Molécula pequeña comunicación entre tejidos y células mediante espectrometría de masas en la proyección de imagen de captura

Cancer Research

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Summary

Un novedoso método de preparación de la muestra fue desarrollado para acomodar el cocultivo de células y tejidos para detectar cambio de molécula pequeña usando spectrometry total de la proyección de imagen.

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Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (146), e59490, doi:10.3791/59490 (2019).

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Abstract

Espectrometría de masas (IMS) la proyección de imagen rutinaria se ha aplicado a tres tipos de muestras: tejido, esferoides y colonias microbianas. Estos tipos de muestras se han analizado mediante láser asistida por matriz de desorción/ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) para visualizar la distribución de las proteínas, lípidos y metabolitos en muestras biológicas de interés. Hemos desarrollado un método de preparación de la novela muestra que combina las ventajas de las tres aplicaciones anteriores para abordar un enfoque underexplored para la identificación de comunicación química en cáncer, por la siembra de cultivos de células mamíferas en agarosa en cocultivo con tejidos sanos, seguidos de desecación de la muestra. Las células y tejidos de mamíferos son morfología en proximidad cercana, permitiendo la comunicación química a través de la difusión entre el tejido y las células. En momentos específicos, se seca la muestra basado en la agarosa de la misma manera que las colonias microbianas preparado para el análisis IMS. Nuestro método se desarrolló para modelar la comunicación entre el cáncer de ovario seroso de alto grado derivada de la trompa de Falopio como interactúa con el ovario durante la metástasis. Optimización de la preparación de la muestra dio como resultado la identificación de la noradrenalina como un componente clave de la química en el microambiente ovárico. Este nuevo método puede aplicarse a otros sistemas biológicos que requieren una comprensión de la comunicación química entre las células adyacentes o los tejidos.

Introduction

Espectrometría de masas (IMS) de imágenes ha sido optimizada para caracterizar la distribución espacial de características moleculares en tres aplicaciones ampliamente utilizadas: rebanadas de tejido, esferoides y colonias microbianas1,2,3. Rebanadas de tejido pueden utilizarse para evaluar la localización de los metabolitos en el contexto de las condiciones biológicas en un host, ya sea dirigido o no dirigido dentro de un intervalo específico de masa. Sin embargo, las diferencias entre características moleculares son los más evidentes y significativos comparados con un tejido sano es una condición enferma, por ejemplo, un tumor. Este enfoque IMS es particularmente adaptado a la detección de biomarcadores de la enfermedad, sin embargo, adquirir muestras de tejido en etapas discretas de progresión de la enfermedad (por ejemplo, grados de tumor) impide la identificación de señales que podrían ser importantes para la iniciación de la de la enfermedad. El intercambio de información a través del espacio es una característica omnipresente de muchos sistemas biológicos, y rebanadas de tejido no pueden capturar esta dinámica química relé. Una técnica que es capaz de visualizar la difusión y el intercambio químico es IMS de microbianas colonias cultivadas en placas de agar; pequeñas moléculas son capaces de difundir a través de y en el agar y pueden ser capturadas mediante láser asistida por matriz (MALDI-TOF) de desorción/ionización espectrometría de masas4. Esta configuración de crecimiento puede utilizarse para identificar moléculas intercambiadas entre entidades biológicas discretas (colonias) y también puede determinar la direccionalidad de la producción del metabolito. La plataforma diseñada originalmente para el crecimiento de la Colonia microbiana se adaptó para explorar el metabolismo primario de explantes de tejido convertido células de mamífero, y IMS se utilizó para evaluar el intercambio químico dinámico en un sistema mamífero in vitro.

En los últimos años, ha quedado claro que el cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC) a menudo se origina en el epitelio de la trompa de Falopio (FTE) y luego se extiende por metástasis al ovario durante la enfermedad temprana de desarrollo5,6, 7 , 8. la razón por la que FTE tumorigenic células propagación al ovario, donde grandes tumores eventualmente forman y hacen metástasis más, es actualmente confusa. Investigaciones anteriores se ha centrado en el papel de proteínas ováricos primaria metástasis al ovario; sin embargo, recientemente ha sido demostrado que la transición de una saludable a un tejido tumorigenic resulta en interrupción masiva del metabolismo celular y altera la producción de moléculas pequeñas9,10,11. Por lo tanto, la hipótesis de que moléculas pequeñas entre la FTE y el ovario pueden ser en parte responsables primaria metástasis de HGSOC.

Con nuestro procedimiento IMS desarrollado recientemente, hemos determinado que cocultivo de FTE tumorigenic y tejido ovárico sano induce la producción de norepinefrina desde el ovario. Sin embargo, otros tipos de la célula o células FTE normales no provocan este efecto. Un beneficio extraordinario de este método es que se pueden visualizar la producción molecular e intercambio de señales que representan moléculas reales, por lo que incluso en un cocultivo es posible determinar la fuente de una señal. Esto es una ventaja sobre el análisis de las muestras homogeneizadas, donde se pierde toda la información espacial. En nuestro sistema modelo, hemos sido capaces de asignar claramente la producción de noradrenalina al ovario. La noradrenalina se ha relacionado con la metástasis y la quimiorresistencia de cánceres ováricos, y la detección de esta molécula ha validado que el novedoso método IMS puede descubrir moléculas biológicamente relevantes12,13, 14. Esta validación nos permite proponer que esta nueva aplicación de IMS puede ser particularmente útil para grupos que están intentando identificar moléculas pequeñas en entornos de cocultivo y para entender los acontecimientos tempranos que influyen en la transformación de la célula de investigación y metástasis. El objetivo general de este método es aclarar la identidad y la distribución espacial de moléculas pequeñas durante el intercambio entre los tejidos y órganos, representados en vitro los cultivos celulares 3D o tejido vivo ex .

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Protocol

Todos los procedimientos animales estaban de acuerdo con directrices para los institutos nacionales de salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio y aprobaron por el Comité institucional de Animal de uso y cuidado (IACUC) de la Universidad de Illinois en Chicago.

1. preparación de reactivos

  1. Mantener células del epitelio oviducto murino (MOE) a 37° C con 5% CO2 en una incubadora humidificada en alfa medios medio esencial mínimo (αMEM) suplementados con suero bovino fetal 10% selenio (FBS), 2 mM L-glutamina, 10 mg/mL insulina, transferrina, (ITS) , ng/mL 1.8 factor de crecimiento epidérmico (EGF), 100 U/mL penicilina-estreptomicina, gentamicina 1 mg/mL y estradiol-17β 18.2 ng/mL. Pasar las células cada 3-4 días, asegurando que hay suficientes células en el mismo día los ratones serán sacrificados.
  2. 1 g de agarosa de bajo punto de fusión de la mezcla con 50 mL de agua destilada para preparar agarosa al 2%. Autoclave de la agarosa, deje que se enfríe, y luego alícuota (1 mL) en 2 mL tubos (véase Tabla de materiales) antes de que solidifique la agarosa. Agarosa puede almacenarse a-20 ° C indefinidamente.
  3. Preparar por lo menos 2 mL de medio de medio (DMEM) modificado Eagle de 1 x Dulbecco.
  4. Para la matriz de MALDI-TOF MS, prepare 10 mL de 5 mg/mL 1:1 ácido de alfa-ciano-4-hyroxycinnamic (CHCA): ácido dihydroxybenzoic (DHB) (véase Tabla de materiales) en 90: 10 ACN:H2O + 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA). Someter a ultrasonidos solución hasta que se disuelva la matriz.

2. Colonia y extirpación de ovario de ratón

  1. Mantener las parejas reproductoras de ratones CD-1 utilizando procedimientos estándar de la vivienda. Cerca del día del parto, revise los ratones todos los días por lo que se conoce la edad de los cachorros.
  2. Eutanasia de cachorros en 16 – 18 días de edad por la inhalación de CO2 por directrices de los NIH. Entregar el CO2 (100%) en un flujo tasa de 10% – 20% cámara de volumen por minuto y continuar durante dos minutos después había parado la respiración. Confirmar la eutanasia por dislocación cervical.
  3. Desinfecte todo el equipo quirúrgico sumergiendo en etanol al 70%. Caliente media de Leibovitz L-15 penicilina-estreptomicina de 1 x a 37 ° C.
  4. Humedezca la superficie abdominal con etanol al 70% para desinfectar la zona y minimizar la contaminación con el pelo. Sujete la piel que cubre la pared abdominal usando blunt tijeras quirúrgicas pinzas y uso para hacer una gran forma de V corta a través de la piel y pared abdominal, exponer los órganos internos.
  5. Hacia el lado con unas pinzas a los órganos internos. Individualmente agarra cada cuerno uterino con pinzas finas y levante ligeramente.
  6. Localizar el ovario, que será el final del cuerno uterino, inmediatamente por debajo de los riñones. Utilice tijeras quirúrgicas para diseccionar el ovario libre de tejido conectivo. Luego, corte el cuerno ovario en la mitad.
  7. Mover el ovario, oviducto y aproximadamente una mitad de cada cuerno uterino a medios de comunicación de L-15 precalentado de Leibovitz.
  8. Con un microscopio de disección mueva cuidadosamente cada ovario de la bursa circundante, liberándola de cualquier tejido adiposo, el oviducto y bursa. Hacia una nueva placa de los medios de comunicación L-15 de Leibovitz a cada ovario.
  9. Corte axial cada ovario en la mitad. Mantenga las piezas ováricas (ahora llamadas explantes) mantenidas a 37 ° C hasta placas de agarosa.

3. puesta en funcionamiento e incubar el portaobjetos tratados con ITO Cocultures

  1. Cocultures indivisos
    1. Licuar la agarosa a 70 ° C en una placa caliente.
    2. Coloque el divisor 8-bien en la parte superior del tinoxide de indio (ITO)-diapositiva tratada (figura 1A). La parte inferior de goma en el divisor del SIDA en la adherencia a la diapositiva, pero no se olvide de aplicar presión continua suave durante placas de agarosa para ninguÌ n escaparse o mezcla entre pozos.
    3. Recoger las células en un tubo cónico de 15 mL, centrifugar (a 5 minutos a 800 rpm) y vuelva a suspender a 50k células por 150 μL en medios x DMEM 1. Si una densidad celular diferentes es óptima, asegúrese de que en este paso la suspensión celular es 2 x la densidad final deseada (por ejemplo, para una concentración final de 50.000 células en 300 μL, densidad celular en este paso es 50.000 células en 150 μL).
    4. Antes de platear el cultivo celular, añadir ovario explante al centro del pozo (figura 1B).
    5. Añadir agarosa a cada cultivo celular en tubos individuales 2 mL justo antes de la galjanoplastia. Para cada bien, combinar 200 μL de suspensión celular y 200 μL de agarosa licuado en un tubo de 2 mL. Por ejemplo, para los cuatro pozos, combinar 800 μl de suspensión celular y 800 μl de agarosa al 2%. Algunos mezcla quedará, pero haciendo un poco más de lo necesario evita las burbujas de aire durante el pipeteo.
      1. Añadir agarosa a cultivos celulares individuales inmediatamente antes de eso cultura de célula de la galjanoplastia. La agarosa se enfríe en menos de un minuto, así que preparados para placa rápidamente.
    6. Inmediatamente añadir 300 μL de la mezcla de agarosa/células a cada pozo (figura 1). Figura 1 muestra tres condiciones de la célula y la condición de media, que cada uno plateado con y sin un ovario.
    7. Incubar los portaobjetos a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada.
  2. Cocultures divididas.
    1. Corte los separadores de plástico delgado y liso (figura 2A).
      Nota: Este experimento utiliza las partes de una cuenca de medios desechables estériles porque son planas y delgadas. Cortar sólo lo suficientemente ancho como para que calcen bien en la hipotenusa del pozo (~ 13 mm).
    2. Licuar la agarosa a 70 ° C en una placa caliente.
    3. Coloque el divisor 8-bien encima de la diapositiva de ITO-tratada (figura 2B). La parte inferior de goma en el divisor del SIDA en la adherencia a la diapositiva, pero no se olvide de aplicar presión continua suave durante placas de agarosa para ninguÌ n escaparse o mezcla entre pozos.
    4. Recoger las células en un tubo cónico de 15 mL, centrifugar (a 5 minutos a 800 rpm) y vuelva a suspender a 50k células por 150 μL en medios x DMEM 1. Si una densidad celular diferentes es óptimo, asegúrese de que en este paso la suspensión celular es 2 x la densidad final deseada (por ejemplo, para una concentración final de 50.000 células en 300 μL, densidad celular en este paso es 50.000 células en 150 μL).
    5. Inserte separadores plástico diagonalmente en pozos (figura 2).
    6. Añadir agarosa a cada suspensión celular uno en un momento justo antes de la galjanoplastia. Para cada bien, mezclar 100 μl de suspensión celular y 100 μl de agarosa licuado en un tubo de 2 mL. Por ejemplo, combinan cuatro pozos, 400 μL del cultivo celular y 400 μL de agarosa al 2%. Algunos mezcla de agarosa/celular quedará pero haciendo un poco más de lo necesario evita las burbujas de aire durante el pipeteo.
      1. Añadir agarosa a cultivos celulares individuales inmediatamente antes de eso cultura de célula de la galjanoplastia. La agarosa se enfríe en menos de un minuto, así que preparados para placa rápidamente.
    7. En un lado del divisor, placa 150 μL de mezcla de agarosa/célula. Permita que la agarosa se enfríe y solidifique (aproximadamente un minuto) y luego retire el divisor (Figura 2D).
    8. Coloque el explante de ovario en el centro de la mitad vacía del pozo. Mezcla de medios de comunicación/agarosa lugar 150 μL sobre la parte superior del ovario y sólo en el lado correcto del pozo (Figura 2E).
    9. Incubar los portaobjetos a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada.

4. Deslice el secado y preparación para MALDI-TOF MS

  1. Después de cuatro días (o cualquier punto del tiempo preferido), retire el divisor de la cámara de los tacos de agarosa y la diapositiva (figura 1). Separe suavemente los lados de la agarosa de la cámara con una espátula plana y tire suavemente la cámara hacia arriba, teniendo cuidado de no mover enchufes de agarosa. Si se mueven, suavemente resituarlos para que no toquen entre sí.
  2. Colocar el portaobjetos en un horno de 37 ° C durante aproximadamente 4 h, rotando 90 º cada h.
    Nota: La rotación de la diapositiva es importante para asegurar la distribución de calor uniforme a lo largo de la muestra.
  3. Una vez seco, retire la corredera del horno (Figura 1E).
  4. Aplique la solución de la matriz usando el rociador (Figura 1F), con los siguientes parámetros: temperatura = 30 ° C, flujo = 0,2 mL/min, número de pasadas = 8, dirección = CC y la distancia de la boquilla = 40 mm.
    Nota: En lugar de un rociador de matriz, un aerógrafo artístico puede utilizarse para aplicar matriz líquida. La misma solución de matriz puede utilizarse para rociar, pero se requiere aproximadamente dos veces más solución. Con la diapositiva con abrazadera que cuelgue verticalmente, rocíe la diapositiva desde un ángulo de 90° aproximadamente un pie de distancia (adaptado de Hoffmann15) hasta la matriz de la capa es visible.
  5. Añadir 1 μl de calibrant (fósforo rojo para objetivos < 500 Da, una mezcla de péptidos (véase Tabla de materiales) para objetivos < Da 5.000) de claro ver en diapositiva. Fósforo rojo no requiere ninguna mezcla con la matriz, pero la mezcla de péptidos requiere mezcla 1:1 con la matriz para facilitar la ionización. Espere calibrant secar.
  6. Dibujar una X con un marcador permanente en cada esquina de la diapositiva y tomar una imagen óptica con una cámara o un escáner de 1.200 ppp.

5. proyección de imagen de adquisición de datos de espectrometría de masas

  1. Abrir una nueva secuencia en el software de análisis de datos IMS (véase Tabla de materiales). Establecer el ancho de la trama deseada resolución espacial, por lo menos 50 μm.
  2. Cargar la imagen óptica de la diapositiva en el software de análisis y enseñan a establecer tres puntos usando las intersecciones en la x en cada esquina.
  3. Designar las regiones de interés para la proyección de imagen en el software de adquisición y el nombre les por consiguiente.
  4. Calibrar el instrumento con el software de adquisición de datos (véase Tabla de materiales) dentro de error de 5 ppm.
  5. Guarde el método optimizado y comenzar a ejecutar. Este experimento optimizado los parámetros siguientes: polaridad = positivo, Detector = Reflectron, tamaño del Laser = 2, energía del Laser = 50%, Reflector modo detector aumento = x 3.

6. procesamiento de datos IMS

  1. Importar archivo de .mis en software estadístico (véase Tabla de materiales) para el análisis de la significación.

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Representative Results

Una óptimo secada diapositiva ITO tendrá como resultado una plana muestra desecada con mínimo sin arrugas en la superficie de la agarosa y agarosa piezas que mantienen la separación espacial de la diapositiva (figura 3). Figura 3A muestra secado óptimo, mientras que la figura 3B muestra las arrugas que deben ser evitadas. Esta optimización requiere cuidadoso monitoreo de la diapositiva en el horno, como los tiempos exactos pueden variar basado en la humedad relativa. Mientras que las arrugas pueden afectar ligeramente la altura, y por lo tanto las señales de la exactitud total de la IMS, arrugas leves no afectará la calidad de los datos. Por lo tanto, cualquier agarosa que en última instancia tiene las arrugas leves todavía puede ser analizada mediante MALDI-TOF MS. La diapositiva debe ser totalmente secada o esto podría conducir a una explosión de la muestra en el alto ambiente vacío del espectrómetro de masas MALDI-TOF.

Otros sustratos además de agarosa pueden trabajar, pero muchas veces no mantiene su integridad estructural al secado o eliminación de la cámara bien, que se traduce en la difusión a través de la diapositiva de ITO y pérdida de información espacial. Por ejemplo, que previamente hemos probado colágeno como sustrato y esto dio lugar a la propagación y pérdida de información espacial, cuando la cámara bien fue quitado (datos no mostrados). El tejido utilizado debe ser en el centro del pozo si es indivisa, o en el centro del triángulo medio si está dividido, para que la adquisición de datos IMS no está contaminado con efectos de borde. La figura 4 muestra ejemplos de tejido perfectamente situado (panel A) y el tejido mal colocado (panel B). En la Figura 4B, el tejido se encuentra en el borde de la agarosa, reflejada, puede resultar es falsas señales masivas de los efectos de borde y no permiten a los usuarios a la imagen de la agarosa del tejido circundante, que significa que secreta las señales puede perderse durante el análisis. Tejidos deben ser más cercano al centro posible, como se muestra en la Figura 4A.

Una serie de experimentos determinaron que una cámara de 8-bien era el mejor buque para la incubación, en comparación con una placa de 6 pozos y una placa de 24 pozos, debido a que la cámara de 8 pozos en perturbaciones mínimas a las células, mientras que las otras cámaras más grandes requieren losas de agarosa a una diapositiva ITO o acero inoxidable, después de incubación16. Las cámaras de 8 pozos de varias marcas de diapositivas de la cámara se pueden utilizar, pero aquellos con un adhesivo de goma inferior y paralelo de los pozos facilitan la fácil introducción y retirada de un divisor de plástico para los pozos divididos. La placa de 6 pozos requiere mucho más material y tuvieron dificultades con esas grandes zonas de sequía. La cámara de 24 pocillos también tuvo problemas durante el secado, porque el efecto del menisco era evidente en los pozos y por lo tanto, los tapones con bordes significativamente mayores. La cámara 8-bien no resulta en el efecto de menisco cuando la agarosa es plateado en el centro del pozo, y tacos de agarosa no tiene que ser transferido. Además, la cámara del pozo 8 permite 8 condiciones de ser probado o controlado para en un solo experimento. Según el experimento, puede ser importante incluir controles como (1) pozos con no ováricos explantes células, (2) pozos con células solamente o (3) pozos con ovarianos explantes solamente. Porque la preparación de la muestra (concentración precisa de medios y agarosa, cantidad de matriz, etc.) difiere ligeramente entre tramos, deben compararse las condiciones cuando se adquieren en la misma diapositiva.

Otros experimentos determinaron que un portaobjetos recubierto ITO era la mejor plataforma para incubación en comparación con una acero placa MALDI porque la diapositiva permite la verificación visual de la celda estado y posicionamiento. Por ejemplo, utilizar la diapositiva de ITO, podemos comprobar que las células tienen morfología normal y que mantienen una distribución homogénea a lo largo de la agarosa antes y siguiente desecación16. La diapositiva también permitirá incorporación de líneas de células fluorescentes según sea necesario. Además, eliminación de la cámara antes de la desecación es necesaria para mantener la totalidad de la clavija de la agarosa. Si la diapositiva es desecada con la cámara 8-bien adherido, el plástico de la tira del enchufe de agarosa aparte y resulta en grandes grietas en los enchufes. Figura 5 muestra los problemas que se enfrentan en la cámara no se quita antes de secado.

Al analizar las poblaciones de la célula, es importante que la resolución espacial es por lo menos 50 μm para comenzar a capturar el tamaño pequeño de la interacción celular y tejido. Con rociado de la matriz, es posible lograr la resolución de 5 μm, pero esto alarga el tiempo total al reunir los datos de espectrometría de masas mientras que rinde resultados comparables. Resolución espacial es también dependiente en la habilidad para enfocar el láser en el espectrómetro de masas MALDI-TOF.

En general, hemos optimizado esta configuración de diapositiva para detectar mejor pequeñas moléculas intercambiadas en cocultivo. Por lo tanto, durante el análisis de datos buscamos características moleculares que sólo están presentes o son significativamente más abundantes en un enchufe de agarosa que representa la condición biológica de interés. Porque existe la opción de incluir siete otros controles y condiciones de la diapositiva, esto se puede lograr visualmente y con la ayuda de software estadístico diseñado para los datos IMS. Nuestro proceso de especializada tras la detección de masas espacialmente relevantes es amplia para que ortogonalmente podemos obtener una alta resolución masa y fragmentación de datos. El primer paso que tomamos para especializada es una búsqueda de la masa nominal a través de una base de datos, como la base de datos humana de Metabolome (HMDB) para metabolitos mamíferos. La mayoría de las moléculas en la base de datos tienen un gran número de espectros que abarca muchas técnicas para la comparación de datos experimentales. Una vez que las masas nominales tienen potencial candidato moléculas como su supuesta identidad, a menudo es posible comparar datos físicos como fragmentación de MS/MS, perfil de UV y el tiempo de retención entre el candidato y un estándar.

Por ejemplo, la identificación de la noradrenalina en el cocultivo de células FTE tumorigenic incubados con tejido ovárico ha validado que este método IMS es capaz de detectar las pequeñas moléculas de este sistema16. Figura 6 muestra la sensibilidad de los funcionamientos IMS, mostrando el tipo de datos que se puede esperar siguiendo el protocolo para cámaras sin repartir. Del mismo modo, la figura 7 muestra datos representativos para la configuración de la cámara dividida.

Figure 1
Figura 1: flujo de trabajo para preparación de muestras de cocultivo indivisa. (A) adhiera bien 8 cámara al lado conductor del portaobjetos recubiertos de ITO. (B) colocar dos ovarios en el centro de pozos por condiciones de cocultivo. (C) añadir 300 μL de la suspensión de agarosa/celular directamente en los pocillos. Asegúrese de que no hay burbujas de aire y que el ovario permanece en el centro del pozo. Si la agarosa pipeteado disturba el ovario, utilice suavemente la punta de la pipeta al centro antes de que se enfríe la agarosa. (D) tras cuatro días de incubación (o lo contrario optimizado tiempo) quitar cámara 8-pozo de portaobjetos. Si agarosa queda sujeta a la cámara, suavemente separar el enchufe de la agarosa de la cámara con una espátula y colocar en la diapositiva. La agarosa no se adherirá a la diapositiva, así que será fácil de mover. Dibujar una 'X' en cada esquina de la diapositiva y tomar una foto. (E) seco el portaobjetos en un horno de 37 ° C durante 4 h, rota 90 ° cada hora. Agarosa debe estar completamente desecada y debe mentir completamente en la diapositiva. (F) aplicar matriz de elección a través de un pulverizador o aerógrafo se deslice. Capa de matriz debe ser visible como amarillo. Analizar la diapositiva en un escáner de 1.200 ppp y añadir calibradores o estándares para el análisis del MS de MALDI-TOF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: flujo de trabajo para preparación de muestras de cocultivo dividido. (A) corte las lengüetas de la cuenca media (~ 13 mm) y asegurar que los lados son rectos. (B) Fije bien 8 cámara al lado conductor del portaobjetos recubiertos de ITO. (C) insertar divisores diagonalmente en pozos. Cultivo de células (D) agregar 150 μL de agarosa a un lado de separador de ambientes, permite agarosa se enfríe y retire el divisor. (E) agregar ovario centro de mitad bien vacía y cubierta con 150 μL de suspensión de medios de comunicación y agarosa. Esta figura reproducido con permiso de Zink et al 201816. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: las arrugas en agarosa enchufes. Las arrugas pueden formarse en los tacos de agarosa si el carro se deja en el horno durante demasiado tiempo. Esto no será obstáculo para la muestra de análisis por MALDI-TOF MS pero puede afectar la calidad de los datos. (A) imagen de una diapositiva perfectamente seca. De agarosa el tejido ovárico circundante es completamente plana y libre de arrugas, proporcionando una amplia área para análisis IMS. (B) imagen de una diapositiva mal secada con agarosa arrugada a lo largo de la muestra. Esta figura reproducido con permiso de Zink et al 201816. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: colocación de tejido. Posición del tejido en muestra seca es muy importante para la adquisición de datos. (A) secos agarosa tapones de cámaras divididas muestran el ovario en el centro de una mitad del pozo, que es óptimo para la proyección de imagen. (B) secado agarosa tapones de cámara dividida donde el ovario no se centraba para incubación o secado. El tejido ovárico seco en el perímetro de los tacos de agarosa y por lo tanto no se puede analizar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: diapositivas con la cámara de secado. Cuando la diapositiva se establece en el horno antes de quitar la cámara, los tacos de agarosa se adhieren más fuertemente a la plástica que a sí mismos y comiencen a separar en el calor. Esto resulta en severas grietas en la agarosa y poca adherencia a la diapositiva sí mismo. Este grandes grietas no son propicias para el análisis IMS. Arriba: Diapositiva después de desecación 2 h con cámara de 8 bien adherido. Todos los tapones de agarosa pero dos agrietado a través del centro debido a la adherencia a la cámara de 8 pozos. Abajo: Diapositiva después del retiro de cámara 8-bien. Solamente un enchufe de agarosa permanecía en la diapositiva. Esta figura reproducido con permiso de Zink et al 201816. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: detección de señales únicas. Al comparar las 8 condiciones, es posible detectar las señales que son exclusivas de una sola condición. (A) secado diapositiva imagen se utiliza para enseñar el espectrómetro de masas MALDI-TOF que regiones a la imagen. Aquí hemos seleccionado regiones pequeñas alrededor del tejido ovárico para IMS a 50 μm. (B) una representativa imagen de una señal de m/z que es upregulated en una condición frente a las ocho en la misma diapositiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: datos representativos de la configuración de la cámara dividida. Tejido ovárico está delineado en blanco. M/z 112 es secretada de la mitad de bien que contiene el ovario. IMS fue realizada a 50 μm. Esta figura reproducido con permiso de Zink et al 201816. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Hay un cuerpo creciente de evidencia que implica el papel de la norepinefrina en el HGSOC12,17,18, y esta técnica ha aportado información más mecanicista. Con al menos ocho condiciones biológicas presentes en la misma diapositiva, el método puede explicar controles biológicos tales como gene y especificidad celular así como controles de los medios de comunicación en un solo IMS. Mientras que el método fue optimizado evaluar intercambia moléculas pequeñas en un modelo de metástasis primaria en HGSOC, cualquier célula o tipo de tejido que puede ser colocado en agarosa puede ser substituido para analizar una amplia variedad de cuestiones biológicas y Estados de la enfermedad.

Uno de los pasos más importantes en el protocolo es asegurar que los tipos de tejido o célula están cerca uno al otro y están presentes en el centro de la clavija de la agarosa. Otra consideración importante es la optimización de tiempo de secado para la diapositiva entera. Este método se optimizó utilizando tejido ovárico, que seca fácilmente y cuyo pequeño tamaño dio lugar a pocas complicaciones de secado. Sin embargo, otros tejidos, con composición diferente como grasa, tienen perfiles muy diferentes de secado y por lo tanto requieren mayor optimización de la desecación. Después de secado se ha optimizado para la muestra biológica, el flujo restante debe requerir sólo mínima alteración.

Durante la adquisición de masa espectral, es probable que muchos proyectos requerirá el análisis de compuestos grupos distintos de moléculas pequeñas. Los parámetros IMS para la adquisición y la selección de la matriz, por lo tanto, deben adaptarse para generar los mejores datos para el respectivo destino, si se conoce. Además, sólo hemos realizamos la adquisición de datos en modo positivo con una matriz de CHCA:DHB de 50: 50, pero experimentos de modo negativo pueden preferir un tipo diferente de la matriz, y moléculas más grandes se detectaría más fácilmente en una matriz diferente, así. El método puede utilizarse con una gama amplia de masa en un enfoque no focalizado o con un rango más estrecho de la masa para una búsqueda específica. En el caso del método discutido anterior, pequeñas moléculas fueron objeto de interés porque el objetivo era detectar las moléculas que fueron intercambiadas a través de la agarosa entre representantes de células y tejidos. Aunque no podemos decir que las limitaciones en cuanto a tamaño y estructura que inhiben el movimiento a través de agarosa, nuestro objetivo era detectar moléculas pequeñas, por lo que nuestra decisión de matriz y parámetros de MALDI-TOF MS fueron optimizados para ese objetivo. Se están desarrollando experimentos futuros a lípidos y proteínas que pueden haberse omitidas en el método de adquisición original de destino.

Además de la limitación de la detección de compuestos de la clase, este método también requiere que las células sean compatibles con agarosa, y que la muestra de tejido (si utiliza) adaptado para caber en una cámara de ocho pozos. Ciertos tejidos pueden ser adaptados a grandes pozos si menos condiciones biológicas son necesarias para la comparación, pero es crucial que el tejido seleccionado es capaz de secar a una altura uniforme de menos de 100 a 200 μm después de desecación4. Múltiples muestras biológicas podrían ser evaluadas como más de un tipo de célula en comunicación con un pañuelo. Debido a la preparación de la muestra es capaz de separar espacialmente cultivos celulares basado en la agarosa, es posible asignar visualizado m/z 's a la fuente de la cultura de célula basada en patrones de difusión observadas.

Uso de IMS para el estudio de las secciones de tejido de muestras humanas o en modelos de ratón transgénico recapitula la complejidad de los tejidos. Sin embargo, muestras humanas son difíciles de obtener, que dramáticamente puede limitar la capacidad de estudiar cosas como progresión de la enfermedad. Tejido a partir de modelos de ratón transgénico se puede recoger en los puntos de tiempo bien definido. Sin embargo, modelos de ratón pueden ser desperdiciador de tiempo y costosa de desarrollar. Además, la complejidad completa de tejidos reales en ambos de estos modelos puede hacer difícil evaluar con precisión la comunicación entre células específicas o los tejidos. En contraste, el método presentado aquí es una gran capacidad de adaptación. Diferentes tejidos o líneas celulares pueden ser cocultured en la misma diapositiva para examinar las diferencias en la comunicación. Por ejemplo, las células normales o células tumorales del mismo tejido pueden cultivarse en la misma diapositiva comprender diferencias debido a la transformación. Estudios del curso de tiempo pueden descubrir nuevas cascadas de señales entre las células, o inhibidores de molécula pequeña o ARNi podría incorporarse para examinar el papel de determinadas moléculas de señalización o metabolitos. Creemos que estas posibilidades hará que esta técnica útil para estudiar la comunicación de célula a célula en una variedad de contextos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar

Acknowledgments

La financiación fue proporcionada por el consorcio biomédico de Chicago con el apoyo de los fondos de Searle en el Chicago Community Trust (C-076) (L.M.S.); Universidad de Illinois en Chicago Inicio fondos (L.M.S.); Donación de 543296 de la Alianza de fondo de investigación de cáncer de ovario (M.D.); y ES029073 UG3 (J.E.B.) y por el centro nacional para avanzar traslacional Ciencias, Instituto Nacional de salud, a través de subsidio UL1TR002003 (JEB & LMS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Falcon tubes Denville C1017-O To collect cells
8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) Millipore PEZGS0816 Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34998-4L Solvent for sprayed matrix
Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) Fisher 10-022-CV Cell culture media
Autoflex speed MALDI-TOF LRF Bruker For IMS data analysis
Centrifuge Eppendorf 5810 R To collect cells and remove supernatant
CHCA Matrix Bruker Daltonic 8201344 Matrix sprayed onto dried slide
DHB Matrix Bruker Daltonic 8201346 Matrix sprayed onto dried slide
Disposable Scalpels Fisher 22-079-707 For removal of the ovaries
Dissecting Scissors Fisher 13-804-6 For removal of the ovaries
DMEM Media Gibco 11995-065 Media mixed with agarose
epidermal growth factor Peprotech Inc. 100-15 Cell culture media supplement
Eppendorf tubes Genesee Scientific 22-282 For agarose aliquots
Estradiol-17β Simga-Aldrich E2758 Cell culture media supplement
Fetal Bovine Serum Denville fb5001 Cell culture media supplement
FlexControl 3.4 Bruker Daltonic IMS data acquisition software
FlexImaging 4.1 Bruker Daltonic IMS data analysis software
Forceps (fine) Fsiher 22-327379 For removal of the ovaries
Gentamycin Cellgro 30-005-CR Cell culture media supplement
Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) Sigma-Aldrich 11074547001 Cell culture media supplement
ITO-coated slide Bruker 8237001 Platform for co-culture incubation
Leibovitz's L-15 Medium Gibco 11415064 Media used during tissue dissection
L-glutamine Gibco 25030-081 Cell culture media supplement
Low-melting agarose Sigma-Aldrich A9414-10G Mixed with media for plating
Media basin Corning 4870 Used to cut plastic dividers for divided chambers
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122 Cell culture media supplement
Peptide Calibration Standard Bruker Daltonic 8206195 Calibrant for medium mass range
Phophorus red Sigma-Aldrich 343-242-5G Calibrant for low mass range
SCiLS Lab 2015 Bruker Daltonic IMS data statistical analysis
Surgical Forceps (blunt) Fisher 08-875-8B For removal of the ovaries
TFA Fisher Technologies A116-50 Added to matrix solution
TM Sprayer HTX Technologies For applying matrix

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References

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