Mønster-utløst oksidativt burst og frøplante Veksthemming analyser i Arabidopsis thaliana

JoVE Journal
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dette papiret beskriver to metoder for kvantifisere forsvar responser i Arabidopsis thaliana etter eksponering for immun elicitors: forbigående oksidativt utbrudd, og hemming av frøplante vekst.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., Monaghan, J. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147), e59437, doi:10.3791/59437 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Planter har utviklet seg et robust immunsystem til å oppfatte patogener og beskytte mot sykdom. Dette papiret beskriver to analyser som kan brukes til å måle styrken av immun aktivering i Arabidopsis thaliana etter behandling med elicitor molekyler. Presentert først er en metode for å fange den raskt indusert og dynamisk oksidativt utbrudd, som kan overvåkes ved hjelp av en luminol-basert analyse. Presentert andre er en metode som beskriver hvordan å måle immun-indusert hemming av frøplante vekst. Disse protokollene er rask og pålitelig, ikke krever spesialisert opplæring eller utstyr, og er mye brukt til å forstå det genetiske grunnlaget for anlegget immunitet.

Introduction

Å oppfatte og forsvare seg mot patogener, har planter utviklet membran-bundet mønstergjenkjenning reseptorer (PRRs) som oppdager bevarte mikrobielle molekyler utenfor cellen kjent som mikrobe-assosiert molekylær mønstre (MAMPs)1. Bindingen av MAMPs til deres beslektet PRRs initierer protein kinase-mediert immun signalering resulterer i bredspektret sykdom motstand2. En av de tidligste svarene etter PRR aktivering er fosforylering og aktivering av integrert plasma membran RESPIRATORISK BURST OKSIDASE HOMOLOGE (RBOH) proteiner som katalysere produksjonen av ekstracellulære reaktive oksygen arter (ROS)3 , 4. ros spiller en viktig rolle i å etablere sykdomsresistens, opptrer både som sekundær budbringere å spre immun signalering samt direkte antimikrobielle agenter5. Den første observasjon av en immun-elicited oksidativt utbrudd ble beskrevet ved hjelp av potet knoller av CV. Rishiri etter Phytophthora infestans inoculation6. ROS produksjonen har blitt evaluert i flere plantearter ved hjelp av blad plater7, celle suspensjon kulturer8, og protoplasts6. Beskrevet her er en enkel metode for assaying mønster-utløst ROS produksjon i blad plater av Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).

Som et svar på MAMP persepsjon, aktivert RBOH proteiner katalysere produksjon av superoxide radikaler (O2-), hydroksyl radikaler (• Oh), og singlet oksygen (1O2) som omdannes til hydrogen peroxide (H2o 2) i ekstracellulære plass9. H2O2 kan bli kvantifisert av luminol-baserte kjemiluminescens i nærvær av oksiderende agent pepperrot peroksidase (HRP)10. HRP oksiderer H2O2 GENERERER en natriumhydroksid (Oh) og oksygen gass (O2) som reagerer med luminol for å produsere en ustabil mellomliggende som frigjør et foton av lys10. Foton utslipp kan være kvantifisert som relative lys enheter (RLU) ved hjelp av en mikroplate leser eller imager i stand til å oppdage luminescence, som har blitt standard stykker av utstyr i de fleste molekylære laboratorier. Ved å måle lyset som produseres over et 40-60-minutters intervall, kan en forbigående oksidativt burst oppdages så tidlig som 2-5 minutter etter elicitor behandling, med topp på 10-20 minutter, og tilbake til basal nivåer etter ~ 60 minutter11. Den kumulative lys produsert over denne tiden kurset kan brukes som et mål på immunforsvaret tilsvarende aktivering av RBOH proteiner12. Beleilig, ikke denne analysen ikke krever spesialisert utstyr eller tungvint prøve forberedelser.

Topp kort tid etter MAMP deteksjon, er oksidativt utbrudd betraktet som en tidlig immunrespons, sammen med MAPK aktivering og etylen produksjon5. Senere uimottakelig responser inkluderer transcriptional omprogrammering, nålene nedleggelse, og callose deponering2,5. Langvarig eksponering for MAMPs kontinuerlig aktiverer energisk-kostbare immun signalering resulterer i Hemming av plantevekst, antyder en trade-off mellom utvikling og immunitet13. Mønster-utløst frøplante veksthemming (SGI) er mye brukt til å vurdere immunforsvaret i Arabidopsis og har vært integrert i identifisering av flere viktige komponenter i immun signalering inkludert PRRs14,15 ,16. Derfor er dette papiret i tillegg presenterer en analyse for mønster-utløst SGI i Arabidopsis, der frøplanter dyrkes i multi-brønn plater som inneholder standard Media eller Media supplert med en immun elicitor for 8-12 dager og deretter veide ved hjelp av en analytisk målestokk.

For å demonstrere hvordan ROS og SGI analyser kan brukes til å overvåke PRR-mediert signalering, tre genotyper som representerer varierende uimottakelig utganger ble valgt: (1) den ville typen Arabidopsis tiltredelse Columbia (Col-0), (2) den dominerende-negative bak1-5 mutant der multi-funksjonell PRR co-reseptor BRASSINOSTEROID ufølsom 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) er ikke-funksjonell i immun signalering17,18, og (3) den resessivt cpk28-1 mutant, som mangler regulatoriske protein kalsium-avhengige protein KINASE 28 (CPK28) og viser økt immun-utløst svar19,20. ROS og SGI analyser er presentert som svar på en syntetisk-produsert elf18 peptid epitope av bakteriell forlengelse Factor Tu (EF-TU), anerkjent i Arabidopsis av PRR EF-Tu RESEPTOR (EFR)15. Disse protokollene kan brukes med andre immune elicitors som bakteriell motilitet protein flagellin14 eller endogene Plant Elicitor proteiner (AtPeps)16, men det bør bemerkes at plante respons varierer avhengig av elicitor21. Sammen kan ROS og SGI analyser brukes for rask og kvantitativ vurdering av tidlig og sent PRR-mediert svar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. påvisning av ROS brast i Arabidopsis Leaf plater etter immune elicitation

  1. Plant vekst og vedlikehold.
    1. For å synkronisere spire, Stratify Arabidopsis frø ved å suspendere ca 50 frø i 1 mL sterilt 0,1% agar [w/v] og lagre ved 4 ° c (ikke lys) for 3-4 dager.
      Merk: Stratify en vill type bakgrunn kontroll (for eksempel Col-0) og genotyper med høy og lav immun utganger (for eksempel cpk28-1 og bak1-5, henholdsvis) å tjene som interne kontroller.
    2. Sår frø på jord og spire under standardkort dag forhold (22 ° c, 10 h lys, 150 mE/m2/s lysstyrke, og 65-70% relativ fuktighet).
    3. Etter ca 7 dager, bruk tang for å transplantere individuelle frøplanter til nye Potter, atskilt med minst 4 cm for å tillate full rosett utvikling. Transplant 6-12 frøplanter per genotype og gå tilbake til standardkort-dag forhold. Regelmessig vann og gjødsle planter (1 g/L 20-20-20 gjødsel hver 2 uker).
  2. Samle blad plater i 96-brønn plater for gjenvinning over natten.
    1. På 4-5 uker etter spire (figur 1a), bruke en skarp 4 mm biopsi punch for å fjerne ett blad plate per plante, unngår midten av venen og være forsiktig med å begrense såret (figur 1B). Plasser blad platene i en ubrukt 96-brønn luminometeret plate som inneholder 100 μL av ddH2O med adaxial IDen vendt oppover for å hindre uttørking22 (figur 1C). Hvis du vurderer flere elicitors, Fjern 1 blad plate fra samme blad for hver elicitor behandling.
      Merk: prøve blader som er fullt utvidet, tredje til femte fra toppen av rosett, og omtrent samme størrelse og alder for å begrense variasjon. Hvis mulig, kutte blad plater i to ved hjelp av en barberhøvel blad før natten utvinning, da dette øker arealet utsatt for elicitor løsning23.
    2. Komme seg over natten ved romtemperatur for å hindre interferens av ROS produsert av såret under Leaf platesamling. Dekkplater med lokk for å hindre fordampning.
  3. Utfør elicitor behandling og måle ROS produksjon.
    1. Program platen leseren før du legger til reaksjons løsning, da dette vil redusere tiden mellom ROS burst initiering og de første målingene registrert. Bruk en kommersiell programvare som passer for plate leseren. I vårt tilfelle (se innholdsfortegnelse), klikk Innstillinger, og velg LUM96 kassetten og kinetisk lese type. Klikk på leseområde kategori og dra for å velge et delsett av brønner eller hele platen som skal leses. Under kategorien avdrag og optikk angir du integrerings tiden til 1 000 MS. under kategorien tidsberegning angir du den totale kjøretiden til 40-60 min og intervallet til 2 min.
    2. Fjern vann fra hver brønn ved hjelp av en flerkanals pipette.
      Merk: ikke punktering blad plater, da dette kan føre til såret stress og resultere i mer variable ROS utganger.
    3. Forbered en reaksjons løsning som inneholder 100 μM-luminol, 10 μg/mL HRP, og ønsket konsentrasjon av elicitor (for eksempel: elf18 ved 1 nM, 10 nM, 100 nM eller 1 000 nM) i steril ddH2O med 10 ml oppløsning for 1 96-brønn plate.
      Merk: løs opp lyofilisert peptider i steril H2O i lav bindings rør for å gjøre en 10 mm lager, Flash-fryse i flytende N2, og lagre ved-80 ° c. Når det er klart til bruk, fortynne bestandene i steril H2O for å generere en 100 μM arbeids lager og oppbevares ved-20 ° c.
    4. Bruk en flerkanals pipette for å dispensere 100 μL av reaksjonsblandingen til hver brønn, og legge til løsningen på alle blad plater av samme behandling på samme tid22. Ta med en kontroll reaksjon (ingen elicitor) for hver genotype å vurdere basal ROS nivåer i fravær av elicitation. Mål umiddelbart lys utslipp for alle bølgelengder i det synlige spekteret ved hjelp av en mikroplate leser.
      Merk: Forbered og påfør reaksjons løsningen under svakt lys, siden luminol og HRP er lysfølsomme reagenser. Oppbevar reagenser på is eller ved-20 ° c med mindre de er i bruk.
    5. Mål lys utslipp med en 1 000 MS integrasjons tid i 2 min intervaller over en 40-60 min periode i en mikroplate leser for å fange opp den dynamiske oksidativt utbrudd (figur 1d).
      Merk: Bruk en lengre integrasjons tid for å forbedre analysen følsomhet11, samtidig som sikrer at alle prøvene i en 96-brønn plate kan måles innenfor ett intervall.
  4. Data tolkning.
    1. For hver genotype, bruk en regneark søknad å Beregn gjennomsnittet Foton greven og målestokk feil for hver tid punkt, og utfoldelse ROS produksjon som funksjonen av tid benytter en spre plot.
      Equation 1
      Hvor t = hvert gang punkt
    2. Alternativt, sum det Foton teller for hver blad skiven og gave gjennomsnittet av disse verdier for hver genotype benytter en stang graf med målestokk feil bars eller en bokse med og whisker flekk.
      Equation 2

2. frøplante Veksthemming analysen

  1. Sterilisere frø og sår på Murashige og Skoog (MS) plater.
    1. Klargjør steril halv styrke (0,5 x) MS medium (2,16 g/L) som inneholder 0,8% agar [w/v]. Hell utskriftsmaterialet inn i platene (90 x 15 mm) i en laminær strømnings hette.
    2. Sterilisere omtrent 100 frø i et mikrosentrifugen rør ved å vaske med 1 mL 70% etanol i 2 min og fjern ved aspirasjon. Tilsett 1 mL 40% blekemiddel og rist forsiktig i 17 minutter ved romtemperatur. Fjern blekemiddel ved aspirasjon og vask tre ganger i 1 mL sterilt vann i 5 min. Resuspend i 1 mL sterilt 0,1% agar.
      Merk: Alternativt, bruk en klor gass frø sterilisering protokoll24.
    3. Sår ca 100 frø per genotype opp på MULTIPLE SCLEROSIS agar tallerken benytter en pipette og sel med mikropore tape inne en laminær flyte Hood.
      Merk: unngå å plassere frø i umiddelbar nærhet da dette vil gjøre transplantere frøplanter vanskelig senere.
    4. Stratify frøene ved å plassere platene ved 4 ° c (ikke lys) i 3-4 dager for å synkronisere spire (figur 2a).
  2. Transplant frøplanter i 48-brønn plater som inneholder immune elicitor peptider.
    1. Etter lagdeling, Flytt platene til lys under korte dags forhold (22 ° c, 10 h lys, 150 mE/m2/s lysstyrke, og 65-70% relativ fuktighet) i 3-4 dager for å la spire.
    2. I en laminær Flow hette, forberede elicitor peptid fortynninger (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, og 1 000 nM) i sterile 0,5 x MS flytende medier som inneholder 1% sukrose [w/v], ved hjelp av 25 mL av MS for hver 48-brønn plate. Forbered plater ved pipettering 500 μL av MS flytende medium eller MS medium som inneholder peptider per brønn. Hvis det er tilgjengelig, kan du bruke en gjentakelses pipettehjelper for å klargjøre platen for å fremskynde prosessen.
      Merk: for hver genotype, vokser frøplanter i MS uten elicitor å gjøre rede for eventuelle iboende forskjeller i frøplante vekst.
    3. Ved hjelp av sterile tang nøye transplantere en frøplante til hver brønn av samme størrelse og alder, slik at det ikke er skade på frøplante eller brudd til roten, og at roten er neddykket i Media. For hver genotype, transplantasjon et minimum av 6-8 frøplanter i hver peptid fortynning (figur 2b).
      Merk: Transplant frøplanter på 4 dager etter spire, som korte røtter er lettere å manipulere, og eldre frøplanter kan gi mindre optimale resultater.
    4. Forsegle plater med mikropore tape og flytte tilbake til lys under standardkort dag forhold (22 ° c, 10 h lys, 150 mE/m2/s lysstyrke, og 65-70% relativ fuktighet). Tillat frøplanter å vokse i 8-12 dager.
  3. Bestem prosentvis veksthemming.
    1. Forsiktig fjerne frøplanter fra 48-brønn plater og tørk av dabbing på papir håndkle. Veie frøplanter på en analytisk skala og rekord verdier. Hvis det er tilgjengelig, bruker du en analytisk skala utstyrt med USB-utgang for å registrere nye Vektverdier i et regneark. Før veiing frøplanter, ta et bilde for å visuelt vise veksthemming (figur 2C).
    2. Bestem prosent veksthemming av elicitor frøplanter sammenlignet med frøplanter dyrket i MS bare (figur 2D) som følger:
      Equation 3
    3. Plot data ved hjelp av et stolpediagram med standard feilfelt eller ved hjelp av en boks og whisker tomten for å bedre vise Inter-eksperimentell varians.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mutant cpk28-119,25 og bak1-517,18 planter ble brukt til å demonstrere forventede utfall for genotyper med høye og lave immunresponser, henholdsvis i oksidativt utbrudd og SGI analyser i forhold til en vill-type bakgrunns kontroll (Col-0). For å vurdere dose avhengige effekter, en 10-fold peptid fortynning serie (1-1000 nM) av elf18 ble brukt. Som forventet, cpk28-1 tap-of-funksjons linjer hadde en høyere kumulativ (figur 3a) og gjennomsnittlig (figur 3b) ros brast sammenlignet med Col-0, mens bak1-5 vist redusert ros produksjon ved konsentrasjoner mellom 10 nM og 1 000 nM (Figur 3). Forventet forskjeller i SGI kunne fanges mellom alle genotyper vokst i 100 nM og 1 000 nM elf18 (figur 4a), som også kan være visuelt observert i 1 000 NM elf18 behandling (figur 4b). Karakteristisk for høy immun signalering, cpk28-1 mutanter var markant mindre enn Col-0 da vokst i 1 000 nM elf18, mens bak1-5 mutanter vises svak veksthemming i forhold til Col-0 på grunn av forstyrret MAMP deteksjon.

