التقاط الاتصالات جزيء صغير بين الأنسجة والخلايا باستخدام التصوير الكتلي

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

تم وضع طريقة جديدة لإعداد نموذج لاستيعاب كوكولتوري الخلايا والأنسجة للكشف عن تبادل جزيء صغير باستخدام التصوير الطيف الكتلي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (146), e59490, doi:10.3791/59490 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

التصوير الطيف الكتلي (IMS) قد طبق بشكل روتيني إلى ثلاثة أنواع من العينات: مقاطع الأنسجة والماغنيسيوم والمستعمرات الميكروبية. أنواع هذه العينة قد تم تحليلها باستخدام الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين وقت الطيران الطيف الكتلي (TOF استخدام MS) لتصور توزيع البروتينات، والدهون، ونواتج الأيض عبر العينة البيولوجية لمصلحة. لقد قمنا بتطوير أسلوب إعداد نموذج رواية يجمع بين نقاط قوة التطبيقات السابقة الثلاث لمعالجة نهج مستقصاة تحديد الاتصالات الكيميائية في السرطان، ببذر الثقافات الخلية الثديية إلى [اغروس] في كوكولتوري مع الأنسجة السليمة التي تتبعها جفاف العينة. خلايا وأنسجة الثدييات هي كوكولتوريد على مقربة من السماح للاتصالات الكيميائية عن طريق نشرها بين الأنسجة والخلايا. عند نقطة زمنية معينة، هي تجفف العينة على أساس [اغروس] بنفس الطريقة كالمستعمرات الميكروبية التي أعدت لتحليل نظام الرصد الدولي. تم تطوير أسلوبنا لنموذج الاتصال بين الدرجة العالية المستمدة من قناة فالوب كما يتفاعل مع المبيض خلال ورم خبيث سرطان المبيض المصلي. الأمثل لإعداد نموذج أسفرت عن تحديد لإفراز كمكون كيميائية رئيسية في المكروية المبيض. يمكن تطبيق هذه الطريقة المطورة حديثا للنظم البيولوجية الأخرى التي تحتاج إلى فهم للاتصالات الكيميائية بين الخلايا المتجاورة أو الأنسجة.

Introduction

تم تصوير الطيف الكتلي (IMS) الأمثل لتميز التوزيع المكاني للسمات الجزيئية في التطبيقات المستخدمة على نطاق واسع ثلاثة: شرائح الأنسجة، والماغنيسيوم، والمستعمرات الميكروبية1،،من23. يمكن استخدام شرائح الأنسجة لتقييم التعريب من نواتج الأيض في سياق الظروف البيولوجية في مضيف، أما المستهدفة أو غير المستهدفة داخل مجموعة أسلحة معينة. ومع ذلك، الاختلافات بين السمات الجزيئية هي الأكثر كبيرة وواضحة عندما تتم مقارنة أنسجة سليمة إلى حالة مريضة، على سبيل المثال، ورم. هذا النهج نظام الرصد الدولي لا سيما تكييفها للكشف عن المرض المؤشرات الحيوية، ومع ذلك، الحصول على عينات الأنسجة في مراحل متميزة في تطور المرض (مثل درجات الورم) يحول دون تحديد الإشارات التي يمكن أن تكون هامة للبدء المرض. تبادل المعلومات عبر الفضاء ميزة في كل مكان من العديد من النظم البيولوجية، وشرائح الأنسجة لا يمكن التقاط هذه التقوية الكيميائية الحيوية. هو أسلوب واحد قادر على تصور التبادل الكيميائي ونشر نظام الرصد الدولي للمستعمرات الميكروبية التي نمت على لوحات أجار؛ جزيئات صغيرة قادرة على منتشر عبر واجار ويمكن الحصول عليها عن طريق الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين (استخدام-TOF) الكتلي4. هذا الإعداد النمو يمكن استخدامها لتحديد الجزيئات المتبادلة بين الكيانات البيولوجية منفصلة (المستعمرات)، ويمكن أيضا تحديد اتجاه الإنتاج المستقلب. منصة مصممة أصلاً للنمو الميكروبي مستعمرة تم تكييفها لاستكشاف استقلاب الأنسجة explants نمت مع خلايا الثدييات الأولية، وتم استخدام نظام الرصد الدولي لتقييم تبادل المواد الكيميائية الحيوية في نظام الثدييات في المختبر.

في السنوات القليلة الماضية، أصبح من الواضح أن ارتفاع درجة سرطان المبيض المصلي (هجسوك) غالباً ما ينشأ في ظهارة قناة فالوب (FTE) ومستطير ثم إلى المبيض خلال بداية المرض التنمية5،6، 7 , 8-والسبب في أن الخلايا الورمية FTE تنتشر في المبيض، حيث تشكل الأورام الكبيرة في نهاية المطاف والسرطاني كذلك، ليس من الواضح حاليا. وقد ركزت البحوث السابقة حول دور البروتينات المبيض في الابتدائي ورم خبيث على المبيض؛ ومع ذلك، مؤخرا أثبتت أن الانتقال من صحية إلى أنسجة الورمية ينتج الجهوري الأيض الخلوية ويغير إنتاج الجزيئات الصغيرة9،،من1011. ولذلك، افترضنا أن الجزيئات الصغيرة وتبادل بين FTE والمبيض قد تكون مسؤولة جزئيا عن ورم خبيث الأولية من هجسوك.

استخدام لدينا إجراء نظام الرصد الدولي وضعت حديثا، قررنا أن كوكولتوري FTE الورمية وأنسجة المبيض صحية يستحث إنتاج إفراز من المبيض. ومع ذلك، أنواع الخلايا أو الخلايا FTE الطبيعية الأخرى لم تثر هذا التأثير. ميزة غير عادية من هذا الأسلوب هو أنه يمكن تصور إنتاج الجزيئية وتبادل الإشارات التي تمثل الجزيئات الحقيقية، بل وحتى في كوكولتوري فمن الممكن تحديد مصدر إشارة. هذه ميزة على تحليل العينات المتجانس، حيث يتم فقدان كافة المعلومات المكانية. في النظام النموذجي، كنا قادرين على وضوح تعيين إنتاج إفراز المبيض. ارتبط إفراز لورم خبيث وتشيموريسيستانسي من سرطان المبيض، ولدينا اكتشاف هذا الجزيء صادق أن أسلوب IMS رواية يمكن الكشف عن الصلة بيولوجيا الجزيئات12،13، 14-التحقق من الصحة هذا يتيح لنا أن يقترح أن هذا الطلب الجديد لنظام الرصد الدولي يمكن أن يكون مفيداً بشكل خاص البحوث الجماعات التي تسعى لتحديد الجزيئات الصغيرة في البيئات كوكولتوري وفهم الأحداث المبكرة التي تؤثر على تحول الخلايا وورم خبيث. والهدف العام لهذا الأسلوب توضيح هوية والتوزيع المكاني للجزيئات الصغيرة من خلال التبادل بين الأنسجة والأعضاء، ممثلة في المختبر الثقافات الخلية 3D أو السابقين فيفو الأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع الإجراءات الحيوان كانت وفقا للمبادئ "التوجيهية الوطنية للمعاهد الصحية" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، والتي أقرتها اللجنة "المؤسسية استخدام الحيوان" والرعاية (إياكوك) في جامعة إلينوي في شيكاغو.

1-إعداد الكواشف

  1. الحفاظ على خلايا ظهارة أوفيدوكتال موريني (وزارة التربية والتعليم) في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 في حاضنة هوميديفيد في الوسائط الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (αMEM) ألفا وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 2 مم ل الجلوتامين، الأنسولين 10 ملغ/مل، ترانسفيرين، السيلنيوم (البحث عن) ، 1.8 عامل نمو البشرة من نانوغرام/مليلتر (لو)، 100 يو/مليلتر البنسلين-ستربتوميسين ومع الجنتامايسين 1 ملغ/مل 18.2 نانوغرام/مليلتر استراديول-17β. تمر الخلايا كل 3 – 4 أيام، وضمان وجود ما يكفي من خلايا في نفس اليوم سيتم التضحية الفئران.
  2. إعداد 2% [اغروس] عن طريق خلط 1 غ من ذوبان منخفضة [اغروس] مع 50 مل ماء المقطر. اﻷوتوكﻻف [اغروس]، السماح لتبرد، وأنابيب قاسمة ثم (1 مل) في 2 مل (انظر الجدول للمواد) قبل أن يتصلب [اغروس]. ويمكن تخزين [اغروس] في-20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
  3. إعداد على الأقل 2 مل من المتوسطة (دميم) وسائل الإعلام "تعديل النسر" دولبيكو س 1 ل.
  4. للمصفوفة لاستخدام TOF مرض التصلب العصبي المتعدد، وإعداد 10 مل من 5 ملغ/مل حمض ألفا-سينو-4-هيروكسيسيناميك 1:1 (شكا): حمض ديهيدروكسيبينزويك (المجالس الصحية المحلية) (انظر الجدول للمواد) في 90:10 ACN:H2س + 0.1% حامض trifluoroacetic (تفا). Sonicate الحل حتى يذوب المصفوفة.

2-الفأر مستعمرة وإزالة المبيض

  1. الحفاظ على أزواج تربية فئران CD-1 استخدام إجراءات الإسكان القياسية. قرب يوم الولادة، تحقق الفئران يوميا حيث أن سن الجراء المعروف.
  2. Euthanize الجراء في الأيام 16-18 من العمر باستنشاق أول أكسيد الكربون2 كل المبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة. تسليم أول أكسيد الكربون2 (100%) في تدفق غرفة التخزين في الدقيقة معدل من 10 – 20% وتستمر لمدة دقيقتين بعد أن توقف عن التنفس. تأكيد القتل الرحيم بخلع عنق الرحم.
  3. تطهير جميع المعدات الجراحية التي غمر في الإيثانول 70%. الحارة L-15 الوسائط في ليبوفيتش مع البنسلين-ستربتوميسين 1 x إلى 37 درجة مئوية.
  4. الرطب على سطح البطن مع الإيثانول 70% لتطهير المنطقة والتقليل من التلوث مع الشعر. فهم الجلد الذي يغطي جدار البطن باستخدام كليلة الملقط واستخدام مقص جراحي جعل كبير الشكل الخامس قطع عن طريق الجلد وجدار البطن، تعريض الأجهزة الداخلية.
  5. نقل الأجهزة الداخلية إلى جانب استخدام الملقط. منفردة الاستيلاء على كل القرن الرحم مع الملقط غرامة ورفع قليلاً.
  6. قم بتحديد موقع المبيض، التي ستكون في نهاية القرن الرحم، مباشرة أسفل الكلي. استخدم المقص الجراحي لتشريح المبيض خالية من النسيج الضام. بعد ذلك، قص القرن المبيض في النصف.
  7. نقل المبيض وقناة، ونحو واحد النصف من كل القرن الرحم ب L-15 وسائل الإعلام حرارة قبل ليبوفيتش.
  8. تحت مجهر تشريح الانتقال بعناية كل المبيض من الجراب المحيطة، تخليصه من قناة وبورصة وأي الأنسجة الدهنية. نقل كل المبيض إلى طبق جديد من الوسائط L-15 ليبوفيتش.
  9. قص كل المبيض في نصف محوريا. الاحتفاظ بالقطع المبيض (تسمى الآن اكسبلانتس) أبقى على 37 درجة مئوية حتى الطلاء من [اغروس].

3-إعداد وتفرخ الشريحة تعامل إيتو كوكولتوريس

  1. كوكولتوريس غير مجزأة
    1. التسييل [اغروس] في 70 درجة مئوية على طبق ساخن.
    2. ضع فاصل 8-جيدا على رأس تينوكسيدي الإنديوم (إيتو)-شريحة المعالجة (الشكل 1A). الإيدز أسفل المطاط على الحد الفاصل في الالتصاق للشريحة، ولكن تأكد من أن تطبيق الضغط النزولي لطيف المستمر أثناء الطلاء [اغروس] لضمان لا تسرب أو خلط بين الآبار.
    3. جمع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل، أجهزة الطرد المركزي (5 دقائق 800 لفة في الدقيقة)، وريسوسبيند إلى 50 ك الخلايا الواحدة 150 ميليلتر في وسائل الإعلام x DMEM 1. إذا كانت كثافة خلية مختلفة الأمثل، تأكد من أن تعليق خلية في هذه الخطوة هو 2 x الكثافة النهائية المطلوبة (مثلاً، لتركيز خلايا 50,000 في 300 ميليلتر، كثافة الخلية في هذه الخطوة نهائية خلايا 50,000 في 150 ميليلتر).
    4. إضافة explant المبيض قبل طلاء الخلية والثقافة، إلى مركز للبئر (الشكل 1B).
    5. إضافة [اغروس] لكل ثقافة الخلية في أنابيب فردية 2 مل فقط قبل الطلاء. لكل بئر، ضم 200 ميليلتر من تعليق خلية و 200 ميليلتر من [اغروس] السائل في أنبوب 2 مل. على سبيل المثال، لأربعة آبار، الجمع بين 800 ميليلتر من تعليق خلية و 800 ميليلتر من 2% [اغروس]. بعض الخليط سوف يكون خلفها، ولكن مما يجعل قليلاً أكثر من اللازم تجنب فقاعات الهواء أثناء بيبيتينج.
      1. إضافة [اغروس] إلى الثقافات الخلية الفردية قبل طلاء تلك الثقافة الخلية مباشرة. وسوف بارد في أقل من دقيقة [اغروس]، حتى تكون مستعدة للوحة بسرعة.
    6. فور إضافة 300 ميليلتر من الخليط خلية/[اغروس] لكل بئر (الشكل 1). ويبين الشكل 1 ثلاثة ظروف الخلية وحالة واحدة من وسائل الإعلام، وبعضها مطلي مع أو بدون مبيض.
    7. احتضان شريحة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في حاضنة هوميديفيد.
  2. كوكولتوريس المقسمة.
    1. قطع فواصل من البلاستيك رقيقة، ناعمة (الشكل 2A).
      ملاحظة: يستخدم هذه التجربة على جانبي حوض العقيمة الوسائط القابل للصرف لأنها مسطحة ورقيقة. قطع منها مجرد واسعة بما يكفي تناسب بشكل مريح في وتر البئر (~ 13 مم).
    2. التسييل [اغروس] في 70 درجة مئوية على طبق ساخن.
    3. ضع فاصل 8-جيدا على رأس الشريحة تعامل إيتو (الشكل 2). الإيدز أسفل المطاط على الحد الفاصل في الالتصاق للشريحة، ولكن تأكد من أن تطبيق الضغط النزولي لطيف المستمر أثناء الطلاء [اغروس] لضمان لا تسرب أو خلط بين الآبار.
    4. جمع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل، أجهزة الطرد المركزي (5 دقائق 800 لفة في الدقيقة)، وريسوسبيند إلى 50 ك الخلايا الواحدة 150 ميليلتر في وسائل الإعلام x DMEM 1. إذا كانت كثافة خلية مختلفة الأمثل، تأكد من أن تعليق خلية في هذه الخطوة هو 2 × كثافة النهائي المطلوب (مثلاً لتركيز نهائي من الخلايا 50,000 في 300 ميليلتر، كثافة الخلية في هذه الخطوة هو الخلايا 50,000 في 150 ميليلتر).
    5. إدراج فواصل بلاستيكية قطرياً في الآبار (الشكل 2).
    6. إضافة [اغروس] لكل تعليق خلية واحدة في وقت واحد فقط قبل الطلاء. لكل بئر، الجمع بين 100 ميليلتر من تعليق خلية و 100 ميليلتر من [اغروس] السائل في أنبوب 2 مل. على سبيل المثال، لأربعة آبار، الجمع بين 400 ميليلتر من ثقافة الخلية و 400 ميليلتر من 2% [اغروس]. سوف يكون خلفها بعض الخليط خلية/[اغروس] ولكن صنع قليلاً أكثر من اللازم تجنب فقاعات الهواء أثناء بيبيتينج.
      1. إضافة [اغروس] إلى الثقافات الخلية الفردية قبل طلاء تلك الثقافة الخلية مباشرة. وسوف بارد في أقل من دقيقة [اغروس]، حتى تكون مستعدة للوحة بسرعة.
    7. على جانب واحد من المفرق، لوحة 150 ميليلتر من الخليط خلية/[اغروس]. يسمح [اغروس] بارد وترسيخ (حوالي دقيقة واحدة) ثم قم بإزالة الفاصل (الشكل 2D).
    8. ضع explant المبيض في وسط النصف الفارغ من البئر. مكان 150 ميليلتر وسائل الإعلام/[اغروس] خليط عبر أعلى المبيض، وفقط في الجانب الصحيح من البئر (الشكل 2E).
    9. احتضان شريحة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في حاضنة هوميديفيد.

4-تجفيف الشريحة والتحضير لاستخدام TOF مرض التصلب العصبي المتعدد

  1. بعد أربعة أيام (أو أي نقطة الوقت المفضل)، إزالة الفاصل الدائرة من المقابس [اغروس] والشريحة (الشكل 1). فصل الجانبين من [اغروس] من الدائرة برفق بملعقة مسطحة واجذب الدائرة إلى الأعلى، مع الحرص على عدم تحريك أي المقابس [اغروس]. إذا تحركت، بلطف موضعها حتى أن أنهم لا لمس بعضها البعض.
  2. ضع الشريحة في فرن 37 درجة مئوية لحوالي 4 ح، تدوير 90° كل ح.
    ملاحظة: تناوب الشريحة مهم لضمان توزيع الحرارة حتى في جميع أنحاء العينة.
  3. وبمجرد جفاف، إزالة الشريحة من الفرن (الشكل 1E).
  4. تطبيق الحل مصفوفة باستخدام البخاخ (الشكل 1F)، مع المعلمات التالية: درجة الحرارة = 30 درجة مئوية، ومعدل التدفق = 0.2 مل/دقيقة، عدد تصاريح الدخول = 8، الاتجاه = CC، وفوهة المسافة = 40 مم.
    ملاحظة: يمكن استخدام بخاخة فنية لتطبيق مصفوفة السائل عوضاً عن بخاخ مصفوفة،. يمكن استخدام نفس الحل مصفوفة للرش، ولكن تقريبا ضعفي الحل المطلوب. مع الشريحة فرضت ذلك لأنها معلقة عمودياً، رذاذ الشريحة من زاوية 90 درجة من ما يقرب من قدم واحدة بعيداً (مواءمة من هوفمان15) حتى المصفوفة طبقة مرئية.
  5. أضف 1 ميليلتر من كاليبرانت (الفوسفور الأحمر لأهداف < 500 دا، خليط ببتيد (انظر الجدول للمواد) لأهداف < دا 5,000) إلى تركيز واضح على الشريحة. الفوسفور الأحمر يتطلب لا خلط مع المصفوفة، ولكن يتطلب الخليط الببتيد الخليط 1:1 مع مصفوفة المعونة التأين. انتظر كاليبرانت لتجف.
  6. رسم علامة X باستخدام علامة دائمة في كل زاوية الشريحة وتأخذ صورة ضوئية باستخدام كاميرا أو ماسح ضوئي على 1,200 نقطة في البوصة.

5-تصوير الطيف الكتلي اقتناء البيانات

  1. فتح تسلسل جديد في برنامج تحليل بيانات نظام الرصد الدولي (انظر الجدول للمواد). تعيين العرض النقطية إلى القرار المكاني المطلوب، على الأقل 50 ميكرومتر.
  2. تحميل الصورة الضوئية للشريحة لبرمجيات التحليل وتعليم تعيين ثلاث نقاط باستخدام التقاطعات في العاشر في كل زاوية.
  3. تعيين المناطق ذات الاهتمام للتصوير في اقتناء البرمجيات واسم لها تبعاً لذلك.
  4. معايرة هذا الصك باستخدام البرمجيات اقتناء البيانات (انظر الجدول للمواد) داخل خطأ 5 جزء في المليون.
  5. حفظ الأسلوب الأمثل وبدء التشغيل. هذه التجربة الأمثل المعلمات التالية: الأقطاب = إيجابية وكاشف = ريفليكترون، حجم الليزر = 2، طاقة الليزر = 50%، مكسب للكشف عن وضع عاكس = 3 x.

6-تجهيز بيانات نظام الرصد الدولي

  1. استيراد ملف.mis في البرامج الإحصائية (انظر الجدول للمواد) لتحليل أهمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

سيؤدي إلى شريحة إيتو مجففة على النحو الأمثل في عينة يهتمان مسطحة مع الحد الأدنى للا التجاعيد عبر السطح [اغروس] و [اغروس] القطع التي تحافظ على الفصل المكاني على الشريحة (الشكل 3). ويبين الشكل 3 ألف التجفيف المثلى، بينما يبين الشكل 3B التجاعيد التي ينبغي تجنبها. هذا التحسين يتطلب حذراً من رصد للشريحة في الفرن، كما يمكن أن تختلف أوقات الضبط استناداً إلى الرطوبة النسبية. بينما التجاعيد يمكن أن تؤثر قليلاً على الارتفاع، وذلك إشارات دقة الشامل لنظام الرصد الدولي، التجاعيد طفيفة لن تؤثر على نوعية البيانات. ولذلك، يمكن لا يزال تحليل [اغروس] أي يحتوي على التجاعيد طفيف في نهاية المطاف عن طريق استخدام TOF مرض التصلب العصبي المتعدد. الشريحة يجب أن تجفف تماما أو يمكن أن يؤدي هذا إلى انفجار من العينة في بيئة فراغ عالية من مطياف كتلة TOF استخدام.

قد تعمل الأخرى ركائز جانبا [اغروس]، ولكن في كثير من الأحيان لا الحفاظ على سلامتها الهيكلية عند التجفيف أو إزالة الدائرة جيدا، الذي ينتج عن امتداد الشريحة إيتو وفقدان المعلومات المكانية. على سبيل المثال، اختبرناها سابقا الكولاجين كركيزة وأسفر ذلك عن نشر وفقدان المعلومات المكانية عندما كانت الدائرة جيدا بإزالة (البيانات لا تظهر). الأنسجة المستخدمة ينبغي أن يكون في مركز البئر إذا كان غير مجزأة، أو في وسط المثلث نصف إذا هي مقسمة، حيث أن الحصول على بيانات نظام الرصد الدولي غير ملوثة بتأثيرات الحافة. ويبين الشكل 4 أمثلة للأنسجة يقع على النحو الأمثل (لوحة أ) وشدة وضع الأنسجة (فريق ب). في الشكل 4 باء، يقع الأنسجة على حافة [اغروس]، عندما تم التقاط صور لها، قد يؤدي إلى إشارات الشامل زائفة من تأثيرات الحافة، وعدم السماح للمستخدمين بصورة [اغروس] المحيطة بالانسجة، مما يعني أن يفرز إشارات قد تكون أخطأت أثناء التحليل. ينبغي أن تكون الأنسجة بالقرب من مركز قدر الإمكان، كما هو موضح في الشكل 4A.

سلسلة من التجارب وقرر أن دائرة 8-جيدا للسفينة أفضل للحضانة، بالمقارنة مع لوحة 6-جيدا وطبق 24-جيدا، لأن نتائج الدائرة 8-جيدا في اضطرابات الحد الأدنى للخلايا، بينما تتطلب الدوائر الكبيرة الأخرى [اغروس] ألواح ستنقل إلى شريحة إيتو أو الفولاذ المقاوم للصدأ بعد الحضانة16. يمكن استخدام الدوائر 8-جيدا من العديد من العلامات التجارية لشرائح الدائرة، ولكن تلك مع الجانبين أسفل والتوازي مطاطية لاصقة آبار تيسير الأخذ بسهولة وإزالة مقسم البلاستيك للآبار مقسمة. لوحة 6-جيدا يتطلب أكثر بكثير من المواد، وواجهت صعوبات مع تجفيف هذه المناطق الكبيرة. الدائرة 24، حسنا كان أيضا مشاكل أثناء التجفيف، نظراً لتأثير غضروف كان واضحا في الآبار وذلك المقابس المجففة مع حواف أعلى بكثير. الدائرة 8-جيدا لا ينتج تأثير غضروف عندما يتم مطلي [اغروس] مباشرة في وسط البئر، والمقابس [اغروس] لا يجب أن يكون نقل. بالإضافة إلى ذلك، يسمح الدائرة 8-جيدا لظروف 8 اختبارها أو تسيطر عليها في تجربة واحدة. اعتماداً على التجربة، قد يكون من المهم تشمل عناصر مثل الآبار (1) مع لا explants المبيض أو الخلايا أو (2) الآبار مع الخلايا فقط، أو (3) آبار مع explants المبيض فقط. نظراً لإعداد نموذج (تركيز وسائط الإعلام و [اغروس] دقيقة، ومقدار مصفوفة، إلخ) يختلف بشكل طفيف بين تشغيل، يجب مقارنة الظروف عند أنها يتم الحصول على الشريحة نفسها.

تجارب أخرى قرر أن شريحة المغلفة إيتو أفضل منصة للحضانة عند مقارنتها باستخدام لوحة الصلب للشريحة تسمح للتحقق البصري للخلية الدولة وتحديد المواقع. على سبيل المثال، باستخدام الشريحة إيتو، يمكننا التحقق من أن الخلايا عادية مورفولوجية وأن تحتفظ بتوزيع متجانس في جميع أنحاء [اغروس] قبل و جفاف التالية16. الشريحة سيسمح أيضا بإدراج خطوط الخلايا الفلورسنت حسب الحاجة. بالإضافة إلى ذلك، إزالة الدائرة قبل جفاف مطلوب للاحتفاظ بأكملها التوصيل [اغروس]. إذا كانت الشريحة هو مبشور مع التقيد الدائرة 8-جيدا، والبلاستيك تسحب التوصيل [اغروس] وبصرف النظر ويؤدي إلى شروخ كبيرة في المقابس. الشكل 5 يوضح المشاكل التي تواجه عندما لا يتم إزالة الدائرة قبل التجفيف.

عند تحليل السكان الخلية، من المهم أن القرار المكانية هو على الأقل 50 ميكرومتر لبدء التقاط الحجم الصغير للتفاعلات الخلوية والأنسجة. مع مصفوفة رش، فإنه من الممكن تحقيق 5 ميكرومتر القرار، لكن هذا يطيل الوقت الإجمالي جمع البيانات الكتلي حين تسفر عن نتائج مماثلة. القرار المكانية أيضا تعتمد على القدرة على التركيز في مطياف كتلة TOF استخدام الليزر.

وعموما، نحن الأمثل هذا الإعداد الشرائح أفضل الكشف عن تبادل الجزيئات الصغيرة في كوكولتوري. ولذلك، نحن نسعى أثناء تحليل البيانات الجزيئية ميزات موجودة فقط أو هي إلى حد كبير أكثر وفرة في المكونات [اغروس] الذي يمثل الحالة البيولوجية للفائدة. لأن هناك خيار لتشمل سبعة ضوابط وشروط على الشريحة الأخرى، هذا يمكن أن يتحقق بصريا و by the aid of الإحصائية البرمجيات المصممة لبيانات نظام الرصد الدولي. لدينا عملية ديريبليكيشن في أعقاب الكشف عن الجماهير المختصة مكانياً واسعة النطاق بحيث يمكننا أورثوجونالي الحصول على بيانات الكتلة وتجزئة ذات الدقة عالية. أن الخطوة الأولى التي نتخذها ديريبليكيشن بحث من الكتلة الاسمية من خلال قاعدة بيانات، مثل قاعدة بيانات ميتابولومي البشرية (همدب) لنواتج الأيض الثدييات. معظمها من الجزيئات في قاعدة البيانات على عدد كبير من الأطياف التي تغطي العديد من التقنيات للمقارنة للبيانات التجريبية. مجرد الجماهير الاسمية الجزيئات المرشحة المحتملة كهويتها المفترضة، من الممكن غالباً لمقارنة البيانات المادية مثل تجزئة MS/MS والشخصية الأشعة فوق البنفسجية والاحتفاظ بالوقت بين هيكل المرشح، ومعيار.

على سبيل المثال، تحديد الهوية لإفراز في كوكولتوري ورمي FTE الخلايا المحتضنة مع أنسجة المبيض صادق أن هذا الأسلوب نظام الرصد الدولي قادرة على اكتشاف جزيئات صغيرة ذات الصلة من هذا النظام16. ويصور الشكل 6 حساسية تشغيل نظام الرصد الدولي، عرض نوع البيانات التي يمكن للمرء أن يتوقع باتباع البروتوكول للدوائر غير مجزأة. كما يبين الشكل 7 بيانات تمثيلية لإعداد غرفة مقسمة.

Figure 1
رقم 1: سير العمل لإعداد عينة غير مجزأة كوكولتوري. (أ) التقيد 8-بئر الدائرة إلى جانب موصل من الشريحة المغلفة إيتو. (ب) مكان النصف المبايض في مركز الآبار لظروف كوكولتوري. (ج) إضافة 300 ميليلتر من تعليق [اغروس]/الخلية مباشرة في الآبار. تأكد من وجود لا فقاعات الهواء وأن المبيض لا يزال في وسط البئر. إذا كان بالانزعاج [اغروس] بيبيتيد المبيض، بلطف استخدام تلميح بيبيت لأنها مركز قبل أن يبرد [اغروس]. (د) بعد أربعة أيام حضانة (أو خلاف ذلك أقصى حد الوقت) إزالة الدائرة 8-جيدا من الشريحة. إذا كان لا يزال [اغروس] المرفقة إلى الدائرة، بلطف فصل التوصيل [اغروس] من الدائرة باستخدام ملعقة وموضعه على الشريحة. [اغروس] لا ستلتزم بالشريحة، حيث أنه سيكون من السهل على التحرك. رسم علامة 'X' على كل زاوية الشريحة والتقاط صورة. () الجاف الشريحة في فرن 37 درجة مئوية ح 4، 90 ° بالتناوب كل ساعة. [اغروس] ينبغي أن يكون مبشور تماما، وينبغي أن تقع الشقة على الشريحة. (و) تطبيق مصفوفة الاختيار عن طريق بخاخ أو البخاخة الشريحة. يجب أن تكون طبقة مصفوفة مرئية كالأصفر. تفحص الشريحة على ماسح ضوئي على 1,200 نقطة في البوصة، وإضافة كاليبرانتس أو معايير لتحليل استخدام TOF مرض التصلب العصبي المتعدد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: سير العمل لإعداد نموذج لتقسيم كوكولتوري. (أ) قطع علامات الخروج من حوض وسائط الإعلام (~ 13 مم) وضمان أن الجانبين على التوالي. (ب) الدائرة 8-كذلك إرفاق إلى جانب موصل من الشريحة المغلفة إيتو. (ج) إدراج فواصل قطرياً في الآبار. (د) إضافة 150 ميليلتر خلية ثقافة في [اغروس] إلى جانب واحد من المفرق، يسمح [اغروس] لتبريد، وإزالة الفاصل. () المبيض إضافة إلى مركز نصف فارغة تماما والغطاء مع 150 ميليلتر من تعليق وسائل الإعلام و [اغروس]. هذا الرقم المستنسخة بإذن من عنصر الزنك et al. عام 201816. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: التجاعيد في المقابس [اغروس]- يمكن أن تشكل التجاعيد في المقابس [اغروس] إذا ترك الشريحة في الفرن لفترة طويلة جداً. هذا لن يمنع العينة من تحليل TOF استخدام مرض التصلب العصبي المتعدد ولكن قد يؤثر على نوعية البيانات. (أ) صورة شريحة المجففة على النحو الأمثل. [اغروس] المحيطة بأنسجة المبيض كله مسطحة تماما وخالية من التجاعيد، وتوفير مساحة كافية لتحليل نظام الرصد الدولي. (ب) صورة من شريحة ضعيفة المجففة مع التجاعيد [اغروس] في جميع أنحاء العينة. هذا الرقم المستنسخة بإذن من عنصر الزنك et al. عام 201816. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تحديد المواقع للأنسجة. وضع الأنسجة في العينة المجففة مهم جداً للحصول على البيانات. (أ) إظهار المجففة [اغروس] المقابس الدوائر المقسمة المبيض في مركز واحد نصف البئر، والأمثل للتصوير. (ب) المجففة المقابس [اغروس] دائرة مقسمة حيث كان مركزة المبيض لا للحضانة أو التجفيف. أنسجة المبيض المجففة على محيط المقابس [اغروس]، و ولذلك لا يمكن أن يتم تحليلها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: تجفيف الشرائح مع الدائرة. عندما يتم تعيين الشريحة في الفرن قبل إزالة الدائرة، تلتزم بقوة أكبر من البلاستيك لأنفسهم المقابس [اغروس] ويبدأ الانسحاب بعيداً في الحرارة. يؤدي هذا في الشقوق الشديدة في [اغروس]، والتصاق قليلاً على الشريحة نفسها. الشقوق الكبيرة هذه، لا تفضي إلى تحليل نظام الرصد الدولي. الأعلى: الشريحة بعد أن انضمت جفاف ح 2 مع الدائرة 8-جيدا. تصدع المقابس [اغروس] جميع ولكن اثنين من خلال المركز بسبب الانضمام إلى الدائرة 8-جيدا. أسفل: الشريحة بعد إزالة الدائرة 8-جيدا. وظل واحد فقط [اغروس] التوصيل على الشريحة. هذا الرقم المستنسخة بإذن من عنصر الزنك et al. عام 201816. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: الكشف عن إشارات فريد. عند مقارنة الظروف 8، من الممكن للكشف عن الإشارات التي فريدة من نوعها لشرط واحد واحد. صورة الشريحة (أ) المجفف يستخدم لتعليم مطياف كتلة TOF استخدام المناطق التي الصورة. هنا لدينا نخبة صغيرة من المناطق المحيطة بأنسجة المبيض لنظام الرصد الدولي في 50 ميكرومتر. (ب) ممثل صورة لإشارة m/z أوبريجولاتيد في حالة واحدة مقابل كل ثمانية في نفس الشريحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: بيانات تمثيلية من إعداد دائرة مقسمة. ويرد أنسجة المبيض في الأبيض. ويفرز m/z 112 من النصف شكل جيد التي تحتوي على المبيض. تم تنفيذ نظام الرصد الدولي في 50 ميكرومتر. هذا الرقم المستنسخة بإذن من عنصر الزنك et al. عام 201816. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة التي تورط الدور في إفراز هجسوك12،،من1718، وقد أسهم هذا التقنية المعلومات آليا إلى أكثر. مع الظروف البيولوجية على الأقل ثمانية موجودة على الشريحة نفسها، يمكن أن تمثل الأسلوب لعناصر بيولوجية مثل الجينات وخصوصية الخلية، فضلا عن ضوابط وسائل الإعلام في IMS واحد تشغيل. في حين كان الأسلوب الأمثل لتقييم وتبادل الجزيئات الصغيرة في نموذج لورم خبيث الابتدائية في هجسوك، أي خلية أو نوع الأنسجة التي يمكن وضعها في [اغروس] يمكن أن تكون بديلاً لتحليل طائفة واسعة من المسائل البيولوجية والحالات المرضية.

واحدة من أهم الخطوات في البروتوكول هو ضمان أن أنواع الخلايا أو الأنسجة بالقرب من بعضها البعض وموجودة في مركز التوصيل [اغروس]. ثمة اعتبار هام آخر هو الأمثل للوقت التجفيف للشريحة بأكملها. هذا الأسلوب الأمثل باستخدام أنسجة المبيض، التي جفت بسهولة وحجمها صغير أسفر عن مضاعفات التجفيف قليلاً. ومع ذلك، الأنسجة الأخرى، مع تكوين مختلفة مثل fat، ملامح تجفيف مختلفة جداً ولذلك تتطلب التحسين جفاف أكثر اتساعاً. سير العمل المتبقية بعد التجفيف قد الأمثل للعينة البيولوجية، ينبغي أن تتطلب تغيير الحد الأدنى فقط.

خلال اكتساب كتلة طيفية، فمن المرجح أن العديد من المشاريع تتطلب تحليل مجموعات مجمع خلاف الجزيئات الصغيرة. معلمات نظام الرصد الدولي لاقتناء والاختيار من المصفوفة، ولذلك، ينبغي أن تتكيف توليد بيانات أفضل للهدف منها، إذا كان معروفا. بالإضافة إلى ذلك، نحن فقط إجراء الحصول على البيانات في وضع إيجابي مع مصفوفة CHCA:DHB 50: 50، لكن التجارب وضع سلبي قد تفضل نوع مختلف من المصفوفة، وجزيئات أكبر سوف يمكن الكشف عنها بسهولة أكثر في مصفوفة مختلفة، وكذلك. يمكن استخدام الأسلوب مع طائفة واسعة النطاق شامل في نهج غير مستهدفة أو مع مجموعة أسلحة أضيق لبحث هادف. في حالة الأسلوب نوقش أعلاه، كانت الجزيئات الصغيرة هدفا للفائدة لأنه كان التركيز على الكشف عن الجزيئات التي تم تبادلها من خلال [اغروس] بين ممثلي الخلايا والأنسجة. على الرغم من أن لا يمكننا أن ندعي بالقيود من حيث الحجم والهيكل التي تمنع الحركة من خلال [اغروس]، كان هدفنا الكشف عن الجزيئات الصغيرة، فلدينا مصفوفة المقرر ومعلمات TOF استخدام MS كانت الأمثل لتحقيق ذلك الهدف. ويجري تطوير التجارب المقبلة لاستهداف الدهون والبروتينات التي قد ضاعت في أسلوبنا اقتناء الأصلي.

بالإضافة إلى الحد من الكشف عن فئة المركبة، يتطلب هذا الأسلوب أيضا أن الخلايا تكون متوافقة مع [اغروس]، وأن عينات الأنسجة (إذا استخدمت) يمكن تكييفها لتناسب دائرة ثمانية آبار. بعض الأنسجة يمكن تكييفها للآبار أكبر إذا كانت الظروف البيولوجية أقل مطلوبة للمقارنة، ولكن من الأهمية بمكان أن النسيج المحدد قادر على تجفيف إلى ارتفاع أقل من 100 إلى 200 ميكرون موحدة بعد جفاف4. يمكن تقييم عينات بيولوجية متعددة مثل نوع خلية واحدة أو أكثر في الاتصالات مع أنسجة. نظراً لأن إعداد عينة قادرة على فصل مكانياً الثقافات الخلية على أساس [اغروس]، فمن الممكن لتعيين تصور m/z 's إلى مصدر ثقافة الخلية استناداً إلى أنماط نشر الملاحظة.

ويجمل الطابع المعقد للأنسجة باستخدام نظام الرصد الدولي لدراسة أقسام الأنسجة من العينات البشرية أو نماذج الماوس المحورة وراثيا. ومع ذلك، العينات البشرية من الصعب الحصول على، التي يمكن أن تحد كبير القدرة على دراسة أشياء مثل تطور المرض. ويمكن جمع الأنسجة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا في نقاط زمنية محددة تحديداً جيدا. ولكن، نماذج الماوس يمكن أن تكون مضيعة للوقت ومكلفة لتطوير. وباﻹضافة إلى ذلك، تعقيد كامل الأنسجة الحقيقية في كل من هذه النماذج يمكن أن تجعل من الصعب على تقييم الاتصالات بين الخلايا المحددة أو الأنسجة بدقة. وفي المقابل، هو الطريقة المعروضة هنا القدرة على التكيف. يمكن كوكولتوريد خطوط الخلايا أو أنسجة مختلفة على نفس الشريحة لدراسة الاختلافات في الاتصالات. على سبيل المثال، يمكن مثقف الخلايا الطبيعية أو خلايا الورم من النسيج نفسه على الشريحة نفسها لفهم الاختلافات بسبب التحول. قد كشف دراسات دورة الوقت رواية الشلالات إرسال الإشارات بين الخلايا، أو يمكن إدراج مثبطات جزيء صغير و/أو [رني] لدراسة دور الجزيئات إشارات محددة أو نواتج الأيض. ونحن نعتقد أن هذه الإمكانيات سوف تجعل هذه التقنية مفيدة لدراسة خلية إلى خلية الاتصالات في مجموعة متنوعة من السياقات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

Acknowledgments

تم تمويل الكونسورتيوم شيكاغو الطبية بدعم من "أموال سيرل" في "شيكاغو المجتمع الأمانة" (C-076) (L.M.S.)؛ وتمول جامعة إلينوي في شيكاغو بدء التشغيل (L.M.S.)؛ منح 543296 من التحالف صندوق أبحاث سرطان المبيض (دكتوراه في الطب)؛ و UG3 ES029073 (J.E.B.)، والمركز الوطني للنهوض متعدية العلوم، المعهد الوطني للصحة، من خلال منحة UL1TR002003 (جيب & سكاي لأب المذكورة).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Falcon tubes Denville C1017-O To collect cells
8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) Millipore PEZGS0816 Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34998-4L Solvent for sprayed matrix
Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) Fisher 10-022-CV Cell culture media
Autoflex speed MALDI-TOF LRF Bruker For IMS data analysis
Centrifuge Eppendorf 5810 R To collect cells and remove supernatant
CHCA Matrix Bruker Daltonic 8201344 Matrix sprayed onto dried slide
DHB Matrix Bruker Daltonic 8201346 Matrix sprayed onto dried slide
Disposable Scalpels Fisher 22-079-707 For removal of the ovaries
Dissecting Scissors Fisher 13-804-6 For removal of the ovaries
DMEM Media Gibco 11995-065 Media mixed with agarose
epidermal growth factor Peprotech Inc. 100-15 Cell culture media supplement
Eppendorf tubes Genesee Scientific 22-282 For agarose aliquots
Estradiol-17β Simga-Aldrich E2758 Cell culture media supplement
Fetal Bovine Serum Denville fb5001 Cell culture media supplement
FlexControl 3.4 Bruker Daltonic IMS data acquisition software
FlexImaging 4.1 Bruker Daltonic IMS data analysis software
Forceps (fine) Fsiher 22-327379 For removal of the ovaries
Gentamycin Cellgro 30-005-CR Cell culture media supplement
Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) Sigma-Aldrich 11074547001 Cell culture media supplement
ITO-coated slide Bruker 8237001 Platform for co-culture incubation
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 11415064 Media used during tissue dissection
L-glutamine Gibco 25030-081 Cell culture media supplement
Low-melting agarose Sigma-Aldrich A9414-10G Mixed with media for plating
Media basin Corning 4870 Used to cut plastic dividers for divided chambers
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122 Cell culture media supplement
Peptide Calibration Standard Bruker Daltonic 8206195 Calibrant for medium mass range
Phophorus red Sigma-Aldrich 343-242-5G Calibrant for low mass range
SCiLS Lab 2015 Bruker Daltonic IMS data statistical analysis
Surgical Forceps (blunt) Fisher 08-875-8B For removal of the ovaries
TFA Fisher Technologies A116-50 Added to matrix solution
TM Sprayer HTX Technologies For applying matrix

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11, (5), e0154837 (2016).
  2. Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating Metabolic Exchange with Imaging Mass Spectrometry. Nature Chemical Biology. 5, (12), 885-887 (2009).
  3. Li, H., Hummon, A. B. Imaging Mass Spectrometry of Three-Dimensional Cell Culture Systems. Analytical Chemistry. 83, (22), 8794-8801 (2011).
  4. Yang, J. Y., et al. Primer on Agar-Based Microbial Imaging Mass Spectrometry. Journal of Bacteriology. 194, (22), 6023-6028 (2012).
  5. Coscia, F., et al. Integrative Proteomic Profiling of Ovarian Cancer Cell Lines Reveals Precursor Cell Associated Proteins and Functional Status. Nature Communications. 7, 12645 (2016).
  6. Labidi-Galy, S. I., et al. High Grade Serous Ovarian Carcinomas Originate in the Fallopian Tube. Nature Communications. 8, (1), (2018).
  7. Klinkebiel, D., Zhang, W., Akers, S. N., Odunsi, K., Karpf, A. R. DNA Methylome Analyses Implicate Fallopian Tube Epithelia as the Origin for High-Grade Serous Ovarian Cancer. Molecular Cancer Research. 14, (9), 787-794 (2016).
  8. Falconer, H., Yin, L., Gronberg, H., Altman, D. Ovarian Cancer Risk After Salpingectomy: A Nationwide Population-Based Study. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 107, (2), dju410 (2015).
  9. Dean, M., Davis, D. A., Burdette, J. E. Activin A Stimulates Migration of the Fallopian Tube Epithelium, an Origin of High-Grade Serous Ovarian Cancer, through Non-Canonical Signaling. Cancer Letters. 391, 114-124 (2017).
  10. King, S. M., Burdette, J. E. Evaluating the Progenitor Cells of Ovarian Cancer: Analysis of Current Animal Models. BMB Reports. 44, (7), 435 (2011).
  11. Reznik, E., et al. Landscape of Metabolic Variation across Tumor Types. Cell Systems. 6, (3), 301-313 (2018).
  12. Watkins, J. L., et al. Clinical Impact of Selective and Nonselective Beta-Blockers on Survival in Patients with Ovarian Cancer: Beta-Blockers and Ovarian Cancer Survival. Cancer. 121, (19), 3444-3451 (2015).
  13. Lutgendorf, S. K., et al. Stress-Related Mediators Stimulate Vascular Endothelial Growth Factor Secretion by Two Ovarian Cancer Cell Lines. Clinical Cancer Research. 9, (12), 4514-4521 (2003).
  14. Sood, A. K. Stress Hormone-Mediated Invasion of Ovarian Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 12, (2), 369-375 (2006).
  15. Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous Matrix Deposition on Dried Agar for MALDI Imaging Mass Spectrometry of Microbial Cultures. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26, (11), 1959-1962 (2015).
  16. Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Imaging Mass Spectrometry Reveals Crosstalk between the Fallopian Tube and the Ovary That Drives Primary Metastasis of Ovarian Cancer. ACS Central Science. 4, (10), 1360-1370 (2018).
  17. Armaiz-Pena, G. N., et al. Src Activation by β-Adrenoreceptors Is a Key Switch for Tumour Metastasis. Nature Communications. 4, 1403 (2013).
  18. Choi, M. J., et al. HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness. Oncogene. 34, (26), 3402 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics