無細胞タンパク質式を使って急速に成長している細菌ビブリオ natriegens

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Bioengineering
 

Summary

無細胞発現系は、ハイスループット合成と重要なタンパク質のスクリーニングのための強力かつコスト効率の高いツールです。ここで、mRNA のテンプレート、線形 DNA プラスミド DNA を使用して急速な蛋白質の生産のビブリオ natriegensを用いた無細胞タンパク質発現系の作製について述べる。

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Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (145), e59495, doi:10.3791/59495 (2019).

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Abstract

海洋細菌ビブリオ natriegensは、バイオ テクノロジーの急速な成長率のための新たな微生物ホストとして注目を集めています。一般的なプロトコルは、一般的な検査機器を使用して粗セルnatriegens (動)抽出物の準備のため説明します。この高降伏プロトコルが具体的にされているユーザのアクセシビリティのために最適化された、コストを削減します。無細胞タンパク質合成 (当たり) 96 または 384 ウェル フォーマット小規模 10 μ L バッチ反応で行うことが再現性をもって 3 h 内 > 260 μ g/mL スーパー フォルダー GFP (sfGFP) の濃度を全体的に利回り、原油細胞抽出準備と当たり単一のユーザーによって 1−2 日間で実現できます。この議定書は、生物生産と合成生物学の応用の進歩を促進するための既存の蛋白質合成パイプラインに簡単に統合できます。

Introduction

無細胞タンパク質合成は、貴重なタンパク質またはペプチド1,2,3,4の式の汎用性とコスト効果の高い方法です。大腸菌発現システムを用いた無細胞タンパク質合成が実行された歴史的に、しかし、ずっとある最近のサージ無細胞5,6,7,8,9のシャーシとして新規プロパティで代替、非モデル生物を使っての,10,11,12.大腸菌無細胞システムに代わるものとして総理候補をユニークな代謝プロファイルを持つ生物。たとえば、海洋細菌のビブリオ natriegensはすべて知られている生物観察の急成長は、10 分13未満の時間を倍増します。これは研究とバイオ テクノロジー14,15,16,17,18新たな微生物ホストとしてnatriegens (動)注目を集めています。Natriegens 対の急速な成長率がタンパク質合成と代謝効率19,20,21, 無料のセルのための細胞機械装置を活用率が高いにリンクされて合成には、急速な蛋白質の生産と高速スクリーニングのためのツールキットが拡大します。

最近、無細胞発現系natriegens 対は T7 プロモーター93 h > 260 μ g/mL の濃度でスーパー フォルダー GFP (sfGFP) を作り出すことができるである実証されています。このメソッドの開発の全体的な目的は、短時間で一般的な実験装置を用いて調製できる高アクセス、コスト効率の高い、再現、および収無細胞タンパク質発現システムをユーザーに提供するためでした。このプロトコルは、シェイク フラスコ 1l 文化、パルス超音波処理と並列化とスループットをスクリーニングを最大限に 96 または 384 ウェル フォーマットで小規模なバッチ反応セル換散を利用しています。長い、持続的なタンパク質発現可能です 3-ホスホ グリセリン酸 (3-PGA) の補給によってエネルギー ソース8,22,23として。このプロトコルを正常に完了するには、ユーザーは目的の蛋白質を表現する機能を持っているまたはnatriegens 対粗セルを用いたセルなしの形式で蛋白質のセットを抽出します。

グリセロール ストックから始まって、 natriegens 対原油細胞抽出液は 600 の光学濃度で採取した細胞から調製した 1.0 nm (外径600)。1 L 文化原油細胞エキス 25% 以上 800 無細胞反応にとっては十分なエキスの約 2−3 mL が得られます。プラスミド DNA、線形 DNA や mRNA テンプレートを使用して蛋白質を表現できます。しかし、内因性核酸による線形 DNA テンプレート劣化携帯無料natriegens 対野生型システム9を使用する場合大きな欠点のままです。文化natriegens の v.から始まって、タンパク質の下流のアプリケーションの使用可能な可能である単一のユーザー 1−2 日以内。

Protocol

1. natriegens 対粗セルを抽出-細菌培養の準備

  1. Natriegens 対細菌の成長媒体 LB V2の表 1に従ってを準備します。成長媒体をオートクレーブで滅菌します。部屋の温度 (RT) に到達するメディアを許可します。室温余分なメディアを保管します。
    注意:適切な個人保護用具 (PPE) を着用、オートクレーブを操作する場合、ラボ固有の手順を参照してください。
  2. LB V2 メディアの 3 mL を接種するのにnatriegens (動)野生型のグリセロール ストックを使用します。225 rpm で揺れながら 30 ° C で一晩培養します。
  3. 1 分吸引上清のベンチトップ遠心分離機で 10,600 x gで遠心分離によって結果ペレットを乱すことがなく一晩文化の 1 mL を洗浄し、新鮮な LB V2 メディアの 1 つの mL で再懸濁します。
  4. オートクレーブ 4 L では、滅菌カバーと困惑の三角フラスコは、新鮮な LB V2 成長媒体の 1 リットルを追加します。(1:1, 000 の希釈倍率) 洗浄の一晩文化の 1 mL を使用して接種します。225 rpm で揺れながら 30 ° C で文化を育てます。
    注:Natriegens V.文化は、縮尺の希釈倍率を維持しながら上下にスケールできます。たとえば、250 μ L を 2 L で新鮮な LB V2 成長媒体の 250 mL 洗浄一晩文化の困惑滅菌カバー付き三角フラスコを追加します。
  5. 分光光度計を使用してカルチャの OD600を監視します。文化が OD600に達したとき = 1.0 ± 0.2、4 ° C で 20 分間 3,500 × gで遠心分離による収穫文化氷の上には、ペレットを配置します。
    注:文化の近くに監視が必要なので、 natriegens 対急速に成長します。外径600成長 = 1.0 は縮尺の希釈比率で約 1.5−2 時間を取る必要があります。
  6. 上清を吸引、-80 ° c 結果細菌ペレットをすぐに保存か直接セル換散のセクション 2 で説明に進みます。
    注:この手順は良い停止ポイント;ただし、ペレットがすぐにか、最良の結果のための 1−2 日以内に処理されることをお勧めします。

2. natriegens 対粗セルを抽出-セル換散の準備

  1. 無菌純水 (DI) の表 1に従って S30 換散バッファーを準備し、7.7 氷酢酸を使用して pH を調整します。
    注意:氷酢酸は、pH を調整するときに適切な PPE を処理必要があります。
  2. セル換散の手順を開始する前に約 4 ° C、冷蔵庫や氷の上に S30 換散バッファーをクールします。
    注:-20 ° C の溶解を冷静に迅速にバッファーを配置できます。凍結するバッファーを許可しません。
  3. 10−20 分または完全に解凍するまで氷の上細胞ペレットを配置します。冷たい S30 換散バッファーの 10 mL を使用して同じ 1 L 文化から生じるすべてのペレットを再懸濁しますし、懸濁液を 50 mL のチューブに転送します。ペレットは-80 ° c 1.6 のステップで冷凍庫に凍っていない場合は巻き上がりに直接進みます。
    注:必要に応じて、ペレットを再懸濁します最初に使用される S30 換散バッファーのボリュームを上げます。
  4. 4 ° C で 10 分間 3,500 × gで遠心分離機を懸濁液ペレットを乱すことがなく、上清を吸引します。冷たい S30 換散バッファーの 10 mL を使用して 2 回餌を洗浄します。氷の上には、ペレットを配置します。
  5. 冷蔵室で 50 mL のチューブでペレットに冷たい S30 換散バッファーの 500 μ L を追加します。ワイドボアのピペット チップを使用すると、ペレットを再懸濁します、慎重に全体ペレット懸濁液を 2 mL チューブに転送。
    注:広い穴ピペットは使用できません、ペレット転送用穴を増加する 1 mL ピペット チップの端をカットするはさみのペアを使用します。
    1. ボリュームを大きく増やすことがなくできるだけ多くのペレットを転送します。ただし、ペレットについては、超音波処理するのに十分な液体の再停止する必要があります 2 mL チューブに均質な懸濁液によって示される。2 mL のチューブを入れすぎないではないです。懸濁液は 1.5 mL を超えないようにしてください。必要に応じて複数のチューブに分割します。
  6. 氷の上細胞ペレットを保ち、寒い部屋で作業します。氷と 600 mL ビーカーを埋めるし、氷.の上に 2 mL チューブ ホルダーを配置
    注:ペレット懸濁液は、超音波処理の進行状況を監視するため氷に表示されますので、ビーカーの側面に近いチューブ ホルダーを配置すると便利です (図 1を参照)。
  7. 渦は細胞をホモジナイズしてくださいに簡単に 2 mL チューブにペレットを中断、フリック チューブ、キャップの一番下のセルを削除し、キャップとチューブ ホルダーに配置を開きます。液体の表面のすぐ下で、懸濁液に超音波発生装置の先端を下げます。
  8. 1/8 インチ先端径と超音波発生装置とプローブを使用して図 2に示すように、超音波処理のセットアップを準備します。超音波発生装置コントロールに次の設定を入力: 20 khz と 50% 振幅、パルス時間: 10 秒、パルス OFF 時間: 60 s。
  9. 3 つの周期のパルス超音波処理プロトコルを実行します。ペレット懸濁系の総量が > 500 μ L の場合 6 回パルス超音波処理プロトコルを実行します。
    注:一般的に、3−6 パルス、 natriegens 対ペレット; を溶解するのに十分です付加パルス超音波発生装置によって必要があります。超音波処理中に、は、管の底に解決するかもしれない任意のペレットを溶解、上下にプローブを移動するのに調整ノブ プラットフォームを使用します。チューブは、ホルダー、簡潔に vortexed パルスの間に懸濁液を再統一するから削除できます。超音波破砕した細胞の目的の整合性のための説明を参照してください。
    注意:超音波発生装置がアクティブなとき、適切な聴力保護具を着用します。
  10. 超音波処理、次 4 ° c またはライセートが図 3に示されている、すべての細胞の残骸の解放されるまで 30−45 分 16,000 x gで遠心分離機粗セルを抽出します。
  11. ペレットを乱すことがなく新しい 2 mL チューブに結果清の 50 μ L 分注の冷蔵室で
    注:
    が新しい 2 mL チューブに誤って転送される任意の残骸が高収量タンパク質合成のエキスの容量を大幅に軽減されます。
    1. 必要に応じて、脇別 2 mL に溶解後プロテインの定量のセルの 10 μ L を抽出管 (2.13 以下の手順を参照してください)。
  12. フラッシュは、別添の図 4で示す浸漬ひも付きチューブ ホルダーにチューブを配置することによって細胞粗抽出液を凍結します。含む液体窒素デュワーにチューブを水没し、すぐに使用するまで-80 ° C で冷凍庫に配置します。
    注意:白衣、安全眼鏡、顔面シールド、寒剤エプロンと手袋を含む液体窒素を処理するためには、適切な PPE を使用します。
  13. 必要に応じて、細胞ライセート リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 サンプル 1: 100 希釈し、ブラッドフォードの試金、ビシンコニン酸など任意の標準総蛋白質定量アッセイを用いたステップ 2.11.1 脇設定 10 μ L を使用して総蛋白質を定量化します。試金 (BCA)、等。

3. 細胞遊離反応コンポーネントの準備

  1. 一般的な反応コンポーネント
    1. それぞれ 100 mM と 2000 mM の濃度で無菌純水で 50 mL のチューブで Mg グルタミン酸とグルタミン酸 K の株式を働いているを準備します。
    2. 250 mL のビーカーに水 100 mL 滅菌・ ディ ・を追加することによって 50% (w/v) ポリエチレング リコール (PEG)-8000 の在庫を準備します。ビーカーに小さな磁性攪拌器を配置します。ペグ 8000 の 50 g を量り、100 mL のビーカーに水を追加します。
    3. 100 ° C に加熱攪拌プレート セットにビーカーを置き、ペグ 8000 がソリューションになるまで 250 rpm で攪拌します。ペグ 8000 50 mL チューブに転送する前に冷却するための液体混合物を許可します。
  2. エネルギー ソリューションのマスター ミックス
    1. KOH ペレットの 140 g を 500 mL の滅菌水に追加することによって島の 5 M 溶液を準備します。
      注意:化学のフードでこのソリューションを準備し、強塩基を取り扱うときに PPE を着用します。ボトル キャップが圧力上昇を防ぐために余裕がなければならないので、ソリューションがホットになります。使用する前に RT に到達する KOH 溶液を許可します。
    2. 1750 mM HEPES 島バッファーを準備するには、100 mL のボトルに HEPES の 20.85 g を追加します。ボリューム 40 mL に達するまで、ゆっくりと滅菌・ ディ ・水を追加します。渦ボトル、HEPES を溶解します。8.0 pH を調整し、50 mL に解決の容積をもたらす 5 M KOH 溶液を使用します。
      注意:島は、pH を調整するときに適切な PPE を処理必要があります。
    3. 無菌純水の表 2に示された濃度でエネルギー マスター ミックス在庫部品 x 残り 10 を準備し、氷の上各株式を配置します。RT と氷の場所で 100 mM ATP、GTP、CTP、UTP 株を解凍します。
      注:37 ° C と 350 rpm に設定 thermomixer を使用して、必要に応じてソリューションに試薬を溶解できます。過熱したり、長期間のため、thermomixer に試薬を残すしないでください。
    4. 15 mL チューブに秩序や表 2で指定されたボリュームにに従ってエネルギー ソリューションのマスターの組合せの各コンポーネントを追加します。渦ソリューションの各コンポーネントが追加された後。これは、エネルギー ソリューションのマスター ミックス x 10 の 5 mL になります。
    5. エネルギー ソリューションのマスター ミックス x 10 を 2 mL 管 200 μ 因数に分割します。フラッシュは、2.12 のステップで実行される各因数をフリーズします。すぐに使用するまで-80 ° C のフリーザーにそれらを配置します。
  3. アミノ酸のマスターの組合せ
    1. マスターのアミノ酸ミックス × 新鮮な 4 を準備、RT で各アミノ酸の在庫を融解し、氷の上それぞれを始めます。渦および/または thermomixer 37 ° C および 350 rpm で設定を使用してすべてアミノ酸株式完全に溶解しています。
      注:システインは完全に溶けない場合があります;それは、懸濁液としてアミノ酸のマスター ミックスに追加できます。過熱したり、長期間のため、thermomixer に試薬を残すしないでください。
    2. 15 mL チューブにそれぞれの最終濃度が 8 mM 以下の順序では、無菌純水に適切な量のアミノ酸を追加: ALA、ARG、ASN、ASP、GLN、GLU、GLY、彼、IIE、LYS、MET、PHE、プロ、SER、木、ヴァル、TRP、TYR、ルー、そしてシステイン。各アミノ酸を追加した後は、渦、マスターはソリューションをミックスします。2.4 mL アミノ酸のマスターの組合せを表 2に示すボリュームになります。
    3. マスターのアミノ酸ミックス x 4 を 2 mL 管 200 μ 因数に分割します。フラッシュは、2.12 のステップで実行される各因数をフリーズします。使用するまで-80 ° C で冷凍庫にすぐに。
  4. 反応準備プラスミド DNA テンプレートの生産
    注:スーパー フォルダー緑色蛍光タンパク質 (GFP) 発現ベクター T7-pJL1-sfGFP (資材表) を使用して、このシステムの無細胞蛋白質の表現を最適化されています。無細胞反応効率およびクローニングとその他のタンパク質の発現のため pJL1 のバックボーンにコントロールとしてこのプラスミドを使用することをお勧めします。他のプラスミド DNA のテンプレートを使用できます。しかし、T7 プロモーターと T7 RNA ポリメラーゼの存在によって転写が制御されることに注意してくださいすることが重要です。変換されたエシェリヒア属大腸菌からのプラスミド DNA のテンプレートの大規模な生産のための単純なプロトコルを説明します。
    1. メーカーの説明書 (材料表) に従ってプラスミド精製キットを使用して希望のベクトルを浄化します。
      注: できるだけ多くのプラスミド DNA のテンプレートを集中細胞反応のタイトなボリュームの制約を満たすために勧めします。一般に、750−1500 ng/μ L 作業在庫を目指してください。
  5. 反応準備 mRNA テンプレートの生産
    注:このセクションはオプションです。タンパク質の発現は T7 pJL1 sfGFP プラスミドの生体外のトランスクリプションから上場の T7 RNA ポリメラーゼ (材料表) によって生成された mRNA のテンプレートを使用してテストされています。
    1. プラスミド DNA の生体外のトランスクリプション反作用コンポーネントを使用して表 3に興味の蛋白質を符号化からの mRNA のテンプレートを準備します。たちの 37 ° C で 1 時間反応を孵化させなさい。
      注:十分な材料を生成する並列でこれらの反応の 8−10x を実行することをお勧めします。
    2. すべての転写反応をプールします。メーカーの説明書 (材料表) に従って mRNA 精製と濃縮キットを使用して浄化します。無菌純水に mRNA のテンプレートを溶出します。使用するまで-80 ° C で mRNA のテンプレートを格納します。

4. 無細胞タンパク質 Eexpression の反応を使用してnatriegens 対原油を抽出を実行します。

  1. 無細胞タンパク質発現プラスミドまたは線形 DNA のテンプレートを使用して
    1. エネルギー ソリューションのマスター ミックス x 10 とアミノ酸のマスターの組合せ因数 × 4-80 ° C のフリーザーから削除、RT で解凍し、氷の上に配置。-20 ° C のフリーザーから T7 RNA ポリメラーゼと RNase 阻害剤株式を削除し、氷の上に配置します。RT と氷の場所で DNA のテンプレートを解凍します。
    2. 氷上 2 mL チューブに次の順序で各コンポーネントを追加することによりテーブル 4に従って細胞遊離反応マスター ミックスを準備: アミノ酸のマスターの組合せ、エネルギー ソリューションのマスターの組合せ、Mg グルタミン酸、グルタミン酸 K、DNA のテンプレート、ペグ 8000、T7 RNA ポリメラーゼと RNase阻害剤.マスターのミックスに追加するたびに優しくはじきます。
      注:線形テンプレートを無細胞タンパク質発現に使用する場合は、蛋白質のかなり取得するプラスミッドのテンプレートと比較してより多くの材料をもたらす 5−10x を追加します。
    3. Natriegens V.原油細胞ライセート 10−20 分解凍までの手順 2.12-80 ° C のフリーザーの場所から氷の上で準備を削除します。適切なボリューム粗セル表 4に従って細胞反応のマスターの組合せに抽出し、軽くフリックまたは上下にピペッティングしてミックスを追加します。
    4. たちを使用してエンドポイント無細胞タンパク質発現
      1. 96 または 384 ウェル PCR プレートの下部に携帯無料反応のマスター ミックスの 10 μ L をピペットします。間に PCR プレートに転送するたびは、チューブを軽くフリック マスター ミックスをミックスします。
        注:携帯無料反応のマスターの組合せは、反応の再現性とすべてのサンプルの無細胞蛋白質の表現を最大限にすべての回でよく混合する必要があります。
    5. 簡単に 10 1,000 x gでプレートを遠心井戸の両側に残ることがあります任意のマスター ミックスをプールする s。蒸発を防止し、105 ° C で加熱蓋付き 26 ° C で設定たちに PCR プレートにプレート接着剤で井戸を封印します。
      注:均等な熱分布と加熱蓋、たちのタンパク質発現量が大幅に向上します。
    6. 3 h の最低の細胞反応を孵化させなさい。インキュベーション後、表現された蛋白質精製、定量化でき下流プロセスで使用されます。
      注:表現された蛋白質は、ユーザーの選択法を用いた無細胞反応で直接示すことができます。たとえば、外部標準曲線を用いた蛍光蛋白質を定量化することができます。 または細胞遊離反応で標識アミノ酸を使用している場合、放射能を測定することができます。紫外可視分光法又は総蛋白質の試金は推奨できません直接初期精製することがなく反応を無細胞タンパク質生産を測定するため。
    7. また、プレート リーダーを使用した無細胞タンパク質発現動態を監視します。
      1. 透明なガラスの底に黒い 384-well アッセイ プレートの下部に携帯無料反応マスター ミックスの 10 μ L をピペットします。氷上アッセイ プレートを維持またはキネティック完全プロファイルが得られることを確保するためのマスターの組合せを追加しながら寒い部屋で作業します。蒸発を防止し、26 ° C のセット プレート リーダーにアッセイ プレートにクリア プレート接着剤で井戸を封印します。
    8. 無細胞発現タンパク質に対応する適切な蛍光励起/蛍光波長を監視しながら h 3−6 反応を孵化させなさい。たとえば、監視 Ex/Em sfGFP 485 nm/528 nm を =。
  2. 無細胞タンパク質発現 mRNA のテンプレートを使用して
    1. RT と氷の場所でステップ 3.5.2 で用意した mRNA テンプレートを解凍します。
    2. 4.1.1 手順ステップ 4.1.6 前述の指定によって線形またはプラスミッド DNA テンプレートの表 4を使用した mRNA のテンプレートの代替細胞遊離反応マスター ミックスを準備します。

5. 携帯無料natriegens 対反応 sfGFP の校正

注:このセクションはオプションです。最適な携帯無料反応のイオン濃度は、セル換散の使用条件に基づいて各粗野なエキスの準備によって多少異なることができます。反応収率が予想よりも大幅に低い場合は、sfGFP を使用して下記オプション無料の細胞反応イオンのキャリブレーション プロトコル (濃度 < 1.0 μ g/mL) を実行してください。

  1. 3.1.1 準備した K グルタミン酸株式 Mg2 +と 100 mM Mg グルタミン酸および 2,000 mM から無菌純水で表 5で指定されている K+イオン校正ソリューションを準備します。必要になるまで氷に校正ソリューションを配置します。
  2. 以下の表 6 に校正マップ、384 ウェル PCR プレートの適切な井戸に Mg グルタミン酸の 1 μ L と K グルタミン酸イオン校正ソリューションの 2 μ L をピペットします。
    1. この手順の操作の順序は次のように: ピペット Mg グルタミン酸イオン校正ソリューションそれぞれの底によく続いて K グルタミン酸イオン キャリブレーションソリューション井戸の側に液体の井戸の存在に触れることがなく。
    2. 校正無料の細胞反応のマスター ミックスを準備中の蒸発を防ぐために板の上に接着剤を置くことによって井戸を封印します。Mg-K-グルタミン酸校正ソリューションをミックスする 384 ウェル プレートを軽くたたきます。
      注:リピータのピペットは、再現性をもって、迅速に、この手順を完了するため勧めします。
  3. 2 mL チューブに T7 pJL1 sfGFP プラスミド DNA のテンプレートを使用してテーブル 5で指定された校正無細胞反応マスター ミックスを準備します。マスター ミックスに次の順序で各コンポーネントを追加: アミノ酸のマスターの組合せ、エネルギー ソリューションのマスターの組合せ、T7 pJL1 sfGFP DNA のテンプレート、ペグ 8000、T7 RNA ポリメラーゼと RNase 阻害剤。各コンポーネントの付加の後でミックスする優しくはじきます。
    注:Mg を追加しないでください2 +または K+キャリブレーションを無細胞のマスターの組合せ。
  4. プレートから接着剤を削除します。慎重に混合イオン キャリブレーションソリューション井戸の存在に触れることがなく井戸の両側に校正無細胞反応マスター ミックスの 7 μ L をピペットします。接着剤で井戸を封印し、優しく 384 ウェル PCR プレートに無細胞マスター ミックスを混ぜてイオン校正ソリューションをタップします。
    注:リピータのピペットは、再現性をもって、迅速に、この手順を完了するため勧めします。
  5. 簡単に遠心分離機の 10 のプレート 1,000 × g井戸の両側に残ることがあります任意の純粋な液体をプールする s。105 ° C で加熱蓋付き 26 ° C で設定たちに 384 ウェル プレートを配置します。
  6. 3 時間無料の細胞反応を孵化させなさい。インキュベーション後、各ウェルの内容をマルチ チャンネル ピペットをガラス底を持つ黒 384-well アッセイ プレートに転送で sfGFP の蛍光を読み取る Ex/Em = 485 nm/528 nm プレート リーダーを使用して、イオン濃度の組み合わせを決定します。蛋白質の最高額を得られます。

Representative Results

Natriegens V.無細胞発現系を用いた蛋白質生産のための記述されているプロトコルは、文化の接種からタンパク質の下流のアプリケーションで使用できる単一のユーザーによって 1−2 日で実行できます。細胞粗抽出液・ マスター ミックス株式の準備が今回の重要な部分を構成します。ただし、準備が整うと、ほとんどバルク試薬 (表 7) 長期保存をすることができ、必要に応じてを使用は、プロトコルを完了に必要な時間の短縮します。

プラスミド DNA のテンプレートまたは mRNA の生体外のトランスクリプション反作用によって生成された記述式システムが適しています。また線形 DNA タンパク質生産のためのテンプレートとして使用できますが、蛋白質の低下量が得られます。たとえば、26 °C で最適な反応条件でシングル 10 μ L 細胞反応を生成すること > 260 μ g/mL 0.3 pmol のプラスミド DNA のテンプレートを使用して 3 時間で sfGFP の mRNA の転写 (図 5 a の 14 pmol を使用して sfGFP の匹敵する > 125 G/ml、B)。ただし、線形 dna 0.3 pmol 大幅に少ない蛋白質 (< 20 μ g/mL) が生成されます。テンプレートの種類ごとにタンパク質の大半を 1−1.5 h; 内で生成されます。ただし、最低 3 時間の反応を実行することをお勧めします。精製 sfGFP の標準曲線に蛍光測定を用いた線形回帰を介して sfGFP の細胞反応濃度を測定した Ex/Em = 485 nm/528 nm。

蛋白質の生産の収量は、カリウムとマグネシウム イオンの濃度により大きく影響されます (K+ 、Mg2 +、それぞれ)。最適化された条件の下で最適な Mg2 + K+イオン濃度される 3.5 mM と 80 mM、それぞれことがわかった (図 6 a, B)。かなりの収穫が付いている蛋白質を生成する無細胞発現系の減らされた容量で最適なイオン濃度からの逸脱があります。追加校正反応収率が予想よりも大幅に低い必要があります。イオンのキャリブレーションのための省略可能なプロトコルは、セクション 5 で説明されます。これにより、ある程度自由に個々 のセル換散等の条件から生じた粗セル抽出変動を補償します。

Figure 1
図 1: 超音波処理プラットフォームにビーカーとチューブ ホルダーのクローズ アップ ビューこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 超音波処理装置を原油のセルの準備のためセットアップを抽出しますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 超音波処理、遠心分離後ペレットのビューこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: フラッシュ エキス ストレージのディップを凍結しますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 代表結果natriegens V.無細胞タンパク質合成が別のテンプレート型を使用します。(A) sfGFP 生産 mRNA のテンプレートの濃度の増加し同様、プラスミッドおよび線形 DNA のテンプレート (0.3 pmol) のモル濃度を使用してエンドポイントの試金。精製 sfGFP の標準曲線を用いた無細胞 sfGFP 濃度を求めた Ex で測定/Em = 10 μ L のボリュームで最適な反応条件で 26 の ° C で培養の 180 分後 485 nm/528 nm。(B) sfGFP 生産 mRNA のテンプレートの濃度の増加し同様、プラスミッドおよび線形 DNA テンプレートのモル濃度を使用しての測定。sfGFP の測定は、3 分間隔にした Ex/EM = 485 nm/528 nm 10 μ L のボリュームで最適な反応条件で合計インキュベーション時間の 180 分以上。エンドポイント、カイネティック アッセイの両方のサンプルは、テンプレートを除くすべてのコンポーネントを添加した細胞反応を使って修正空白なっていました。平均と標準偏差を示す (n = 3)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: 代表結果イオン濃度校正します。(A) natriegens V.無細胞反応した Mg2 +濃度の増加で補ったし、10 μ L 反応で 180 分の 26 ° C で培養しました。濃度 K+のすべての Mg2 +濃度を 160 mM であった。精製 sfGFP の標準曲線を用いた無細胞 sfGFP 濃度を求めた Ex で測定/Em = 485 nm/528 nm。(B) natriegens (動)携帯無料反応した K+の濃度の増加で補ったし、10 μ L 反応で 180 分の 26 ° C で培養しました。Mg2 +の濃度は、すべての K+濃度 3.5 mM だった。両方の校正サンプルは、テンプレートを除くすべてのコンポーネントを添加した細胞反応を使って修正空白なっていました。平均と標準偏差を示す (n = 3)。この図は、ウィーガンドら9から変更されています。ウィーガンドから許可を得て転載 đ、李、H.H.、カルロヴィ ・ ヴァリ、(名)、教会、G.M. 携帯無料ビブリオ natriegens 発現系を確立します。ACS の合成生物。7 (10) 2475−2479 (2018 年)。著作権 2018年アメリカの化学社会。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

テーブル 1 LB V2 細菌の成長媒体の作製
コンポーネント 量 (g) 最終濃度 (mM) 最終巻 (L)
流体培養基 LB (ミラー) 25 1
塩化ナトリウム 11.69 200
MgCl2 2.20 23.1
JCM 0.31 4.2
テーブル 1 S30A 換散バッファーの準備
コンポーネント 量 (g) 最終濃度 (mM) 最終巻 (L)
トリス ソリューション (pH 8.0) 1 M (mL) * 25 50 0.5
Mg グルタミン酸 2.72 14
グルタミン酸 K 6.10 60
ジチオトレイトール (DTT) - 1 M (mL) * 1 2

表 1: LB V2 細菌の成長媒体の 1 L、0.5 L S30A セル換散バッファーの調製用試薬Excel でこのファイルをダウンロードするここをクリックしてください 

エネルギー ソリューション マスター ミックス x 10 の準備
コンポーネント ストック濃度 (mM) 最終濃度 (mM) 量 (μ L) 最終巻 (μ L)
HEPES 島 pH 8 1750 500 1428.57 5000
ATP 100 15 750.00
GTP 100 15 750.00
CTP 100 9 450.00
UTP 100 9 450.00
大腸菌MRE 600 から tRNA (mg/mL) * 100 2 100.00
補酵素 A の水和物 200 2.6 65.00
ナド 200 3.3 82.50
キャンプ 650 7.5 57.69
フォリン酸 100 0.7 35.00
スペルミジン 1600 10 31.25
3 PGA 2000 300 750.00
無菌純水 49.99
マスターのアミノ酸ミックス x 4 の準備
コンポーネント ストック濃度 (mM) 最終濃度 (mM) 量 (μ L) 最終巻 (μ L)
アラ 168 8 114.3 2400
ARG 168 8 114.3
ASN 168 8 114.3
ASP 168 8 114.3
GLN 168 8 114.3
GLU 168 8 114.3
GLY 168 8 114.3
彼の 168 8 114.3
イイエ 168 8 114.3
LYS 168 8 114.3
会った 168 8 114.3
ペー 168 8 114.3
プロ 168 8 114.3
SER 168 8 114.3
スレオニン 168 8 114.3
ヴァル 168 8 114.3
TRP 168 8 114.3
TYR 168 8 114.3
ルー 140 8 137.1
システイン 168 8 114.3
無菌純水 91.4

表 2: エネルギー ソリューション x 10 の 5 mL の調製用試薬マスター ミックスとマスターのアミノ酸ミックス x 4 の 2.4 mL    Excel でこのファイルをダウンロードするここをクリックしてください

生体外のトランスクリプション反作用の T7 RNA ポリメラーゼ
コンポーネント 株式 (mM) 最終濃度 (mM) 量 (μ L) 1 x 反応 量 (μ L) 50 x 反応
RNAPol 反応バッファー x 10 1.00 50
ATP 100 0.5 0.10 5
GTP 100 0.5 0.10 5
CTP 100 0.5 0.10 5
UTP 100 0.5 0.10 5
DNA テンプレート (ng/μ L) * 1000 500 0.50 25
T7 RNA ポリメラーゼ 200 2.6 2.00 100
Rnase 阻害剤、マウス 200 3.3 0.50 25
無菌純水 15.60 780
反応量 (μ L): 20

MRNA の世代表 3: 生体外のトランスクリプション コンポーネント    Excel でこのファイルをダウンロードするここをクリックしてください

携帯無料反応マスター ミックス
コンポーネント ストック濃度 (mM) 最終濃度 (mM) 量 (μ L) 1 x 反応 量 (μ L) 50 x 反応
抽出 (%) * 25 2.50 125.00
Mg グルタミン酸 100 3.5 0.35 17.50
グルタミン酸 K 2000 80 0.40 20.00
マスターのアミノ酸ミックス x 4 8.0 2 2.50 125.00
エネルギー ソリューション マスター ミックス x 10 1.00 50.00
プラスミド DNA (ng/μ L) * 1000 500 0.50 25.00
50 %PEG-8000 (%) * 50 2 0.40 20.00
T7 RNA ポリメラーゼ 1.00 50.00
RNase 阻害剤、マウス 0.10 5.00
無菌純水 1.25 62.50
反応量 (μ L): 10
MRNA のテンプレートの代替細胞遊離反応マスター ミックス
コンポーネント ストック濃度 (mM) 最終濃度 (mM) 量 (μ L) 1 x 反応 量 (μ L) 50 x 反応
抽出 (%) * 25 2.50 125.00
Mg グルタミン酸 100 3.5 0.35 17.50
グルタミン酸 K 2000 80 0.40 20.00
マスターのアミノ酸ミックス x 4 8.0 2 2.50 125.00
エネルギー ソリューション マスター ミックス x 10 1.00 50.00
mRNA のテンプレート (ng/μ L) * 2000 4000 2.00 100.00
50 %PEG-8000 (%) * 50 2 0.40 20.00
RNase 阻害剤、マウス 0.10 5.00
無菌純水 0.75 37.50
反応量 (μ L): 10

表 4: 最適化されたnatriegens (動)のコンポーネント無細胞反応 DNA のテンプレートそして mRNA のテンプレートのためのマスターの組合せ    Excel でこのファイルをダウンロードするここをクリックしてください

Mg2 +校正 量 (μ L) 1 x 反応 量 (μ L) 1 x 反応 量 (μ L) 100 x 反応 量 (μ L) 100 x 反応
決勝 (mM) 株式 100 mM Mg-グルタミン酸 式行先方向20 100 mM Mg-グルタミン酸 脱イオン H2O
2.5 0 0.00 1.00 0 100
3.5 1 0.10 0.90 10 90
4.5 2 0.20 0.80 20 80
5.5 3 0.30 0.70 30 70
反応量 (μ L): 10
K+校正 量 (μ L) 1 x 反応 量 (μ L) 1 x 反応 量 (μ L) 100 x 反応 量 (μ L) 100 x 反応
決勝 (mM) 株式 2000 mM K-グルタミン酸 式行先方向20 2000 mM K-グルタミン酸 脱イオン H2O
40 30 0.15 1.85 12 148
80 70 0.35 1.65 28 132
160 150 0.75 1.25 60 100
320 310 1.55 0.45 124 36
反応量 (μ L): 10
イオン校正無細胞反応マスター ミックス
コンポーネント ストック濃度 (mM) 最終濃度 (mM) 量 (μ L) 1 x 反応 量 (μ L) 50 x 反応
抽出 (%) * 25 2.50 125.00
Mg グルタミン酸 変数 変数 1.00 50.00
グルタミン酸 K 変数 変数 2.00 100.00
マスターのアミノ酸ミックス x 4 8.0 2 2.50 125.00
エネルギー ソリューション マスター ミックス x 10 1.00 50.00
プラスミド DNA (ng/μ L) * 1000 250 0.25 12.50
50 %PEG-8000 (%) * 50 2 0.40 20.00
T7 RNA ポリメラーゼ 1.00 50.00
RNase 阻害剤、マウス 0.10 5.00
無菌純水 0.00 0.00
反応量 (μ L): 10

表 5: イオン濃度校正マスター ミックス    Excel でこのファイルをダウンロードするここをクリックしてください

CF イオン校正地図 40 ミリメートル K+ 80 ミリメートル K+ 160 ミリメートル K+ 320 ミリメートル K+
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
2.5 mM Mg2 + A
3.5 mM Mg2 + B
4.5 mM Mg2 + C
5.5 mM Mg2 + D

表 6: イオン校正マップします    Excel でこのファイルをダウンロードするここをクリックしてください

保管条件や棚 CF コンポーネントの生活
コンポーネント ストレージの場所 シェルフ ライフ
滅菌 LB V2 の成長媒体 4 ° C 3-6 ヶ月
原油細胞抽出natriegens v. -80 ° C 1-3 週間
100 mM Mg グルタミン酸 室温 6 ヶ月
2000 mM K-グルタミン酸 室温 6 ヶ月
50 %PEG-8000 室温 6 ヶ月
エネルギー ソリューション マスター ミックス x 10 -80 ° C 3-6 ヶ月
マスターのアミノ酸ミックス x 4 -80 ° C 3-6 ヶ月
プラスミド/線形 DNA のテンプレート -20 ° C 6-12 ヶ月
mRNA テンプレート -80 ° C 3-4 週間

表 7: 携帯無料保管条件や棚生活    Excel でこのファイルをダウンロードするここをクリックしてください

Discussion

このプロトコルは、 natriegens 対野生型と V2 塩 (資材表) を添加した lb 膜から成る細菌の成長媒体のために最適化されています。Natriegens v.の他の系統は、無細胞反応; 原油細胞抽出液を生成する同様に培養することができます。ただし、その使用には、このプロトコルのさらなる最適化が必要です。さらに、この無細胞タンパク質発現システムは、一次エネルギー再生ソースとして 3-ホスホ グリセリン酸 (3-PGA) を使用して最適化されています。その他再生エネルギーを使用可能性があります。ただし、高収量タンパク質式10,11を入手しなければに試薬および校正の最適化でしょう。

このプロトコルのいくつかの重要なステップに固有の注意は高収量の最大抽出生産性を確保する無細胞タンパク質の生産。まず、成長の半ば指数段階で収穫された細胞培養natriegens 対からの原油の細胞抽出液を準備しなければなりません文化外径600に達するとき、蛋白質収量が最大 1.0 ± 0.2 を =。光学密度の範囲で採取した細胞から無細胞タンパク質生産が可能ですが、我々 は以前セル成長の急激な状態で収穫がかなり多くタンパク質9をもたらすことを発見しました。原油細胞抽出パフォーマンスの光学密度の観測効果、バッチ培養条件1で育った細胞から派生した他の無細胞システムの報告と一致。Natriegens V.急速な率で増加するので、文化の光学密度を密接に監視する重要です。一般に、それはnatriegens 対文化がこのプロトコルを使用して 1−1.5 h 以内 1.0 の外径600を再現性をもって到達することが期待します。ただし、個々 の成長条件の使用などはどの影響曝気や空気水孵化率と孵化の温度の安定性に影響を与えると成長時間を変更可能性があります非困惑のフラスコと困惑。さらに、 natriegens 対1 L 困惑してフラスコで簡単操作や転送のための収穫で大細胞ペレットを確保するための少なくとも 250 mL を培養することを一般的にお勧めします。ペレット由来抽出物の総容積の増加と同様、原油セル抽出準備の成功が大幅に向上します。小さい規模の準備機能を使用するとき培養条件および試薬適切に調整できます。さらに大規模な発酵、培養条件の最適化が必要になります。最後に、高蛋白質収量を確保するため、収穫後すぐにまたは-80 ° C で保存する 1−2 日以内に細胞ペレットを処理する重要なです。

パルス超音波照射によって細胞ペレットの適切な換散は無細胞タンパク質発現の成功に不可欠です、このプロトコルの新しいユーザーのための最も困難な側面は、しばしば。通常、分離よくペレットの残骸がない液体抽出物の膨大な量になります。抽出物は少し粘性が液体窒素で凍結する前に管のストレージに早かったとき簡単に戻されることができます。図 3は、ポスト溶解遠心分離のステップ後不十分な分離ペレット (図 3 b) と比較しても分離ペレット (図 3 a) の表現を示しています。完全セル換散の主要な徴候は原油細胞抽出総蛋白濃度 > 20 mg/mL 総蛋白質の試金 (ステップ 2.13) によって決定されます。過剰超音波または原油の細胞抽出液の過剰加熱無細胞反応を行わず確定できない細胞機械装置が破損します。したがって、下流蛋白質式アプリケーションに膨大な時間と労力を捧げる前にコントロール反応の抽出効率をテストするのには非常に有益です。その他の最適化は、別の超音波処理装置に必要なかもしれませんが、パルス超音波処理の手順は、私たちの手で再現性の高いされています。

PCR 増幅、制限の酵素のダイジェスト、または商業遺伝子合成から派生した線形 DNA のテンプレートの使用は大幅無細胞システム24で高スループットと急速な蛋白質の生産のための容量を増やすことができます。PCR 増幅された線形テンプレートからの蛋白質の生産を示されている、これらの反応の収率が約 13.5-fold 下に比べてプラスミドを用いた反応モル比9時の DNA のテンプレート。これは主に内因性核酸natriegens 対の原油の細胞抽出液の存在によって低下はほとんど線形 DNA のテンプレートの不安定性。ラムダファージ · タンパク質 GamS は線形 DNA テンプレート24,25を保護するために既に使用されている、時natriegens 対に対応する9を抽出それが見つかりました。さらに、線形 DNA テンプレートの濃度を増加させるタンパク質の収量が可能ことがあります、原油の細胞抽出液の高速パフォーマンスが低下は大きな問題とされます。

線形 DNA の生体外のトランスクリプションから生成された mRNA のテンプレートで無料の細胞反応を補足する線形 DNA テンプレートの劣化を克服するための解決策があります。その一方で、RNase 阻害剤の使用は、mRNA 転写分解に対して重要な保護を提供しています、10 μ L 反応の無細胞形式 (図 5 a, B) でかなりのタンパク質の収量を得ることができます。TA 結紮を円形のテンプレートへの線形 DNA のクローニング、テンプレートの劣化を回避するために TOPO のクローニング、ゴールデン ゲートのアセンブリ、または他の結合方法を使用可能性があります。さらにそれにもかかわらず、アプローチのヌクレアーゼ活性を阻害すると、線形 DNA のテンプレートを使用して効率的なタンパク質発現の必要があります。

日には、無細胞タンパク質発現9,1011,26の粗野なエキスの準備のためいくつかの異なる方法が提案されています。このプロトコルを開発する上では、ユーザのアクセシビリティを最大限、全体的なコストの削減、時間のかかる手順を最小限にましょう。たとえば、高蛋白質収量は単純な 2 段階の超音波処理遠心分離プロセスを使用して実現され、セルのホモジナイザー、長い透析の手順や流出反応は必要ありません。簡単に時間の短い期間で実行、実験室の専門知識の高レベルを必要としません。したがって、並進の学術研究や産業プロセスの設計のための標準として無細胞発現を促進することに役立ちます。

このプロトコルは、調査およびnatriegens 対、ユニークな生物学的特性を非モデル生物のユーティリティに使用できるツールキットを拡張します。エネルギー回生システムのように、半または完全に-連続無細胞の反応を用いた高蛋白質収量を実現できますアミノ酸および廃棄物3,5,27の除去の間。さらに、野生型natriegens V. DNAse、RNAse 欠損株を生成するためのエンジニア リング、劇物と競合する代謝経路の除去および追加 Trna の表現が大幅に強化の蛋白質の生産このシステム28,29急速な成長の基礎となる生物学的解明、 natriegens 対無細胞システムの更なる発展が生物生産機能を加速、治療的なペプチド、低分子、合成の堅牢な式を有効にします。材料。

Disclosures

DJW、いいえ、GMC は、この作品に関連する特許を提出したと。

Acknowledgments

この作品は、一般医学国立研究所 1U01GM110714-01 とエネルギー ・ デ ・ FG02 02ER63445 部門によって賄われていた。著者は、この原稿のプロトコル セクションの構築に関する有益な助言を博士リチャード Kohman、タム ジェニーと博士エドガー Goluch を感謝したいです。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Tubes Corning 352196
2 mL Tubes Eppendorf 22363352
384-well Black Assay Plates Corning 3544
384-well PCR Plates Eppendorf 951020702
50 mL Tubes Corning 352070
96-well PCR Plates Eppendorf 30129300
Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate Sigma A6885
Adenosine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler ThermoFisher 4388444
Assay Plate Adhesives BioRad MSB1001
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) Sigma/Roche 10127965001
Coenzyme A hydrate Sigma C4283
Cytidine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) Sigma P8877
Dewar Flask - 4L ThermoScientific 10-194-100C
DL-Dithiothreitol solution - 1 M Sigma 42816
Folinic acid calcium salt hydrate Sigma 47612
Glacial Acetic Acid Sigma A6283
Guanosine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
HEPES Sigma H3375
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate Sigma 49605
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma G1149
LB Broth (Miller) Sigma L3522
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Plasmid pJL1-sfGFP Addgene 69496
Plasmid Plus Maxi kit Qiagen 12963
Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 Sigma 89510
Potassium chloride (KCl) Sigma P9333
Potassium hydroxide Pellets Sigma/Roche 1050121000
Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ?-inch tip Qsonica 4422
RNA Clean and Concentrator Kit Zymo R1013
RNase Inhibitor, Murine NEB M0314
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit BR1401801
Sodium chloride (NaCl) Sigma S7653
Spermidine Sigma S0266
T7 RNA Polymerase NEB M0251
Tris Solution (pH 8.0) - 1 M Invitrogen AM9856
tRNA from E. coli MRE 600 Sigma/Roche 10109541001
Uridine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock ATCC 14048

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References

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