Ein kolorimetrischer Test der Citrat-Synthase-Aktivität in Drosophila Melanogaster

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Biochemistry

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Summary

Wir präsentieren ein Protokoll für einen kolorimetrischen Test der Citratsynthase-Aktivität zur Quantifizierung intakter mitochondrialer Masse in Drosophila-Gewebehomogenaten.

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Wei, P., Liu, Q., Xue, W., Wang, J. A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (155), e59454, doi:10.3791/59454 (2020).

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Abstract

Mitochondrien spielen die wichtigste Rolle im Zellstoffwechsel, indem sie ATP durch oxidative Phosphorylierung produzieren und eine Vielzahl von physiologischen Prozessen regulieren. Mitochondriale Dysfunktion ist eine primäre Ursache für eine Reihe von metabolischen und neurodegenerativen Erkrankungen. Intakte Mitochondrien sind entscheidend für ihr ordnungsgemäßes Funktionieren. Das Enzym Citratsynthase ist in der mitochondrialen Matrix lokalisiert und kann somit als quantitativer Enzymmarker intakter mitochondrialer Masse verwendet werden. Angesichts der Tatsache, dass viele Moleküle und Wege, die wichtige Funktionen in Mitochondrien haben, sind stark zwischen Menschen und Drosophilakonserviert, und dass eine Reihe von leistungsfähigen genetischen Werkzeugen in Drosophilazur Verfügung stehen, Drosophila dient als ein gutes Modellsystem für die Untersuchung mitochondriale Funktion. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur schnellen und einfachen Messung der Citrat-Synthase-Aktivität in Gewebehomogenat von erwachsenen Fliegen, ohne Mitochondrien zu isolieren. Dieses Protokoll eignet sich auch zur Messung der Citratsynthase-Aktivität in Larven, kultivierten Zellen und Säugetiergeweben.

Introduction

Mitochondrien sind am besten bekannt als die kraftproduzierenden Organellen in den meisten eukaryotischen Organismen, die die Energiewährung ATP durch den Tricarbonsäurezyklus (d.h. Krebs-Zyklus) und oxidative Phosphorylierung produzieren. Mitochondrien werden auch gefunden, um wichtige Rollen in vielen anderen physiologischen Prozessen zu spielen, wie Regulierung der Apoptose1, Ca2+ Homöostase2,3, reaktive Oxidation Spezies (ROS) Generation4, und endoplasmisches Retikulum (ER)-Stress-Antwort5. Mitochondriale Dysfunktion kann jedes Organ im Körper in jedem Alter beeinflussen und ist eine primäre Ursache für metabolische, Alterungs-bedingte6, und neurodegenerative Erkrankungen7. Intakte Mitochondrien sind mechanistisch mit der mitochondrialen Funktion verwandt. Daher ist eine korrekte Quantifizierung der intakten mitochondrialen Masse sehr wichtig für die Bewertung der mitochondrialen Funktion8. Citrat-Synthase, ein ratenbegrenzendes Enzym im ersten Schritt des Tricarbonsäurezyklus9, ist in der mitochondrialen Matrix innerhalb eukaryotischer Zellen lokalisiert und kann daher als quantitativer Marker für das Vorhandensein intakter mitochondrialer Masse9,10verwendet werden. Citrat-Synthase-Aktivität kann auch als Normalisierungsfaktor für intakte mitochondriale Proteine11,12verwendet werden.

Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, ist ein ausgezeichnetes Modellsystem für das Studium der mitochondrialen Funktion, da viele Moleküle und Wege, die eine zentrale Rolle in Mitochondrien spielen, evolutionär von Drosophila bis zum Menschen konserviert werden13,14,15. Hier stellen wir ein Protokoll zur schnellen und einfachen Methode zur Messung der Citrat-Synthase-Aktivität durch einen kolorimetrischen Assay in Drosophila-Gewebehomogenaten 16 in einem 96-Well-Platten-Format vor. Im Citrat-Synthase-Aktivitätstest katalysiert Citrat-Synthase in Drosophila-Gewebehomogenat die Reaktion von Oxaloacetat mit Acetylcoenzym A (Acetyl CoA) zu dem Citrat CoA-SH und H+. CoA-SH reagiert anschließend mit 5,5'-Dithiobis-(2-Nitrobenzoesäure) (DTNB) und erzeugt ein farbiges Produkt, 2-Nitro-5-Thiobenzoat (TNB), das bei 412 nm spektrophotometrisch leicht gemessen werden kann. Die Citrat-Synthase-Aktivität kann durch die Rate der Farbproduktion widergespiegelt werden.

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Protocol

1. Colorimetric Citrat Synthase Activity Assay für D. melanogaster16

  1. Sammeln Sie zehn erwachsene Fliegen für jede Probe. Sammeln Sie mindestens dreifache Proben für jeden Genotyp.
  2. Bereiten Sie 500 l eiskalten Extraktionspuffer mit 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA und 0,1% Triton X-100 in einem 1,5 ml Reagenzglas für jede Probe vor.
  3. Anästhesisieren Sie erwachsene Fliegen mit CO2 auf einem Anästhesiepad und isolieren Sie die gewünschten Gewebe. Um die erwachsenen Fliegenbrustzuale zu isolieren, zum Beispiel, fixieren Sie die Fliegenbrust durch ein Paar Zange, und dann isolieren Sie den Fliegenbauch, indem Sie entlang der Grenze des Thorax und Bauch mit einer Schere schneiden. Sammeln Sie die Fliegenbrustaxen für die Muskelcitrat-Synthase-Aktivität Assay.
    HINWEIS: Bestimmen Sie das frische Gewicht des Gewebes in diesem Schritt, wenn Sie es verwenden, um die Citrat-Synthase-Aktivität zu normalisieren.
  4. 10 erwachsene Fliegenthoraxes sofort auf 100 L eiskalten Extraktionspuffer übertragen und mit einem Stößel auf Eis homogenisieren. Um die Proben eiskalt zu halten, homogenisieren Sie die Proben für 5-10 s auf Eis, dann lassen Sie die Proben 5 s auf dem Eis sitzen und wiederholen Sie, bis alle Gewebe in der Röhre vollständig homogenisiert sind.
    HINWEIS: Verkleben Sie das Rohr, überprüfen Sie die Homogenate, um sicherzustellen, dass sich keine Gerinnsel in den Homogenaten befinden und dass die Gewebe im Rohr vollständig homogenisiert sind. Alle Probenbehandlungen sollten auf Eis durchgeführt werden.
  5. Nehmen Sie 10 l jeder homogenisierten Probe in einem neuen Rohr für die Messung des Proteingehalts. Bewahren Sie die Proben für die Proteinmessung auf Eis auf.
    HINWEIS: Die Proteinproben können eingefroren und bei -80 °C für eine spätere Analyse gelagert werden. Die Proteinkonzentrationen dienen als interner Parameter für die Normalisierung der Citrat-Synthase-Aktivitäten.
  6. Fügen Sie jeder verbleibenden Probe 400 l eiskalten Extraktionspuffer hinzu, um ein Gesamtvolumen von 500 l zu erzielen. Mischen Sie gut, indem Sie mindestens 5x nach oben und unten pfeifen, wodurch Blasenbildung vermieden wird. Für jede Reaktion 1 l verdünntes Zelllysat zu 150 l der frisch zubereiteten Reaktionslösung (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM DTNB, 0,3 mM Acetyl-CoA, 1 mM Oxaloessigsäure) hinzufügen. Mischen Sie gründlich und sofort durch sanfte Pipettierung, Vermeidung von Blasenbildung. Messen Sie die Absorption bei 412 nm alle 10-30 s für 4 min bei 25 °C mit einem Plattenleser, der in der Lage ist, die Absorption bei 412 nm in minimalen Intervallen von 10 s zu messen.
    HINWEIS: Ändern Sie die Spitze, bevor Sie ein anderes Reagenz pipetieren, und vermeiden Sie das Bilden von Blasen in den Brunnen. Eine unvollständige Vermischung der Reagenzien kann zu Abweichungen in den Messungen führen. Der Citrat-Synthase-Aktivitätstest sollte bei Raumtemperatur unmittelbar nach der Entnahme der Proben durchgeführt werden, da dieser Assay verwendet wird, um intakte mitochondriale Masse zu quantifizieren. Der Reaktionspuffer sollte unmittelbar vor Gebrauch vorbereitet und nicht gespeichert werden.
  7. Plotdaten als optische Dichte (OD) Absorption (abs) (Y-Achse) im Vergleich zur Zeit (in Minuten) (X-Achse). Berechnen Sie dann die Steigung für den linearen Teil der Kurve, wobei die Reaktionsgeschwindigkeit



    Dividieren Sie den Wert durch die Probenproteinkonzentration, um die Citratsynthase-Aktivität zu normalisieren. Die Citrat-Synthase-Aktivität wird als



    HINWEIS: Die Probenproteinkonzentration kann mit einem Proteinkonzentrations-Assay-Kit gemessen werden.

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für die kinetischen Kurven für die OD-Absorption bei 412 nm im Zeitverlauf, die mit hilfe des kolorimetrischen Assays der Citrat-Synthase-Aktivität zur Messung der Drosophila Thoraxgewebehomogenate verschiedener Genotypen erhalten wurden. Es ist allgemein bekannt, dass PGC-1a ein Master Regulator der mitochondrialen Biogenese ist. PGC-1 ist funktionell zwischen Drosophila und Menschen konserviert. Drosophila RNF34 (dRNF34) ist eine E3-Ubiquitinligase für Drosophila PGC-1, dPGC-1, und fördert den DPGC-1-Proteinabbau17. Transmissionselektronenmikroskopie und mitochondriale DNA qPCR haben gezeigt, dass der Knockdown von dRNF34 in Drosophila-Muskeln den mitochondrialen Gehalt erhöht, der durch den Knockdown von dPGC-11 unterdrückt wird. Basierend auf diesen Ergebnissen vermuteten wir, dass Knockdown von dRNF34 in Drosophila Muskel mitochondriale Citrat-Synthase-Aktivität erhöhen würde, die durch Knockdown von dPGC-1 umgekehrt werden sollte. In der Tat, mit dem farbmetrischen Assay der Citrat-Synthase-Aktivität hier beschrieben, fanden wir, dass Knockdown von dRNF34 in Drosophila Muskel erhöhte mitochondriale Citrat-Synthase-Aktivität, die durch Knockdown von dPGC-1 umgekehrt wurde. Speziell mit der hier beschriebenen Methode wurde für jeden Test eine erste lineare enzymatische Rate festgelegt (Abbildung 1). Die Trendlinien mit ihren Formeln und dem Bestimmungskoeffizienten (R2) sind in der Grafik dargestellt (Abbildung 1). Die Steigungen der Trendlinien stellen die maximalen Reaktionsraten dar, die Äquivalenten der maximalen Citrat-Synthase-Aktivitäten der verschiedenen Genotypen sind. Die Steigungen für die verschiedenen Genotypen sind unterschiedlich (Abbildung 1). Der Bestimmungskoeffizient liegt näher bei 1; die Formeln der Trendlinien sind zuverlässiger. Die proteinkonzentration normalisierte maximale Citratsynthase-Aktivitäten verschiedener Genotypen wurden aus den Abbildung 1 Daten berechnet (Abbildung 2). Die maximale Citrat-Synthase-Aktivität von Fliegenthoraxen mit muskelspezifischem dRNF34-Knockdown nahm zu, was durch muskelspezifischen dPGC-1-Knockdown umgekehrt wurde (Abbildung 2).

Figure 1
Abbildung 1: Ein Beispiel für die kinetischen Kurven für den kolorimetrischen Test der Citratsynthase-Aktivität. Die erwachsenen Fliegenthoraxhomogenate von (a) 24B-Gal4>+ (b) 24B-Gal4>dRNF34RNAi(II) und (c) 24B-Gal4>dRNF34RNAi(II),dPGC-1RNAi wurden dem kolorimetrischen Assay der Citratsynthase-Aktivität unterzogen. Die horizontalen Achsen stellen Reaktionszeiten dar, und die vertikalen Achsen stellen OD-Absorptionen bei 412 nm dar. Für jeden Genotyp wurde eine lineare enzymatische Rate festgelegt. Die Trendlinien wurden gezeichnet und die Formeln und R2 der Trendlinien werden im Diagramm dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Die maximalen Citrat-Synthase-Aktivitäten, die aus den kinetischen Kurven berechnet und durch die Proteinkonzentration normalisiert werden. Die maximale Citrat-Synthase-Aktivität von Fliegenthoraxen mit muskelspezifischem dRNF34-Knockdown nahm zu, was durch muskelspezifischen dPGC-1-Knockdown umgekehrt wurde. Alle Daten werden als Mittel dargestellt: SEM (*p < 0,01, durch ANOVA-Test und Tukeys Test für mehrfache Vergleiche, n = 3, 10 Thoraxes pro Replikation). Diese Zahl wurde von Wei et al.17geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Metabolische Studien mit Drosophila als Modell müssen den genetischen Hintergrund, die Ernährung und die Bestandspflege der Fliegen berücksichtigen18. Um die Auswirkungen unterschiedlicher genetischer Hintergründe auf die Messung der Citrat-Synthase-Aktivität zu vermeiden, sollten verschiedene Stämme von Drosophila für 10 Generationen auf den Kontrollstamm zurückgekreuzt werden. Der genetische Hintergrund aller Drosophila-Stämme, die in unseren Experimenten verwendet werden, ist w1118, also haben wir w1118 als Kontrolle verwendet. Im Allgemeinen denken wir, dass w1118 eine gute Kontrolle ist, da es der genetische Hintergrund für die meisten Drosophila-Stämme ist und viel einfacher zu backcrossen ist als Canton-S. Die Ernährung und die Bestandspflege müssen für alle Versuchsgruppen genau gleich sein. In unseren Experimenten werden Fliegen normalerweise bei 25 °C und 50-60% relativer Luftfeuchtigkeit gehalten. Der Probenvorbereitungsschritt sollte ebenfalls mit Vorsicht durchgeführt werden. Die Kreuze, die für das Experiment eingerichtet sind, sollten in einem ähnlichen und geeigneten Maßstab sein. Um ein Kreuz aufzustellen, werden 3-4 weibliche Jungfräuleinfliegen mit 2-3 männlichen erwachsenen Fliegen in einem Durchmesser von 4 cm gehalten, 15 cm hohe Durchstechflasche mit frischem Futter. Je nach versuchsweiseer Gestaltung kann das Lebensmittelrezept variieren (z.B. fettreiche Ernährung, normale Ernährung, zuckerreiche Ernährung). Zwei Tage später wird die elternde Generation von Fliegen in ein neues Fläschchen mit frischem Essen übertragen. Die Pflege der Larven, die in der Nahrung geschlüpft sind, beinhaltet, wenn nötig etwas Wasser hinzuzufügen. Wenn die kindliche Generation der Fliegen zu schlüpfen beginnt, werden die Fläschchen alle 24 h umgedreht, die Fliegen des gewünschten Genotyps werden in einer neuen Durchstechflasche für das Experiment gesammelt und das Schraffurdatum der Fliegen auf jeder Durchstechflasche markiert. Etwa 20-30 gesammelte Fliegen des gleichen Genotyps, Geschlechts und Alters werden in einer Durchstechflasche mit Nahrung aufbewahrt. Die gesammelten Fliegen müssen alle zwei Tage bis zur Durchgeführtder Experimente auf frische Fläschchen mit entsprechender Nahrung übertragen werden. Um die Auswirkungen des Alters auf die Citrat-Synthase-Aktivität zu vermeiden, sollten die Fliegen der verschiedenen getesteten Gruppen am selben Tag schlüpfen. Darüber hinaus sollte das Geschlecht der Fliegen abgestimmt werden. In der Regel ist die Körpergröße von Frauen größer als die von Männern, daher ist die Proteinkonzentration weiblicher Körper höher als die von männlichen Körpern.

Der Citrat-Synthase-Aktivitäts-Assay kann auch zur Messung der Citrat-Synthase-Aktivität bei Larven verwendet werden. Zu diesem Zweck kann jede Probe aus fünf wandernden dritten Insternlarven bestehen. Die dritte Instar-Larven kann durch einen dunkelorangefarbenen Ring an der Spitze ihrer hinteren Spiracles unterschieden werden, der in den zweiten Instarlarven fehlt oder schwach vorhanden ist.

In Schritt 6 können die Verdünnungsverhältnisse von Proben für verschiedene Proben variieren. Für die zuerst gemessenen Proben müssen mehrere Verdünnungsverhältnisse versucht werden, um ein geeignetes Verdünnungsverhältnis zu bestimmen, um eine lineare enzymatische Rate im Test zu ermitteln. Die Gesamtmesszeit für die maximale Enzymaktivität, die eine lineare enzymatische Rate im Test festlegt, variiert je nach Enzym-Substrat-Verhältnis. Wenn das Substrat im Vergleich zum Enzym extrem überdosiert ist, erreicht die Enzymaktivität oder die Reaktionsgeschwindigkeit maximal, was die Etablierung einer linearen enzymatischen Rate im Assay ermöglicht. Im Anfall der Reaktion nimmt die Menge des Substrats ab, und die Enzymaktivität oder die Reaktionsgeschwindigkeit verlangsamt sich. Wenn eine lineare enzymatische Rate nicht dargestellt werden kann, was bedeutet, dass das Substrat im Vergleich zum Enzym nicht überdosiert ist, verdünnen Sie die Gewebehomogenate mit Reaktionslösung weiter oder verkürzen Sie die Intervallzeit für die 412 nm Messwerte, bis ein lineares enzymatisches Ratendiagramm etabliert. Die Intervallzeit für den 412 nm-Messwert sollte nicht mehr als 30 s betragen. Die Dauer des 412 nm-Messwerts basiert auf der Reaktionsgeschwindigkeit und der Zeit. Der Spektralphotometer-Messwert sollte aufhören, wenn bei allen Reaktionen keine weitere Farbänderung beobachtet wird.

Die Citrat-Synthase-Aktivität kann durch die Probenproteinkonzentration, das Probenfrische Gewicht oder die Zellnummer normalisiert werden. Das Probenfrische Gewicht kann vor der Homogenisierung wie in Schritt 3 gemessen werden. Die Zellenzahl kann auch verwendet werden, um das Lysat von kultivierten Zellen zu normalisieren, aber die Zellen müssen vollständig lysiert werden. Der DNA-Gehalt ist keine gute Option für eine interne Kontrolle, da das DNA-Extraktionsverfahren Variationen in den Proben einführen kann, insbesondere bei Proben, die eine geringe Menge an DNA enthalten.

Wenn nach der Reaktion keine Farbänderung beobachtet wird, können verschiedene Schritte zur Fehlerbehebung durchgeführt werden:
1. Überprüfen Sie den Probenvorbereitungsschritt, stellen Sie sicher, dass die Proben richtig behandelt werden, halten Sie die Proben auf Eis und vermeiden Sie mehrere Gefrierzyklen.
2. Versuchen Sie, eine höhere Proteinkonzentration zu verwenden, da einige Proben möglicherweise viel niedrigere Expressionsniveaus der Citrat-Synthase haben, die durch den Citrat-Synthase-Aktivitätstest nicht nachweisbar sind.
3. Beachten Sie, dass einige kommerziell erhältliche Kits für Citrat-Synthase-Aktivität assay nicht für Drosophilaverwendet werden können, da diese Kits die mitochondriale Citrat-Synthase-Aktivität auf der Grundlage der Immunaufnahme von Säugetier-Citrat-Synthase bestimmen und der Säugetier-Citrat-Synthase-Antikörper die Drosophila-Citrat-Synthase möglicherweise nicht erkennt.

Ebenso, wenn es eine Diskrepanz zwischen Denmustern gibt:
1. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen in den Brunnen befinden.
2. Prüfen Sie, ob dies durch schlechte Pipettiertechnik verursacht wird.

Im Gegensatz zur Messung der Citratsynthase-Aktivität durch einen kolorimetrischen Assay in gereinigten Mitochondrien, der fast 200 Fliegen für die Reinigung von Mitochondrien jedes Genotyps19benötigt, stellen wir ein Protokoll für einen schnellen und einfachen Assay zur Messung der Citratsynthase-Aktivität durch eine kolorimetrische Methode im Gewebehomogenat oder in ganzen Zellextrakten16vor. Für jede Probe werden nur zehn fliegend am selben Tag geschlüpft werden; Für dreifache Proben jedes Genotyps werden 30 Fliegen benötigt. Das beschriebene Protokoll gilt nicht nur für Drosophila, sondern auch für andere Systeme, wie z. B. kultivierte Zellen und Säugetiergewebe.

Neben dem Citrat-Synthase-Aktivitäts-Assay können andere Methoden verwendet werden, um die mitochondriale Masse zu quantifizieren. Im Vergleich zu anderen häufig verwendeten quantitativen Methoden der Mitochondrien, wie die Messung des mitochondrialen DNA-Gehalts durch qPCR und die Quantifizierung von mitochondrialen Proteinen durch Western Blotting, die alle Mitochondrien unabhängig von ihrer Funktion detektieren, wird der Citrat-Synthase-Aktivitätstest verwendet, um das Vorhandensein intakter mitochondrialer Masse zu quantifizieren. Im Gegensatz zum mitochondrialen Atmungstest, der mitochondriale Reinigung und spezielle Assay-Ausrüstung16benötigt, ermöglicht der Citrat-Synthase-Aktivitätstest den Forschern, schnelle Messungen mittels Spektrophotometrie mit einfacher Probenvorbereitung, wie z. B. Vollzellextrakt oder Gewebehomogenat, durchzuführen, ohne dass eine mitochondriale Isolation erforderlich ist. Somit ist der Citrat-Synthase-Aktivitäts-Assay ein schneller und wirtschaftlicher Test zur Quantifizierung intakter mitochondrialer Masse.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch die Stipendien der National Natural Science Foundation of China (31401013 und 31471010), der Wissenschafts- und Technologiekommission der Shanghai Municipality, shanghai Pujiang Program (14PJ1405900) und der Natural Science Foundation of Shanghai (19ZR1446400).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich V900477
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) Sigma-Aldrich V900483
Acetyl-CoA Sigma-Aldrich A2181
Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) Sigma-Aldrich D8130
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich V900106
Oxaloacetate Sigma-Aldrich O4126
Pellet pestle Sangon F619072
Pellet pestle motor Tiangen OSE-Y10
Plate reader BioTek Eon
Protein BCA Assay kit Beyotime P0010S
Scissors WPI 14124
Triton X-100 Sangon A110694-0100

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References

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