Imaging kalsium Dynamics i subpopulasjoner av mus bukspyttkjertelen Holme celler

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her presenterer vi en protokoll for bildebehandling og kvantifisere kalsium dynamikk i heterogene celle populasjoner, som bukspyttkjertelen Holme celler. Fluorescerende journalister leveres inn i perifere lag av celler i Holmen, som deretter immobilisert og avbildet, og per-celle analyse av dynamikken i fluorescens intensitet er utført.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hamilton, A., Vergari, E., Miranda, C., Tarasov, A. I. Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells. J. Vis. Exp. (153), e59491, doi:10.3791/59491 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bukspyttkjertel Holme hormoner regulere blod glukose homeostase. Endringer i blodsukkeret induserer svingninger av cytosolic kalsium i bukspyttkjertelen Holme celler som utløser utskillelsen av tre hoved hormoner: insulin (fra β-celler), glukagon (α-celler) og somatostatin (δ-celler). β-celler, som utgjør flertallet av Holmen celler og er elektrisk koplet til hverandre, svare på glukose stimulans som en enkelt enhet. Excitability av de mindre subpopulasjoner, α-cellene og δ cellene (utgjør rundt 20% (30%) og 4% (10%) av den totale gnager1 (Human2) Holme celle tall, henholdsvis) er mindre forutsigbar og er derfor av spesiell interesse.

Kalsium sensorer leveres inn i perifere lag av celler innenfor den isolerte Holmen. Holmen eller en gruppe holmer blir deretter immobilisert og avbildet ved hjelp av et fluorescens mikroskop. Valget av tenkelig modus er mellom høyere gjennomstrømning (Wide-feltet) og bedre romlig oppløsning (konfokalmikroskopi). Konvensjonelt, laserskanning konfokalmikroskopi mikroskopi brukes for bildebehandling vev, som det gir den beste separasjon av signalet mellom nabocellene. Et bredt felt system kan utnyttes også, hvis forurensende signal fra dominerende befolkning på β-celler er minimert.

Når kalsium dynamikk som svar på spesifikke stimuli er registrert, data uttrykkes i numerisk form som fluorescens intensitet kontra tid, normalisert til den første fluorescens og Baseline-korrigert, for å fjerne effektene knyttet til bleking av fluoroforen. Endringer i Spike frekvens eller delvis område under kurven (pAUC) er beregnet kontra tid, for å kvantifisere de observerte effektene. pAUC er mer følsom og ganske robust, mens skyter frekvens gir mer informasjon om mekanismen for kalsium økning.

Mindre celle subpopulasjoner kan identifiseres ved hjelp av funksjonelle reaksjoner på markør forbindelser, slik som adrenalin og ghrelin, som induserer endringer i cytosolic kalsium i en bestemt populasjon av Holme celler.

Introduction

Formålet med metoden er å image Real-Time endringer i cytosolic kalsium konsentrasjon ([ca2 +]cyt) i mindre subpopulasjoner av bukspyttkjertel Holme celler. Dette gjør avdekke mekanismer styrende hormon sekresjon i disse cellene, avslørende detaljer om kryss-snakk mellom ulike celletyper og, potensielt, innføre en populational dimensjon i større bilde av Holmen signalering.

Holmer består av flere celletyper. I tillegg til de mer kjente insulin-sekresjon β-cellene, er det minst to subpopulasjoner som også er avgjørende for å regulere blodsukkeret3. α-celler (som utgjør rundt 17% av Holme celler) skiller glukagon når blodsukkeret blir for lavt, som signaler for frigjøring av glukose i blodet fra lagre i leveren. Overdreven glukagon nivåer (hyperglucagonemia) og nedsatt kontroll av glukagon-Release følge (og, teknisk, kan bidra til) den prediabetic tilstand av nedsatt insulinfølsomhet4. δ-celler (rundt 2%) skiller somatostatin som svar på glukose høyde. Denne allestedsnærværende peptid hormon vil trolig være til stede ved høye konsentrasjoner i nærheten av α-og β-celler innen holmer, som har en sterk Gjeg reseptor-mediert demping effekt på både glukagon og insulin sekresjon.

α-celler og δ deler en stor del av glukosesensor maskineriet med sine nære slekts slektninger, β-celler. Alle tre celler typer er utstyrt med ATP-sensitive K+ kanaler, utdype metabolske sensorer5 som kontrollerer plasma membran potensialet i disse nervøs celler. På samme tid, sekresjon av insulin, somatostatin og glukagon er regulert forskjellig av glukose. Imaging av ca2 + dynamikk i de to mindre subpopulasjoner av Holme celler kan derfor gi et innblikk i kryss-snakk mellom blodsukker og Holme sekretoriske output.

Tidlige forsøk på å overvåke excitability av α-og δ ved hjelp av patch-Clamp elektrofysiologi ble snart etterfulgt av avbildning av ca2 + i enkelt α-og δ-celler. Identiteten til cellene i disse eksperimentene ble verifisert via en etterkontroll farging med anti-glukagon eller anti-somatostatin antistoffer. Dette arbeidet ble ofte hindret av å finne at Holme celler oppfører seg svært annerledes i Holmen og som enkeltceller. Selv om β-celler kan synes å være den viktigste velgjørere av Holme arrangement (på grunn av deres overveldende flertall som ligger til deres sterke elektriske kopling), var det viktigste avviket, overraskende, funnet i α-celler. Innenfor den intakte Holme er disse cellene konstant og vedvarende aktivert ved lavt glukose, som bare gjelder for rundt 7% av enkelt spredte α-celler6. Å rapportere aktiviteten til α-og δ i intakte holmer antas derfor å representere en tettere tilnærming av in vivo-forhold.

Generelt er det to måter å rapportere ca2 + dynamikk spesifikt fra α-cellen eller δ-subpopulasjoner: (i) å uttrykke en genetisk kodet ca2 + sensor via en vevs spesifikk formidler eller (II) bruke markør forbindelser. Den mer elegante tidligere tilnærmingen gir den betydelige fordelen av ekte 3D-bilde og dermed studere celle distribusjon i Holmen. Det kan imidlertid ikke brukes på intakt menneskelig Holme materiale. En annen potensiell bekymring er "leakiness" av arrangøren, spesielt når β-/α-celle transdifferentiation eller α-celle responsen på høy glukose er på plass. Sistnevnte tilnærming kan brukes med ferskt isolert vev inkludert menneskelige prøver eller kultivert holmer. Dataene er imidlertid samlet utelukkende fra perifere lag av Holme celler, som leverer fargestoff/markør molekylet i dypere lag uten å endre Holme arkitekturen er utfordrende. En uventet fordel med sistnevnte tilnærming er kompatibiliteten med bred-feltet Imaging-modus, som tillater skalering opp eksperimenter til samtidige Imaging av titalls eller hundrevis av holmer (dvs. tusenvis til titusenvis av celler).

Kalsium er avbildet i vivo ved hjelp av genetisk kodede GCaMP7 (eller pericam8) familie sensorer, som er varianter av sirkulært permutated grønne fluorescerende protein (GFP) smeltet til kalsium-bindende protein calmodulin og dens mål sekvens, M13 fragment av myosin lys kjeden kinase7,9. GCaMPs har suveren signal-til-støy-forhold i rekken av nanomolar ca2 + -konsentrasjoner og et høyt 2-Foton tverrsnitt, noe som gjør dem til et ideelt valg for in vivo-arbeid10,11. Det utfordrende aspektet ved bruk av rekombinant sensorer er deres levering i cellene. Heterologous uttrykk krever bruk av en viral vektor og multi-Hour ex vivo dyrking, som ofte reiser bekymringer om potensielle de-differensiering eller forverring av celle funksjoner. Selv om musen modeller pre-konstruert for å uttrykke GCaMP løse dette problemet, legger de nye utfordringer ved å øke ledet tid betydelig og begrense arbeidet til en ikke-menneskelig modell. Svært høy følsomhet for endringer av intracellulære pH er en annen ugunstig side av protein-baserte sensorer12, som er imidlertid mindre av et problem for sensing oscillasjon signaler, for eksempel ca2 +.

Fordelen med oppfangbar fargestoffer (for eksempel grønne fluorescerende Fluo4) er at de kan lastes inn i ferskt isolert vev innen rundt en time. Forutsigbart, oppfangbar fargestoffer har lavere signal-til-støy-forhold og (mye) lavere photostability enn sine rekombinant kolleger. Vi kan ikke bekrefte13 rapporter om toksisitet av oppfangbar fargestoffer14, men, Dye overbelastning er et hyppig problem.

Rød rekombinant ca2 + sensorer basert på sirkulære permutasjon har vært i utvikling raskt siden 201115, og siste utviklingen presentere en sterk konkurranse til GCaMPs16 for vev Imaging, gitt høyere dybde av inntrengning av rødt lys. Kommersielt tilgjengelige røde oppfangbar fargestoffer kan brukes pålitelig for single-celle Imaging, men på vev nivå, kan ikke konkurrere godt med den grønne analogs.

Det er tilsynelatende svært lite utvalg av tenkelig teknologi for eksperimenter i vev hvor ut-av-fokus lys blir et kritisk problem. Den konfokalmikroskopi systemet gir akseptabel enkelt celle oppløsning ved kansellering av ut-av-fokus lys med noen mål på NA over 0,3 (for tilfellet av GCaMP6) eller 0,8 (oppfangbar fargestoff). I teknisk forstand kan et konvensjonelt konfokalmikroskopi mikroskop brukes til samtidig avbildning av [ca2 +]cyt fra hundrevis (GCaMP) eller titalls holmer (oppfangbar fargestoff). Den eneste realistiske alternativ til konfokalmikroskopi modus i tilfelle av 3D-uttrykk for sensoren i vev er kanskje lys-ark mikroskopi.

Ting er litt annerledes for saken Når sensoren uttrykkes i perifere lag av celler i Holmen vev. For lyse rekombinant sensorer som har en levende intracellulære uttrykk mønster, ved hjelp av en bred-feltet Imaging modus med en Low-NA objektiv kan gi tilstrekkelig kvalitet og belønne forskeren med en betydelig økning i synsfeltet området og dermed Gjennomstrømming. Et bredt felt system gir dårligere romlig oppløsning, ettersom lyset utenfor fokuset ikke avbrytes. Derfor Imaging vev med High-NA (lav dybdeskarphet) mål er mindre informativ, som enkelt celle signal er vesentlig forurenset av nabocellene. Forurensningen er mye mindre for Low-NA (høy dybdeskarphet) mål.

Det finnes imidlertid oppgaver der høy gjennomstrømming og/eller samplingsfrekvens blir en kritisk fordel. α-og δ viser betydelige heterogenitet, noe som skaper et behov for høye utvalgsstørrelser for å avdekke subpopulasjoner bidrag. Bred-åker tenkelig er rask og flere følsom, med en industriell-skalaen stor åker-av-utsikt system tenkelig flere hundre (GCaMP) eller spent (Fluo4) av holmer på likt signal-å-bråk forhold idet det konfokalmikroskopi eksperimenter opp på ti eller en enkelt Holme, respectively. Denne forskjellen i gjennomstrømning gjør bredt felt systemet fordelaktig for populational avbildning med en enkelt celle oppløsning, noe som kan være spesielt viktig for små subpopulasjoner, for eksempel δ-cellen. På samme måte, forsøk på å rekonstruere elektrisk aktivitet fra ca2 + skyter17 ville dra nytte av høyere samplingsfrekvens gitt av en bred-feltet Imaging modus. På samme tid, flere "nisje" problemer som aktiviteten av bukspyttkjertelen α-celler ved stimulering av den dominerende β-celle pasientpopulasjonen, krever bruk av et konfokalmikroskopi system. En faktor som påvirker beslutningen mot konfokalmikroskopi modus er tilstedeværelsen av betydelige forurensende signal fra β-celle pasientpopulasjonen.

Selv om du bruker hormon-spesifikke antistoff flekker for å verifisere identiteten til cellene etter Imaging eksperimenter er fortsatt et alternativ, mindre celle subpopulasjoner kan identifiseres ved hjelp av funksjonell markør forbindelser, slik som adrenalin og ghrelin som ble vist å selektivt stimulere ca2 + dynamikk i α-18 og δ-celler19,20, henholdsvis.

Analysen av time-lapse Imaging data som mål å gi informasjon utover trivielle farmakologi, som populational heterogenitet, korrelasjon og samhandling av ulike signaler. Konvensjonelt er bildedata analysert som intensitet kontra tid og normalisert til den opprinnelige fluorescens (F/F0). Baseline korreksjon er ofte nødvendig, på grunn av bleking av fluoroforen signal eller forurensning av endringer i autofluorescence eller pH (vanligvis indusert av millimolar nivåer av glukose12). Ca2 + data kan analyseres på mange forskjellige måter, men tre viktigste trendene er å måle endringer i Spike frekvens, platået brøkdel, eller området under kurven, beregnet kontra tid. Vi fant den sistnevnte tilnærmingen fordelaktig, spesielt i søknaden til tungt undersampled konfokalmikroskopi data. Fordelen med pAUC målingen er dens følsomhet for både endringer i signal frekvens og amplitude, mens databehandling frekvensen krever et betydelig antall svingninger21, som er vanskelig å oppnå ved hjelp av konvensjonell bildebehandling. Den begrensende faktoren for pAUC-analyse er den høye følsomheten for endringer i grunnlinjen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder beskrevet her ble utviklet i samsvar med Storbritannia Animals (vitenskapelige prosedyrer) Act (1986) og University of Oxford etiske retningslinjer.

1. Isoler mus bukspyttkjertelen holmer

  1. Klargjør kultur mediet og isolasjons løsningen.
    1. Make up kulturen medium: RMPI1640 (se tabell over materialer), supplert med 10% av fosterets kalv serum, 100 enheter/ml penicillin, 100 μg/ml Streptomycin. Dispensere mediet i 2 60 mm plastikk Petri retter (ikke behandlet med noen lim), og holde rettene i inkubator (37 ° c, 5% CO2, absolutt fuktighet).
    2. Gjør opp isolasjons løsningen (50 mL/mus): Hanks medium med 5 mM glukose, 100 enheter/mL penicillin 100 μg/mL Streptomycin. Oppbevares på is (4 ° c).
    3. Gjør opp enzym løsningen (f. eks Liberase): 0,2 mg/mL i isolasjons løsningen, 2 mL per mus. Oppbevares på is (4 ° c). Alternativt, pre-test aktiviteten av liberase, og optimalisere inkubasjons parametere for hver batch av enzymet22.
  2. Injiser enzymet løsningen i musen galle duct.
    1. Ofre musen (12-ukers gammel kvinne, C57Bl/6J) via cervical forvridning.
    2. Under et disseksjon mikroskop, kutt åpne huden og muskel lag ved hjelp av fin saks og finne galle duct.
    3. Ombinde tarmen på begge sider av krysset med galle duct, ved hjelp av en bomullstråd.
    4. Løft gallekanalen forsiktig med buet fin urmaker ' s tang og innføre iskald enzym løsning i kanalen ved hjelp av en 2 mL sprøyte med en 30G nål. En inflasjon av bukspyttkjertelen bør observeres på dette stadiet.
    5. Samle oppblåst bukspyttkjertelen ved hjelp av en kombinasjon av sløv-nese tommel tang og fine urmaker ' s tang inn i en 15 mL Falk tube og holde den på isen (4 ° c). Tilsett 1 mL enzym løsning i røret.
  3. Frigjør og samle bukspyttkjertelen holmer fra bukspyttkjertelen.
    1. Ruge pancreata oppblåst med enzymet løsning for 16 min i et vannbad, ved 37 ° c. Lett risting kan brukes, men er ikke kritisk, forutsatt at inflasjonen har vært god.
    2. Stopp fordøyelsen ved tilsetning av iskald isolasjon løsning, opp til 10 mL. Forsiktig riste sammendraget: det skal falle i små biter.
    3. Vask sammendraget tre ganger i 10 mL isolasjons oppløsning, la stå 5 min ved 1 x g til sediment de frigjort holmer, på is. Aspirer supernatanten forsiktig, med en 10 mL serologisk pipette.
    4. Legg kaldt RPMI til sammendraget (for å gjøre opp til 10 mL).
    5. Bruk plast Petri retter (trinn 1.1.1) for å plukke holmer. Dekanter den RMPI medium av en av Petri retter, og forsiktig helle noen (4-5 mL) av sammendraget i stedet. Samle de frigjort holmer som vises som runde, glatte og høy tetthet stykker, med en P10 pipette inn i andre Petri parabolen.
    6. Kultur holmer i inkubator (37 ° c, 5% CO2, absolutt fuktighet). Eksperimentet kan stanses midlertidig på dette stadiet. Leaving holmer for 1-2 timer antas av noen å bidra til å gjenopprette fra mekanisk stress under isolasjon.

2. Legg i fargestoffet eller uttrykk sensoren

  1. Forbered oppfangbar fargestoff.
    1. Løs opp alikvot (normalt 50 μg) av oppfangbar fargestoff (f. eks Fluo-4) i DMSO til en lager konsentrasjon på 2 mM. Legg pluronic syre til en endelig konsentrasjon på 1% (ved hjelp av en 20% lager i DMSO), for å forbedre oppløseliggjøringen av fargestoff.
    2. Alikvot fargestoffet i små PCR-rør (2 μL i hver). Fargestoffet kan oppbevares frosset (-20 ° c) i flere uker.
  2. Alternativt, forberede rekombinant sensor.
    1. Distribuer sensoren (f.eks. adenoviral vektor-koding GCaMP6f) til 10 μL alikvoter og oppbevar ved-80 ° c.
    2. (Frivillig) pre-test titer av viral lager av infisere holmer (idet neden) benytter adskillige føljetong fortynninger, å avsløre det optimal konsentrasjonen for infeksjon.
      Merk: rekombinant sensorer kodet av ulike vektorer (lentivirus, BacMam, AAV) krever en annen infeksjon protokollen. Sørg for å sjekke dette med vektoren leverandøren og optimalisere arbeidsforholdet for dine behov. Den "arbeider" lager av adenovirus kan lagres ved-20 ° c og frosset/tint flere ganger. Overdreven fryse-tine sykling reduserer den effektive titer av viruset.
  3. Klargjør bildebehandlings løsningen.
    1. Utgjør Imaging løsning, mM: 140 NaCl, 4,6 KCl, 2,6 CaCl2, 1,2 MgCl2, 1 NaH2PO4, 5 NaHCO3, 10 HEPES (pH 7,4, med NaOH).
    2. Utgjør et lager av glukose (0,5 M) og mannitol (0,5 M) i Imaging løsning. Aksjen kan oppbevares i kjøleskapet (4 ° c) i flere uker.
  4. Legg i oppfangbar fargestoff.
    1. Gjør opp farge arbeids løsningen ved å oppløse 2 μL av fargestoffet i 600 av bildeoppløsningen som inneholder 6 mM glukose. Løsningen kan varmes opp eller blåste for å forbedre oppløseliggjøringen.
    2. Legg holmer isolert i trinn 1 i arbeids løsningen av fargestoffet. Lastingen kan gjøres ved hjelp av en multiwell plate eller en Petri parabolen. I det sistnevnte tilfellet, Plasser en 100 μL dråpe av arbeids løsningen på undersiden av en ikke-selvklebende Petri parabol (35-eller 60-mm) og pipette 10-30 holmer inn i dråpe.
    3. I tilfelle av forskjellige grupper av holmer (f.eks. vill-type/Knock-Out), arrangere flere brønner og flere dråper slik at lasting kan gjøres samtidig.
    4. Ruge de holmer i farge arbeids løsningen ved romtemperatur i mørket i 70-90 minutter. Ikke ruge.
    5. Kontroller lasting under fluorescens mikroskop; de holmer skal få milde fluorescens, mens noen celler er lysere enn resten. Avrunding av celler og kjernefysisk lokalisering av fargestoff er tegn på overbelastning.
    6. Overfør holmer til farge fri bilde løsning som inneholder 6 mM glukose. De holmer kan brukes til bildebehandling umiddelbart, men valgfritt fargestoff kan overlates til de-forestre for en annen 10-15 minutter. Holmer vil beholde fargestoffet i flere timer og kan derfor brukes til bildebehandling i flere SKIFT.
  5. Alternativt, infisere holmer med rekombinant vektor.
    1. Plate holmer i dråper i RPMI dyrking medium (trinn 1.1.1) (f. eks, 30 μL), for å minimere volumet av vektor nødvendig.
    2. Legg til vektoren i et forhold på ca 105 smittsomme enheter/Holme som bør ideelt sett resultere i mangfold av smitte > 2. Ideelt forholdet bør optimaliseres til minimal ratio som ville gi uttrykk i det perifere lag. Pre-titrering (trinn 2.2.3) kan hjelpe.
    3. Introduser 20-50 holmer i dråpe og kultur for 8-48 timer. (Ideelt sett, over natten). Holmer bør utvikle en svakt grønn fluorescens i de fleste cellene, uten endringer i celle morfologi.
      Merk: suksessen til infeksjonen og uttrykket avhenger av tidspunktet for eksponering for viruset løsning. Ideelt sett bør viruset bo i løsningen over natten, men kan eventuelt fjernes etter så lite som 15 minutter. Men infectivity, og derfor uttrykk, vil trolig bli dramatisk lavere.

3. Imaging ca2 + dynamikk

  1. Nakkens holmer under (invertert) mikroskop.
    1. Monter bilde kammeret for invertert mikroskopi. Plasser glasset dekkglass (tykkelse 1 eller 1,5) inne i kammeret og sørg for at glass-kammer-grensesnittet er vanntette. Kontroller at dekkglass er innenfor rekkevidden til målet for mikroskopet (kritisk for tilfellet av en omfangsrik High-NA-objektiv).
    2. Klargjør immobilisering tilbehør. Skjær små rektangler (20 mm x 20 mm) fra den fine mesh og grov mesh. Introduser to spacer "vegger" på fine mesh ved hjelp av en 45-50 μm tykk klebrig tape. Bruk doble lag av avstandsstykket Hvis størrelsen på holmer til-være-avbildet vesentlig overstiger den konvensjonelle 100 μm.
    3. Dypp maskene og vekten i avbildnings løsningen ved hjelp av en 35 mm Petri-rett. Sørg for at plasten og metallet er våte.
    4. Under et disseksjon mikroskop vrir du det fine nettet med avstands "veggene" opp ned, avstandsstykker vendt oppover. Plukk flere holmer lastet med oppfangbar fargestoff eller uttrykke rekombinant sensor med en P20 pipette og forsiktig plassere dem på toppen av fine mesh, mellom de to avstandsstykker. Kontroller at nettet og skivene ikke inneholder store mengder bilde løsning på dem.
    5. Plukk opp mesh med holmer, bruke urmaker ' s tang, og plassere den opp ned inne i bilde kammeret, slik at avstandsstykker ansiktet nedover og sitte direkte på kammeret dekkglass. Sørg for at holmer er fanget mellom avstandsstykker og mesh, i midten av dekkglass.
    6. Plasser grov mesh og vekten på toppen av den fine mesh i kammeret. Introduser bildebehandlings løsningen i kammeret. Sørg for at holmer er immobilisert og klare til å bli avbildet. Unngå overdreven risting av kammeret (små forstyrrelser som bærer kammeret til mikroskopet og sette inn i en opphetet scene er akseptabelt).
      Merk: en lignende immobilisering ordning kan brukes for oppreist system.
  2. Sett opp mikroskopet.
    1. Velg bildemodus og målsettingen, plasser kammeret med holmer fra trinn 3,1 på det temperaturstyrte nivået i mikroskopet.
      1. Still inn temperaturregulering (ideelt mellom 30 ° c og 36 ° c) og perifusion. For en invertert system, posisjon tilsig lavere enn strøm i kammeret, og sette strøm Flux å være større enn for tilsig (som vanligvis oppnås ved hjelp av en slange av en større indre diameter på en peristaltisk pumpe).
      2. Sørg for at utløpet har en minimal kontakt overflate med løsningen, slik at den fjerner løsningen i flere sekvensielle små dråper, unngår lange intervaller av kontinuerlig løsning fjerning. Sistnevnte er den viktigste kilden til gjenstanden i time-lapse Imaging av periodiske signaler som de vises som regelmessig periodisk intensitet svingninger av hver avbildet pixel og blir ofte tolket som "langsomme bølger".
      3. Start perifusion med avbildnings løsningen som inneholder 3 mM glukose.
    2. Velg lys banen og filtre for avbildning av den grønne fluorophores; eksitasjon mellom 470 og 500 og utslipp mellom 505 og 550 ville fungere for hver av dem.
    3. Kjør Live Imaging for å sette opp bilde parametrene. Juster visningen for å fange opp de mest interessante.
    4. Optimaliser signal-til-støy-forholdet i bildet. For dette formål, justere eksitasjon lys intensitet, eksponeringstid og binning. Sørg for at innstillingene tillater en tydelig visualisering av hver celle i Holmen på minimal mulig lys intensitet og eksponering.
    5. Utfør bilde anskaffelse. Avhengig av oppgaven kan bilder tas på 0,1 til 5 Hz. Dette er godt under Nyquist kriterier for rask na+-drevet svingninger i α-og δ-celler (≫ 300 Hz), noe som betyr at dataene er undersampled som standard. Men å øke oppkjøpet frekvensen for å matche dette kravet er ikke gjennomførbart i flercellede/multi-Holmen Imaging med et stort synsfelt. GCaMP kan bli avbildet raskere, mens Fluo4 vil uunngåelig blekemiddel under raske oppkjøp forhold.
      Merk: gitt at [ca2 +]cyt svingninger i Holmen cellene er drevet av elektrisk aktivitet, ved hjelp av lave oppkjøp priser kan høres mot sin hensikt. I realiteten kan imidlertid anskaffelses ratene på rundt eller over 1 Hz være tilstrekkelige til å løse β-cellers skyter oppførsel13, mens terskelen for påvisning av natrium kanal drevne svingninger i α-og δ-celler er godt over 300 Hz. Hvorvidt α-eller δ-cellen [ca2 +]cyt svingninger er ervervet ved 1 Hz eller 0,1 Hz, de vil bli alvorlig undersampled og reflektere ca2 + håndtering av cellen i stedet for elektrisk aktivitet.
      1. Sjekk kvaliteten på de oppnådde data: ved 3 mM glukose, bør α-celle aktivitet være godt synlig/sporbar. Sørg for at dette er tilfellet og Fortsett til fullskala time-lapse Imaging.
  3. Bilde av tidsforløp
    1. Gjør bruk av en elektronisk diagram av signalet dynamikk, implementert i oppkjøpet programvare hvis dette er tilgjengelig. Hvis online kartlegging er ikke et alternativ, bruke et blikk-up-tabellen som viser signal intensiteten på den mest omfattende måten (for eksempel "Rainbow").
    2. Påfør stimuli i en reversibel måte: registrere utvinning av signalet til basal nivå. Ignorer gjenstandene helt fra starten og slutten av opptaket; sistnevnte kan se ut som irreversible "øke"/"reduksjon" av sonden fluorescens på grunn av endringer i pH eller celle død.
    3. Differensiere α-celler ved oscillasjon ca2 + dynamikk, ved lavt glukose. Innføre adrenalin eller glutamat i badekaret løsning, reverserbart for 2-5 min. En rask hoppe i [ca2 +]cyt etterfulgt av en langsom ned eller kansellering av svingninger vil følge.
      Merk: adrenalin er en anerkjent markør sammensatt for α-celler, som har en selektiv positiv effekt på denne pasientpopulasjonen av Holme celler, formidlet av utgivelsen av ca2 + fra intracellulære lagre18. Glutamat er lagt frem som en annen α-celle-spesifikk Agonistiske23.
    4. Sammenlegge/fjerne ghrelin, hvilke er blitt i den seneste tid rapportere å aktivere δ-cellen selektivt19,20. Observer en rask reversibel økning i [ca2 +]cyt i en liten pasientpopulasjonen av Holme celler.
    5. Tilsett/Fjern 20 mM glukose. Observer en koordinert oscillasjon respons i β-celle pasientpopulasjonen. Legg merke til responsen til celler som tidligere har blitt aktivert av adrenalin eller glutamat og ghrelin.
    6. Lagre bildesekvensen. Vurder å bruke "automatisk lagring" under innspillingen.

4. analysere dataene

  1. Analyser tidsforløp bildet.
    1. Importer tidsforløp bildet til et bildeanalyse program, for eksempel en åpen kilde ImageJ/FIJI.
    2. Hvis det har oppstått store/raske bevegelser under innspillingen, forkaster du dataene som unrepairable. Bruk StackReg eller TurboReg plugins24 for å korrigere mindre driver.
    3. Opprett et maskebilde for kartlegging av celle gjenkjenning og region av interesse (ROI). Den foretrukne måten å oppnå dette ville være å lage en stabel bilde ved hjelp av en av funksjonene som "gjennomsnittlig intensitet" eller "maksimal intensitet". Funksjonen som skal brukes, er den som vil gi den beste anerkjennelse av enkeltceller.
    4. Terskel masken bildet, fjerne alle data utenfor Holmen regionen. Funksjonen fungerer i automatisk modus for 32-bits bilder.
    5. Oppdage Maxima i terskelen bildet. Maxima kan representeres av punkter, regioner eller til og med sektorer, hvis bildet er tett.
    6. Påfør "finne Maxima"-funksjonen uten noen størrelsesbegrensninger og lim den oppdagede Maxima inn i regionen av interesse (ROI) editor.
    7. Glatt/interpolere hver av ROIs kartlagt; muligens vil ROIs kreve ekspansjon. En enkel skriften kan skrevet for (4.1.6-4.1.8) og løpe adskillige timene å skaffe best cellen oppdagelsen resultater. Flere ROIs kan overlappe, men dette er sjelden.
    8. Analyser plasseringen av ROIs og lim inn de respektive X-og Y-dataene i den elektroniske tabell programvaren (for eksempel Microsoft Excel).
    9. Analysere den grå intensitet kontra tid for alle ROIs og lime inn data i den elektroniske tabellen programvare.
  2. Analyser de numeriske dataene.
    1. Importer dataene til dataanalyse programvaren. Avhengig av valg av programvare og varighet/prøvetaking/størrelse på eksperimentet, kan dette være en enkel kopi-paste-operasjon eller en frittstående prosedyre. Sikre tilrettelegging og lagring av numeriske data.
    2. Importer tidsstemplene eller tids notatene, hvis de er tilgjengelige.
    3. Normalisere rå fluorescens intensitet data ("F") til den opprinnelige verdien av fluorescens ("F0"). Dette trenger ikke å være fluorescens i det aller første punktet, men kan være gjennomsnittet av flere første poeng. Normalisering bør redusere variasjonen av data og, i et ideelt tilfelle (ingen drivende Baseline) resultere i et analyzable datasett ("F/F0").
    4. Hvis celle-til-celle-variasjonen for F/F0 -DataSet fortsatt er betydelig (lang innspilling, bleking), utfører du grunnlinje korrigeringen. For dette formål definerer du en ' kontroll '-region, det vil si tidsintervallet for når kontroll løsningen (for mus bukspyttkjertelen holmer, 3 mM glukose uten agonister/motstandere) ble påført.
      1. Hvis kontrollområdet har et klart, ikke-oscillasjon signal, må du anta at F/F0 var tilbake til startverdien (F/f0= 1) etter hver påføring av kontroll løsningen. Korriger data for tidsforløp for hver celle ved å dele dataene inn i segmenter, atskilt med punktene når kontroll løsningen ble lagt til, og bruke lineær korrigering på hvert segment. Ikke bruk polynom eller annen ikke-lineær korreksjon, da dette resulterer i artefakter.
      2. Hvis kontrollområdet har klare svingninger eller flere faktorer (for eksempel FAD autofluorescence) er til stede, kan du bruke en topp gjenkjennings algoritme17. En triviell og rask kjøre rundt for det er en Maxima-følsom wavelet Transform (Figur 3a).
    5. Kvantifisere dataene. Selv om ca2 + er et svært dynamisk signal, presenterer ca2 + data i form av absolutte F/F0 verdier er allment akseptabelt i biomedisinsk litteratur. Hvis resultatene fra flere eksperimenter må sammenlignes, velger du en beregning.
      1. Mål hyppigheten av ca2 + pigger (Figur 4A, D), og dens respons på tillegg av (Ant) agonister. For dette formål, dele innspillingen i like tidsintervaller og beregne timecourse av delvis frekvens (skyter frekvens i hvert av intervallene) ved å telle toppene innenfor intervallet og normalisere til intervallet varighet.
      2. Du kan også angi terskelen og beregne platå fraksjonen (PF) for hvert av intervallene som er definert ovenfor (Figur 4B, F). Brøkdelen angir prosentandelen av tid i intervallet cellen har brukt i tilstanden "opphisset".
      3. Alternativt kan du beregne det delvise området under kurven (pAUC) for hvert av intervallene som er definert ovenfor (Figur 4C, G). Denne målingen er følsom for endringer i både frekvens og amplitude av skyter.
        Merk: en påminnelse for måling frekvens er dens mangel på følsomhet for Spike varighet og dårlig stabilitet. Ettersom dataene er tungt undersampled kontra den elektriske skyter, antall pigger per intervall er ganske liten og dermed en eneste ekstra pigg kan dramatisk påvirke resultatet. "Flaskehalsen" i pAUC er dens følsomhet for endringer i grunnlinjen. Selv om mindre utsatt for gjenstander og mer følsomme for endringer i [ca2 +]cyt enn frekvens, pAUC likevel er ikke veldig informativ om innholdet i ca2 + Dynamics. Platå brøkdel er en utvidelse av det åpne Sannsynlighets konseptet for hele celle systemet. Det er mindre robust enn pAUC skjønt, på grunn av sin avhengighet av terskelverdien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Holmer belastning ganske godt med oppfangbar fargestoffer (figur 1A), med mindre lipid sammensetningen av membranen har blitt påvirket (f. eks, ved kronisk eksponering for fettsyrer). Den menneskelige adenovirus type 5 (Ad5) vektor mål også alle Holme celler (figur 1B). Det kan oppstå problemer når mer enn én rekombinant sensor uttrykkes i samme celle. Videre er holmer vanligvis svært godt immobilisert ved hjelp av teknologien som er beskrevet ovenfor, noe som gir eksepsjonell stabilitet og løsnings tilgang.

Ca2 + skyter i α-celler kan lett oppdages ved lavt glukose nivå (figur 2). Det er en høy celle-for-celle korrelasjon mellom aktiviteten ved lav glukose og responsen til adrenalin og glutamat. Ghrelin aktiverer noen adrenalin-responsive celler (α-celler?) ved lavt glukose, men det har ingen effekt på ca2 + dynamikk i de fleste av cellene som aktiveres av lavt glukose (β-celler).

Når analysert i form av delvis frekvens (Figur 4A, C), adrenalin-eller ghrelin-stimulert celler vise en betydelig økning under alt-eller-ingenting forhold. Det er en celle med lav basal aktivitet som blir aktivert av adrenalin eller ghrelin utstillinger en dramatisk økning i denne beregningen. Men de generelle endringene mellom basal skyter og adrenalin effekten er svært subtil (Figur 4A, C). I kontrast er delvis AUC følsom for endringene introdusert av adrenalin i alle celler, selv når basal aktivitet er høy (Figur 4B, D).

Figure 1
Figur 1: lasting av oppfangbar fargestoff og uttrykk for rekombinant sensor i holmer. Typiske mus holmer lastet med oppfangbar fargestoff Fluo-4 (A) eller uttrykke rekombinant sensor GCaMP6 i perifere lag av celler (B) eller i dypere lag (C). Polar Tracer sulforhodamine B (SRB, vist som hvit) har blitt benyttet for å skissere individuelle celler innenfor hver Holme25. (D) representant Kinetics av ca2 + som svar på glukose som er registrert fra enkeltceller i Holmen ved hjelp av Fluo4. Legg merke til heterogenitet i mindre celle populasjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: typisk ca2 + Response av Holme celler til ulike stimuli. Typisk α-celle (A) og δ-celle (B) ca2 + dynamikk, som respons på adrenalin, glutamat, ghrelin, glukose. (C)-(d) varme kart av holmen celle responsen viser adrenalin-positive (c) og ghrelin-positive (d) subpopulasjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: grunnlinje korrigering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: analyse av tidsforløp data. Analyse av ca2 + dynamikk i α-celler. Delvis frekvens (A), platå fraksjon (B) og areal under kurven (C) til en α-celler [ca2 +]jeg sporer. Populational [ca2 +]jeg data fra en mus bukspyttkjertel Holme uttrykt som rå (f/f0) (D), delvis frekvens (E), platå brøk (F) og areal under kurven (G). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er tre stadier i protokollen som er avgjørende for total suksess. Vellykket injeksjon av Liberase enzymet i gallekanalen bestemmer ikke bare den kvantitative suksessen til isolasjons prosedyren, men også påvirker kvaliteten på de isolerte holmer. Uninflated pancreata kan føre til mangel på noen viktige metabolske responser i de isolerte holmer. Dernest, lasting av fargestoff/uttrykket av sensoren definerer signal-til-støy forholdet mellom tidsforløp innspillingen. Signalene er fraværende eller dempes i overbelastet holmer. Endelig, vellykket og tett posisjonering av vevet inne i Imaging Chamber er et avgjørende øyeblikk for meningsfull og analyzable eksperimenter. Dårlig plassert eller bevegelige vev resulterer i bortkastet eksperimentell tid og/eller uklare data.

Metoden kan endres for å gjøre rede for flere signaler (ved hjelp av konfokalmikroskopi systemet) og flere grupper av holmer (f. eks, av forskjellige genotype). Imaging av flere signaler forutsetter levering av en annen sensor i hver celle av Holmen, Spectrally kompatibel med ca2 + reporter (for eksempel en pH-sensor SNARF5f26,27). For å nå dette målet, holmer kan være co-Loaded/co-smittet med ca2 + og pH-sensorer, som deretter sekvensielt avbildet innenfor hver gang-Frame.

Imaging signalet i grupper av holmer med én celle oppløsning krever bruk av et bredt felt-of-View mål. Målet er sannsynlig å ha lavere forstørrelse og numerisk blenderåpning (NA), og dermed redusere romlig oppløsning. På grunn av den økte dybden-av-fokus av Low-NA målsetting, kan Imaging utføres på et bredt felt system. Ulempene ved denne ordningen er celle-celle krysskontaminering av lyssignalet og redusert evne til å avbilde 3D-signalet (f. eks, mus uttrykker ca2 + sensor under insulin arrangører). Samtidig, signal uttrykt fra overflaten Holmen celler kan være perfekt løst med høy Temporal oppløsning fra grupper, inkludert titalls til hundrevis av holmer18.

Selv om det kan høres ubehagelig, men utfører bildeanalyse og numerisk dataanalyse i separate programvarepakker er en god idé. På det nåværende tidspunkt, ImageJ/FIJI dominerer vitenskapelig bildeanalyse. De mest populære miljøene for vitenskapelig koding er Python og MATLAB, men det er også kjent innsats for å analysere ca2 + data i R28. Beste brukervennlighet er levert av flere nisje-pakker som IgorPro. Vårt valg er å prototype i MATLAB/Python og deretter implementere koden i IgorPro for "rørledning" bruk. Tilpasning av signal analyse pakker for elektrofysiologi (f.eks. Clampfit, Neuroexplorer) for analytiske behov kan være nyttig for enkelt celle bildebehandling, men det er vanskelig å skalere opp. Mange alternativer som tilbys av slike pakker er ikke tilgjengelig for Holme Imaging på grunn av lav samplingsfrekvens.

Det er viktig å huske at denne metodikken er begrenset av en rekke faktorer. For det første, som nevnt ovenfor, er Imaging i stor grad basert på undersampling dataene, betyr det ikke indikerer, og derfor kan ikke være direkte sammenlignet med elektrisk aktivitet i cellen. For det andre kommer dataene fra Holmen periferi og reflekterer ikke viktig kopling prosesser som er, generelt sett, tredimensjonale. For det tredje, nivået på lasting/uttrykk påvirker oppfatningen av sensoren intensitet. Til slutt, aktivering av mindre godt undersøkt Holme celle subpopulasjoner (f. eks PP celler & ε-celler) av markøren forbindelser kan ikke utelukkes, men på grunn av det lave antallet av disse cellene i Holmen noen potensiell forurensning vil være minimal.

Metoden er en sann "mester" i form av visuell effekt, som oscillasjon prosessene gir et sterkt inntrykk av et genuint levende vev. Anvendt på mindre celle subpopulasjoner, metoden sonder funksjonen til hver enkelt pålitelig, slik at identifisering av undergrupper og reflekterer heterogenitet.

Kalsium dynamikk har blitt studert i bukspyttkjertelen Holme-celler i over 40 år, hovedsakelig drevet av fremdriften i oppkjøpet/deteksjon teknologi. Tidlige studier brukte Atomic absorpsjon spektroskopi29, men det var ikke før ankomsten av fluorescerende ca2 + sensorer30 som detaljerte Kinetics kunne løses i individuelle Islet celler, med fotometri31,32,33. Kort tid etter det, det romlig komponenten av ca2 + Kinetics var forbedret idet ca2 + tenkelig34,35,36 ble en praksis teknologien, takket være det så ny-anvendelig avgift-koplet apparat (CCD) detektorer. Problemet med ut-av-fokus lys, som hemmet Imaging signalet fra individuelle celler i vevet, ble deretter løst på midten av 1990-tallet via laserskanning konfokalmikroskopi mikroskopi (LSCM)37 og total intern refleksjon fluorescens MIKROSKOPI (TIRFM)38. Begge metodene, supplert med ankomsten av en ny generasjon av fluorescerende ca2 + sensorer nervøs med en 488 NM laser, har blitt brukt til bilde ca2 + dynamikk i Holmen Cell subpopulasjoner39,40,41.

Det nye århundret brakte frem to nye trender som stammet fra nevrovitenskap-relaterte teknologiske utviklinger. For det første, rekombinant fluorescerende sensorer basert på sirkulær Permutasjon av GFP varianter vesentlig økt signal-til-støy-forhold for ca2 + deteksjon, effektivt bringe studiene til nivået av store celle populasjoner, der dynamikken i [ca2 +]cyt i hver celle kan løses. For det andre, bruk av vev-spesifikke arrangører tillatt målretting sensor uttrykk til mindre subpopulasjoner.

Selv om generelt antatt å reflektere utviklingen i nevrovitenskap, har studier på Holmen ca2 + Dynamics to viktige forskjeller. For det første er teknologisk, enhver in vivo Imaging av Holme signalering mer kompleks enn tenkelig i hjernen på grunn av uforutsigbar anatomi av bukspyttkjertelen og holmer plassering42. Dernest, utmerket elektrisk kopling mellom Holmen β-celler i hovedsak gjengir holmer i elektrisk inert populasjoner viser en tilsynelatende perfekt alt-eller-ingenting svar på høy glukose stimulans. Vi tror at studier av [ca2 +]jeg Kinetics i mindre Holme subpopulasjoner, slik som δ-celler, basert på vev-spesifikk målretting er sannsynlig å utvide vår kunnskap om deres farmakologi/fysiologi. Samtidig gjør svært følsomme sonder det mulig å utvide den statistiske kraften i slike målinger, som kan brukes til å variere fra Holme til Holme, og til å tillate bilde av holmer fra ulike grupper innenfor ett parallelt eksperiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

AH var en mottaker av en diabetes UK PhD studentship, EV ble støttet av OXION-Wellcome Trust treningsprogram, holdt AIT en Oxford Biomedical Research Council postdoktor fellesskap.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40x/1.3 objective
Axiovert 200 microscope
emission
Excitation
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F7524-500ML
Fluo4 Thermo Fisher (Life Technologies) F14201
GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector Vector Biolabs 1910
Hanks' solution Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)
Liberase Sigma-Aldrich 5401020001
penicillin/streptomycin Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) 15140122
RPMI medium Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) 61870044
Zeiss LSM510-META confocal system Carl Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elayat, A. A., el-Naggar, M. M., Tahir, M. An immunocytochemical and morphometric study of the rat pancreatic islets. Journal of Anatomy. 186, Pt 3 629 (1995).
  2. Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (7), 2334-2339 (2006).
  3. Brereton, M. F., Vergari, E., Zhang, Q., Clark, A. Alpha-, delta-and PP-cells: are they the architectural cornerstones of islet structure and co-ordination. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 63, (8), 575-591 (2015).
  4. Færch, K., et al. Insulin resistance is accompanied by increased fasting glucagon and delayed glucagon suppression in individuals with normal and impaired glucose regulation. Diabetes. 65, (11), 3473-3481 (2016).
  5. Dabrowski, M., Tarasov, A., Ashcroft, F. M. Mapping the architecture of the ATP-binding site of the KATP channel subunit Kir6 2. The Journal of Physiology. 557, (2), 347-354 (2004).
  6. Liu, Y. J., Vieira, E., Gylfe, E. A store-operated mechanism determines the activity of the electrically excitable glucagon-secreting pancreatic alpha-cell. Cell Calcium. 35, (4), 357-365 (2004).
  7. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca 2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, (2), 137 (2001).
  8. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, (6), 3197-3202 (2001).
  9. Broussard, G. J., Liang, R., Tian, L. Monitoring activity in neural circuits with genetically encoded indicators. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 97 (2014).
  10. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32, (40), 13819-13840 (2012).
  11. Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, (2), 111-129 (2017).
  12. Tarasov, A. I., Rutter, G. A. Methods in enzymology. 542, Elsevier. 289-311 (2014).
  13. Tarasov, A. I., et al. Frequency-dependent mitochondrial Ca(2+) accumulation regulates ATP synthesis in pancreatic β cells. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 465, (4), 543-554 (2013).
  14. Smith, N. A., et al. Fluorescent Ca2+ indicators directly inhibit the Na, K-ATPase and disrupt cellular functions. Science Signal. 11, (515), 2039 (2018).
  15. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333, (6051), 1888-1891 (2011).
  16. Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. Elife. 5, 12727 (2016).
  17. Theis, L., et al. Benchmarking Spike Rate Inference in Population Calcium Imaging. Neuron. 90, (3), 471-482 (2016).
  18. Hamilton, A., et al. Adrenaline Stimulates Glucagon Secretion by Tpc2-Dependent Ca(2+) Mobilization From Acidic Stores in Pancreatic alpha-Cells. Diabetes. 67, (6), 1128-1139 (2018).
  19. Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59, (10), 2156-2165 (2016).
  20. DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5, (7), 449-458 (2016).
  21. Mourao, M., Satin, L., Schnell, S. Optimal experimental design to estimate statistically significant periods of oscillations in time course data. PloS One. 9, (4), 93826 (2014).
  22. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  23. Cabrera, O., et al. Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release. Cell Metabolism. 7, (6), 545-554 (2008).
  24. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7, (1), 27-41 (1998).
  25. Tarasov, A. I., et al. Monitoring real-time hormone release kinetics via high-content 3-D imaging of compensatory endocytosis. Lab on a Chip. 18, (18), 2838-2848 (2018).
  26. Knudsen, J. G., et al. Dysregulation of Glucagon Secretion by Hyperglycemia-Induced Sodium-Dependent Reduction of ATP Production. Cell Metabolism. (2018).
  27. Adam, J., et al. Fumarate hydratase deletion in pancreatic β cells leads to progressive diabetes. Cell Reports. 20, (13), 3135-3148 (2017).
  28. Wills, Q. F., et al. Statistical approaches and software for clustering islet cell functional heterogeneity. Islets. 8, (2), 48-56 (2016).
  29. Berggren, P. O., Ostenson, C. G., Petersson, B., Hellman, B. Evidence for divergent glucose effects on calcium metabolism in pancreatic beta- and alpha 2-cells. Endocrinology. 105, (6), 1463-1468 (1979).
  30. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260, (6), 3440-3450 (1985).
  31. Longo, E. A., et al. Oscillations in cytosolic free Ca2+, oxygen consumption, and insulin secretion in glucose-stimulated rat pancreatic islets. The Journal of Biological Chemistry. 266, (14), 9314-9319 (1991).
  32. Johansson, H., Gylfe, E., Hellman, B. Cyclic AMP raises cytoplasmic calcium in pancreatic alpha 2-cells by mobilizing calcium incorporated in response to glucose. Cell Calcium. 10, (4), 205-211 (1989).
  33. Grapengiesser, E., Gylfe, E., Hellman, B. Three types of cytoplasmic Ca2+ oscillations in stimulated pancreatic β-cells. Archives of Biochemistry and Biophysics. 268, (1), 404-407 (1989).
  34. Okamoto, Y., et al. Role of cytosolic Ca2+ in impaired sensitivity to glucose of rat pancreatic islets exposed to high glucose in vitro. Diabetes. 41, (12), 1555-1561 (1992).
  35. Gilon, P., Henquin, J. C. Influence of membrane potential changes on cytoplasmic Ca2+ concentration in an electrically excitable cell, the insulin-secreting pancreatic B-cell. The Journal of Biological Chemistry. 267, (29), 20713-20720 (1992).
  36. Valdeolmillos, M., Nadal, A., Soria, B., Garcia-Sancho, J. Fluorescence digital image analysis of glucose-induced [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans. Diabetes. 42, (8), 1210-1214 (1993).
  37. Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262, (5134), 740-744 (1993).
  38. Stout, A. L., Axelrod, D. Evanescent field excitation of fluorescence by epi-illumination microscopy. Applied Optics. 28, (24), 5237-5242 (1989).
  39. Stozer, A., Dolensek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8, (1), 54638 (2013).
  40. Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in alpha- and beta-cells within intact pancreatic islets. Diabetes. 60, (5), 1535-1543 (2011).
  41. Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet. Biophysical Journal. 95, (11), 5048-5061 (2008).
  42. van Gurp, L., et al. Sequential intravital imaging reveals in vivo dynamics of pancreatic tissue transplanted under the kidney capsule in mice. Diabetologia. 59, (11), 2387-2392 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics