimizado para los platos de cultivo de células de 10 cm (aunque se pueden utilizar otros tamaños de platos); por lo tanto, si se están utilizando los NSCs disponibles comercialmente, los NSCs pueden necesitar ser ampliados por primera vez cultivados en platos de seis-pozo con el fin de dar lugar a suficientes células para sembrar 10 cm de platos. Este protocolo puede ser adaptado alternativamente para una variedad de tamaños de plato de cultivo celular (pero no contiene instrucciones para el paso de los NSCs ya que estos protocolos están disponibles en otros lugares11,12).

  1. Para la preparación de placas de cultivo celular, retire una alícuota de recubrimiento de matriz de membrana de sótano congelado para placas de cultivo celular y permita que se descongele a 4 ° c (las alícuotas se pueden colocar a 4 ° c durante la noche del día antes de que las células se sembren). Añadir 385 μL de recubrimiento de matriz de membrana sótano a 5 mL de medios DMEM/F12 + penicilina-streptomicina.
    Nota:
    5 ml de medios DMEM/F12 + penicilina-estreptomicina es suficiente para recubrir un solo plato de 10 cm (1 ml de esta solución de recubrimiento de matriz de membrana sótano es suficiente para recubrir un pozo de un plato de seis pozo). Alternativamente, si las células deben ser fijas e inmunostinadas, o teñidas para tioflavina, las células de cultivo en cubreobjetos de vidrio en los platos de cultivo de 24-well.
    1. Mantenga fríos los medios y el recubrimiento de la matriz antes y agregándolos a los platos de cultivo. Añadir el recubrimiento de matriz de membrana sótano a los platos de cultivo y colocar los platos en una incubadora (a 37 ° c) para 1 h. Para un recubrimiento óptimo, no Incube la matriz de membrana del sótano durante más de 1 h o menos. Después de 1 h, aspiran el recubrimiento de matriz de membrana del sótano de los platos de cultivos celulares. Asegúrese de que esto coincida con los NSCs que están listos para ser chapados.
      Nota: Si las celdas no se descongelan de las existencias congeladas, omita el paso 3,2 y continúe con el paso 3,3.
  2. Si las células se descongelan de las existencias de NSC congeladas, tome un vial de células congeladas y caliente en un baño de agua calentado a 37 ° c moviendo el vial hacia atrás y hacia adelante en el agua. Una vez descongelada, pulverice el vial con etanol al 70% y colóquelo en una campana de cultivo celular. Transfiera las células a ~ 10 mL de medios DMEM/F12 + penicilina-estreptomicina y centrifugue el tubo a temperatura ambiente a 1.000 x g durante 5 min. Aspire los medios y resuspender las células en los medios NSC.
  3. Diluir las células en medios NSC para obtener la densidad de siembra apropiada para el recipiente de cultivo celular que se está utilizando.
    Nota: Por ejemplo, si los NSCs están siendo chapados en una placa de seis pozo — uno bien en un plato de seis cultivos tiene una superficie de 9 cm2— 900.000 a 1.350.000 las células se requieren para la semilla. Por lo tanto, un vial que contiene 1 millón células se puede precipitado resuspendido en 2 ml de medios y se añade a un solo pozo de un plato de seis podos.
  4. Agregue suficientes células suspendidas en los medios de la NSC para sembrar los platos de cultivo recubiertos con matriz de membrana basal (100.000 células/cm2) y cambie los medios cada dos días (si usa un caldo congelado, cambie los medios el día después del chapado y cada dos días después). Cultivar las células hasta que sean 75% – 80% confluentes.
    Nota: Las células probablemente alcancen 75% – 80% confluencia poco después de chapado, pero esto puede tomar más tiempo si se utilizan las existencias congeladas.
  5. Una vez que los NSCs son del 75% – 80% confluentes, comienzan la diferenciación neuronal quitando los medios de bFGF de la NSC (+) y reemplazándolos con los medios NSC (-) bFGF. Cultivo de las células en este medio (reemplazando los medios cada otro día) durante al menos 4 semanas.
    Nota: Las células continuarán dividiéndose durante unos días después de la retirada de bFGF; por lo tanto, las células pueden alcanzar 90 – 100% confluencia. Después de cultivar durante 4 semanas, las células tendrán un destino neuronal y estarán listas para el tratamiento del lentivirus.

4. transducción y mantenimiento de cultivos neuronales

  1. Para transducir neuronas con lentivirus, utilice un conteo de título de 3,4 x 105 transducibles unidades/célula (un 100% de 10 cm de confluido de plato contendrá ~ 10 millones neuronas). Diluir las unidades transducibles a la concentración necesaria en los medios de cultivo celular y añadirlas a las células (utilizar el volumen normal de los medios para el plato de cultivo celular). Dos días después de añadir el lentivirus, lave las células 1X con medios frescos (-) bFGF (sin lentivirus) y continúe cultivando en (-) medios de bFGF como de costumbre.
  2. Para el tratamiento post-lentiviral, alimente las neuronas transducadas cambiando el medio de cultivo celular ([-] medio de bFGF) cada otro día. Mantener las células durante ~ 8 semanas después de la transducción. Rutinariamente visualizar las células bajo un microscopio de luz para asegurar la viabilidad.
    Nota: La dispersión o las roturas dendríticas son signos de que las células ya no son viables.

5. imágenes de las células

  1. Las imágenes de células vivas
    1. Después de la transducción (4 días después de la adición de lentivirus), observar las señales de YFP bajo un microscopio fluorescente capaz de imágenes de células vivas. Tome los platos de cultivo celular de la incubadora y asegúrese de que los pozos de cultivo permanecen estériles manteniendo la tapa en la parte superior de los platos de cultivo. Visualice las células usando un objetivo de 10x con una longitud de onda de excitación de ~ 514 nm y un filtro de emisión de ~ 527 nm.
      Nota: Los agregados son típicamente visibles en cultivos celulares transducados 6 – 8 días después de la aplicación del lentivirus.
  2. Tinción de células fijas (etiquetado β-Tubulin III y tinción de tioflavina)
    1. Para fijar las células en paraformaldehído (PFA), retire los medios de cultivo de las neuronas transducidas cultivadas en cubreobjetos de vidrio. Lave las células 1X con PBS, extraiga el lavado y añada 300 – 500 μL (si utiliza placas de 24-Well) de 4% de PFA (diluido en PBS) a los cubreobjetos durante 20 minutos a temperatura ambiente. Retire la PFA y lave los cubreobjetos 2x con PBS.
    2. Preparar una solución de bloqueo que consiste en PBS, 3% albúmina sérica bovina (BSA), y 0,3% Triton X-100. Añadir 300 – 500 μL de la solución a los pozos e incubar los cubreobjetos durante 2 h a 4 ° c. Después de 2 h, diluir los anticuerpos primarios (a una concentración de anticuerpos de 1:500) en la solución de bloqueo y añadir 300 – 500 μL de solución de anticuerpos primarios a cada pozo. Coloque la placa en una plataforma oscilante o giratoria (a baja velocidad) durante la noche a 4 ° c.
    3. Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos primarios y lave los cubreobjetos 3x durante 5 min cada uno con PBS. Diluir los anticuerpos secundarios en una solución tampón de bloqueo (con una concentración de 1:1000) y añadir una solución de anticuerpos secundaria a cada pozo. Seleccione el anticuerpo secundario apropiado utilizando una etiqueta fluorescente que no se superponga con la señal YFP (CY-3, por ejemplo). Incubar las células a temperatura ambiente durante 2 h en una plataforma oscilante o giratoria. Después de 2 h, retire la solución de anticuerpos secundarios y lave los cubreobjetos 3x durante 10 min cada uno con PBS.
    4. Lavar los cubreobjetos en agua desionizada doble (DDW) durante 10 min. extraer el DDW y añadir 300 μL/pozo de 0,015% de tioflavina-S diluido en etanol al 50% durante 10 min. Retire la solución de tioflavina y lave las cubiertas 2x por 4 min cada una con un 50% de etanol, seguida de 4 min lavar con etanol al 30% y dos lavados durante 5 min cada uno con un 30% de etanol. Lave los cubreobjetos 1X con DDW antes del montaje.
      Nota: La tinción de tioflavina descrita en el paso 5.2.4 es opcional.
    5. Para montar los cubreobjetos en diapositivas de vidrio, coloque una sola gota de soporte de montaje en el lado "+" de un portaobjetos de vidrio. Retire todo el líquido del pozo que contiene el recubrimiento de vidrio y, utilizando fórceps finos, retire con cuidado el recubrimiento de vidrio, manteniendo un registro de qué lado tiene las células cultivadas.
    6. Presione suavemente el borde de la cubreobjetos contra un Kimwipe para eliminar el exceso de humedad. Aún agarrando el cupado con fórceps finos, toque el borde (con el lado de la célula mirando hacia la gota de soporte de montaje) de la cubreobjetos a los medios de montaje, y luego, Coloque suavemente el cobertillo en el soporte de montaje (colocando las células cultivadas en el montaje medios de comunicación y intercalarlos entre el colador y el tobogán de cristal). Deje que el soporte de montaje se endurezca durante 30 minutos antes de la toma de imágenes. Las diapositivas se pueden almacenar a-20 ° c para su uso futuro.
    7. Imagen de las células utilizando un microscopio fluorescente y los espectros de excitación/emisión apropiados (YFP = ~ 514/527 nm, CY-3 = ~ 555/568 nm, y thioflavin S = ~ 390/426 nm).

6. métodos opcionales

  1. Cada 2 días, recoger los medios acondicionados de las culturas y almacenarlos a-20 ° c para futuros análisis de especies de Tau liberados por las culturas.

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Representative Results

Las neuronas de Tau-RdlM-YFP-transduced se etiquetaron con fluorescencia con YFP, y las culturas RdlM-transduced muestran agregados después de la transducción. Estas inclusiones manchadas positivas para tioflavina (figura 1). Como se muestra en la figura 1 , este protocolo produce cultivos neuronales que muestran agregados de Tau tioflavina positivos. Para los experimentos iniciales, se recomienda que la diferenciación neuronal se confirme mediante la inmunoglobulina del marcador específico de neurona β-tubulina III en cultivos. Es importante destacar que los anticuerpos secundarios con etiquetas fluorescentemente deben tener un espectro de excitación/emisión que no se solapa con el de YPF (Cy3, por ejemplo). Aunque los agregados amarillos fluorescentes tau serán visibles en ausencia de manchas, tioflavina también se debe utilizar para la toma de imágenes con el fin de confirmar que la señal fluorescente es TAU agregada y no desechos celulares. Además, el ejemplo de la figura 1 no incluye la tinción DAPI para etiquetar los núcleos celulares como la excitación/emisión de SOLAPAMIENTOS DAPI con el de thioflavin-S; las manchas de los núcleos alternativos se deben utilizar con thioflavin-S si se desea.

Figure 1
Figura 1: tioflavina tinción de cultivos transducidas. Las neuronas transductadas con el lentivirus tau-RDLM-YFP fueron fijas e inmunolabadas con el marcador específico de la neurona β-tubulina III (rojo). Adicionalmente, los agregados Tau (señal de YFP en verde) fueron manchados para tioflavina (azul). Barras de escala = 25 μm. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo describe la generación de un modelo in vitro de tauopatía humana que exhibe agregados de plata-mancha positiva y ovillos neurofibrilares positivos de tioflavina (NFTs). Además, las células transducadas muestran patologías inducidas por TAU, como defectos morfológicos, reducción de la sinaptogénesis y un aumento del volumen lisosomal. La principal ventaja de este protocolo es que proporciona un modelo accesible y rentable de la tauopatía neuronal, que se puede utilizar para los estudios de detección de fármacos, así como para el análisis de la toxicidad de tau. Este modelo llena una necesidad material en la investigación neurodegenerativa como líneas celulares de la tauopatía humana todavía no están ampliamente disponibles y el uso de Tau transgénico de las neuronas derivadas del ratón requiere la cría de animales y es limitado debido a las diferencias en el neuronal características entre las especies.

Además de los enumerados anteriormente, hay una serie de pasos críticos para el éxito de este procedimiento. En primer lugar, asegúrese de que se utiliza el título viral correcto porque si el título viral es demasiado bajo, las culturas no formarán agregados. En segundo lugar, asegúrese de que los cultivos de la NSC se mantengan adecuadamente y no excedan la confluencia de ~ 80%. El crecimiento excesivo de los NSCs causará una diferenciación prematura. Por último, espere un total de 4 semanas para que las culturas neuronales se diferencien después de retirar los medios bFGF de los NSCs. Esta duración es necesaria para asegurar la maduración de las neuronas.

Aunque el procedimiento descrito anteriormente es un método eficaz para producir un modelo de tauopatía in vitro, existen algunas limitaciones asociadas con este protocolo. En primer lugar, como se describió anteriormente, este método produce NFTs en las neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducida por humanos pero no en las neuronas embrionarias de rata (E18)-derivadas. Incluso después de usar tres veces más virus para transducir las neuronas de rata que las que se utilizaron para las neuronas humanas, los cultivos de células de roedores seguían siendo negativos para la tinción de tioflavina, lo que sugiere que este método no se puede adaptar a cultivos de roedores. Las diferencias entre las células de ratón transducidas y las neuronas humanas pueden deberse a la mayor propensión de Tau humano hacia la agregación13. La segunda limitación de este procedimiento es que, aunque los agregados de Tau se forman en culturas, los cambios en la fosforilación de Tau entre las células transtransducadas de Tau-RDLM y las culturas de Tau-WT-YFP-transduced fueron indetectables usando proteína PHF-1 (que detecta Tau fosforilados en ser 396/ser 404) y anticuerpos CP13 (que detectan tau fosforilado en ser 202). Estos hallazgos sugieren que la agregación de tau en cultivos tau-RDLM-YFP debido a P301L y V337M implica un mecanismo que es independiente de la hiperfosforilación, o el nivel de fosforilación de Tau endógeno está bajo el nivel detectable por inmunoblot. Debido a la falta de diferencias en la inmunoreactividad de PHF-1 y CP13 entre las culturas tau-RDLM-YFP y tau-WT-YFP, no está claro si este modelo sería útil para estudios que analizan los efectos de la actividad de Tau quinasa/fosfatasa en patología. Sin embargo, ambos anticuerpos PHF-1 y CP13 reconocen las regiones fuera del dominio de repetición que albergan las mutaciones; por lo tanto, los anticuerpos adicionales que se plantean contra varios sitios de fosforilación de Tau pueden ser útiles para futuros estudios.

Además de los ensayos de cultivo celular, este modelo puede ser una herramienta valiosa para estudios más allá del paradigma de cultivo celular. Por ejemplo, los exosomas aislados de los medios de las células transducadas contienen especies tóxicas de tau. Los exosomas son pequeñas vesículas secretarias que se liberan de casi todos los tipos de células, y los exosomas se han implicado en la propagación de Tau14. Los exosomas neuronales tau-RDLM contienen tau humano que es detectable por Western Blot9, y estos exosomas son suficientes para producir inclusiones de tau en el cerebro de ratón ingenuo. Estas inclusiones son inmunoreactivas para anticuerpos específicos para tau humano (K9JA), pero no está claro si las inclusiones incluyen Tau de ratón agregado. La constatación descrita aquí que el procedimiento no produce los agregados de tinción tioflavina positiva en las neuronas de roedores sugiere que las inclusiones observadas en el cerebro del ratón están compuestas enteramente de Tau humano, aunque se requieren estudios futuros para confirmar la composición de los depósitos in vivo.

Dado el papel aparente de Tau derivado de exosomas en Tauopatías, el modelo descrito aquí puede ser un recurso útil para examinar el papel del exosomas en la mediación de la neurodegeneración inducida por tau. En conclusión, este procedimiento produce un modelo in vitro de tauopatía humana que tiene ventajas significativas sobre los sistemas neuronales de ratón transgénicos y puede emplearse para una variedad de análisis preclínicos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores le agradecen al Dr. Peter Davies en el Albert Einstein College of Medicine por suministrar anticuerpos PHF-1 y CP13 y al Dr. Marc Diamond en la Universidad de Texas, Southwestern, por proveer las construcciones tau. Este trabajo fue apoyado por becas de la Asociación de Alzheimer (NIRG-14-322164) a S.H.Y. y del Instituto de Medicina Regenerativa de California (TB1-01193) a P.R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm culture dishes Thermofisher 12556002
15 mL tubes Biopioneer CNT-15
16% paraformaldehyde Thermofisher 50-980-487
24 well culture plates Thermofisher 930186
50 mL tubes Biopioneer CNT-50
70% ethanol in spray bottle Various sources NA
B27 supplement Thermofisher 17504044
Basement membrane matrix (Matrigel) Corning 356231
Basic FGF Biopioneer HRP-0011
Bovine serum albumin Sigma A7906
Cell culture incubator Various sources NA
Centrifuge Various sources NA
DMEM-F12 culture media with glutamine Thermofisher 10565042
Ethanol (50% concentration or higher) Various sources NA
Flourescently labeled secondary antibodies Various Sources, experiment dependent NA
Fluorescent microscope Various sources NA
Glass coverslips Thermofisher 1254581
Glass slides Thermofisher 12-550-15
Human neural stem cells Various sources NA
Lentiviral vectors Various sources custom order
Mounting media Thermofisher P36934
N2 supplement Thermofisher 17502048
Penicillin-Streptomycin Thermofisher 15140122
Phosphate buffered saline Thermofisher 14190250
Primary antibodies Various Sources, experiment dependent NA
Rocking or rotating platform Various sources NA
Sterile cell culture hood Various sources NA
Thioflavin S Sigma T1892-25G
Triton X-100 Thermofisher BP151-100
Water bath Various sources NA

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References

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