תבנית-המופעל חמצוני ושתיל עיכוב הצמיחה שתילה Assays באריידרופסיס thaliana

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

נייר זה מתאר שתי שיטות לכמת את התגובות ההגנה באריידאופזיס thaliana בעקבות החשיפה elicitors החיסונית: פרץ חמצוני חולף, ואת עיכוב צמיחת שתיל.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., Monaghan, J. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147), e59437, doi:10.3791/59437 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

צמחים התפתחו מערכת חיסונית חזקה לתפוס פתוגנים ולהגן מפני מחלה. נייר זה מתאר שתי מטרות שניתן להשתמש בהן כדי למדוד את כוחה של הפעלה חיסונית באריידאופזיס thaliana בעקבות הטיפול עם מולקולות מעורר. מוצג הראשון הוא שיטה ללכידת התפרצות חמצוני במהירות ודינמית, אשר ניתן לפקח באמצעות שיטת הלומירול מבוסס. השני הוא שיטה המתארת כיצד למדוד החיסונית המושרה עיכוב של צמיחת שתיל. פרוטוקולים אלה הם מהירים ואמינים, אינם דורשים הכשרה או ציוד מיוחדים, והם משמשים רבות כדי להבין את הבסיס הגנטי של חסינות הצמח.

Introduction

כדי לתפוס ולהגן מפני פתוגנים, הצמחים התפתחו ממברנה מאוגד הזיהוי דפוסים קולטנים (PRRs) המאתרות מולקולות מיקרוביאלית שימור מחוץ לתא המכונה תבניות מולקולריות הקשורות חיידק (MAMPs)1. הכריכה של mamps כדי קנצוני שלהם prrs יוזם חלבון קינאז-בתיווך איתות החיסונית וכתוצאה מכך עמידות מחלת ספקטרום רחב2. אחת התשובות המוקדם ביותר בעקבות הפעלת PRR הוא זרחון והפעלה של ממברנה בלתי נפרד פלזמה פרץ הומואוקסידאז log (RBOH) חלבונים אשר מזרז את הייצור של מינים חמצן תגובתי לחילוץ (ROS)3 , 4. ROS לשחק תפקיד חשוב בהקמת התנגדות למחלות, משחק הן כמו שליחים משניים להפיץ איתות החיסונית, כמו גם סוכנים מיקרוביאלית ישיר5. התצפית הראשונה של פרץ חמצוני מחוסן מפני החיסון המתואר באמצעות פקעות תפוחי אדמה של קורות חיים. רישירי אחרי Phytophthora ... הפקה ROS כבר הוערך מינים צמחים מספר שימוש בדיסקי העלה7, הבולם התרבויות התאים8, ו protoplasts6. המתואר כאן היא שיטה פשוטה עבור הפקת דפוס-הפקה של רוס מופעל דיסקים של העלים של arabidopsis thaliana (arabidopsis).

כתגובה לתפיסה mamp, מופעל חלבונים rboh לזרז את הייצור של רדיקלים סופראוקסיד (O2-), רדיקלים הידרוקסיל (• או), ו סינגתן חמצן (1o2) המומרים חמצן מימן (H2o 2) בחלל החילוץ9. H2O2 ניתן לכמת על-ידי הלומירול מבוססי כימובסנס בנוכחות של הסוכן האוקסיגון חזרת peroxidase (hrp)10. HRP מחמצן2o2 יצירת יון הידרוקסיד (הו-או) וגז חמצן (O2) אשר מגיבים עם הלומירול כדי לייצר ביניים לא יציבה המשחרר פוטון של אור10. פליטת פוטון ניתן לכמת כיחידות אור יחסית (rlus) באמצעות קורא מיקרופלייט או צמידה מסוגל לזהות לומינסנציה, אשר הפכו להיות חלקים סטנדרטיים של ציוד במעבדות המולקולרית ביותר. על ידי מדידת האור המיוצר על פני מרווח 40-60 דקות, פרץ חמצוני חולף ניתן לזהות כבר מוקדם ככל 2-5 דקות לאחר הטיפול הפקה, לשיא ב 10-20 דקות, וחזרה לרמות בסיס אחרי ~ 60 דקות11. האור המצטבר שהופק במהלך הזמן הזה יכול לשמש כמדד של כוח החיסון המתאים להפעלת חלבונים RBOH12. באופן נוח, שיטת הפעולה אינה דורשת ציוד מיוחד או הכנה לדוגמה מסורבלת.

לשיא זמן קצר לאחר זיהוי MAMP, פרץ חמצוני נחשב תגובה חיסונית מוקדמת, יחד עם הפעלה MAMP וייצור אתילן5. מאוחר יותר תגובות החיסון כוללות תכנות משנה, הסגר שיניים, ולהוריד את התצהיר2,5. חשיפה ממושכת למחברי הפרלמנט מפעילה באופן שוטף את האיתות החיסוני אנרגטית-יקר הנובע מעיכוב צמיחת הצמח, הרומז על סחר בין פיתוח לחסינות13. תבנית-המופעל שתיל הצמיחה עיכוב (sgi) משמש רבות כדי להעריך את הפלט החיסונית ב arabidopsis והיה אינטגרלי לזיהוי של מספר רכיבים מרכזיים של איתות החיסון כולל prrs14,15 ,בן 16 לכן, הנייר הזה בנוסף מציג את התשובה עבור מדגם מופעל SGI ב Arabidopsis, לפיו שתילים גדלים בצלחות רב-היטב המכילים מדיה רגילה או מדיה בתוספת מעורר החיסון עבור 8-12 ימים ולאחר מכן שקלת תוך שימוש בקנה מידה אנליטי.

כדי להדגים כיצד ROS ו sgi בחני ניתן להשתמש כדי לפקח על prr בתיווך איתות, שלושה גנוטיפים המייצגים פלטי החיסונית משתנים נבחרו: (1) סוג פראי arabidopsis ההצטרפות קולומביה (Col-0), (2) הדומיננטי-שלילי bak1-5 מוטציה שבה רב תפקודי prr שיתוף קולטן brassinosteroid 1-הקשורים קינאז 1 (BAK1) הוא שאינו פונקציונלי איתות החיסונית17,18, ו (3) המוטציה cpk28-1 , אשר חסרה את ה קינאז חלבון משועבד לחלבונים בחלבון (CPK28) ומציג תגובות מוגברת למערכת החיסונית19,20. ROS ו sgi בחני מוצגים בתגובה מלאכותית המיוצר elf18 פפטיד אפירופה של התארכות בקטריאלי פקטור Tu (EF-tu), מזוהה arabidopsis על ידי הקולטן prr EF-tu (efr)15. פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש עם elicitors החיסונית אחרים כגון כותל חלבון בקטריאלי לתנועתיות14 או אנדוגני הצמח מקבל חלבונים (atpeps)16, עם זאת, יש לציין כי תגובתיות הצמח שונה בהתאם ל . מעורר21 יחד, ROS ו sgi בחני יכול לשמש הערכה מהירה וכמותית של תגובות prr מוקדם ומאוחר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. זיהוי פרץ של רוס בדיסקי העלה Arabidopsis בעקבות ההעצמה החיסונית

  1. גידול ואחזקה של צמחים.
    1. כדי לסנכרן את הנביטה , הזרעים האראבאכופזיס באמצעות השעיית כ 50 זרעים ב 1 מ ל סטרילי 0.1% אגר [w/v] ולאחסן ב 4 ° צ' (ללא אור) עבור 3-4 ימים.
      הערה: Stratify שליטה ברקע סוג פראי (לדוגמה, Col-0) ו-גנוטיפים עם פלטי המערכת החיסונית גבוהה ונמוכה (לדוגמה, cpk28-1 ו -bak1-5, בהתאמה) כדי לשמש כפקדים פנימיים.
    2. לזרוע זרעים על הקרקע ולנבוט בתנאים הסטנדרטיים של יום קצר (22 ° c, 10 h אור, 150 mE/m2/s האור בעוצמה, ו 65-70% לחות יחסית).
    3. לאחר כ 7 ימים, השתמש מלקחיים להשתלות שתילים בודדים לסירים חדשים, מופרדים על ידי לפחות 4 ס מ כדי לאפשר פיתוח שושנת מלא. השתלת 6-12 שתילים לכל גנוטיפ וחזרה לתנאים הסטנדרטיים של היום הקצר. המים באופן קבוע צמחים להפרות (1 g/L של 20-20-20 דשן כל 2 שבועות).
  2. לאסוף דיסקי עלים ב 96-היטב צלחות עבור התאוששות לילה.
    1. ב 4-5 שבועות לאחר נביטה (איור 1A), להשתמש חדה 4 מ"מ ביופסיה באגרוף להסרת דיסק עלה אחד לכל צמח, הימנעות באמצע וריד ולהיות זהיר כדי להגביל את הפצע (איור 1a). מניחים דיסקים עלים בצלחת 96-ולומילומטר הכולל 100 μL של ddH2O עם הצד השני פונה כלפי מעלה כדי למנוע התייבשות22 (איור 1c). אם הערכת elicitors מרובים, להסיר את התקליטור 1 עלה מאותו עלה עבור כל טיפול באמצעות.
      הערה: עלים לדוגמה המורחבים לחלוטין, שלישי עד חמישי מראש הוורשה, ובערך בגודל ובגיל זהה להגבלת השונות. במידת האפשר, גזור דיסקי עלים במחצית באמצעות להב גילוח לפני התאוששות לילה, כמו זה מגדיל את פני השטח חשוף לקבלת פתרון23.
    2. לשחזר את הלילה בטמפרטורת החדר כדי למנוע את ההפרעה של ROS המיוצר על ידי פצועים במהלך אוסף דיסק עלה. לכסות את הצלחות עם מכסה כדי למנוע אידוי.
  3. בצע את הטיפול הפקת ולמדוד הייצור של ROS.
    1. התוכנית הקורא לוחית לפני הוספת פתרון התגובה, כמו זה יהיה להקטין את הזמן בין התפרצות הפריצה של רוס ואת המידות הראשונות שנרשמו. השתמש בתוכנה מסחרית המתאימה לקורא הצלחות. במקרה שלנו ( עיין בתוכן העניינים), לחץ על הגדרות ובחר את מחסנית LUM96 ואת סוג הקריאה הקינטית. לחץ על הקטגוריה ' קרא אזור ' וגרור כדי לבחור קבוצת משנה של בארות או את כל הלוח שייקרא. תחת הכרטיסייה PMT ו-אופטיקה , הגדר את זמן השילוב ל-1,000 Ms. תחת הכרטיסיה תזמון , הגדר את הזמן הקצוב הכולל ל-40-60 דקות ואת המרווח ל-2 דקות.
    2. מסירים מים מכל הבאר בעזרת פיפטה רב-ערוצית.
      הערה: אין לנקב דיסקים עלה, כי זה עלול לגרום ללחץ פצועים ולגרום ליותר משתנה ROS התפוקות.
    3. להכין פתרון התגובה המכילה 100 μM לומייול, 10 μg/mL HRP, ואת הריכוז הרצוי של מעורר (למשל: elf18 ב 1 ננומטר, 10 ננומטר, 100 nM, או 1,000 nM) ב-מעוקר ddH2O באמצעות 10 מ"ל של פתרון עבור 1 96-באר צלחת.
      הערה: התמוססות הפפטידים בצינורות בכריכה נמוכה2O בצינוריות מחייב לעשות מלאי של 10 מ"מ, הקפאת הבזק בנוזל N2, ואחסן ב-80 ° c. כאשר מוכן לשימוש, לדלל את המניות בבית השני סטרילי2O כדי ליצור 100 μm עבודה מלאי וחנות ב-20 ° c.
    4. השתמש בצינורות מרובי ערוצים כדי לוותר על 100 μL של תערובת התגובה לכל טוב, הוספת הפתרון לכל הדיסקים עלים של אותו טיפול באותו זמן22. כלול תגובת שליטה (לא מעורר) עבור כל גנוטיפ כדי להעריך את רמות ה-ROS הבזליים בהעדר מעורר. מיד למדוד את פליטת האור עבור כל אורכי גל בספקטרום גלוי באמצעות קורא מיקרופלייט.
      הערה: הכינו והחילו את פתרון התגובה תחת אור נמוך, כמו הלומירול ו-HRP הם ריאגנטים רגיש לאור. המשיכו לעקוב אחרי הקרח או ב-20 ° c, אלא אם כן בשימוש.
    5. מדידת פליטת האור עם 1,000 ms זמן האינטגרציה ב 2 דקות מרווחי מעל התקופה 40-60 דקות בקורא מיקרופלייט כדי ללכוד את פרץ חמצוני דינאמי (איור 1D).
      הערה: השתמש בזמן שילוב ארוך יותר כדי לשפר את רגישות התיקון11, תוך הקפדה על כל הדגימות בצלחת 96-באר ניתן למדוד בתוך מרווח אחד.
  4. . פרשנות נתונים
    1. עבור כל גנוטיפ, השתמש ביישום גיליון אלקטרוני כדי לחשב את ספירת הפוטון הממוצעת ואת השגיאה הסטנדרטית בכל נקודת זמן, ולהציג את הייצור של ROS כפונקציה של זמן באמצעות מזימת פיזור.
      Equation 1
      כאשר t = בכל פעם שאתה מצביע
    2. לחילופין, לסכם את ספירות פוטון עבור כל דיסק עלה ולהציג את הממוצע של ערכים אלה עבור כל גנוטיפ באמצעות גרף בר עם קווי שגיאה סטנדרטיים או תיבת והחלקה העלילה.
      Equation 2

2. שתיל שיטת עיכוב הצמיחה

  1. מעקר זרעים ומחזיר על לוחות מורראשיג ו Skoog (MS).
    1. הכן סטרילי חצי כוח (0.5 x) MS בינונית (2.16 g/L) המכיל 0.8% אגר [w/v]. שופכים מדיה ללוחות (90 x 15 מ"מ) במכסה זרימה למינארי.
    2. לחטא כ 100 זרעים בצינור מיקרוצנטריפוגה על ידי כביסה עם 1 מ ל של 70% אתנול עבור 2 דקות ולהסיר על ידי השאיפה. הוסף 1 מ ל של 40% אקונומיקה ו רוק בעדינות עבור 17 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר אקונומיקה על ידי שאיפה ולשטוף שלוש פעמים 1 מ ל של מים סטריליים עבור 5 דקות. השהה מחדש 1 מ ל של סטרילי 0.1% אגר.
      הערה: לחלופין, השתמש בפרוטוקול העיקור בזרעי הגז כלור24.
    3. מחזירה כ-100 זרעים לכל גנוטיפ על לוחות MS אגר באמצעות פיפטה וחותם עם סרט מיקרונקבובית במכסה של זרם למינארי.
      הערה: הימנע הצבת זרעים בקרבת זה יהיה להפוך שתילים השתילים קשה מאוחר יותר.
    4. הזרעים stratify על ידי הצבת צלחות ב 4 ° צ' (אין אור) עבור 3-4 ימים כדי לסנכרן נביטה (איור 2A).
  2. השתלת שתילים לתוך 48-לוחיות הרישוי המכילות את הנוגדנים החיסונית.
    1. לאחר ריבוד, להעביר לוחות לאור בתנאי יום קצר (22 ° צ', 10 h אור, 150 mE/m2/s בעוצמת האור, ו 65-70% לחות יחסית) עבור 3-4 ימים כדי לאפשר נביטה.
    2. במכסה של זרם למינארי, הכינו מדים פפטיד (0 ננומטר, 1 ננומטר, 10 ננומטר, 100 nM, 1,000 nM) במדיה סטרילית של 0.5 x MS המכיל 1% סוכרוז [w/v], באמצעות 25 מ ל של MS עבור כל הצלחת 48-באר. להכין צלחות על ידי pipetting 500 μL של MS בינונית נוזלית או MS בינונית המכילה פפטידים לכל טוב. אם הוא זמין, השתמש בצינורות חוזרים להכנת הצלחות כדי לזרז את התהליך.
      הערה: עבור כל גנוטיפ, לגדל שתילים ב-MS ללא הגיוני לחשבון עבור כל הבדלים הטבועות בצמיחה נבט.
    3. שימוש מלקחיים סטרילי השתלת בזהירות אחד שתיל לכל טוב של אותו גודל וגיל, להבטיח כי אין נזק שתיל או שבירה לשורש וכי השורש הוא השקוע במדיה. עבור כל גנוטיפ, השתלה מינימום של 6-8 שתילים לתוך כל דילול פפטיד (איור 2B).
      הערה: שתילי להשתלות 4 ימים לאחר נביטה, כמו שורשים קצרים קל יותר לתמרן, ושתילים ישנים עשויים להניב תוצאות מיטביות פחות.
    4. איטום צלחות עם סרט מיקרונקבוביות ולחזור לאור בתנאים סטנדרטיים של יום קצר (22 ° c, 10 h אור, 150 mE/m2/s בעוצמת האור, ו 65-70% לחות יחסית). אפשר לשתילים לצמוח במשך 8-12 ימים.
  3. קביעת אחוז עיכוב בגדילה.
    1. בזהירות להסיר שתילים מ 48-צלחות טוב ויבש על ידי מגבת נייר. שוקלים שתילים בקנה מידה אנליטי ומתעדים ערכים. אם הוא זמין, השתמש בקנה מידה אנליטי המצויד בפלט USB כדי להקליט ערכי משקל טריים בגיליון אלקטרוני. לפני שתלי שקילה, לצלם תמונה כדי להציג חזותית עיכוב גדילה (איור 2C).
    2. קביעת אחוז הגידול בעיכוב של שתילים מטופלים שטופלו לעומת שתילים גדל MS בלבד (איור 2D) כדלקמן:
      Equation 3
    3. התווה נתונים באמצעות גרף עמודות עם קווי שגיאה סטנדרטיים או שימוש בתיבה והחלקת מזימה כדי להציג בצורה טובה יותר את השונות הבין-ניסויית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מוטציה cpk28-119,25 ו bak1-517,18 צמחים שימשו כדי להפגין תוצאות צפויות עבור גנוטיפים עם תגובות החיסון גבוה ונמוך, בהתאמה, בפרץ חמצוני ו sgi בחני יחסית לבקרת רקע פראי (Col-0). כדי להעריך אפקטים תלויי-מינון, השתמשו בסדרת דילול פפטיד בעלת 10 מקפלים (1-1000 ננומטר) של elf18. כצפוי, cpk28-1 שורות הפונקציה היה מצטבר גבוה יותר (איור 3a) ו ממוצע (איור 3a) פרץ רוס לעומת Col-0, ואילו bak1-5 הציג הפקה של רוס מופחת בריכוזים בין 10 ננומטר ו 1,000 nM (איור 3). הבדלים צפויים ב SGI יכול להיות מבחינים בין כל גנוסוגים גדל ב 100 nM ו 1,000 nM elf18 (איור 4A), אשר יכול גם להיות מצופה באופן חזותי ב 1,000 ננומטר elf18 הטיפול (איור 4a). מאפיין של איתות החיסונית גבוהה, cpk28-1 המוטנטים היו קטנים במידה ניכרת יותר Col-0 כאשר גדל ב 1,000 ננומטר elf18, בעוד bak1-5 מוטציות הציגו עיכוב גדילה חלש יחסית אל Col-0 עקב שיבש זיהוי mamp.

Figure 1
איור 1. לומינול מבוססי פרץ חמצוני המערכת בעקבות אינדוקציה חיסונית בערידרופזיס. (א) לגדול צמחים על הקרקע בתנאי יום קצר עבור 4-5 שבועות. (ב) השתמש באגרוף ביופסיה 4 מ"מ כדי לאסוף דיסקי עלים מכל צמח ולשחזר את הלילה ב ddH2O. (ג) להוסיף פתרון תגובה (100 μm לומייול, 10 μg/ML hrp, ואת הריכוז הרצוי של המוני) ולמדוד פליטת אור מעל 40-60 דקות, ב 2 דקות מרווחי עם זמן שילוב של 1,000 ms. (D) לקבוע ספירות פוטון ממוצע עבור כל גנוטיפ יחסית ל-Col-0 (המוצג בירוק), פקד רוס גבוה כגון cpk28-1 (מוצג בסגול), ופקד רוס נמוך כגון bak1-5 (המוצג בכתום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. התוצאה-המושרה שתיל הנגרמת שיטת העיכוב בערידרופזיס. (א) לזרוע שתילים ב-MS אגר ולצמוח במשך 3-4 ימים בתנאים סטנדרטיים יום קצר. (ב) שתילים להשתלות 48-צלחות המכילות MS בינונית או MS המכיל ריכוזים שונים של elf18. (ג) לאחר 8-12 ימים, ויזואלית להעריך את גודל שתיל ולאחר מכן למדוד משקל טרי באמצעות סולם אנליטי כדי לקבוע אחוז עיכוב הגדילה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
. איור 3 Elf18 מייצגת את פרץ החמצוני בשלושה מבני הגנוסים. צמחים בני ארבעה שבועות טופלו עם סדרת דילול של elf18 (0 ננומטר "ללעוג", 1 ננומטר, 10 ננומטר, 100 nM, ו 1,000 nM). Col-0 מייצג את בקרת הרקע הפראי, עם cpk28-1 ו -bak1-5 המייצגים פנוטיפים של רוס גבוה ונמוך, בהתאמה. (A) סה כ הפוטונים המיוצגים כיחידות אור יחסית בעקבות טיפול elf18 (n= 6 תקליטורי עלים מצמחים עצמאיים). הבדלים סטטיסטיים מיוצגים על ידי מכתבים באותיות קטנות וחושבו באמצעות ANOVA חד כיוון עם מבחן ההבדל הכנה של Tukey לאחר-הוק (p< 0.05). (ב) ספירת פוטון ממוצעת, המיוצגת כיחידות אור יחסית, לאורך 40 דקות לאחר טיפול elf18 (n= 6 דיסקי עלים מצמחים עצמאיים). קווי שגיאה מייצגים שגיאה סטנדרטית של הממוצע. תוצאות דומות התקבלו בשני מתוך שלושה ניסויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. נציג elf18 המושרה שתיל עיכוב הצמיחה שלוש באראאידיזיס גנוטיפים. פראי סוג (Col-0), cpk28-1, ו bak1-5 שתילים גדלו בסדרת דילול 10-קיפול (0-1000 ננומטר) של elf18. (A) אחוז עיכוב הצמיחה היה מחושב על ידי השוואת המשקל של שתילים בודדים גדל ב elf18 (n= 6 שתילים בודדים) למשקל הממוצע של שתילים של גנוטיפ אותו גדל ב-MS בלבד (' ללעוג ') (n= 6 שתילים בודדים) במשך 10 ימים. הבדלים סטטיסטיים מיוצגים על ידי מכתבים באותיות קטנות וחושבו באמצעות ANOVA חד כיוון עם מבחן הבדלים משמעותיים הכנה של Tukey לאחר-הוק (p< 0.05). (ב) הפגנה חזותית של SGI בשני שתילים נציג של Col-0, cpk28-1, ו bak1-5 בתגובה הגדלת ריכוזים של elf18. תוצאות דומות התקבלו בשלושה מתוך ארבעה ניסויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

נייר זה מתאר שתי שיטות לגבי התגובה החיסונית המופעל דפוס ב Arabidopsis, המציע גישות כמותיים להערכת התפוקה החיסונית ללא שימוש בציוד מיוחד. בשילוב, מופעלת תבנית ROS ו SGI ניתן להשתמש כדי להעריך את התגובות מוקדם ומאוחר לתפיסת חיידק, בהתאמה.

המגבלה העיקרית של שיטת פרץ חמצוני היא שינויים. מסיבות שאינן מובנות לחלוטין, RLUs מוחלטים לעתים קרובות שונים על ידי סדר גודל בין ניסויים. מכיוון שבין ההבדלים בניסוי הוא גבוה, מומלץ לכלול פקדי התייחסות פנימיים עם high (למשל, cpk28-1) נמוך (למשל, bak1-5) התפרצויות חמצוני בנוסף לשליטה מסוג פראי (למשל, Col-0). עם זאת, ניתן לנקוט באמצעים להגברת התוכסות בין ניסויים. תנאים סביבתיים כגון טמפרטורה, לחות, photoperiod, ואת עוצמת האור צריך להיות זהה בין משכפל. הגיל והבריאות של הצמחים צריך להיחשב גם בעת הדגימה. תקליטורי עלים ניתן לאסוף מצמחים כי הם בין 4 ו -7 שבועות של גיל גדל תחת תנאי יום קצר (6-10 שעות של אור). Anecdotally, התוצאות העקביות ביותר נמצאו עם צמחים מבוגרים יותר 6 שבועות לאחר נביטה אבל עדיין לא פורח או senescing. חשוב לגדל צמחים בתאי איכות הסביבה נקי כך שהם לא חשופים מזיקים החממה המשותפת כגון טחב אבקתי או חרקים לעיסה. מאז שתילים של SGI גדלים במדיית MS סטרילית, ובמשך זמן קצר יותר, תנודות סביבתיות הן בעיקר לא דאגה. עם זאת, וריאציה יכולה להתרחש אם השתילים להיפגע בעת הזריעה, אם השתילים שנבחרו עבור הטיפולים מעורר בגדלים שונים, או אם מדיית הצמיחה הופך מזוהם. מומלץ לכלול את ה-גנוטיפים הפנימיים של בקרת ההפניות המתוארים לעיל גם בניסויי SGI.

ריכוז של השטור הוא שיקול חשוב נוסף בעת ביצוע החיסון החיסוני. Elicitors נתפסים על ידי PRRs וכתוצאה מכך פרץ רוס מהירה וחזקה השיא 10-20 דקות לאחר הטיפול באמצעות (איור 2B). עם זאת, הסדר הגודל של הפרץ תלוי בשני הצדדים וגם בגנוטיפ של הצמח. לכן, מומלץ למצוא סדרת מינון מעוררת, כפי שהוצגה באיור 3 ובאיור 4, כדי לזהות ריכוז מתאים של האדם. לתבנית-מופעלות הדגם יכול גם להיות מפותח על ידי הפעלת דיסקי העלים עם חיידקים חיים23,26 או מיקרוביאלית תמציות26,27,28. לדוגמה, התפרצויות של מינון ארעי ותלוי במינון ניתן לזהות ב Arabidopsis בתגובה לפתופלמות מרופמות של פסאודומונס syringae, לשיא ב 35-40 דקות ולהגיע רמות בסיס כ 70 דקות לאחר התוצאה מיכל בן 23 , 29. בתגובה avirulent חיידקים29 או הפתוגן פטרייתי P.המחלה30,31, הצטברות נוספת בולטת יותר של רוס מופק כי ניתן לפקח 6-10 שעות לאחר חיסון. עבור elicitors חלשה יותר, כגון כלגון פטריות32 או chitosan33, מחוונים רגישים יותר זורח יכול לשמש, כגון נגזרות הלומירול L-012, עם זאת, את אות הרקע המיוצר הוא לעתים קרובות יותר32, 34. החשוב ביותר, אקוטיפ הצמח יהיה גם להכתיב את התגובתיות שלה ספציפי elicitors35,36. לדוגמה, בעוד שהחיידק החיידקי מסוגל לעורר תגובות החיסון במספר מסוגים Arabidopsis כולל Col-0, Wassilewskija (Ws-0) האקולוגי מבטא גרסה שאינה תפקודית של prr מסוג FLAGELLIN-חישה 2 (FLS2) והוא לכן חסר רגישות לפלגסטב14,37.

החיסון מושרה החיסונית יכול להיות גם נצפה בדיסקי העלה של צמחים dicotyledonous אחרים כולל כרובמ38, עגבניות39, טבק benthamiana22,40,41, ו עוד כמה מינים של סולאנאאוס41. נוסף מבוססי הלומירול מבוסס מערכת האיתור של רוס פותחו עבור צמחים באמצעות תמציות רקמות10, הבולם התרבויות של התא8,42, ו protoplasts43, והם שימושיים במיוחד במערכות שבו פרוטוקולי דיסק עלה אינם יעילים42. לדוגמה, מבזקי התפרצויות של ROS המושרה כבר תוארו באמצעות תרביות ההשעיה של התאים ב אורז42,44 וחיטה45,46, כמו גם את הזרע אראוקריה שונות 47 האזוב Physcomitrella patens48. SGI לא נעשה שימוש נרחב כדי למדוד איתות החיסונית. עם זאת, עיכוב גדילה בתגובה elicitors הוכחו ב -N. benthamiana41 ו -B. napus38,49. עיכוב הצמיחה המהירה הוכח גם ב P. patens בתגובה כפות פטרייתי המתרחשים בתוך 2 דקות של חשיפה, אשר ניתן להבחין באמצעות צילום זמן צניחה48.

עם שינוי, הן SGI ו התפרצות חמצונית שיכול לשמש עבור מסכי תפוקה גבוהה כדי לזהות הרגולטורים החיסונית. לדוגמה, אוכלוסיות מוטאנטים של arabidopsis ניתן לגדל על MS בינוני מוצף elicitors כדי לזהות מוטציות לא רגישות15,50,51,52,53. לחילופין, אוכלוסיות מוטניקות ניתן להעריך עבור מעורר המופעל, אשר בוצע בהצלחה עם שני העלים-דיסקים54 ושתילים שלמים גדלו על MS צלחות19. שיטת הקרנה שימושית נוספת היא הביטוי החולף של חלבונים ב -N. benthamiana עבור ניתוח ROS לפני הפיתוח של שורות היתר ביטוי הטרנסגניים22,40,55. עם זאת, וריאציה פנים-ניסויית גבוהה יותר מאשר בקווי הבאראפזיס היציבים בשל ביטוי חלבון משלים ב -N. benthamiana עוזב22, למרות זאת ניתן להתייחס באופן חלקי על ידי חדירה התייחסות שולטת על אותו עלה כמו דגימות ניסוי.

לסיכום, החיסונית המושרה פרץ חמצוני sgi בחני הם שיטות מהיר ואמין להערכת prr-תיווך איתות ב arabidopsis. שיטות אלה ניתן להרחיב למערכות אחרות בשימוש עבור מסכי בקנה מידה גדול כדי לחשוף הרגולטורים החיסונית הרומן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא.

Acknowledgments

העבודה במעבדה שלנו ממומנת באמצעות המועצה הטבעית של משאבי מחקר והנדסה של קנדה (NSERC) תוכנית דיסקברי, הקרן הקנדית לחדשנות ג'ון R. אוונס קרן מנהיג, ואוניברסיטת המלכה. KS והוא נתמך על ידי מלגות דו-מושביים אונטריו ובוגר NSERC קנדה מלגות לסטודנטים של מאסטר (CGS-M).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20-20-20 Fertilizer Plant Prod 10529 Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.
4 mm Biopsy Punch Medical Mart 232-33-34-P A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.
48-Well Sterile Plates with Lid Sigma-Aldrich CLS3548
Analytical Scale with Draft Sheid VWR VWR-225AC Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) Sartorius 725240 Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab cp7211 Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich P6782 Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.
Luminol Sigma-Aldrich A8511 Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.
Murisage and Skoog Basal Salts Cedarlane Labs MSP09-100LT Store at 4C.
Soil SunGrow Horticulture Sunshine Mix #1 Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module Molecular Devices Must request a quote Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG Store at room temperature.
White Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-589

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
  2. Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Perception of Microbe-Associated Molecular Patterns and Danger Signals by Pattern-Recognition Receptors. Annual Review of Plant Biology. 60, 379-406 (2009).
  3. Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 56, (8), 1472-1480 (2012).
  4. Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD during Plant Immunity. Plant and Cell Physiology. 56, (8), 1472-1480 (2015).
  5. Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
  6. Doke, N. Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissues to infection with an incompatible race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Physiological Plant Pathology. 23, (3), 345-357 (1983).
  7. Bindschedler, L. V., et al. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance. The Plant Journal. 47, (6), 851-863 (2006).
  8. Keppler, L. D. Active Oxygen Production During a Bacteria-Induced Hypersensitive Reaction in Tobacco Suspension Cells. Phytopathology. 110, (3), 759-763 (1989).
  9. Wrzaczek, M., Brosché, M., Kangasjärvi, J. ROS signaling loops - production, perception, regulation. Current Opinion in Plant Biology. 16, (5), 575-582 (2013).
  10. Warm, E., Laties, G. G. Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Phytochemistry. 21, (4), 827-831 (1982).
  11. Trujillo, M. Analysis of the lmmunity-Related Oxidative Bursts by a Luminol-Based Assay. Methods in Molecular Biology. 1398, 323-329 (2016).
  12. Nühse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M. E., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. The Plant Journal. 51, (5), 931-940 (2007).
  13. Belkhadir, Y., Yang, L., Hetzel, J., Dangl, J. L., Chory, J. The growth-defense pivot: Crisis management in plants mediated by LRR-RK surface receptors. Trends in Biochemical Sciences. 39, (10), 447-456 (2014).
  14. Gómez-Gómez, L., Felix, G., Boller, T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 18, (3), 277-284 (1999).
  15. Zipfel, C., et al. Perception of the Bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR Restricts Agrobacterium-Mediated Transformation. Cell. 125, (4), 749-760 (2006).
  16. Krol, E., et al. Perception of the Arabidopsis danger signal peptide 1 involves the pattern recognition receptor AtPEPR1 and its close homologue AtPEPR2. Journal of Biological Chemistry. 285, (18), 13471-13479 (2010).
  17. Schwessinger, B., et al. Phosphorylation-dependent differential regulation of plant growth, cell death, and innate immunity by the regulatory receptor-like kinase BAK1. PLoS Genetics. 7, (4), e1002046 (2011).
  18. Roux, M., et al. The Arabidopsis Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinases BAK1/SERK3 and BKK1/SERK4 Are Required for Innate Immunity to Hemibiotrophic and Biotrophic Pathogens. The Plant Cell. 23, (6), 2440-2455 (2011).
  19. Monaghan, J., et al. The calcium-dependent protein kinase CPK28 buffers plant immunity and regulates BIK1 turnover. Cell Host and Microbe. 16, (5), 605-615 (2014).
  20. Wang, J., et al. A Regulatory Module Controlling Homeostasis of a Plant Immune Kinase. Molecular Cell. 69, (3), 493-504 (2018).
  21. Mott, G. A., et al. Genomic screens identify a new phytobacterial microbe-associated molecular pattern and the cognate Arabidopsis receptor-like kinase that mediates its immune elicitation. Genome Biology. 17, 98 (2016).
  22. Sang, Y., Macho, A. P. Analysis of PAMP-Triggered ROS Burst in Plant Immunity. Methods in Molecular Biology. 1578, 143-153 (2017).
  23. Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Methods. 10, (1), 6 (2014).
  24. Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds. Journal of Visualized Experiments. 128, (2017).
  25. Matschi, S., Werner, S., Schulze, W. X., Legen, J., Hilger, H. H., Romeis, T. Function of calcium-dependent protein kinase CPK28 of Arabidopsis thaliana in plant stem elongation and vascular development. The Plant Journal. 73, (6), 883-896 (2013).
  26. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. The Plant Journal. 18, (3), 265-276 (2002).
  27. Kunze, G., Zipfel, C., Robatzek, S., Niehaus, K., Boller, T., Felix, G. The N Terminus of Bacterial Elongation Factor Tu Elicits Innate Immunity in Arabidopsis Plants. The Plant Cell. 16, (12), 3496-3507 (2004).
  28. Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428, (6984), 764-767 (2004).
  29. Mur, L. A. J., Kenton, P., Draper, J. In planta measurements of oxidative bursts elicited by avirulent and virulent bacterial pathogens suggests that H2O2 is insufficient to elicit cell death in tobacco. Plant, Cell and Environment. 28, (4), 548-561 (2005).
  30. Kobayashi, M., et al. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. The Plant Cell. 19, (3), 1065-1080 (2007).
  31. Yoshioka, H., et al. Induction of Plant gp91 phox Homolog by Fungal Cell Wall, Arachidonic Acid, and Salicylic Acid in Potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14, (6), 725-736 (2001).
  32. Klauser, D., Flury, P., Boller, T., Bartels, S. Several MAMPs, including chitin fragments, enhance AtPep-triggered oxidative burst independently of wounding. Plant Signaling and Behavior. 8, (9), e25346 (2013).
  33. El Gueddari, N. E., Rauchhaus, U., Moerschbacher, B. M., Deising, H. B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi. New Phytologist. 156, (1), 103-112 (2002).
  34. Daiber, A., et al. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radical Research. 38, (3), 259-269 (2004).
  35. Bauer, Z., Gómez-Gómez, L., Boller, T., Felix, G. Sensitivity of Different Ecotypes and Mutants of Arabidopsis thaliana toward the Bacterial Elicitor Flagellin Correlates with the Presence of Receptor-binding Sites. Journal of Biological Chemistry. 276, (49), 45669-45676 (2001).
  36. Vetter, M. M., et al. Flagellin perception varies quantitatively in arabidopsis thaliana and its relatives. Molecular Biology and Evolution. 29, (6), 1655-1667 (2012).
  37. Chinchilla, D. The Arabidopsis Receptor Kinase FLS2 Binds flg22 and Determines the Specificity of Flagellin Perception. The Plant Cell. 18, (2), 465-476 (2006).
  38. Lloyd, S. R., Schoonbeek, H., Trick, M., Zipfel, C., Ridout, C. J. Methods to Study PAMP-Triggered Immunity in Brassica Species. Molecular Plant-Microbe Interactions. 27, (3), 286-295 (2014).
  39. Clarke, C., Vinatzer, B. Characterizing the Immune-Eliciting Activity of Putative Microbe-Associated Molecular Patterns in Tomato. Methods in Molecular Biology. 1578, 249-261 (2017).
  40. Gimenez-Ibanez, S., Hann, D. R., Chang, J. H., Segonzac, C., Boller, T., Rathjen, J. P. Differential Suppression of Nicotiana benthamiana Innate Immune Responses by Transiently Expressed Pseudomonas syringae Type III Effectors. Frontiers in Plant Science. 9, 688 (2018).
  41. Wei, Y., et al. The Ralstonia solanacearum csp22 peptide, but not flagellin-derived peptides, is perceived by plants from the Solanaceae family. Plant Biotechnology Journal. 16, (7), 1349-1362 (2018).
  42. Melcher, R. L. J., Moerschbacher, B. M. An improved microtiter plate assay to monitor the oxidative burst in monocot and dicot plant cell suspension cultures. Plant Methods. 12, 5 (2016).
  43. Perraki, A., et al. Phosphocode-dependent functional dichotomy of a common co-receptor in plant signalling. Nature. 561, (7722), 248-252 (2018).
  44. Yamaguchi, K., Kawasaki, T. Chitin-Triggered MAPK Activation and ROS Generation in Rice Suspension-Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 1578, 309-316 (2017).
  45. Ortmann, I., Conrath, U., Moerschbacher, B. M. Exopolysaccharides of Pantoea agglomerans have different priming and eliciting activities in suspension-cultured cells of monocots and dicots. FEBS Letters. 580, (18), 4491-4494 (2006).
  46. Ortmann, I., Sumowski, G., Bauknecht, H., Moerschbacher, B. M. Establishment of a reliable protocol for the quantification of an oxidative burst in suspension-cultured wheat cells upon elicitation. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64, (5), 227-232 (2004).
  47. Dos Santos, A. L. W., El Gueddari, N. E., Trombotto, S., Moerschbacher, B. M. Partially acetylated chitosan oligo- and polymers induce an oxidative burst in suspension cultured cells of the gymnosperm Araucaria angustifolia. Biomacromolecules. 9, (12), 3411-3415 (2008).
  48. Bressendorff, S., Rasmussen, M., Petersen, M., Mundy, J. Chitin-Induced Responses in the Moss Physcomitrella patens. Methods in Molecular Biology. 317-324 (2017).
  49. Lloyd, S. R., Ridout, C. J., Schoonbeek, H. Methods to Quantify PAMP-Triggered Oxidative Burst, MAP Kinase Phosphorylation, Gene Expression, and Lignification in Brassicas. Methods in Molecular Biology. 1578, 325-335 (2017).
  50. Gómez-Gómez, L., Boller, T. FLS2: An LRR Receptor-like Kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Molecular Cell. 5, (6), 1003-1011 (2000).
  51. Li, J., et al. Specific ER quality control components required for biogenesis of the plant innate immune receptor EFR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (37), 15973-15978 (2009).
  52. Lu, X., et al. Uncoupling of sustained MAMP receptor signaling from early outputs in an Arabidopsis endoplasmic reticulum glucosidase II allele. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (52), 22522-22527 (2009).
  53. Nekrasov, V., et al. Control of the pattern-recognition receptor EFR by an ER protein complex in plant immunity. EMBO Journal. 28, (21), 3428-3438 (2009).
  54. Boutrot, F., et al. Direct transcriptional control of the Arabidopsis immune receptor FLS2 by the ethylene-dependent transcription factors EIN3 and EIL1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (32), 14502-14507 (2010).
  55. Kadota, Y., et al. Direct Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD by the PRR-Associated Kinase BIK1 during Plant Immunity. Molecular Cell. 54, (1), 43-55 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics