Direkt Intrabronchial administrering för att förbättra det selektiva medlet deposition inom mus lung

JoVE Journal
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Intratracheal (IT) administrering av experimentella medel hos möss resulterar ofta i asymmetrisk tillförsel till distala lungorna.  I denna rapport beskriver vi en direkt intrabronchial (IB) metod för att kannulera varje lunga i levande möss icke-operativt.  Denna metod kan användas för att selektivt administrera agenter till en lunga eller kan anpassas för att förbättra den symmetriska agenten leverans till båda lungorna.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Liao, S., Eickelberg, O., Schmidt, E. P., Yang, Y. Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung. J. Vis. Exp. (147), e59450, doi:10.3791/59450 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Intratracheal (IT) administration av experimentella medel är en viktig teknik i murina modeller av diffusa lungsjukdomar, såsom bleomycin-inducerad lungfibros.  Emellertid, distribution av intratracheally-administrerade agenter till distala muslungan är ofta asymmetrisk, med lungparenkymal koncentrationer ökade i mindre (men lika tillgängliga) vänster lunga av musen.  Beskrivs i denna rapport är en roman intrabronchial (IB) tillvägagångssätt för att kannulera vänster och/eller höger lungor levande möss icke-operativt.  Det är också visat hur denna metod kan användas för att selektivt administrera agenter till en lunga eller anpassas (via DOSJUSTERAD IB-leverans) för att förbättra den vänster-högra symmetrin för lung leverans av experimentella medel, och därigenom förbättra modeller av diffusa lungsjukdom såsom bleomycin-inducerad lungfibros.

Introduction

Direkt pulmonell administrering av experimentella medel i möss möjliggör studiet av lung immunsvar, Akut lungskada, och lungfibros. Direkt pulmonell administrering utförs vanligtvis via intratrakeal (IT) instillation, som beskrivitstidigare 1,2,3. Emellertid, denna metod är nonselective, påverkar båda lungorna i en nonmålinriktat och ofta asymmetrisk sätt.  Experimentell modellering av lungskada kan dra nytta av förmågan att selektivt rikta en specifik lung, möjliggör användning av den kontralaterala lungan som en kontroll. Omvänt, noggrann modellering av mänskliga diffusa lungsjukdomar fördelar från symmetrisk fördelning av experimentella agenter till den bilaterala lungparenkymet.

Det övergripande målet med denna rapport är att beskriva en metod för selektiv leverans av försöks agenter till vänster eller höger lunga i en mus (figur 1). Denna intrabronchial (IB) administreringssätt möjliggör ensidig behandling av en mus lunga och kan lätt anpassas för att säkerställa lika leverans av en agent till den bilaterala mainstem bronkerna. Genom att använda IB-administrering för att leverera större doser av experimentella medel till den större högra lungan och mindre volymer till den mindre vänstra lungan (dvs. Dosjusterad IB-administrering), som visats i denna rapport, är en förbättring av homogeniteten hos pulmonell leverans av försöks agenter, optimera modellen av diffus lungskada hos möss. Som sådan, denna rapport kan hålla värde för utredare som vill antingen ensidigt administrera försöks agenter till möss eller förbättra symmetrin av drogen deposition i båda lungorna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djur protokoll har godkänts av University of Colorado Denver institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC). Alla procedurer som beskrivs nedan (avsnitten 4 – 7) har optimerats med både manliga och kvinnliga C57BL/6-möss. Denna metod har validerats med möss som sträcker sig från 19 – 40 g i kroppsvikt.

1. inrättande av en plattform för IB-administration

  1. Böj bokslutet från den ursprungliga 90 ° vinkeln mellan den basala flygeln och stående vinge till 70 ° (figur 2A).
  2. Borra ett hål i mitten-toppen av den stående flygeln av metall Bokstöd (figur 2A).
  3. Borra ett hål av identisk storlek vid motsvarande position av plast kartong. Borra två mindre hål inferiorly och lateralt (figur 2A).
  4. Drapera en 4:0 sidensuturen mellan dessa små hål i plast kartong (figur 2A).
  5. Placera kroken och slingtejpen på kanten av plast brädet (figur 2A).
  6. Montera plast brädet till metall bokslutet med skruven (figur 2b). Se till att skruv muttern är tillräckligt snäv för att hålla brädan i läge samtidigt som det möjliggör justering av vinkeln, om det behövs.
  7. Se till att rotationen av plast kartong är medurs och moturs, röra sig fritt.
    Obs: medurs rörelse representeras i den här rapporten som en (+) graders rotation och motsols representeras som en (-) graders rotation.
  8. Använd en vinkel gradskiva för att placera plast ombord på + 30 °, + 86 °,-30 °, och-74 ° och markera dem på Bookend, respektive.

2. inrättande av utökade katetrar för IB-agentadministration

  1. Gör en rätvinklig snitt med ett vasst blad på spetsen av en ursprunglig 22 G kateter (25 mm, se tabell över material) (figur 3, steg 1a).
  2. Avfasning (~ 50 ° – 60 °) spetsen på den andra originalkatetern (25 mm) med bladet, sedan avskuren i rätt vinkel från navet (figur 3, steg 1b).
  3. Limma de två katetrar i deras trubbiga ändar med en något mindre än 180 ° vinkel (figur 3, steg 2).
  4. Trubbigt den avfasade spetsen genom smältning med en låg temperatur diatermi (se tabell över material).
  5. Polera den utökade katetern med "0" storlek sandpapper på det limmade området och avfasade spetsen på den utökade katetern (figur 3, steg 3).
  6. Markera på den utökade katetern med olika färger vid 25 mm, 30 mm och 35 mm (figur 3, steg 3).
  7. Ange kant sidan av den utökade katetern genom att märka dess NAV med markör.
  8. Skölj den förlängda katetern med DI vatten, efter genom spolning insidan av katetern med 70% etanol. Lufttorka katetern.
  9. Sterilisera med UV-ljus i 10 minuter före användning.

3. förberedelse före ingreppet

  1. Gör alla administrerade agenter i en biologisk säkerhets huv under steril teknik.
  2. Rengör arbetsplatsen med 70% etanol.
  3. Sterilisera alla kirurgiska verktyg med 70% etanol.
  4. Fäst basen av arbetsplattformen till bänken omedelbart framför forskaren genom att fästa C-klämmor till basala flygeln av Bookend.
  5. Generera flera provisoriska Spirometrar, som är enheter som gör det möjligt att upptäcka tidvatten luftflöde i möss. Kort, deponera 60 μL steriliserad saltlösning i en 1 mL spruta (kolven avlägsnas) med en gel lastning spets.
    Anmärkning: den deponerade droppe saltlösning ockluderar tunnan och rör sig uppåt och nedåt när de utsätts för tidvatten ventilation3.
  6. Sätt fast navet på en 22 G utökad kateter till provisoriska spirometern.
  7. Placera var och en av glas Droppers på vardera sidan av plattformen för enkel åtkomst.
  8. Anslut isofluran induktion kammaren till gnagare anestesi maskin (se tabell över material) i en isofluran-kompatibla biologiska säkerhetsskåp.

4. icke-operativ IT intubation tillvägagångssätt

  1. Anesthetize en C57BL/6 mus (man eller kvinna, 8 – 10 veckor, ~ 25 g) med syre (2 L/min) och 5% isofluran (se tabell över material) i en induktions kammare för 4 min.
  2. Aspirera den experimentella agenten som ska levereras (t. ex. Evans Blue Dye eller FITC-dextran, som visas i figur 4) i två pipetter, placera dem sedan på vardera sidan av plattformen under sedering.
  3. Säkerställ en andningsfrekvens på cirka 24 – 30 andetag/min innan du tar bort musen från anestesi induktions kammaren.
    Obs: isofluran anestesi varar vanligtvis i 4 min, tillräcklig för alla IB-procedurer. Om operatören inte är skicklig med tekniken, ketamin/xylazin (80 mg/kg och 10 mg/kg intraperitonealt, se tabell över material) kan användas för mer långvarig anestesi.
  4. Suspendera musen genom dess framtänder på den draavna suturen linjen i ryggläge. Säkra musen med två till tre bitar av krok och slinga tejpen löst, undvika begränsning av ventilation.
  5. Slå på LED fiberoptiska belysningsanordning (se tabell över material, figur 2C).
  6. Placera operatören bakom plattformen (dorsal till musen).
  7. Orientera den svanhals av illuminatorn så att den belyser struphuvudet området genom huden. Avståndet mellan musen och ljuskällan är 2 – 3 cm (figur 2C).
  8. Bekräfta djupet av anestesi med en tå/Paw nypa innan du utför alla procedurer nedan.
  9. Håll den sterila tång med den dominerande handen, sedan dra tungan ur munhålan med tång.
  10. Håll den sterila depressor med dominanta hand, sedan platta roten av tungan med depressor att exponera orofarynx allmänt. Pincett kan sedan släppas, frigöra den dominerande handen.
  11. Använd den dominerande handen för att intubera den utökade katetern i luftstrupen via munhålan (figur 2C).
  12. Bekräfta placeringen genom att observera om bubblan i sprutan rör sig uppåt och nedåt med varje andetag.
  13. Ytterligare information om IT intubation har publicerats tidigare3. Total procedur tid, exklusive anestesi, varar 10 – 15 s för en välutbildad operatör.

5. icke-operativ IB-intubation och leveransmetoder

  1. IB tillvägagångssätt för selektiv lobära kanylering av distala höger lunga
    1. Efter att ha utfört den kanylering (steg 4,11), rotera plast kortet + 30 ° (figur 4a).
    2. Håll kateterns nav och styr den naturligt parallellt med musens mittlinje och utvidga den till viktbaserade djup enligt beskrivningen i tabell 1.
      Anmärkning: motståndet på dessa djup bör noteras. Vid denna punkt, kommer musen att bli något tachypneic, som förklaras i representativa resultat. För en erfaren operatör, cirka 90% av försöken kommer framgångsrikt kannulate den högra lungan (med takypné noteras).
    3. Leverera 20 μL 0,3% Evans blå färgämne (EBD, se tabell över material) med en gel lastning spets.
    4. Dispensera 1 – 2 alikvoter (0,1 mL vardera) av luft med hjälp av glaset Dropper.
      Anmärkning: Detta säkerställer clearance av resterande EBD-lösning (eller experimentella medel) inifrån katetern.
    5. Dra ut katetern och behåll sedan muspositionen i 30 s.
    6. Placera djuret på en värmande filt tills det återfår medvetandet. Återställningen är vanligtvis klar inom 2 minuter.
  2. IB-metoden för selektiv segmentell kanylering av den distala vänsterlungan
    1. Efter att ha utfört den kanylering (steg 4,11), rotera plast kartong-74 ° (figur 4b).
    2. Håll navet i katetern och tillämpa mjukt tryck för att föra katetern i den vänstra mainstem bronchus, samtidigt som blygsamma trycket både nedåt (90 °) och mot Bookend. På djup som noteras i tabell 1bör operatören notera motståndet eftersom de nedre segmenten av den vänstra lungan är engagerade. Om takypné uppstår, dra ut katetern till 20 – 25 mm position, och försök igen.
    3. Efter kanylering av vänster lägre lung segment, en förändring i position krävs för att tillåta gravitations hjälp för agentadministration. Rotera plast brädet-30 ° (figur 4b).
    4. Leverera 40 μL av 0,3% EBD med en gel lastnings spets.
      Anmärkning: det är möjligt att leverera en större volym av agent eftersom den vänstra lungan har bara en LOB.
    5. Fördela 1 – 2 alikvoter (0,1 – 0,3 mL vardera) luft med hjälp av glas Droppers.
      Anmärkning: Detta säkerställer clearance av alla kvarvarande EBD (eller experimentella agenter) inifrån katetern.
    6. Dra ut katetern och behåll sedan muspositionen i 30 s.
    7. Placera djuret på en värmande filt tills det återfår medvetandet. Återställningen är vanligtvis klar inom 2 minuter.
  3. Anpassning av IB-administreringen så att agenten kan levereras till hela vänster eller höger lunga
    Anmärkning: om operatören försöker leverera agenter inte till en viss rätt lunga LOB eller vänster lung segmentet, utan snarare till hela lungan (höger eller vänster lunga), katetern bör vara något tillbaka till respektive mainstem bronkerna, enligt följande.
    1. Rätt hela lung administration
      1. Efter steg 4,11 roterar du plast tavlan + 30 ° (bild 5a).
      2. Håll navet i katetern och vägleda den naturligt parallellt med musen mittlinjen, når den till djup som behövs för högersidig distala lobära kanylering (tabell 1).
      3. Bekräfta utseendet på takypné-tecknet.
      4. Vrid musen-74 ° för att möjliggöra gravitations hjälp för agentens leverans (Figur 5b).
      5. Dra ut katetern till en position som motsvarar start av höger mainstem luftrör (tabell 1). Se till att kateterns avfasning är vänd nedåt (Figur 5b).
      6. Leverera 30 μL 0,3% EBD med en gel lastning spets till höger lunga.
      7. Fördela 1 – 2 alikvoter (0,1 – 0,3 mL vardera) luft med hjälp av en glaspipetter.
      8. Dra ut katetern och behåll sedan muspositionen i 30 s. Placera djuret på en värmande filt tills det återfår medvetandet. Återställningen är vanligtvis klar inom 2 minuter.
    2. Lämnade hela lung administrationen
      1. Efter steg 4,11 roterar du plast brädet-74 ° (figur 6a). Alternativt kan rotation uppstå efter steg 5.3.1.8 genom att dra ut katetern till luftstrupen, vilket möjliggör bilateral IB-agentadministration.
      2. Håll navet i katetern och tillämpa mjukt tryck för att föra katetern i den vänstra mainstem katetern, samtidigt som blygsamma trycket både nedåt (90 °) och mot Bookend. Djupet av intubation styrs av tabell 1.
      3. Bekräfta ingen takypné tecken.
      4. Rotera musen + 86 ° för att möjliggöra gravitations hjälp med agentadministration.
      5. Dra ut katetern till vänster mainstem luftrör (samma avstånd som den högra lungan är tillräckliga, tabell 1) och rotera avfasning av katetern ansikten nedåt (figur 6b).
      6. Leverera 30 μL 0,3% EBD med en gel lastning spets till vänster lunga.
      7. Fördela 1 – 2 alikvoter (0,1 – 0,3 mL vardera) luft med hjälp av en glaspipetter.
      8. Dra ut katetern och behåll sedan muspositionen i 30 s. Placera djuret på en värmande filt tills det återfår medvetandet. Återställningen är vanligtvis klar inom 2 minuter.

6. användning av sekventiella IB-kanyleringsmetoder för att leverera dosjusterade volymer av medel till

  1. Grupp för IT-administration
    1. Utför den kanylering enligt beskrivningen i steg 4.1 – 4.11.
    2. Leverera 60 μL av 0,05% FITC-dextran (se tabell över material) med en gel lastnings spets (figur 1b).
    3. Fördela 1 – 2 alikvoter (0,1 – 0,3 mL vardera) luft med hjälp av glas Droppers.
    4. Behåll positionen för 60 s och möjliggöra mus återhämtning enligt beskrivningen ovan.
  2. Symmetrisk bilateral IB-administration
    1. Utför steg 5.3.1.1 – 5.3.1.8 (höger lunga) och steg 5.3.2.1 – 5.3.2.8 (vänster lunga).
    2. Administrera lika volymer (30 μL) av 0,05% FITC-dextran (eller ett experiment medel) på vardera sidan av lungan.
  3. Dosjusterad bilateral IB-administrering
    1. Utför steg 5.3.1.1 – 5.3.1.8 (höger lunga) och steg 5.3.2.1 – 5.3.2.8 (vänster lunga).
    2. Administrera större volym (40 μL) av 0,05% FITC-dextran till den större högra lungan, och en mindre volym (20 μL) av 0,05% FITC-dextran till den mindre vänstra lungan. I stället för FITC-dextran, en experimentell agent kan administreras.

7. användning av Dosjusterad IB-administrering för att förbättra symmetrin hos enkeldos bleomycin (BLM)-inducerad lungskada

  1. BLM-administrationsgrupper
    1. Dosjusterad IB-BLM (1,2 mg/kg, se tabell över material) administrationsgrupp: 60 μl (20 μl för vänsterlunga och 40 μl för höger lunga) av BLM-lösning levererades till möss (n = 5). Kontroller (n = 5) fick liknande volymer saltlösning.
      Anmärkning: se steg 5.3.1 och 5.3.2.
    2. IT-administrationgrupp: 60 μL av BLM-lösningen levererades till möss med IT-administrationstekniker.
      Anmärkning: se steg 6.1.1 – 6.1.4.
  2. Mätning av lung funktion
    1. På dag 21 efter BLM eller saltlösning, söva möss med en intraperitoneal (IP) injektion av ketamin (160 mg/kg) och xylazin (32 mg/kg).
    2. Efter att ha bekräftat djupet av anestesi av Paw/Toe nypa, utföra en trakeostomi med en 18 G kanyl (se tabell över material).
    3. Anslut möss till ventilatorn och mät respiratorisk mekanik enligt tidigare beskrivna4.
  3. Insamling och bearbetning av lung vävnad
    1. Efter mätning av lungmekanik, euthanize de sövda möss av hjärt punktering.
    2. Öppna bröstväggen och framkalla bilaterala pneumothoraces.
    3. Blåsa upp lungor med 1% låg smält-aguppstod (40 ° c)5 i PBS vid ett jämnt tryck (42 cm H2O).
    4. Skär fyra till fem stycken av lungan längs den långa axeln transversely, Fix i 10% formalin, och bädda in paraffin.
    5. Skär 5 μm sektioner och fläcken med Massons trikrom för att visualisera kollagen deposition.

8 efter handläggningen

  1. I slutet av överlevnads procedurer, placera djuret på en värmande filt tills det återfår medvetandet. Återställningen är vanligtvis klar inom 2 minuter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Selektiv IB-intubation riktar sig till specifika lober (höger lunga) eller basilaris segment (vänster lunga).

IB-administrering av EBD till höger lunga utfördes enligt beskrivningen i avsnitt 5,1. Efter avslutad försöket, möss administrerades en dödlig dos av intraperitoneal ketamin/xylazin, och lungor skördades för demonstration av EBD distribution (figur 4a, höger). Brutto utseendet på lungan visar att 90% av försöken kanylerade den lilla bakre LOB av rätt lunga, medan 10% av försöken riktade sämre LOB. Det spekuleras att de små volymerna av dessa lober förklarar kompenserande takypné av musen under distala kanylering (för att bibehålla minutventilation genom katetern).

IB-administrering av EBD till vänster lunga utfördes enligt beskrivningen i avsnitt 5,2. 100% av försöken riktar sig till de sämre segmenten av vänster lunga (figur 4b). I motsats till högersidig intubation sker ingen takypné med detta engagemang, reflekterande intubation (och ventilation) av de större vänstra lung segmenten.

Anpassning av den selektiva IB-kanyltekniken kan riktas till hela vänster eller höger lunga.

När IB-kanylering utförs kan återkallelse av IB-katetern (och förändringar i mus positionering, enligt beskrivningen i avsnitt 5,3) användas för att förbättra leverans av agenter till alla lober av den högra lungan (och alla delar av den vänstra lungan). Instillation av EBD-lösning till höger lunga (avsnitt 5.3.1) riktade framgångsrikt alla högerlober, vilket visas i figur 5c. Instillation av EBD-lösning till vänster lunga (avsnitt 5.3.2) framgångsrikt riktade alla vänstra segment (figur 6C).

IT-administration eller symmetrisk IB-administration ger asymmetrisk lung koncentrationer av parenkymal agent, som kan korrigeras med IB-dosjustering.

Möss genomgick bilateral administrering av 30 μL 0,05% FITC-dextran till vänster lunga och 30 μL 0,05% FITC-dextran till höger lunga enligt beskrivningen i avsnitt 6,2. Alternativt fick möss 60 μL av 0,05% FITC-dextran intratracheally enligt avsnitt 6,1. I slutet av experimentet var möss euthanized via Terminal anestesi överdosering (ketamin/xylazin). Lungorna var omedelbart skördas och homogeniseras. FITC-Fluorescence (kvantifieras med optisk densitet) mättes med 96-brunn Plattläsare. Datum analyserades med Students t-test för jämförelser mellan två grupper.

Som beskrivs i figur 7, har både det (figur 7a) och den symmetriska IB-administreringen (figur 7b) av FITC-dextran lett till asymmetrisk lungparenkymala-fluorescens, med större relativa koncentrationer (normaliserade till vikt) noterade i vänster lunga. Detta tyder på att asymmetrisk lung leverans av experimentella agenter efter IT-administration är inte en följd av asymmetrisk presentation av dessa agenter till varje mainstem bronchus. Snarare var det en hypotes om att lika mainstem leverans (som säkerställs genom symmetrisk IB administration) späddes av skillnader i lung vikter/massa, som observerats i tabell 2.

För att övervinna dessa skillnader i symmetrisk leverans administrerades 40 μL av 0,05% FITC-dextran till den större högra lungan och 20 μL till den mindre vänstra lungan, enligt avsnitt 6,3. Denna "dosjusterade IB-administrering" förbättrade symmetrin för tillförsel av lungparenkymal agent (figur 8a). Trots denna korrigering observerade vi dock ihållande heterogenitet inom olika lober av den högra lungan (figur 8b).

BLM-inducerad lungskada i olika leveranssystem:

För att påvisa att Dosjusterad IB-administrering av försöks agenter kan förbättra modellering av diffus lungsjukdom, har vi administrerat BLM (en musmodell av fibroserande lungskada) antingen intratracheally eller via Dosjusterad IB-administrering, enligt avsnitt 7. som förväntat med denna skademodell ledde både IT-och IB-injektioner av BLM till lungskada och systemisk sjukdom (med viktminskning). Denna systemiska sjukdom försvann i 7 dagar. 21-dagarsdödligheten var 20% (1/5) i IT-gruppen och 0% (0/5) i den dosjusterade IB-gruppen.

21 dagar efter det-eller IB-BLM administration, möss skördats för lunghistologi. Som visats i representativa histologiska bilder (figur 9a),

För att avgöra om denna förbättrade homogenitet från vänster till höger av fibrotisk lungskada är fysiologiskt relevant, observerades att Dosjusterad IB-administrering av BLM förmedlade en mer konsekvent förlust av inspiratorisk kapacitet (IC) och efterlevnad av andningsorganen (CRS), samt en konkordans ökning av andningssystemet elastance (ERS) (figur 9b).

Figure 1
Figur 1: anatomi mus luftvägarna kanylering. (A) en mus luftvägs kastet gjordes genom att blåsa upp en muslunga (skördad från en 25 g mus) med silikonelastomer. (B) kateter placering för standard IT-administration. C) kateter placering för IB-administrering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Bild 2: inställning för arbetsplattformen. (A) en metall bokslut (90 ° vinkel) är böjd till 70 °. Ett skruv hål placeras i den övre mittlinjen för att förankra en rörlig (80 mm x 150 mm). Krok och ögla tejp och en suspenderade suturen är placerade för att möjliggöra positionering av en sövda musen på tavlan. (B) plast brädet är förankrat med en skruv på metall bokslutet. Skruven är tillräckligt lös för att möjliggöra rotation av brädet i en medurs (+) eller motsols (-) riktning. Cen sövda mus placeras med kardborreband (0,75 "W) för IT/IB agentadministration. En sutur är passerat under musen framtänder att tillåta huvud stabilisering. Operatören är placerad vid den dorsala aspekten av musen, och halsen är upplyst via en gås hals lampa. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: skapande av kundanpassade katetrar för IB-administrering. (Steg 1) För att möjliggöra tillräcklig kateter längd för att engagera den mainstem bronkerna, två katetrar kombineras. (Steg 2) Katetrar är anslutna i en liten vinkel, vilket underlättar selektiv intubation till mainstem bronkerna. (Steg 3) Dessutom är den distala kateterspetsen avfasade, vilket möjliggör bättre riktningskontroll av luftvägarna instillation. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: tillvägagångssätt för selektiv höger/vänster lung lobära kanylering och administration. (A) för att rikta rätt lunga, är plast styrelsen roteras + 30 °, att förbättra enkelheten att selektivt engagera rätt mainstem bronchus. Katetern är avancerad (per avstånd som föreslås i tabell 1) för att selektivt engagera högersidig lober. 20 μL 0,3% EBD administrerades. I ~ 90% av försöken, den bakre LOB är kanylerad. De återstående 10% av försöken engagera sämre LOB. (B) för att rikta den vänstra lungan, är plast styrelsen först roteras-74 ° för vänster mainstem engagemang. Efter lyckad intubation av katetern, rotation minskas sedan till-30 ° för att möjliggöra gravitation för att hjälpa till med agent leverans. För att bevisa selektivt engagemang från vänster sida levererades 40 μL 0,3% EBD. Detta tillvägagångssätt konsekvent (100% av försöken) riktade vänster lung basilaris segment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: symmetrisk administration metod för att ensidigt leverera agenter till hela högra lungan. (A) IB-intubation på höger sida utfördes vid + 30 °, identisk med selektiv höger lung lobära-kanylering (figur 4a). (B) plast brädet roteras sedan till-74 ° för att möjliggöra gravitations hjälp underagent administrationen. Katetern spetsen dras sedan till djup som beskrivs i tabell 1, som motsvarar den högra mainstem bronchus. Spetsens avfasning är placerad nedåt genom att vrida kateter navet. C30 μl EBD levererades vid-74 °, vilket bevisar diffus rätt lung administrering av EBD. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Metod för symmetrisk administration att ensidigt administrera agenter till hela vänstra lungan . (A) vänstersidig IB-intubation utfördes vid-74 °, identisk med selektiv vänster lung lobära-kanylering (figur 4b). (B) efter en lyckad intubation, var plast styrelsen roteras sedan + 86 ° för att möjliggöra gravitation hjälp underagent administration. Kateterspetsen dras sedan till djupet som beskrivs i tabell 1. Spetsens avfasning förskjuts nedåt genom att vrida kateter navet. C) 30 μl EBD levererades med gel laddnings spets, vilket bevisar diffus vänster lung administrering av EBD. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: IT-administration av experimentella agenter levereras lika till mainstem bronkerna, men leder till olika lungparenkymala koncentrationer. (A) IT-administration av 0,05% FITC-dextran (60 μl) förmedlade högre fluorescens i den vänstra lungan, vilket tyder på ojämna lungkoncentrationer av levererade medel. (B) denna ojämlika lungparenkymala fluorescens kvarstår även när lika volymer på 0,05% FITC-dextran (30 μl) administreras till varje mainstem bronchus. Denna ihållande parenkymal obalans, trots lika höger/vänster mainstem leverans, tyder på att skillnader i lung agent koncentrationer återspeglar utspädning i den större högra lungan (n = 10 per grupp). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: förbättrad homogenitet hos medel nedfall genom dosjusterat IB administrering. (A) asymmetri i lungparenkymal leverans förbättras när en större andel av medlet (40 μL av 0,05% FITC-dextran) administreras till den större högra lungan och en mindre andel av medlet (20 μL av 0,05% FITC-dextran) till den mindre vänstra lungan. (B) trots denna förbättrade symmetri vänster-höger, finns det fortfarande lobära heterogenitet av agenten deposition (svart: överlägsen LOB; gul: mellersta LOB; blå: sämre LOB; grön: posterior LOB; röd: vänster lung). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: förbättring av mus-och BLM-inducerad lungfibros-modell med Dosjusterad IB-administrering. A) IT-administration av BLM (1,2 mg/kg i 60 μl lösning) inducerar dominerande lungskada/fibros 21 dagar senare, i enlighet med högre lungkoncentrationer av medlet i denna mindre lunga. Vänster-höger symmetri förbättras genom att justera volymen av BLM till varje sida av lungan: 40 μL av lösningen administreras till den större högra lungan och 20 μL av lösningen administreras till den mindre vänstra lungan. I: sämre LOB, M: Middle Lobe, S: överlägsen LOB, P: posterior LOB. Bilder representerar lober från en enda, representativ mus. B) i överensstämmelse med förbättrad symmetri för distributionen förbättrar den DOSJUSTERADE IB-administreringen av BLM fysiologisk modellering av lungfibros, med mer representativa ökningar i andningssystemet elastance (ERS) och minskningar i inandnings kapacitet (IC) och dynamisk respiratorisk efterlevnad (CRS). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kroppsvikt (g) Antal testade möss Kateter djup (mm)
för selektiv kanylering
Kateter djup (mm) för hel lung kanylering
Höger lung Vänster lung
15 - 19 17 37 38 26
20 - 25 22 38 39 27
25 - 30 29 39 40 28
> 30 11 40 41 31

Tabell 1: föreslagna djupet av kateter insättning. Förutspådde kateter djup som krävs för att selektivt kanylera distala och proximala lungor var empiriskt bestäms med C57BL/6 möss av olika vikter (totalt = 79 möss).

Kroppsvikt (g) Antal testade möss Förhållandet mellan lung vikter
14 - 10 25 2,01 ± 0,16
20 - 25 35 1,88 ± 0,27
25 - 30 15 1,88 ± 0,27
> 30 6 2,03 ± 0,09

Tabell 2: höger: vänster lung vikt nyckeltal. Skillnader i lung vikter observerade i 81 C57BL/6 möss visar motiv för korrigerad IB-läkemedelsadministrering. Lungorna dissekeras och vägas efter en dödlig dos av ketamin och xylazin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lung skada har klassiskt modelleras på gnagare med hjälp av IT-administration av skadliga ämnen såsom BLM6. Sådan IT-administration, men leder bara till fläckig skada, vilket återspeglar den icke-riktade karaktären av lung leverans med denna metod7. Dessa begränsningar av modellering lungskada är lärorika utmaningar inför när man försöker IT-leverans av icke-skadevållande experimentella agenter, såsom droger, siRNA, eller cellulära terapier.

I denna rapport beskriver vi den direkta IB-administrationen av försöks agenter. Den här metoden erbjuder två distinkta fördelar jämfört med klassiska metoder för IT-administration. För det första, tillvägagångssättet tillåter selektiv ensidig administration till en lunga, vilket möjliggör sparande av kontralaterala lungan. Detta tillvägagångssätt är användbart för selektiv administrering av läkemedel till en ensidigt skadad lunga (t. ex., ischemia-reperfusion skada8), undvika ospecifika effekter i den oskadade lungan. Vidare, riktad administrering av tumörceller kan användas för att skilja primär tumörtillväxt från kontralateral, metastaserande spridning9,10.

För det andra, rapporten specificerar en tidigare okänd förmån för IB-administrationen. Som beskrivs i figur 7a, IT-administration relativt koncentrat experimentella agenter inom den mindre vänstra lungan. Denna asymmetri kan korrigeras genom att administrera en relativt större volym av medlet till den större högra lungan (tabell 2), samtidigt som den ger en mindre volym till den mindre vänstra lungan (figur 8a). Relevansen av denna dosjusterade IB-administrering till BLM-inducerad fibrotisk lungskada visades här. Dosjustering minskar skadan till vänster lunga (som fick mindre BLM), samtidigt öka skadan på höger lunga (figur 9a). Denna ökade symmetri sammanfaller med minskad variation av lungskador, som kvantifierats genom mätningar av lungfunktion (figur 9b).

Det finns flera kritiska steg i protokollet, inklusive behovet av att ha en monter kan enkelt och upprepade gånger ändra djurens positionering (dvs rotation). Mer kritisk är förmågan att avgöra när selektiv lung kanylering har uppnåtts. Som beskrivs i avsnitt 4,12, användning av en Spirometer (där en vatten kolumn visar tidvatten ventilation) säkerställer en lyckad trakeal kanylering3. Observation av mus takypné är förenligt med distala höger lung segmentet kanylering, medan frånvaron av dyspné (trots känsla motstånd med kateter insättning) föreslog kanylering av vänster lunga. Med hjälp av dessa icke-operativa lokaliserings tekniker ska operatören kunna korrekt vägleda IB-kanylering och försöks agentens deposition.

Den här metoden har flera begränsningar. IT-modellen för agent leverans är attraktiv i sin enkelhet. Det kräver en måttlig grad av övning och teknisk skicklighet, även om en skicklig operatör kan fortfarande snabbt utföra denna teknik inom fönstret för isofluran anestesi. Den ytterligare tekniska skicklighet/praxis som krävs, kan dock lätt kompenseras av fördelen med detta tillvägagångssätt i experiment som prioriterar antingen selektiv agent/siRNA/cell leverans eller ökad homogenitet av medlet nedfall. En ytterligare begränsning av denna metod är osäkerheten om längden på kateter insättning. Som beskrivs i tabell 1, mättes 79 manliga och kvinnliga möss för att uppskatta djupet av kateter införing som krävs för selektiv IB-kanylering. Dessa data fungerar som en resurs för att vägleda operatören att utföra vårt protokoll. Emellertid, vi kan inte tryggt extrapolera vår resurs till andra möss stammar (inklusive knockout möss) eller sjukligt feta möss. Dessutom har vi inte mätt om det finns skillnader i luftrummets volym (lobar, segmentell) som varierar beroende på vikt. Som sådan är det möjligt att stora möss kan rymma större instillation volymer med IB administration. Således bör operatören utföra en initial optimering/Felsökning steg (med EBD instillation) för att säkerställa att vår teknik är väl anpassad till önskad musmodell.

Sammanfattningsrapporten beskriver denna rapport en ny IB-teknik som kan användas för att selektivt administrera försöks agenter till en enda lunga eller anpassas för att säkerställa symmetrisk fördelning i båda lungorna. Dessa fördelar motiverar den marginella ökningen av komplexiteten jämfört med vanliga IT-tekniker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av NHLBI Grant HL125371 to E.P.S. och av DOD (CDMRP) Grant W81XWH-17-1-0051 till Y.Y.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 G shielded IV Catheter BD 381423
Bleomycin Enzo life sciences BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine  DRE Veterinary 9280
Evans blue dye Sigma-Aldrich E2129
FITC-dextran Sigma-Aldrich FD150
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator AmScope LED-30W
Low temperature cautery with fine tip  Bovie AA02
Precisionglide needle, 18G x 1" BD 305195 Beveled tip, 12 mm in length 
Xylazine AKORN NDC 59399-110-20
Zatamine VetOne NDC 13985-702-10  Ketamine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. Journal of Applied Physiology. 106, (3), 984-987 (2009).
  2. Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
  3. Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), 53771 (2016).
  4. McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50172 (2013).
  5. Halbower, A. C., Mason, R. J., Abman, S. H., Tuder, R. M. Agarose infiltration improves morphology of cryostat sections of lung. Laboratory Investigation. 71, (1), 149-153 (1994).
  6. Thrall, R. S., McCormick, J. R., Jack, R. M., McReynolds, R. A., Ward, P. A. Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in the rat: inhibition by indomethacin. American Journal of Pathology. 95, (1), 117-130 (1979).
  7. Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, (3), L379-L399 (2008).
  8. Del Sorbo, L., et al. Intratracheal Administration of Small Interfering RNA Targeting Fas Reduces Lung Ischemia-Reperfusion Injury. Criticial Care Medicine. 44, (8), e604-e613 (2016).
  9. McLemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Research. 47, (19), 5132-5140 (1987).
  10. Vertrees, R. A., et al. Development of a human to murine orthotopic xenotransplanted lung cancer model. Journal of Investigative Surgery. 13, (6), 349-358 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics