초파리 멜라노가스터의 구연산 신타제 활동의 대색 분석

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Biochemistry

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Summary

우리는 Drosophila 조직 균질제에서 온전한 미토콘드리아 질량의 정량화를 위한 구연산염 합성 활성의 색색 분석법을 제시한다.

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Wei, P., Liu, Q., Xue, W., Wang, J. A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (155), e59454, doi:10.3791/59454 (2020).

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Abstract

미토콘드리아는 산화 인산화를 통해 ATP를 생산하고 다양한 생리적 과정을 조절함으로써 세포 대사에서 가장 중요한 역할을 합니다. 미토 콘 드리 아 기능 장애는 다양 한 신진 대사 및 신경 퇴행 성 질환의 주요 원인. 그대로 미토콘드리아는 적절한 기능에 매우 중요합니다. 효소 구연산염 신타제는 미토콘드리아 매트릭스에 국한되어 그대로 미토콘드리아 질량의 정량효소 마커로서 사용될 수 있다. 미토콘드리아에서 중요한 기능을 가진 많은 분자와 통로가 인간과 Drosophila사이에서 높게 보존된다는 것을 감안할 때, 강력한 유전 도구의 배열은 Drosophila에서유효하다는 것을, Drosophila는 미토콘드리아 기능을 공부하기 위한 좋은 모형 시스템 역할을 합니다. 여기서, 우리는 미토콘드리아를 분리하지 않고 성인 파리에서 조직 균질화에서 구연산염 합성 활성의 빠르고 간단한 측정을 위한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 또한 유충, 배양 된 세포 및 포유류 조직에서 구연산염 합성 활성을 측정하는 데 적합합니다.

Introduction

미토콘드리아는 대부분의 진핵 생물에서 전력 생산 세포기관으로 가장 잘 알려져 있으며, 이는 에너지 통화인 ATP를 삼차갈래산 주기(즉, 크렙스 주기) 및 산화 인산화를 통해 생산합니다. 미토콘드리아는 또한 세포사멸1,Ca2+ 항상성2,3,반응성 산화 종(ROS)4세대및 내포성 망상(ER)-스트레스반응의조절과 같은 많은 다른 생리적 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 미토콘드리아 기능 장애는 모든 연령대의 신체에 영향을 미칠 수 있으며 대사, 노화 관련6및 퇴행성 신경 질환의 주요 원인입니다7. 본래 미토콘드리아는 미토콘드리아 기능과 기계적으로 관련이 있습니다. 따라서, 미토콘드리아 질량의 적절한 정량화는 미토콘드리아 기능을 평가하는 데 매우 중요하다8. 구연산 신타제는 트리카르복실산 주기9의제1단계에서 속도 제한 효소로서, 진핵 세포 내의 미토콘드리아 매트릭스에 국한되어 있으며, 따라서 그대로 미토콘드리아 질량9,10의존재에 대한 정량적 마커로서 사용될 수 있다. 구연산염 합성 활성은 또한 온전한 미토콘드리아 단백질11,12에대한 정상화 인자로 사용될 수 있다.

열매 파리, Drosophila melanogaster는미토콘드리아에서 중추적 인 역할을하는 많은 분자 및 경로가 진화적으로 인간13,14,15로보존되기 때문에 미토콘드리아 기능을 연구하기위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 여기서, 우리는 96웰 플레이트 포맷에서16개의 동질성 혈색 분석법에 의한 구연산염 합성 활성의 측정을 위한 빠르고 간단한 방법을 제시한다. 구연산염 합성 활성 분석에서, 구연산염 합성효소는 초파리 조직에서 동질화 촉매 작용을 아세틸 코엔자임 A(아세틸 CoA)와 함께 옥살로아세테이트의 반응을 형성하여 구연산염 CoA-SH 및H+를형성한다. CoA-SH는 이어서 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산)(DTNB)와 반응하여 412 nm에서 분광광도 측정을 쉽게 측정할 수 있는 2-니트로-5-티오벤조에이트(TNB)의 유색 생성제품을 생성합니다. 구연산염 합성 활성은 색상 생산의 속도에 의해 반영될 수 있다.

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Protocol

1. D. 멜라노가스터에대한 대색 구연산 신타제 활동 분석16

  1. 각 샘플에 대해 10 개의 성인 파리를 수집합니다. 각 유전자형에 대해 적어도 세 배의 샘플을 수집합니다.
  2. 각 시료에 대해 1.5 mL 시험관에서 20 mM HEPES (pH = 7.2), 1 mM EDTA 및 0.1 % 트리톤 X-100을 포함하는 얼음 차가운 추출 완충액 500 μL을 준비합니다.
  3. 성인이 마취 패드에CO2로 파리를 마취하고 원하는 조직을 분리. 예를 들어, 성인 플라이 흉부들을 분리하기 위해 한 쌍의 포셉으로 플라이 흉부를 고정한 다음 가위를 사용하여 흉부와 복부의 경계를 따라 절단하여 플라이 복부를 분리합니다. 근육 구연산염 합성 활성 분석에 대한 플라이 토락을 수집합니다.
    참고 : 구연산염 합성 활동을 정상화하는 데 사용하는 경우이 단계에서 조직의 신선한 무게를 결정하십시오.
  4. 10 명의 성인 플라이 토락을 얼음 차가운 추출 완충액 100 μL로 즉시 옮기고 얼음에 유봉으로 균질화하십시오. 샘플을 얼음 차가운 상태로 유지하려면 얼음에 5-10 초 동안 샘플을 균질화 한 다음 샘플을 5 s용 얼음에 앉게하고 튜브의 모든 조직이 완전히 균질화 될 때까지 반복하십시오.
    참고 : 튜브테이프, 균질화에 혈전이 없는지, 튜브의 조직이 완전히 균질화되었는지 확인하십시오. 모든 샘플 처리는 얼음에서 수행해야합니다.
  5. 단백질 함량 측정을 위해 새로운 튜브에서 각 균질화된 샘플의 10 μL을 섭취하십시오. 얼음에 단백질 측정을 위해 샘플을 보관하십시오.
    참고: 단백질 샘플을 동결하여 나중에 분석을 위해 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 단백질 농도 구연산 염 합성 활동의 정상화에 대 한 내부 매개 변수 역할을.
  6. 남은 각 시료에 400 μL의 얼음-차가운 추출 버퍼를 추가하여 총 부피를 500 μL로 만듭니다. 각 반응에 대해, 1 μL의 희석 된 세포 용해액을 150 μL의 신선하게 제조 된 반응 용액 (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM DTNB, 0.3 mM 아세틸 CoA, 1 mMoxaloacetic 산)을 추가합니다. 거품 형성을 피하면서 부드럽게 파이펫팅하여 철저하고 즉시 섞으세요. 최소 10초 간격으로 412 nm에서 흡광도를 측정할 수 있는 플레이트 리더를 사용하여 25°C에서 4분 동안 10-30초마다 412 nm에서 흡광도를 측정합니다.
    참고: 다른 시약을 파이펫팅하기 전에 팁을 변경하고 웰에서 거품이 형성되지 않도록 하십시오. 시약의 불완전혼합은 측정에 변화를 일으킬 수 있다. 구연산염 합성 활성 분석은 시료가 수집된 직후 실온에서 수행되어야 하며, 이 분석제는 그대로 미토콘드리아 질량을 정량화하는 데 사용된다. 반응 버퍼는 사용 직전에 준비해야 하며 저장해서는 안 됩니다.
  7. 광 밀도(OD) 흡광도(abs) 대 시간(분) (X축)으로 데이터를 플롯합니다. 그런 다음 반응 속도가 있는 곡선의 선형 부분에 대한 경사를 계산합니다.



    구연산염 합성 활성을 정규화하기 위해 시료 단백질 농도로 값을 나눈다. 구연산염 합성 활성은



    참고: 샘플 단백질 농도는 단백질 농도 분석 키트에 의해 측정될 수 있다.

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Representative Results

도 1은 상이한 유전자형의 Drosophila 흉부 조직 균질화를 측정하기 위해 구연산염 합성 활성 색인식 분석법을 사용하여 얻은 시간이 지남에 따라 412 nm에서 의 OD 흡광도에 대한 운동 곡선의 예를 제시한다. PGC-1α는 미토콘드리아 생물발생의 마스터 레귤레이터라는 것은 잘 알려져 있습니다. PGC-1α는 초파리와 인간 사이에서 기능적으로 보존된다. 초파리 RNF34(dRNF34)는 초파리 PGC-1α, dPGC-1에 대한 E3 유비퀴틴 리가제이며, dPGC-1 단백질분해를 촉진한다 17. 전송 전자 현미경 및 미토콘드리아 DNA qPCR은 dPGC-117의녹다운에 의해 억압되는 미토콘드리아 함량을 증가시키는 초파리 근육에서 dRNF34의 녹다운을 보여주었다. 이러한 결과에 따라 우리는 drosophila 근육에 dRNF34의 녹다운 미토콘드리아 구연산염 합성 활동을 증가 시킬 것 이라고 가설, dPGC-1의 녹다운에 의해 반전 해야 하는. 실제로, 여기에 설명된 구연산염 합성 활성의 색색 분석법을 사용하여, 우리는 drosophila 근육에서 dRNF34의 녹다운이 dPGC-1의 녹다운에 의해 반전된 미토콘드리아 구연산염 합성 활성을 증가시키는 것을 발견했습니다. 구체적으로 여기에 기술된 방법을 사용하여, 각 분석법에 대해 초기 선형 효소 레이트(d.s)가 확립되었다(도1). 수식과 결정 계수가 있는 추세선(R2)은 그래프(그림1)에나타내었습니다. 추세선의 경사는 다른 유전자형의 최대 구연산염 합성 활동과 동등한 최대 반응 속도를 나타냅니다. 다른 유전자형에 대한 경사는 다릅니다(그림 1). 결정 계수는 1에 가깝습니다. 추세선의 수식은 더 신뢰할 수 있습니다. 상이한 유전자형의 단백질 농도 정규화 최대 구연산염 합성 활동은 도 1 데이터로부터 계산하였다(도2). 근육 특이적 dRNF34 녹다운을 가진 플라이 토락의 최대 구연산염 합성 활성이 증가하였고, 이는 근육 특이적 dPGC-1 녹다운에 의해 반전되었다(그림2).

Figure 1
도 1: 구연산염 합성 활성의 비색 분석에 대한 운동 곡선의 예. (a)24B-Gal4>+(b)24B-Gal4>dRNF34RNAi(II) 및(c)24B-Gal4>dRNF34RNAi(II), dPGC-1RNAi의 대흉균균을 시테라테스의 유색 분석기를 실시하였다. 수평 축은 반응 시간을 나타내고 수직 축은 412nm의 OD 흡수를 나타냅니다. 각 유전자형에 대해 선형 효소 비율이 확립되었습니다. 추세선이 그려지고 추세선의 수식과R2가 그래프에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 운동 곡선으로부터 계산되고 단백질 농도에 의해 정규화된 최대 구연산염 합성 활동. 근육 특이적 dRNF34 녹다운을 가진 플라이 토락스의 최대 구연산염 합성 활동은 증가하였고, 이는 근육 특이적 dPGC-1 녹다운에 의해 반전되었다. 모든 데이터는 ANOVA 테스트에 의해 ± SEM (*p < 0.01, 및 복제당 n = 3, 10 thoraxes)에 대한 Tukey의 테스트로 표시됩니다. 이 그림은 웨이 외17에서수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

Drosophila를 모델로 사용하는 신진 대사 연구는 파리의 유전적 배경, 식단 및 재고 유지 를 고려해야합니다18. 구연산염 합성 활동의 측정에 다른 유전 적 배경의 영향을 피하기 위해, 초파리의 다른 변종은 10 세대에 대한 제어 균주에 역교차되어야한다. 우리의 실험에 사용된 모든 Drosophila 긴장의 유전 배경은 w1118입니다,그래서 우리는 대조군으로 w1118를 이용했습니다. 일반적으로, 우리는 w1118이 대부분의 Drosophila 긴장에 대한 유전 적 배경이며 캔톤-S보다 백크로스가 훨씬 쉽기 때문에 좋은 통제라고 생각합니다. 식이 요법과 재고 유지 보수는 모든 실험 그룹에 대해 정확히 동일해야합니다. 우리의 실험에서, 파리는 일반적으로 25 °C와 50-60 % 상대 습도에서 유지됩니다. 샘플 준비 단계도 주의해서 수행해야 합니다. 실험에 대해 설정된 십자가는 비슷하고 적절한 규모여야 합니다. 십자가를 설정하기 위해, 3-4 여성 처녀 성인 파리는 신선한 음식과 함께 공급 4cm 직경, 15cm 높은 유리병에 2-3 남성 성인 파리로 유지됩니다. 식품 조리법은 실험 설계에 따라 다를 수 있습니다 (예를 들어, 고지방 식단, 정상적인 식단, 높은 설탕 다이어트). 이틀 후, 파리의 부모 세대는 신선한 음식과 함께 새로운 유리병으로 옮겨질 것입니다. 음식에 부화 애벌레에 대 한 돌보는 포함 필요한 경우 몇 가지 물을 추가. 파리의 filial 생성이 부화하기 시작하면, 바이알은 매 24 시간마다 뒤집히고, 원하는 유전자형의 파리는 실험을 위한 새로운 바이알에서 수집되고, 파리의 해치 날짜는 각 바이알에 표시됩니다. 대략 20-30는 동일 유전자형, 성별 및 나이의 집합된 파리가 음식과 유리병에 보관됩니다. 수집된 파리는 실험이 수행될 때까지 2일마다 적절한 음식과 함께 신선한 바이알로 옮겨야 합니다. 구연산염 합성 활동에 대한 나이의 영향을 피하기 위해, 테스트 된 다른 그룹의 파리는 같은 날에 부화해야합니다. 또한 파리의 성별이 일치해야합니다. 일반적으로 여성의 신체 크기는 남성의 몸 크기보다 크므로 여성의 신체의 단백질 농도는 남성의 몸보다 높습니다.

구연산염 합성 활성 분석은 또한 애벌레에서 구연산염 합성 활성을 측정하는데 사용될 수 있다. 이를 위해, 각 샘플은 5개의 방황하는 세 번째 유충으로 구성될 수 있다. 세 번째 별 유충은 두 번째 인스타 애벌레에 부족하거나 약하게 존재하는 후방 첨탑의 끝에 어두운 주황색 고리로 구별 될 수 있습니다.

6단계에서, 시료의 희석비는 상이한 샘플에 대해 달라질 수 있다. 먼저 측정되는 시료의 경우, 여러 가지 희석비를 분석에서 선형 효소 레이트(선형 효소 레이트)를 확립하기 위해 적절한 희석비를 결정해야 한다. 분석에서 선형 효소 속도를 확립하는 최대 효소 활성에 대한 총 측정 시간은 효소 기질 비에 따라 다양하다. 기질이 효소에 비해 극단적으로 과다 복용되면 효소 활성 또는 반응 속도가 최대에 도달하므로 분석에서 선형 효소 속도를 확립 할 수 있습니다. 반응이 진행됨에 따라 기질의 양이 감소하고 효소 활성 또는 반응 속도가 느려집니다. 선형 효소 비율을 플로팅할 수 없는 경우, 이는 기질이 효소에 비해 과다 복용되지 않음을 의미하며, 조직 균질화를 반응 용액으로 더 희석하거나 선형 효소 속도 플롯이 될 때까지 412 nm 판독값에 대한 간격 시간을 단축하는 것입니다. 설립. 412 nm 판독의 간격 시간은 30s를 넘지 않아야 합니다. 412 nm 판독의 지속 시간은 반응 속도 및 시간을 기준으로 합니다. 분광광도계 판독은 모든 반응에 대해 더 이상 색상 변화가 관찰되지 않을 때 중지되어야 합니다.

구연산염 합성활성은 샘플 단백질 농도, 샘플 신선한 중량, 또는 세포 수에 의해 정규화될 수 있다. 샘플 신선한 중량은 3단계에서와 같이 균질화되기 전에 측정될 수 있다. 세포 번호는 또한 배양된 세포의 용해를 정규화하기 위하여 이용될 수 있습니다, 그러나 세포는 완전히 용해되어야 합니다. DNA 함량은 DNA 추출 절차가 샘플의 변이를 소개 할 수 있기 때문에, 특히 소량의 DNA를 포함하는 샘플에 대한 내부 제어를위한 좋은 옵션이 아닙니다.

반응 후 색상 변화가 관찰되지 않으면 다음과 같은 여러 가지 문제 해결 단계를 수행할 수 있습니다.
1. 시료 준비 단계를 확인하고 샘플을 올바르게 처리하고 샘플을 얼음 위에 보관하고 여러 번 의 동결 해동 주기를 피하십시오.
2. 일부 샘플은 구연산염 합성 활성 분석에 의해 감지 할 수없는 구연산염 합성의 훨씬 낮은 발현 수준을 가질 수 있기 때문에, 더 높은 단백질 농도를 사용하려고합니다.
3. 구연산염 합성 활성 분석에 대한 일부 시판 키트는 Drosophila에사용될 수 없으며, 이러한 키트는 포유류 구연산염 합성체 및 포유류 구연산염 synthase의 면역 포착에 기초한 미토콘드리아 구연산 합성 활성을 결정하기 때문에 Drosophila 구연산염 합성체를 인식하지 못할 수 있습니다.

마찬가지로 샘플 간에 불일치가 있는 경우:
1. 우물에 거품이 없는지 확인합니다.
2. 이것이 가난한 파이펫팅 기술로 인한 것인지 검사하십시오.

정제된 미토콘드리아에서 비색 분석법에 의한 구연산 합성 활성을 측정하는 것과는 대조적으로, 각 유전자형19의미토콘드리아의 정제를 위해 거의 200개의 파리가 필요하며, 조직 호모게네이트 또는 전체 세포 추출물에서16개의비색 방법으로 구연산염 합성 활성을 측정하기 위한 빠르고 간단한 분석 프로토콜을 제시한다. 각 샘플에 대해 같은 날에 부화한 파리는 10개만 필요합니다. 각 유전자형의 삼중종 샘플의 경우 30개의 파리가 필요합니다. 기재된 프로토콜은 Drosophila뿐만 아니라 배양 된 세포 및 포유류 조직과 같은 다른 시스템에도 적용 가능하다.

구연산염 합성 활성 분석법 외에, 다른 방법은 미토콘드리아 질량을 정량화하는데 사용될 수 있다. qPCR에 의한 미토콘드리아 DNA 함량의 측정 및 그들의 기능에 관계없이 모든 미토콘드리아를 검출하는 서양 블로팅에 의한 미토콘드리아 단백질의 정량화와 같은 미토콘드리아의 다른 일반적으로 사용되는 정량적 방법과 비교하여, 구연산염 합성 활성 분석법은 그대로 미토콘드리아 질량의 존재를 정량화하는 데 사용된다. 미토콘드리아 정화 및 전문 분석장비(16)가필요한 미토콘드리아 호흡 분석과 달리, 구연산염 합성 활성 분석법은 연구원이 전체 세포 추출물 또는 조직 균질화와 같은 간단한 시료 준비로 분광광도법에 의한 신속한 측정을 수행할 수 있게 해주며, 미토콘드리아 분리가 필요하지 않습니다. 따라서, 구연산염 합성 활성 분석제는 온전한 미토콘드리아 질량의 정량화를 위한 신속하고 경제적인 분석이다.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (31401013 및 31471010), 상하이 시 과학 기술위원회, 상하이 푸장 프로그램 (14PJ1405900), 그리고 자연 과학 재단의 보조금에 의해 지원되었다 상하이 (19ZR1446400).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich V900477
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) Sigma-Aldrich V900483
Acetyl-CoA Sigma-Aldrich A2181
Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) Sigma-Aldrich D8130
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich V900106
Oxaloacetate Sigma-Aldrich O4126
Pellet pestle Sangon F619072
Pellet pestle motor Tiangen OSE-Y10
Plate reader BioTek Eon
Protein BCA Assay kit Beyotime P0010S
Scissors WPI 14124
Triton X-100 Sangon A110694-0100

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References

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