Figure 1
Figur 1. Luminol-basert oksidativt burst analysen etter immun induksjon i Arabidopsis. (A) dyrke planter på jord i korte dag forhold for 4-5 uker. (B) bruk en 4 mm biopsi punch for å samle blad plater fra hver plante og komme seg over natten i ddH2O. (C) Legg til reaksjons løsning (100 μM luminol, 10 μg/ml HRP, og ønsket konsentrasjon av elicitor) og måle lys utslipp over 40-60 min, i 2 minutter intervaller med en integrasjons tid på 1 000 MS. (D) Bestem gjennomsnittlig Foton teller for hver genotype forhold til Col-0 (vist i grønt), en høy ROS kontroll som cpk28-1 (vist i lilla), og en lav ros kontroll som bak1-5 (vist i oransje). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Elicitor-indusert frøplante veksthemming analysen i Arabidopsis. (A) sår frøplanter på MS agar og vokse for 3-4 dager under standardkort dag forhold. (B) Transplant frøplanter til 48-brønn plater som inneholder MS medium eller MS som inneholder ulike konsentrasjoner av elf18. (C) etter 8-12 dager, visuelt vurdere frøplante størrelse og deretter måle frisk vekt ved hjelp av en analytisk skala for å bestemme prosent veksthemming. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Representative elf18-indusert oksidativt utbrudd i tre Arabidopsis genotyper. Fire uker gamle planter ble behandlet med en fortynning serie av elf18 (0 nM ' mock ', 1 nM, 10 nM, 100 nM, og 1 000 nM). Col-0 representerer vill-type bakgrunn kontroll, med cpk28-1 og bak1-5 representerer høy og lav ros fenotyper, henholdsvis. (A) totalt Foton-antall representert som relative lys enheter etter elf18 behandling (n= 6 Leaf-plater fra uavhengige anlegg). Statistiske forskjeller er representert ved små bokstaver og ble beregnet ved hjelp av en enveis ANOVA med en post-hoc Tukey ' s ærlig signifikant forskjell test (p< 0,05). (B) gjennomsnittlig Foton teller, representert som relative lys enheter, over 40 min etter elf18 behandling (n= 6 Leaf plater fra uavhengige anlegg). Feilfelt representerer standard feil i gjennomsnittet. Lignende resultater ble oppnådd i to av tre eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Representative elf18-indusert frøplante veksthemming i tre Arabidopsis genotyper. Wild-type (Col-0), cpk28-1, og bak1-5 frøplanter ble dyrket i en 10-fold fortynning serien (0-1000 nM) av elf18. (A) prosent veksthemming ble beregnet ved å sammenligne vekten av individuelle frøplanter dyrket i elf18 (n= 6 individuelle frøplanter) til den gjennomsnittlige vekten av frøplanter av samme genotype VOKST i MS bare ("mock") (n= 6 individuelle frøplanter) over en 10-dagers periode. Statistiske forskjeller er representert ved små bokstaver og ble beregnet ved hjelp av en enveis ANOVA med en post-hoc Tukey ' s Honest signifikante forskjeller test (p< 0,05). (B) visuell demonstrasjon av SGI i to representative frøplanter av Col-0, cpk28-1, og bak1-5 som svar på økende konsentrasjoner av elf18. Lignende resultater ble oppnådd i tre av fire eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette papiret beskriver to metoder for assaying av mønster-utløst immunresponser i Arabidopsis, tilbyr kvantitative tilnærminger til evaluering av immunforsvaret uten bruk av spesialisert utstyr. I kombinasjon, mønster-utløst ROS og SGI kan brukes til å vurdere tidlig og sent svar på mikrobe persepsjon, henholdsvis.

Den store begrensningen av oksidativt burst-analysen er variasjon. Av grunner som ikke er helt forstått, absolutt RLU ofte forskjellig med en størrelsesorden mellom eksperimenter. Fordi mellom-eksperiment variasjonen er høy, er det tilrådelig å inkludere interne referanse kontroller med høy (f. eks cpk28-1) og lav (foreksempel bak1-5) oksidativt sprekker i tillegg til en vill-type kontroll (f. eks, Col-0). Det kan imidlertid iverksettes tiltak for å øke reproduserbarheten mellom eksperimenter. Miljøforhold som temperatur, fuktighet, photoperiod og lys intensitet bør være identiske mellom replikeres. Alder og helse av planter bør også vurderes når prøvetaking. Leaf plater kan hentes fra planter som er mellom 4 og 7 ukers alder vokst under korte dag forhold (6-10 timer med lys). Anecdotally, de mest konsekvente resultatene ble funnet med planter eldre enn 6 uker innlegg spire men ennå ikke blomstrende eller senescing. Det er viktig å dyrke planter i rene miljø kamre, slik at de ikke utsettes for vanlige Glasshouse som pulveraktig mugg eller tygge insekter. Siden frøplanter for SGI dyrkes i sterile MS Media, og for kortere tid, er miljømessige svingninger i stor grad ikke en bekymring. Imidlertid kan variasjon oppstå hvis frøplanter blir skadet mens transplantere, hvis frøplanter valgt for elicitor behandlinger er forskjellige størrelser, eller hvis veksten medier blir forurenset. Det anbefales å inkludere den interne Referansekontrollen genotyper beskrevet ovenfor i SGI eksperimenter også.

Elicitor konsentrasjon er en annen viktig faktor ved gjennomføring av immunanalyser. Elicitors oppfattes av PRRs resulterer i en rask og robust ROS brast topp 10-20 minutter etter elicitor behandling (figur 2b). Størrelsen på burst er imidlertid avhengig av både elicitor og plante genotype. Derfor anbefales en elicitor dose serie, som presentert i Figur 3 og Figur 4, for å identifisere en egnet elicitor konsentrasjon. Oppskrift-utløst ros kan også analyseres av vaksinere Leaf plater med levende mikrober23,26 eller mikrobielle ekstrakter26,27,28. For eksempel, transient og dose avhengig ROS støt kan oppdages i Arabidopsis som svar på ondartet Pathovars av Pseudomonas syringae, topp på 35-40 minutter og nå basal nivåer ca 70 min etter elicitation 23 andre , 29. som svar på avirulent bakterier29 eller fungal patogen P. infestans30,31, en annen mer uttalt akkumulering av ros produseres som kan overvåkes 6-10 timer etter Inoculation. For svakere elicitors, slik som sopp kitin32 eller Chitosan33, kan mer følsomme selvlysende indikatorer brukes, slik som luminol derivat L-012, men bakgrunnen signalet produsert er ofte høyere32, 34. viktigere, vil anlegget ecotype også diktere sin respons til bestemte elicitors35,36. For eksempel, mens bakteriell flagellin er i stand til fremlokkende immunresponser i flere Arabidopsis Ecotypes inkludert Col-0, den Wassilewskija (WS-0) ecotype uttrykker en ikke-funksjonell variant av PRR FLAGELLIN-SENSING 2 (FLS2) og er Derfor ufølsom for flagellin14,37.

Immune-indusert ros kan også observeres i Leaf plater av andre dikotyledoniske planter inkludert Brassica napus38, tomat39, Nicotiana benthamiana22,40,41, og flere andre Solanaceous arter41. Ytterligere luminol-baserte ros deteksjon analyser er utviklet for planter ved hjelp av vev ekstrakter10, celle suspensjon kulturer8,42og protoplasts43, og er spesielt nyttig i systemer der Leaf plate protokoller ikke er effektive42. For eksempel, elicitor-indusert ros støt har blitt beskrevet ved hjelp av celle suspensjon kulturer i ris42,44 og hvete45,46, samt Nakenfrøede Araucaria angustifolia 47 og Moss Physcomitrella patens48. SGI har ikke blitt brukt som grovt for å måle immun signalering. Veksthemming som respons på elicitors har imidlertid blitt demonstrert i N. benthamiana41 og B. napus38,49. Rask veksthemming har også blitt demonstrert i P. patens som svar på fungal kitin oppstår innen 2 minutter av eksponering, som kan observeres ved hjelp av tidsforløp fotografering48.

Med modifisering, både SGI og oksidativt burst analyser kan brukes for høy gjennomstrømming skjermer å identifisere uimottakelig regulatorer. For eksempel kan mutagenized populasjoner av Arabidopsis dyrkes på MS medium og oversvømmet med elicitors å identifisere ufølsom mutanter15,50,51,52,53. Alternativt kan mutagenized populasjoner vurderes for elicitor-utløst ROS, som har blitt gjennomført med både Leaf-plater54 og hele frøplanter VOKST på MS plater19. En annen nyttig screening metoden er transient uttrykk for proteiner i N. benthamiana for ros analyse før utviklingen av transgene overuttrykte linjer22,40,55. Imidlertid, intra-eksperimentelle variasjon er høyere enn inne stabile Arabidopsis linjer på grunn av differansen protein gjengivelsen inne N. benthamiana blader22, til tross for denne kan delvis dempet av infiltrere henvisning Kontroller på samme blad som eksperimentelle prøver.

Oppsummert er immune-indusert oksidativt utbrudd og SGI-analyser raske og pålitelige metoder for å vurdere PRR-mediert signalering i Arabidopsis. Disse metodene kan utvides til andre systemer og brukes for stor skala skjermer for å avdekke romanen uimottakelig regulatorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Arbeid i laboratoriet vårt er finansiert gjennom naturressurser og engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery program, den kanadiske stiftelsen for innovasjon John R. Evans Leader ' s Fund, og Queen ' s University. KS og er støttes av tandem Ontario Graduate stipender og NSERC Canada Graduate stipend for Master ' s Students (CGS-M).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20-20-20 Fertilizer Plant Prod 10529 Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.
4 mm Biopsy Punch Medical Mart 232-33-34-P A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.
48-Well Sterile Plates with Lid Sigma-Aldrich CLS3548
Analytical Scale with Draft Sheid VWR VWR-225AC Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) Sartorius 725240 Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab cp7211 Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich P6782 Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.
Luminol Sigma-Aldrich A8511 Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.
Murisage and Skoog Basal Salts Cedarlane Labs MSP09-100LT Store at 4C.
Soil SunGrow Horticulture Sunshine Mix #1 Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module Molecular Devices Must request a quote Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG Store at room temperature.
White Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-589

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
  2. Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Perception of Microbe-Associated Molecular Patterns and Danger Signals by Pattern-Recognition Receptors. Annual Review of Plant Biology. 60, 379-406 (2009).
  3. Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 56, (8), 1472-1480 (2012).
  4. Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD during Plant Immunity. Plant and Cell Physiology. 56, (8), 1472-1480 (2015).
  5. Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
  6. Doke, N. Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissues to infection with an incompatible race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Physiological Plant Pathology. 23, (3), 345-357 (1983).
  7. Bindschedler, L. V., et al. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance. The Plant Journal. 47, (6), 851-863 (2006).
  8. Keppler, L. D. Active Oxygen Production During a Bacteria-Induced Hypersensitive Reaction in Tobacco Suspension Cells. Phytopathology. 110, (3), 759-763 (1989).
  9. Wrzaczek, M., Brosché, M., Kangasjärvi, J. ROS signaling loops - production, perception, regulation. Current Opinion in Plant Biology. 16, (5), 575-582 (2013).
  10. Warm, E., Laties, G. G. Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Phytochemistry. 21, (4), 827-831 (1982).
  11. Trujillo, M. Analysis of the lmmunity-Related Oxidative Bursts by a Luminol-Based Assay. Methods in Molecular Biology. 1398, 323-329 (2016).
  12. Nühse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M. E., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. The Plant Journal. 51, (5), 931-940 (2007).
  13. Belkhadir, Y., Yang, L., Hetzel, J., Dangl, J. L., Chory, J. The growth-defense pivot: Crisis management in plants mediated by LRR-RK surface receptors. Trends in Biochemical Sciences. 39, (10), 447-456 (2014).
  14. Gómez-Gómez, L., Felix, G., Boller, T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 18, (3), 277-284 (1999).
  15. Zipfel, C., et al. Perception of the Bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR Restricts Agrobacterium-Mediated Transformation. Cell. 125, (4), 749-760 (2006).
  16. Krol, E., et al. Perception of the Arabidopsis danger signal peptide 1 involves the pattern recognition receptor AtPEPR1 and its close homologue AtPEPR2. Journal of Biological Chemistry. 285, (18), 13471-13479 (2010).
  17. Schwessinger, B., et al. Phosphorylation-dependent differential regulation of plant growth, cell death, and innate immunity by the regulatory receptor-like kinase BAK1. PLoS Genetics. 7, (4), e1002046 (2011).
  18. Roux, M., et al. The Arabidopsis Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinases BAK1/SERK3 and BKK1/SERK4 Are Required for Innate Immunity to Hemibiotrophic and Biotrophic Pathogens. The Plant Cell. 23, (6), 2440-2455 (2011).
  19. Monaghan, J., et al. The calcium-dependent protein kinase CPK28 buffers plant immunity and regulates BIK1 turnover. Cell Host and Microbe. 16, (5), 605-615 (2014).
  20. Wang, J., et al. A Regulatory Module Controlling Homeostasis of a Plant Immune Kinase. Molecular Cell. 69, (3), 493-504 (2018).
  21. Mott, G. A., et al. Genomic screens identify a new phytobacterial microbe-associated molecular pattern and the cognate Arabidopsis receptor-like kinase that mediates its immune elicitation. Genome Biology. 17, 98 (2016).
  22. Sang, Y., Macho, A. P. Analysis of PAMP-Triggered ROS Burst in Plant Immunity. Methods in Molecular Biology. 1578, 143-153 (2017).
  23. Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Methods. 10, (1), 6 (2014).
  24. Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds. Journal of Visualized Experiments. 128, (2017).
  25. Matschi, S., Werner, S., Schulze, W. X., Legen, J., Hilger, H. H., Romeis, T. Function of calcium-dependent protein kinase CPK28 of Arabidopsis thaliana in plant stem elongation and vascular development. The Plant Journal. 73, (6), 883-896 (2013).
  26. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. The Plant Journal. 18, (3), 265-276 (2002).
  27. Kunze, G., Zipfel, C., Robatzek, S., Niehaus, K., Boller, T., Felix, G. The N Terminus of Bacterial Elongation Factor Tu Elicits Innate Immunity in Arabidopsis Plants. The Plant Cell. 16, (12), 3496-3507 (2004).
  28. Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428, (6984), 764-767 (2004).
  29. Mur, L. A. J., Kenton, P., Draper, J. In planta measurements of oxidative bursts elicited by avirulent and virulent bacterial pathogens suggests that H2O2 is insufficient to elicit cell death in tobacco. Plant, Cell and Environment. 28, (4), 548-561 (2005).
  30. Kobayashi, M., et al. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. The Plant Cell. 19, (3), 1065-1080 (2007).
  31. Yoshioka, H., et al. Induction of Plant gp91 phox Homolog by Fungal Cell Wall, Arachidonic Acid, and Salicylic Acid in Potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14, (6), 725-736 (2001).
  32. Klauser, D., Flury, P., Boller, T., Bartels, S. Several MAMPs, including chitin fragments, enhance AtPep-triggered oxidative burst independently of wounding. Plant Signaling and Behavior. 8, (9), e25346 (2013).
  33. El Gueddari, N. E., Rauchhaus, U., Moerschbacher, B. M., Deising, H. B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi. New Phytologist. 156, (1), 103-112 (2002).
  34. Daiber, A., et al. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radical Research. 38, (3), 259-269 (2004).
  35. Bauer, Z., Gómez-Gómez, L., Boller, T., Felix, G. Sensitivity of Different Ecotypes and Mutants of Arabidopsis thaliana toward the Bacterial Elicitor Flagellin Correlates with the Presence of Receptor-binding Sites. Journal of Biological Chemistry. 276, (49), 45669-45676 (2001).
  36. Vetter, M. M., et al. Flagellin perception varies quantitatively in arabidopsis thaliana and its relatives. Molecular Biology and Evolution. 29, (6), 1655-1667 (2012).
  37. Chinchilla, D. The Arabidopsis Receptor Kinase FLS2 Binds flg22 and Determines the Specificity of Flagellin Perception. The Plant Cell. 18, (2), 465-476 (2006).
  38. Lloyd, S. R., Schoonbeek, H., Trick, M., Zipfel, C., Ridout, C. J. Methods to Study PAMP-Triggered Immunity in Brassica Species. Molecular Plant-Microbe Interactions. 27, (3), 286-295 (2014).
  39. Clarke, C., Vinatzer, B. Characterizing the Immune-Eliciting Activity of Putative Microbe-Associated Molecular Patterns in Tomato. Methods in Molecular Biology. 1578, 249-261 (2017).
  40. Gimenez-Ibanez, S., Hann, D. R., Chang, J. H., Segonzac, C., Boller, T., Rathjen, J. P. Differential Suppression of Nicotiana benthamiana Innate Immune Responses by Transiently Expressed Pseudomonas syringae Type III Effectors. Frontiers in Plant Science. 9, 688 (2018).
  41. Wei, Y., et al. The Ralstonia solanacearum csp22 peptide, but not flagellin-derived peptides, is perceived by plants from the Solanaceae family. Plant Biotechnology Journal. 16, (7), 1349-1362 (2018).
  42. Melcher, R. L. J., Moerschbacher, B. M. An improved microtiter plate assay to monitor the oxidative burst in monocot and dicot plant cell suspension cultures. Plant Methods. 12, 5 (2016).
  43. Perraki, A., et al. Phosphocode-dependent functional dichotomy of a common co-receptor in plant signalling. Nature. 561, (7722), 248-252 (2018).
  44. Yamaguchi, K., Kawasaki, T. Chitin-Triggered MAPK Activation and ROS Generation in Rice Suspension-Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 1578, 309-316 (2017).
  45. Ortmann, I., Conrath, U., Moerschbacher, B. M. Exopolysaccharides of Pantoea agglomerans have different priming and eliciting activities in suspension-cultured cells of monocots and dicots. FEBS Letters. 580, (18), 4491-4494 (2006).
  46. Ortmann, I., Sumowski, G., Bauknecht, H., Moerschbacher, B. M. Establishment of a reliable protocol for the quantification of an oxidative burst in suspension-cultured wheat cells upon elicitation. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64, (5), 227-232 (2004).
  47. Dos Santos, A. L. W., El Gueddari, N. E., Trombotto, S., Moerschbacher, B. M. Partially acetylated chitosan oligo- and polymers induce an oxidative burst in suspension cultured cells of the gymnosperm Araucaria angustifolia. Biomacromolecules. 9, (12), 3411-3415 (2008).
  48. Bressendorff, S., Rasmussen, M., Petersen, M., Mundy, J. Chitin-Induced Responses in the Moss Physcomitrella patens. Methods in Molecular Biology. 317-324 (2017).
  49. Lloyd, S. R., Ridout, C. J., Schoonbeek, H. Methods to Quantify PAMP-Triggered Oxidative Burst, MAP Kinase Phosphorylation, Gene Expression, and Lignification in Brassicas. Methods in Molecular Biology. 1578, 325-335 (2017).
  50. Gómez-Gómez, L., Boller, T. FLS2: An LRR Receptor-like Kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Molecular Cell. 5, (6), 1003-1011 (2000).
  51. Li, J., et al. Specific ER quality control components required for biogenesis of the plant innate immune receptor EFR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (37), 15973-15978 (2009).
  52. Lu, X., et al. Uncoupling of sustained MAMP receptor signaling from early outputs in an Arabidopsis endoplasmic reticulum glucosidase II allele. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (52), 22522-22527 (2009).
  53. Nekrasov, V., et al. Control of the pattern-recognition receptor EFR by an ER protein complex in plant immunity. EMBO Journal. 28, (21), 3428-3438 (2009).
  54. Boutrot, F., et al. Direct transcriptional control of the Arabidopsis immune receptor FLS2 by the ethylene-dependent transcription factors EIN3 and EIL1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (32), 14502-14507 (2010).
  55. Kadota, Y., et al. Direct Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD by the PRR-Associated Kinase BIK1 during Plant Immunity. Molecular Cell. 54, (1), 43-55 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics