El patrón tridimensional de biofilms de ingeniería con un Bioprinter hágalo usted mismo

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Bioengineering

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Summary

Este artículo describe un método para transformar una impresora 3D comercial de bajo costo en una impresora 3D bacteriana que puede facilitar la impresión de biofilms estampados. Se describen todos los aspectos necesarios de la preparación del bioprintro y la bio-tinta, así como los métodos de verificación para evaluar la formación de biofilms.

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Spiesz, E. M., Yu, K., Lehner, B. A., Schmieden, D. T., Aubin-Tam, M. E., Meyer, A. S. Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter. J. Vis. Exp. (147), e59477, doi:10.3791/59477 (2019).

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Abstract

Los biofilms son agregados de bacterias incrustadas en una matriz extracelular de patrón espacialmente autoproducida. Las bacterias dentro de un biofilm desarrollan una mayor resistencia a los antibióticos, lo que plantea posibles peligros para la salud, pero también puede ser beneficioso para aplicaciones ambientales como la purificación del agua potable. El desarrollo ulterior de terapias antibacterianas y aplicaciones inspiradas en biofilm requerirá el desarrollo de métodos reproducibles e ingenierables para la creación de biopelículas. Recientemente, se ha desarrollado un novedoso método de preparación de biofilm utilizando una impresora tridimensional (3D) modificada con una tinta bacteriana. Este artículo describe los pasos necesarios para construir este biofrintro 3D eficiente y de bajo costo que ofrece múltiples aplicaciones en el procesamiento de materiales inducidos por bacterialmente. El protocolo comienza con una impresora 3D comercial adaptada en la que la extrusora ha sido reemplazada por un dispensador de bio-tinta conectado a un sistema de bomba de jeringa que permite un flujo controlable y continuo de bio-tinta. Para desarrollar una tinta biológica adecuada para la impresión de biofilm, las bacterias de Escherichia coli diseñadas se suspendieron en una solución de alginato, de modo que se solidifican en contacto con una superficie que contiene calcio. La inclusión de un producto químico inductor dentro del sustrato de impresión impulsa la expresión de las proteínas de biofilm dentro de la tinta bio impresa. Este método permite la impresión 3D de varios patrones espaciales compuestos por capas discretas de biofilms impresos. Estos biofilms controlados espacialmente pueden servir como sistemas modelo y pueden encontrar aplicaciones en múltiples campos que tienen un gran impacto en la sociedad, incluyendo la prevención de resistencia a los antibióticos o la purificación del agua potable, entre otros.

Introduction

Actualmente existe una creciente necesidad de desarrollar soluciones sostenibles y respetuosas con el medio ambiente para la producción de materiales con patrones espacialmente, debido al creciente número de mercados para dichos materiales1. Este artículo presenta un método sencillo y económico para la producción de estos materiales y, por lo tanto, ofrece un amplio espectro de aplicaciones futuras. El método que se presenta aquí permite la impresión tridimensional (3D) de estructuras con patrones espacialmente utilizando un bio-Ink que contiene bacterias vivas. Las bacterias permanecen viables dentro de las estructuras impresas durante más de una semana, lo que permite a las bacterias realizar actividades metabólicas naturales o diseñadas. Por lo tanto, las bacterias impresas pueden producir y depositar los componentes deseados dentro de la estructura impresa, por ejemplo, creando un biofilm cruzado funcional2.

Los métodos tradicionales para la producción de materiales avanzados implican gastos de alta energía (por ejemplo, altas temperaturas y/o presiones) y pueden producir grandes cantidades de desechos químicos, a menudo sustancias tóxicas que requieren una utilización de gran costo3 ,4. En contraste, múltiples especies bacterianas son capaces de producir materiales que pueden ser fácilmente aplicables en diversas industrias. Estos materiales incluyen polímeros tales como polihidroxialcananatos (PHA)5 o poli (glicolide-Co-lactida) (PGLA)6, celulosa bacteriana7, materiales de hormigón bacteriano8, compuestos biomiméticos9, adhesivos a base de amiloides10, o interruptores eléctricos de base biológica11, entre otros. Por otra parte, la producción bacteriana de materiales valiosos normalmente tiene lugar a temperaturas y presiones casi ambientales y en ambientes acuosos, sin necesidad de producir compuestos tóxicos. Mientras que la producción de materiales con bacterias se ha demostrado en la literatura y algunas aplicaciones industriales ya han surgido12,13, un método confiable para el patrón espacial de estos materiales sigue siendo un desafío.

Este artículo muestra un método sencillo de convertir una impresora 3D comercial de bajo costo en una impresora bacteriana 3D. El protocolo muestra cómo preparar una bio-tinta que contiene y sostener las bacterias vivas, así como la forma de preparar sustratos sobre los que se puede realizar la impresión 3D. Este método es apropiado para usar con una variedad de cepas bacterianas naturales y diseñadas capaces de producir materiales. Estas bacterias pueden distribuirse espacialmente dentro de una estructura impresa en 3D y continuar con su actividad metabólica, lo que resultará en una distribución espacial de los materiales deseados producidos por las bacterias.

Este método de impresión permite la fabricación aditiva de biofilms, agregados de bacterias rodeadas por una matriz extracelular autoproducida. Las biofilms son redes 3D heterogéneas en las que las proteínas, los polímeros, las células bacterianas, el oxígeno y los nutrientes se estructuran espacialmente14. Mientras que en la forma de un biofilm, las bacterias exhiben una mayor resistencia a los antibióticos y robustez estructural, haciéndolos difíciles de erradicar de las superficies incluyendo catéteres médicos e implantes. La clave de las propiedades de biofilm, y también el mayor desafío a la investigación de biofilm, parece ser la heterogeneidad de biofilms15,16,17. La producción de biofilms de modelo controlados espacialmente es de especial interés, ya que permitiría reproducir o ajustar los patrones espaciales de los componentes de biofilm, ayudando a la comprensión de la deposición estable de biofilms en prácticamente cualquier superficie en naturaleza.

Este artículo presenta un método para la producción de biofilms utilizando hidrogeles impresos en 3D que contienen bacterias de E. coli diseñadas que producen proteínas de biofilm en presencia de un inductor, así como métodos de verificación de la formación de biofilm2 . Los principales componentes de la matriz extracelular de estos biofilms son las fibras de curli amiloide18 que contienen proteínas csga autoensambladas. Cuando las bacterias de E. coli diseñadas se inducen a expresar proteínas csga, forman un biofilm modelo estable que protege las células contra ser lavado fuera de la superficie de impresión. Este biofilm impreso en 3D puede controlarse espacialmente y puede servir como una herramienta de investigación útil para la investigación de la estructura de biofilm multiescala-mecánica de función o materiómica19. Estos biofilms personalizados ayudarán a la comprensión de los principios de la formación de biofilm y sus propiedades mecánicas, permitiendo una mayor investigación sobre los mecanismos de resistencia a los antibióticos entre otras aplicaciones.

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Protocol

1. conversión de una impresora 3D comercial en un bioprintro 3D

  1. Extraiga el extrusor y el calentador de una impresora 3D comercial (tabla de materiales) del bastidor de la impresora y desenchufe el cableado que controla estos elementos de la placa de circuito principal (figura 1A). Dado que el sensor que controla la temperatura operativa de la impresora debe ser funcional para comunicarse con el software de la impresora, quite del software de impresión el algoritmo que retrasa la impresión hasta que se alcance la temperatura operativa.
  2. Conectar una punta de pipetas (200 μL de punta) mediante tubería de silicio (diámetro interior de 1 mm) a una jeringa de 5 mL cargada en una bomba de jeringa. Monte la punta de la Piera en el cabezal de la extrusora de la impresora 3D como reemplazo para el extrusor original (figura 1B).
  3. Si se va a utilizar más de un tipo de bio-tinta, Monte los sistemas de tuberías adicionales y las puntas de pipetas a la impresora.

2. preparación del sustrato para la impresión 3D

  1. Añadir 4 mL de 5 M de solución CaCl2 a 400 ml de agar 1% p/v disuelto en medio de caldo Luria-BERTANI (lb), complementado con antibióticos e inductores apropiados (aquí 34 μg/ml de cloranfenicol y 0,5% de Rhamnose).
  2. Dispense 20 mL de la solución LB-agar en cada plato de Petri de 150 mm x 15 mm. Secar 30 min a temperatura ambiente con la tapa semiabierta.
    Nota: el protocolo se puede pausar aquí almacenando estos sustratos de impresión a 4 ° c durante varios días.

3. preparación de la bio-tinta

  1. Prepare una solución de alginato sódico (3% p/v) y caliente el punto de ebullición tres veces para esterilizar la solución. Conservar a 4 ° c hasta que se utilice.
  2. Crecer E. coli MG1655 Pro Δcsga ompR234 (e. coli δcsga) bacterias que transportan plásmidos pSB1C3-proteína fluorescente verde (GFP) (expresión GFP constitutiva)2 o PSB1C3-GFP-csga (expresión GFP constitutiva, Rhamnose-inducible csga expresión) durante la noche a 37 ° c con agitación a 250 rpm en 50 mL de medio LB que contiene 34 μg/mL de cloranfenicol y 0,5% de Rhamnose.
  3. Centrifugar el cultivo celular durante 5 min a 3.220 x g para pellets de las bacterias. Retire el sobrenadante.
  4. Vuelva a suspender el pellet de bacterias en 10 mL de medio LB y añada 10 mL de alginato sódico (3% p/v).

4. proceso de impresión 3D

  1. Instale y abra el software de impresión 3D (tabla de materiales) en un ordenador. Conecte la impresora 3D al ordenador. Mueva el cabezal de impresión a su posición de inicio haciendo clic en el botón de inicio para los ejes X, y y Z.
  2. Para cada impresión, coloque un sustrato de impresión preparado en una ubicación particular en la cama de impresión.
  3. Calibrar la altura del cabezal de impresión en el eje Z.
    1. Levante el cabezal de impresión a una altura de 22 mm bajo control manual, de modo que no colisionará con el borde de la placa de Petri cuando se mueva a la posición deseada. Coloque el cabezal de impresión en la parte superior de la placa y muévase hacia abajo hasta que la punta de la Piera se contacto con la superficie de impresión. Asigne esta posición del eje Z como Z1 (la altura de la superficie de impresión).
    2. Levante el cabezal de impresión y muévase fuera del área de la placa mediante control manual en los ejes X, y y Z. Si la distancia de trabajo entre el cabezal de impresión y la superficie de la placa se define como Z2, introduzca Z1 + Z2 en el programa de impresión como valor Z durante la impresión.
  4. Programa la forma de impresión mediante un método de coordenadas punto a punto autodesarrollado según la trayectoria deseada.
    1. Si la trayectoria deseada es una línea recta, defina sólo los puntos inicial y final. Incluir puntos adicionales en las líneas curvas resultará en curvas más suaves. Mueva el cabezal de impresión manualmente a cada punto secuencialmente y registre las coordenadas de estos puntos en orden. Introduzca todas estas coordenadas, así como la velocidad de movimiento del cabezal de impresión para cada segmento impreso en el editor de G-Code.
  5. Tanto antes como después de imprimir, levante el cabezal de impresión a una distancia superior al borde de la placa (20 mm) y muévase directamente fuera de la región de la placa. Guarde este programa como un archivo de código G y cargue directamente para su uso en impresiones posteriores, mientras se vuelve a medir la altura del eje Z para cada nuevo sustrato de impresión.
    Nota: Consulte la tabla 1 para ver un ejemplo de código G para imprimir un cuadrado.
  6. Cargue el archivo de código G preprogramado. Abra el editor de G-Code en el software y programa en los comandos para imprimir la forma deseada. En cada línea de comando, la posición del cabezal de impresión puede cambiarse en los ejes X, y y/o Z. Introduzca el valor Z durante todos los pasos de impresión como Z1 + Z2 (altura de la superficie de impresión + distancia de trabajo).
    Nota: la velocidad de movimiento también es ajustable; 9.000 mm/min es un valor adecuado para las tasas de impresión típicas.
  7. Cargue la bio-tinta líquida en la jeringa (s) y móntela en la (s) bomba (es) de la jeringa del bioprintro 3D.
  8. Imprima la tinta biológica en el sustrato de impresión haciendo clic en el botón Imprimir .
  9. Durante la impresión, controle el movimiento del cabezal completamente por el software. Inicie manualmente la bomba de la jeringa antes de que el cabezal de impresión entre en contacto con la superficie.
    Nota: la coordinación de la bomba de jeringa y de la impresora se determina empíricamente en función de la velocidad de extrusión, la velocidad a la que el cabezal de impresión se desplaza hasta el primer punto y la posición inicial del cabezal. Si la posición inicial del cabezal de impresión es de 20 mm, con una velocidad de cabezal de impresión de 9.000 mm/min y una velocidad de extrusión de 0,1 mL/h, inicie la bomba de jeringa inmediatamente después de iniciar la impresión. Si se cambia la velocidad de extrusión de 0,1 mL/h a 0,3 mL/h, espere 2 − 3 s para iniciar la bomba de jeringa una vez iniciada la impresión.
  10. Detenga la bomba de la jeringa tan pronto como el cabezal llegue al último punto de impresión. Detenga la bomba de la jeringa antes de que el cabezal se levante al final del proceso de impresión, de lo contrario, el exceso de tinta biológica caerá sobre el sustrato de impresión y reducirá la resolución de impresión.
  11. Para la construcción de estructuras 3D, controle todos los movimientos del cabezal de impresión en el editor de G-Code. Escriba la altura de impresión de la primera capa. Aumente el valor Z en el código G en 0,2 milímetros para que la segunda capa aumente la altura de impresión. A partir de entonces, aumente el valor Z en 0,1 milímetros cuando se mueva a una capa superior. No mueva la placa durante el proceso de impresión.
  12. Para medir la anchura y la altura del hidrogel impreso, utilice una regla de acero colocada debajo o junto a la muestra.

5. aumentar y probar la efectividad de la producción de biofilm por E. coli

  1. Incubar las muestras impresas a temperatura ambiente durante 3 − 6 días para permitir la producción de componentes de biofilm (fibras de curli). Imagen de las placas utilizando una cámara o un escáner fluorescente.
  2. Para disolver la matriz de alginato, añadir 20 mL de solución de citrato sódico de 0,5 M (pH = 7 ajustado con NaOH) a los sustratos de impresión e incubar durante 2 h con 30 RPM temblando a temperatura ambiente. Desechar el líquido y la imagen de las placas de nuevo para comparar con las imágenes de las placas antes del tratamiento con citrato.

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Representative Results

El primer paso para la impresión 3D exitosa de biofilms es convertir una impresora 3D comercial en un bioprintro. Esta conversión se logra quitando el extrusor y el calentador de la impresora, diseñado para la impresión con una tinta polimérica, y reemplazándolos con componentes apropiados para la impresión de bio-tinta que contiene bacterias vivas (figura 1A). El extrusor se sustituye por una punta de pipetas (o puntas, si se utilizarán varios bio-tintas en el proceso de impresión) conectados a un sistema de tuberías conectado a una bomba de jeringa (figura 1B). La conversión exitosa de la impresora comercial en un bioprintro se puede evaluar en función de la capacidad de transferir los bio-Ink (s) deseados de la bomba de jeringa a través del sistema de tubos y la punta (s) de la Piera en una superficie de impresión sin fugas o calentando el Bio-Ink. Si el tubo se abulta debido al flujo de bio-tinta durante la impresión, puede ser reemplazado por un tubo con paredes más gruesas. Cabe señalar que esta técnica de impresión debe ser capaz de trabajar con cualquier tipo de impresora 3D comercial para el que la tubería se puede adjuntar al cabezal de impresión.

El bioimpresora 3D puede crear hidrogeles encapsulantes de bacterias en una variedad de formas bidimensionales (2D) y 3D (figura 2). Los iones de calcio en el sustrato de impresión inducen la solidificación (quelación de iones de calcio con grupos carboxilo de alginato) de la bio-tinta al imprimir, convirtiendo la bio-tinta líquida en un hidrogel sólido. La resolución de la biopsia dependerá de la velocidad de extrusión, del tamaño de la punta de la Piera, de la velocidad del cabezal de impresión, del volumen y de la concentración de la solución CaCl2 añadida a la solución de agar, de la planitud de la superficie y de la viscosidad de la bio-tinta utilizada. La concentración de la solución de CaCl2 tiene una gran influencia en la nitidez del hidrogel. Se muestrearon cuatro concentraciones diferentes de CaCl2 (0,1 m, 0,2 m, 1 m y 5 m), y solo 5 m de solución CaCl2 resultó en hidrogel que no se difuminó después de la impresión. Por lo tanto, 5 M fue elegido como la concentración óptima de la solución de CaCl2 .

En una versión anterior de este protocolo, la solución CaCl2 se aplicó sobre la superficie de la placa de agar en lugar de mezclarse en la solución de agar antes de verter la placa de agar. Cuando se utiliza esta versión, el volumen de la solución CaCl2 tiene una influencia crítica sobre la calidad de impresión y la resolución. Cuando se utiliza una placa de Petri de 150 x 15 mm, la aplicación de un volumen de solución de cloruro cálcico de más de 100 μL (o 30 μL para una placa de Petri de 90 mm) resulta en un exceso de líquido restante en la superficie de impresión. Este líquido puede propagarse de forma desigual cuando se mueve la placa, lo que puede cambiar la distancia de trabajo y causar el bloqueo de la punta de la Piera. Demasiado volumen de CaCl2 también puede causar hidrogeles impresos para flotar y deslizarse a través de la solución, cambiando la forma y la posición del hidrogel impreso. Si el volumen de la solución de cloruro de calcio es demasiado pequeño, algunas regiones de la placa pueden no recibir la solución de CaCl2 y tendrán una solidificación de hidrogel deficiente. En este protocolo mejorado, la adición de la solución CaCl2 directamente en la solución de agar antes de verter la placa de agar resultó en sustancialmente menos humedad en la superficie del sustrato de impresión en comparación con el método aplicado a la superficie, lo que resulta en resolución de impresión dramáticamente mejorada.

La velocidad de extrusión y el movimiento del cabezal de impresión son interdependientes y se pueden ajustar de manera coordinada para alterar la resolución de impresión. Por ejemplo, si la impresora funciona con una velocidad de extrusión entre 0,1 ml/h y 0,5 ml/h con una velocidad de movimiento de cabezal de impresión constante de 300 mm/min, el diámetro del hidrogel impreso aumenta con el aumento de la velocidad de extrusión de2,20. A velocidades de extrusión de más de 0,5 mL/h, los bordes exteriores de las líneas impresas de hidrogel cambian de líneas rectas, paralelas a líneas onduladas, y el ancho de la línea también aumenta. La velocidad del cabezal también influye en la resolución de impresión. Con una velocidad de extrusión constante de 0,3 mL/h, el aumento de la velocidad del cabezal de impresión de 300 mm/min a 500 mm/min da como resultado el ancho del hidrogel impreso cada vez más estrecho, disminuyendo de 1,8 mm a 0,9 mm. Si la velocidad de movimiento del cabezal de impresión es de más de 500 mm/min, la línea de gel se convertirá fácilmente en discontinua. Para una punta de pipetas de 200 μL y la tinta biológica utilizada en el estudio actual, se consideran óptimas varias combinaciones de la resolución de impresión (tabla 2). A la velocidad de bombeo 0,3 mL/h, la velocidad de movimiento del cabezal de impresión 500 mm/min, y la distancia de trabajo de 0,2 mm, el hidrogel impreso se produce con una anchura de aproximadamente 0,9 mm.

Un logro crucial del método de impresión 3D bacteriana es su capacidad para crear biofilms de ingeniería. Para crear un biofilm diseñado y controlado espacialmente, las bacterias no solo deben sobrevivir al proceso de impresión 3D, sino que también deben producir componentes de biofilm mientras permanecen dentro del patrón impreso. Las bacterias de e. coli de ingeniería utilizadas en este protocolo, bacterias de e. coli δcsga que transportan el plásmido pSB1C3-GFP-csga, permiten la expresión controlable de las proteínas curli. El uso de una cepa csga-Knockout asegura que la proteína csga sólo se expresa cuando se induce a partir de un plásmido con Rhamnose. La bacteria exporta las subunidades de proteína CsgA inducidas, que luego se auto-ensamblan21 sobre las proteínas csgb en la membrana externa bacteriana22 para formar fibras de curli. Estas fibras como amiloides son los principales componentes proteínicos de la matriz extracelular de biofilm: una red conectada de proteínas y polímeros en el que se incrustan las bacterias. La matriz de alginato impreso de la bio-tinta de impresión 3D presta soporte físico y estructura a las bacterias durante el proceso de producción de curli. El uso de la expresión GFP constitutiva permite la visualización y cuantificación de células impresas a través de imágenes por fluorescencia.

Con el fin de evaluar si la formación de biofilm fue exitosa, la matriz de alginato se disolvió utilizando una solución de citrato sódico, y la forma de la bio-tinta impresa se evaluó después del tratamiento con citrato (figura 3). En el caso de la biotinta sin el plásmido de producción de curli inducible, el patrón impreso se disolvió por completo después del tratamiento con citrato sódico, lo que significa que no se había formado una red de curli de biofilm (figura 3a, B). En el caso de las bacterias que contienen el plásmido de producción de curli inducible, el gel no se disolvió después del tratamiento con citrato sódico (Figura 3C, D). Este resultado indica que las bacterias impresas fueron capaces de formar una red de curli lo suficientemente extensa como para estabilizar el patrón impreso de bacterias2.

Para construir estructuras multicapa, se imprimieron capas adicionales (figura 4) ajustando la altura de impresión y la trayectoria de impresión en el editor de G-Code. Aumentar el número de capas impresas en una muestra provocó que el ancho y la altura de las estructuras impresas aumentara incrementalmente (figura 5)2,20, pero incluso las estructuras impresas de 5 capas podían crearse con una resolución de milímetros a sub-milímetros. Cuando e. coli se diseñó para producir inducidamente proteínas de curli se imprimieron en estructuras multicapa, el tratamiento con citrato sódico no disolvió las muestras, mientras que las estructuras multicapa que contenían E. coli que producía no curli eran disuelto en solución de citrato sódico (figura 6). Este experimento demuestra que se pueden crear biofilms de ingeniería en estructuras impresas tridimensionales de varias capas, así como en estructuras impresas de una sola capa.

Figure 1
Figura 1: fotos que muestran la conversión de una impresora 3D comercial en un bioprintro 3D. (A) los componentes del bioprintro 3D después de la conversión de una impresora 3D comercial. (B) el extrusor de tinta biológica formado por un sistema de tubería conectado a una punta de Piera. Se pueden añadir puntas de impresión adicionales en el segundo orificio del cabezal o añadiendo orificios adicionales al cabezal, para su uso en la impresión de varios tipos de tinta biológica. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: ejemplos de patrones bioprinados en 3D que contienen E. coli pSB1C3-GFP-csga. Estas imágenes fueron tomadas dos días después de la impresión. Esta resolución de impresión se obtuvo con una velocidad de bombeo de 0,3 mL/h, una velocidad de movimiento del cabezal 300 mm/min y una distancia de trabajo de 0,2 mm. Los códigos G para imprimir estas formas se pueden encontrar en los archivos suplementarios. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: un método para verificar si los componentes de biofilm han sido producidos por bacterias E. coli dentro de un patrón impreso. Cuando E. coli impreso contenía un plásmido que no codificaría para la inducción de curli, el patrón impreso fue completamente disuelto por el tratamiento de citrato sódico (a y B). Cuando se usó E. coli que contenía un plásmido que codificaba proteínas curli inducibles, el biofilm impreso era resistente al tratamiento con citrato sódico (C y D). El proceso de programación y las explicaciones del código G para la impresión de este patrón cuadrado se proporcionan en la tabla 1. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: vista superior (A) y vista lateral (B) de estructuras impresas de varias capas que contienen E. coli pSB1C3-GFP-csga. Esta muestra se imprimió con una velocidad de bombeo de 0,3 mL/h, una velocidad de movimiento del cabezal de impresión de 200 mm/min y una distancia de trabajo de 0,2 mm. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: el ancho y la altura de la línea de los hidrogeles impresos que contienen diferentes números de capas impresas. Las mediciones se realizaron en muestras impresas con velocidad de bombeo de 0,3 mL/h, velocidad de movimiento del cabezal de impresión de 500 mm/min y distancia de trabajo de 0,2 mm. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: un método para verificar si los componentes de biofilm han sido producidos por bacterias E. coli dentro de estructuras impresas de múltiples capas. La ingeniería E. coli se imprimió en hidrogeles de 1, 3 o 5 capas e incubó durante 6 días. Cuando el E. coli impreso contenía un plásmido que no codificaría para la inducción de curli, el patrón impreso fue completamente disuelto por el tratamiento con citrato sódico (a y B). Cuando el E. coli impreso contenía un plásmido que codificaba proteínas de curli, el biofilm impreso era resistente al tratamiento con citrato sódico (C y D). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los comandos de G-Code Tareas
G1 Z20 F9000 SUPERIOR Levante el eje Z a una altura de 20 mm con una velocidad de movimiento de 9.000 mm/min.
G1 X95 Y65 F9000 SUPERIOR Pasar al punto inicial de la primera línea con una velocidad de movimiento de 9.000 mm/min.
G1 Z6 F9000 SUPERIOR Muévase hacia abajo en la dirección Z a una distancia de impresión correcta (aquí Z = 6 mm).
G1 X95 Y105 F300 Punto final de la primera línea y punto inicial de la segunda línea.
G1 X135 Y105 Punto final de la segunda línea y punto de partida de la tercera línea.
G1 X135 Y65 Punto final de la tercera línea y punto de partida de la cuarta línea.
G1 X95 Y65 Punto final de la cuarta línea y punto de partida de la primera línea; se forma un cuadrado.
G1 Z20 F9000 SUPERIOR Levante el eje Z a una altura de 20 mm a 9.000 mm/min.
G1 X55 Y40 F9000 SUPERIOR Pasar a una coordenada (55, 40) fuera de la gama de placas de Petri.

Tabla 1: proceso de programación y explicaciones del código G para la impresión de un cuadrado.

Velocidad de extrusión (mL/h) Velocidad de movimiento del cabezal de impresión (mm/min) Ancho del gel (mm)
0,1 100 1,6 ± 0,1
0,1 200 1,1 ± 0,1
0,1 300 1,0 ± 0,1
0,3 300 1,8 ± 0,1
0,3 400 1,2 ± 0,1
0,3 500 0,9 ± 0,1
0,5 200 2,2 ± 0,2
0,5 1.200 1,2 ± 0,2
0,7 200 2,8 ± 0,1
0,7 1.200 1,3 ± 0,1

Tabla 2: los parámetros óptimos de impresión para los hidrogeles con alta resolución. Se midieron cinco puntos para cada condición. El valor medio y la desviación estándar se muestran en la tabla.

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Discussion

El protocolo presentado aquí para la impresión 3D de biofilms de ingeniería tiene dos pasos críticos. En primer lugar, la preparación de la superficie de impresión de agar, que es el factor más crítico para producir una resolución de impresión específica. Es importante asegurarse de que la superficie de impresión sea plana y de que la punta de la Piera del cabezal esté colocada a la altura correcta de la superficie. Si la superficie no es plana, la distancia de trabajo cambiará durante el proceso de impresión. Si la distancia de trabajo es inferior a 0,1 mm, la solución CaCl2 podría entrar dentro de la punta de la Piera y provocar la formación de hidrogel, provocando que la punta de la Piera se obstruya. Si la distancia de trabajo es superior a 0,3 mm, el gel no se puede imprimir continuamente. La distancia de trabajo óptima en este estudio es de 0,2 mm. los buenos enfoques para la preparación de superficies planas de impresión de agar son utilizar placas de Petri de mayor diámetro (placa de Petri de 150 mm de diámetro en lugar de una chapa de 90 mm de diámetro), colocar las planchas sobre una mesa plana, verter el agar solución con velocidad rápida e incluso, y evite mover la placa de agar durante su solidificación.

El segundo paso crítico es la selección de los parámetros de impresión deseados, incluyendo la velocidad de bombeo, la viscosidad de la bio-tinta utilizada, y la velocidad del cabezal de impresión, que determinan la resolución resultante. Para seleccionar estos parámetros de manera eficiente, el usuario puede muestrear varios valores extremos para la velocidad del cabezal de impresión con una tasa de extrusión constante, señalando la anchura del hidrogel impreso para cada conjunto de condiciones. A continuación, repita este experimento con otras 4 tasas de extrusión. A continuación, tome las cinco combinaciones que produjeron la mejor resolución de impresión para la aplicación, y varíe ambos parámetros de impresión (velocidades de bombeo y cabezal de impresión) en pasos más pequeños y pequeños hasta que se obtenga la resolución deseada.

El grosor de las líneas impresas tiene un impacto en la capacidad de las bacterias de ingeniería impresas para formar biofilms estables. En condiciones óptimas de impresión (velocidad de bombeo de 0,3 mL/h, velocidad de cabezal 300 mm/min y distancia de trabajo de 0,2 mm), las líneas impresas de bio-tinta producirán biofilms estables después de 3-6 días de incubación a temperatura ambiente. Si las líneas se vuelven más gruesas, por ejemplo, aumentando la velocidad de bombeo, las regiones intermedias de cada línea pueden no ser inducidas suficientemente para producir biofilms estables de citrato.

Al imprimir un hidrogel de tinta biológica multicapa, cada capa impresa se solidifica al ponerse en contacto con los iones de calcio que se han difundido en la capa impresa anterior. Dado que la concentración de CA2 + en el sustrato de impresión es alta, los iones Ca2 + pueden difundirse rápidamente a través de las capas inferiores. Por lo tanto, las capas superiores se pueden imprimir inmediatamente después de que se hayan impreso las capas anteriores, simplemente ajustando la altura de impresión en el editor de G-Code. Además, la distancia de impresión de la capa superior debe limitarse a sólo 0.1 − 0,2 mm más alta que la distancia de impresión de la capa anterior. Si la distancia de impresión añadida es inferior a 0,1 mm, la punta se arrastrará a través de la primera capa y reducirá la resolución del hidrogel impreso. Si la distancia de impresión añadida es superior a 0,2 mm, la bio-tinta formará gotas de líquido durante la extrusión, haciendo que el hidrogel impreso se convierta en discontinuo.

El enfoque de bioprinting actual permite la producción de biofilms de ingeniería reproducibles y controlados espacialmente, adecuados para su uso en el estudio de las propiedades mecánicas de biofilm o la resistencia biológica de las bacterias de biofilm a diversos factores, incluyendo antibióticos, tensioactivos, etc. Esta capacidad garantiza una usabilidad directa del método propuesto. El desarrollo de bioprinters hágalo usted mismo (DIY) de mayor precisión probablemente sea posible manteniendo la distancia de trabajo de impresión, pero reduciendo la velocidad de bombeo y la velocidad de movimiento del cabezal, o probando diferentes geometrías de extrusor y químicos bio-Ink. Con mejoras futuras en la resolución de impresión, se pueden activar aplicaciones adicionales, como la ingeniería de tejidos o la administración de fármacos. El enfoque de la biopsia 3D descrito aquí también debe ser ampliado a la impresión de tipos adicionales de especies de bacterias que son biocompatibles con nuestra bio-tinta basada en alginato. El protocolo actual proporciona suficiente esterilidad al hervir repetidamente la bio-tinta durante la preparación, utilizando jeringas estériles y puntas de impresión, y utilizando antibióticos tanto en la placa de bio-tinta como de impresión. Los experimentos futuros con bacterias de tipo silvestre pueden requerir medidas de esterilización adicionales, como reemplazar o desinfectar el sistema de tubos entre impresiones.

Para el mejor conocimiento de los autores, el método presentado (originalmente desarrollado en Lehner et al.20) es el primer ejemplo publicado de un estilo de fabricación aditiva para la impresión 3D de bacterias. En la primera parte de este protocolo, este método general se describe detalladamente para la impresión 3D de bacterias, que se aplica a la producción de biofilms de ingeniería2. Múltiples aplicaciones futuras de biofilms impresas en 3D son posibles usando este método. En la naturaleza, múltiples sistemas bacterianos han evolucionado que crean varios tipos de biofilms, de los cuales en este artículo se exploró un único sistema. Se pueden examinar fácilmente varios otros sistemas mediante la creación de biofilms impresos en 3D con otros sistemas bacterianos, como Bacillus subtilis o Acetobacter xylinum. También se han desarrollado métodos alternativos23,24 para el patrón espacial de bacterias a alta resolución utilizando señales ópticas. Estos enfoques requieren equipos más caros y complicados para alcanzarlos en comparación con esta impresora, y sólo son adecuados para el patrón de las bacterias genéticamente diseñadas.

La capacidad de patrones espacialmente de biofilms impresos en 3D con este método puede permitir la creación de biofilms de ingeniería que reproducen la heterogeneidad espacial de biofilms naturales25. Debido a la disposición altamente detallada de proteínas y fibras poliméricas dentro de un biofilm, las bacterias en un estado de biofilm logran una resistencia mucho mayor a los estímulos químicos y físicos, como una mayor resistencia a los antibióticos en comparación con el mismo bacterias en un estado planktónico. Además, las bacterias dentro de un biofilm muestran una mayor resistencia al flujo de fluidos, haciendo que el mantenimiento y la esterilidad de los dispositivos médicos implantables sean mucho más difíciles26. Los biofilms de ingeniería impresos que intentan reproducir las distribuciones espaciales específicas de los componentes de biofilm son herramientas poderosas para estudiar los mecanismos por los cuales las bacterias dentro de un biofilm logran los fenotipos de resistencia.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por una subvención AOARD (no. FA2386-18-1-4059), la Organización Neerlandesa de investigación científica (NWO/OCW) como parte del programa Frontiers of Nanoscience, y el programa de materiales avanzados NWO-NSFC (núm. 729.001.016). Los autores reconocen la asistencia de laboratorio de Ramon van der Valk y Roland Kieffer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer CoLiDo 3D-P Kit
3D printing software CoLiDo Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1
Agar Sigma-Aldrich 05040
CaCl2 dihydrate Sigma-Aldrich C7902
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Chloramphenicol Sigma-Aldrich 3886.1
LB broth powder Sigma-Aldrich L3022
Orbital shaker VWR 89032-092 Model 3500
Petri dish VWR 25384-326 150 x 15 mm
Rhamnose Sigma-Aldrich 83650
Silicon tubing VWR  DENE 3100103/25
Syringe pump ProSense B.V.  NE-300
Sodium alginate Sigma-Aldrich W201502
Sodium citrate monobasic Sigma-Aldrich 71498
Sodium hydrooxide VWR 28244.295

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References

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