셀 무료 단백질 식을 사용 하 여 빠르게 성장 박테리아 비 브리 오 natriegens

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Bioengineering
 

Summary

셀-무료 식 시스템은 높은 처리량 합성과 중요 한 단백질의 심사에 대 한 강력 하 고 비용 효율적인 도구입니다. 여기, 우리는 플라스 미드 DNA, 선형 DNA, mRNA 서식 파일을 사용 하 여 급속 한 단백질 생산에 대 한 비 브리 오 natriegens 를 사용 하 여 셀 무료 단백질 식 시스템의 준비를 설명 합니다.

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Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (145), e59495, doi:10.3791/59495 (2019).

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Abstract

해양 박테리아 비 브리 오 natriegens 그것의 빠른 성장 속도 때문에 생명 공학에 대 한 새로운 미생물 호스트로 상당한 관심을 얻고 있다. 일반적인 프로토콜은 일반적인 실험실 장비를 사용 하 여 원유 셀 추출 natriegens 대 의 준비에 대 한 설명 합니다. 이 높은 저조한 프로토콜은 특별히 되었습니다 사용자 액세스에 대 한 최적화 및 비용 감소. 셀 무료 단백질 합성 (CFPS) 작은 규모 10 μ 배치 반응 96 또는 384 잘 형식에서에서 실행 될 수 있습니다 그리고 reproducibly 전반적 > 260 μ g/mL 슈퍼 GFP (sfGFP) 내의 폴더 3 헤의 농도 산출, 원유 셀 추출 준비 및 CFPS 단일 사용자에 의해 1−2 일에서 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜 바이오 생산 및 합성 생물학 응용 프로그램을 촉진 하기 위해 기존 단백질 합성 파이프라인에 쉽게 통합할 수 있습니다.

Introduction

셀 무료 단백질 합성은 귀중 한 단백질 또는 펩 티 드1,2,,34의 표현에 대 한 다양 하 고 비용 효율적인 방법입니다. 역사적으로, 셀 무료 단백질 합성 수행 된 대장균 식 시스템을 사용 하 여 그러나, 거기를 사용 하 여 대체, 비 모델 생물 소설 속성 섀시로 셀 자유 식5,6,7,,89 으로 최근 급등이 하고있다 , 10 , 11 , 12. 생물 고유의 대사 프로필은 주요한 후보자 대장균 세포-무료 시스템 대안. 예를 들어 비 브리 오 natriegens 는 관찰 된 모든 알려진된 생물의 급성장은 해양 박테리아1310 분 미만의 시간을 두 배로. 이 대 한 연구와 생명 공학14,15,,1617,18신흥 미생물 호스트 natriegens V. 상당한 관심을 얻고 있다. Natriegens 대 의 급속 한 성장 속도 그 단백질 합성과 대사 효율19,20,21, 셀-무료에 대 한 그것의 세포질 기계 활용의 높은 속도에 연결 되어있다 합성 크게 빠른 단백질 생산 및 높은 처리량 검열에 대 한 도구 키트를 확장 수 있습니다.

최근, 한 셀-무료 식 시스템 natriegens V. T7 발기인93 h에서 > 260 μ g/mL의 농도에서 슈퍼 폴더 GFP (sfGFP) 생산 능력은 입증 되었습니다. 이 방법을 개발의 전반적인 목표는 시간의 짧은 금액에 일반 실험실 장비를 사용 하 여 준비 될 수 있다 매우 액세스할 수, 비용 효율, 재현성, 및 높은 저조한 셀 무료 단백질 표정 시스템 사용자를 제공 했다. 이 프로토콜에 쉐이크 플라스 크 1 L 문화, 펄스 쥡니다, 및 병렬화 및 심사 처리량을 최대화 하기 위해 96 또는 384 잘 형태로 소규모 일괄 처리 반응에 의해 세포 세포의 용 해를 사용 합니다. 긴, 지속적인 단백질 표정은 가능 하 게 3 phosphoglyceric 산 (3-PGA)의 보충에 의해 에너지 소스8,,2223으로. 이 프로토콜을 성공적으로 완료 되 면 사용자는 원하는 단백질을 표현 하는 능력 있을 것 이다 또는 natriegens 대 원유 셀을 사용 하 여 셀 무료 형태로 단백질의 집합 추출.

조 셀 추출 물 natriegens 대 600에서 광학 밀도에서 수확 하는 세포에서 준비가 글리세롤 재고에서 시작 해 서, 1.0 nm (OD600). 1 L 문화 25% 원유 세포 추출 물에서 800 개 이상의 셀 무료 반응에 대 한 충분 한 추출 물의 약 2−3 mL를 얻을 것입니다. 단백질은 플라스 미드 DNA, 선형 DNA 나 mRNA 템플릿;를 사용 하 여 표현 될 수 있다 그러나, 내 생 nucleases에 의해 선형 DNA 템플릿 저하 야생 타입 natriegens V. 셀-무료 시스템9를 사용 하 여 주요 단점은 남아 있습니다. Natriegens 대 문화에서 시작 해 서, 단백질 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 유용한 얻을 수 있습니다 단일 사용자에 의해 1−2 전체 일에서.

Protocol

1. natriegens 대 원유 셀 추출-세균성 문화의 준비

  1. Natriegens 대 세균 성장 미디어 파운드-v 2 표 1에 따라 준비 합니다. 압력가 마로 소독 하 여 성장 매체를 소독. 미디어 실 온 (RT)에 도달 하실 수 있습니다. 실시간에서 초과 미디어 저장
    주의: 적절 한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 하 고 때 압력솥 연구소 특정 지침을 참조 하십시오.
  2. Natriegens 대 야생 타입의 글리세롤 재고를 사용 하 여 파운드 V2 미디어의 3 mL 접종 하. 하룻밤 30 ° C에 225 rpm에서 떨고 있는 동안 성장 한다.
  3. 결과 펠 렛을 방해 하지 않고 1 분 Aspirate는 상쾌한 대 벤치탑 분리기에 10600 x g 에서 원심 분리 하 여 1 mL의 숙박 문화를 세척 하 고 신선한 파운드-V2 미디어의 1 mL에 resuspend.
  4. 압력가 4 L 살 균 커버, 당황 하 고 삼각 플라스 크 1 L 신선한 파운드-V2 성장 매체의 추가. 씻어 하룻밤 문화 (1:1, 000 희석 비율) 1 mL를 사용 하 여 접종. 225 rpm에서 떨고 있는 동안 30 ° C에서 문화를 성장.
    참고: 문화 동 natriegens 1:1,000 희석 비율을 유지 하면서 위 또는 아래로 확장할 수 있습니다. 예를 들어 250 μ L 2에 신선한 파운드-V2 성장 매체의 250 mL을 씻어 하룻밤 문화의 멸 균 커버 삼각 플라스 크를 당황 하 게 추가 합니다.
  5. 문화권의 OD600 는 분 광 광도 계를 사용 하 여 모니터링 합니다. 문화에 세600 를 도달 하는 때 = 1.0 ± 0.2, 4 ° c.에 20 분 동안 3500 x g 에서 원심 분리를 통해 수확 문화 얼음에 펠 릿을 놓습니다.
    참고: Natriegens 대 자 랍니다, 그래서 문화의 가까운 모니터링 하는 것이 필요. OD600 성장 = 1.0 1:1,000 희석 비율에 약 1.5−2 h를 취해야 한다.
  6. 상쾌한 발음 즉시-80 ° C에서 결과 세균성 펠 릿 저장 하거나 2 절에서 설명 하는 세포를 세포를 직접 진행 합니다.
    참고: 이 단계는 좋은 멈추는 포인트; 그러나, 펠 릿 또는 최상의 결과 위해 1−2 일 이내 즉시 처리할 수 하는 것이 좋습니다.

2. natriegens 대 원유 셀 추출-세포 세포의 용 해의 준비

  1. S 30 표 1 살 균 이온된 (DI) 수에 따라 세포의 용 해 버퍼를 준비 하 고 pH 7.7 빙 초 산을 사용 하 여를 조정 합니다.
    주의: 빙하 아세트산 pH를 조정할 때 적절 한 보호구와 함께 처리 되어야 합니다.
  2. 약 4 ℃ 냉장고에서 또는 세포 세포의 용 해 절차를 시작 하기 전에 얼음에 멋진 S30 세포의 용 해 버퍼입니다.
    참고: 빠른 쿨 다운, 세포의 용 해 버퍼는-20 ° c.에 배치 될 수 있습니다. 고정 버퍼를 허용 하지 않습니다.
  3. 10−20 분 또는 완전히 해 동 때까지 얼음에 셀 펠 릿을 놓습니다. 차가운 S30 세포의 용 해 버퍼의 10 mL를 사용 하 여 동일한 1 L 문화에서 발생 하는 모든 펠 릿 resuspend 다음 현 탁 액 50 mL 튜브에 전송 합니다. 펠 릿-80 ° c 단계 1.6에서에서 냉장고에서 동결 되지는 경우 물의 resuspension 직접 진행 합니다.
    참고: S30 세포의 용 해 버퍼 처음 필요에 따라 펠 릿을 resuspend 하는 데 사용의 볼륨을 증가.
  4. 3500 x g 4 ° c.에서 10 분 원심 분리기 정지 펠 릿을 방해 하지 않고는 상쾌한 발음. 워시 펠 릿 찬 S30 세포의 용 해 버퍼의 10 mL를 사용 하 여 두 번째 시간. 얼음에 펠 릿을 놓습니다.
  5. 추운 방에 찬 S30 세포의 용 해 버퍼의 500 μ 50 mL 튜브에 펠 릿을 추가 합니다. 넓은 구멍 피 펫 팁을 사용 하 여, 펠 릿 resuspend 하 고 신중 하 게 전체 펠 릿 현 탁 액 2 mL 튜브에 전송.
    참고: 넓은 구멍 피 펫은 사용할 수 없습니다, 증가 펠 릿 전송 위한 구멍을 1 mL 피 펫 팁의 끝을 잘라가 위를 사용 하 여.
    1. 볼륨; 크게 증가 하지 않고 최대한 많은 펠 릿을 전송 그러나 균질 성 현 탁 액 2 mL 튜브에 의해 표시 된 대로, 펠 릿 sonicated 수에 충분 한 액체 resuspended 한다. 2 mL 튜브를 넣 하지 마십시오. 현 탁 액 1.5 mL;을 초과 해서는 안 필요한 경우 여러 개의 튜브로 분할.
  6. 얼음에 셀 펠 릿을 유지 하 고 추운 실내에서. 얼음으로 600 mL 비 커를 얼음. 위에 2 mL 튜브 홀더를 배치
    참고: 펠 릿 정지 쥡니다 진행 상황을 모니터링할 얼음에서 볼 수 있도록, 비 커의 측면 근처 튜브 홀더를 도움이 된다 ( 그림 1참조).
  7. 소용돌이 셀 균질에 짧게 2 mL 튜브에 펠 릿을 중단, 영화 튜브, 뚜껑의 하단에 있는 세포를 제거 하 고 모자와 튜브 홀더를 엽니다. 그것은 액체 표면 바로 아래 서 스 펜 션으로 낮은 sonicator 팁.
  8. ⅛ 인치 팁 직경 sonicator 및 프로브를 사용 하 여 그림 2 에서처럼 쥡니다 설치를 준비 합니다. Sonicator 컨트롤에 다음과 같은 설정을 입력: 20 kHz 주파수 및 50% 진폭, 펄스 시간: 10 s, 펄스 OFF 시간: 60 s.
  9. 3 사이클 펄스 쥡니다 프로토콜을 실행 합니다. 펠 렛 서 스 펜 션의 총 볼륨 > 500 μ 인 경우 펄스 쥡니다 프로토콜 6 번을 실행 합니다.
    참고: 일반적으로, 3−6 펄스는 natriegens 대 펠 릿; lyse 충분 추가 펄스 sonicator 따라 필요할 수 있습니다. 쥡니다, 동안 조정 손잡이 플랫폼을 사용 하 여 프로브 튜브의 바닥에 침전 할 수 있습니다 어떤 펠 릿을 lyse를 아래로 이동. 튜브 홀더 고에서 짧게 vortexed 다시 펄스 사이 정지 균질을 제거할 수 있습니다. Sonicated 셀의 원하는 일관성에 대 한 토론 아래 참조.
    주의: Sonicator 활성화 될 때 적절 한 청력 보호를 착용 하십시오.
  10. 쥡니다, 다음 원심 분리기 조 세포 30−45 분 또는 lysate 그림 3에서처럼 어떤 세포질 파편 든 지 무료입니다 때까지 4 ° C에서 16000 x g 에서 추출 합니다.
  11. 차가운 방에서 새로운 2 mL 튜브에 펠 렛을 방해 하지 않고 결과 supernatants의 aliquot 50 μ.
    참고:
    새로운 2 mL 튜브에 실수로 전송 되는 어떤 파편 든 지 크게 높은 저조한 단백질 합성에 대 한 추출의 용량을 줄일 것입니다.
    1. 필요한 경우, 설정 옆으로 별도 2 mL에 후 세포 단백질 정량화에 대 한 셀의 10 μ 추출 튜브 (단계 아래 2.13 참조).
  12. 플래시 튜브 홀더에 찍기 문자열 그림4에서와 같이 연결 된 튜브를 배치 하 여 원유 셀 추출 물을 동결. 액체 질소를 포함 하는 Dewar에 튜브를 잠수함을 즉시 사용까지-80 ° C에서 냉동 실에 두십시오.
    주의: 얼굴 방패, 제 앞치마와 장갑, 안전 안경, 연구실 코트를 포함 하 여 액체 질소를 처리 하기 위한 적절 한 보호구를 사용 합니다.
  13. 필요에 따라 계량 lysate 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1에서 샘플 1: 100 희석 Bradford 분석 실험, bicinchoninic 산 같은 모든 표준 총 단백질 정량화 분석 결과 사용 하 여 단계 2.11.1 제외 설정 10 μ를 사용 하 여 셀의 총 단백질 분석 결과 (BCA), 등입니다.

3. 셀 무료 반응 구성 요소 준비

  1. 일반적인 반응의 구성 요소
    1. 각각 100 m m와 2000 m m의 농도에서 살 균 디 물 50 mL 튜브에 Mg-조미료 및 K-조미료 일 주식을 준비 합니다.
    2. 250 mL 비 커에 물 100 mL의 멸 균 디를 추가 하 여 50% (w/v) 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)-8000의 작업 주식을 준비 합니다. 비 커에 작은 자력을 놓습니다. 그리고 말뚝-8000의 50 g으로 무게 비 커에 물 100 mL에 추가.
    3. 100 ° C로가 열된 볶음 판 설정에는 비 커를 놓고 못-8000은 솔루션에까지 250 rpm에서 저 어. 나무 못 8000 50 mL 튜브에 전송 하기 전에 냉각 액체 혼합물을 허용 한다.
  2. 에너지 솔루션 마스터 믹스
    1. 살 균 디 물 500 mL에 코 펠 릿의 140 g를 추가 하 여 코의 5 M 솔루션을 준비 합니다.
      주의: 화학 후드에이 솔루션을 준비 하 고 강력한 베이스를 처리할 때 보호구 착용. 그래서 병 뚜껑 압력 형성을 방지 하는 느슨한 해야 솔루션 뜨거운 될 것 이다. 사용 하기 전에 RT 도달 코 솔루션을 허용 합니다.
    2. 100 mL 병 HEPES 20.85 g를 추가 하 여 1750 mM HEPES 코 버퍼를 준비 합니다. 볼륨 40 mL에 도달할 때까지 천천히 살 균 디 물을 추가 합니다. 소용돌이 HEPES 해산 병. 5 M 코 솔루션을 사용 하 여 pH 8.0에 조정 하 고 다음 솔루션 볼륨 50 mL를가지고.
      주의: 코는 pH를 조정할 때 적절 한 보호구와 함께 처리 되어야 합니다.
    3. 에너지 마스터 혼합 살 균 디 물에 표 2 에 표시 된 농도에서 주식 구성 요소 x 나머지 10을 준비 하 고 얼음에 각 주식을 배치. RT와 얼음에 장소에서 100 m m ATP와 GTP, CTP, UTP 주식 녹여
      참고: 37 ° C를 350 rpm 설정 thermomixer 필요한 경우 솔루션에 시 약을 해산 하기 위해 사용할 수 있습니다. 과열 하거나 시간의 연장된 기간에 대 한 시 약은 thermomixer에 떠나 마십시오.
    4. 15 mL 튜브에 순서 및 표 2에 지정 된 볼륨에 사용에 따라 각 에너지 솔루션 마스터 믹스 구성 요소를 추가 합니다. 각 구성 요소를 추가한 후 솔루션 소용돌이입니다. 이 에너지 솔루션 마스터 믹스 x 10의 5 mL을 만들 것입니다.
    5. 에너지 솔루션 마스터 믹스 x 10 200 μ aliquots 2 mL 튜브에 나눕니다. 플래시 동결 각 약 수 단계 2.12에서에서 수행 합니다. 즉시 사용까지-80 ° C 냉동 실에 배치 합니다.
  3. 아미노산 마스터 믹스
    1. 신선한 4x 아미노산 마스터 믹스를 준비, 각 아미노산 재고 RT에서 녹고 고 다음 얼음에 각각 배치 하 여 시작 합니다. 소용돌이 / 37 ° C 350 rpm에서 설정 하는 thermomixer를 사용 하 여 모든 아미노산 주식은 완전히 용 해 되도록.
      참고: 시스테인 완전히 분해 되지 않을 수 있습니다; 그것은 정지로 아미노산 마스터 믹스에 추가할 수 있습니다. 과열 하거나 시간의 연장된 기간에 대 한 시 약은 thermomixer에 떠나 마십시오.
    2. 15 mL 튜브에 적절 한 볼륨 아미노산을 추가 살 균 디 물 각각의 최종 농도 다음 순서에 따라 8 mM: ALA, ARG, ASN, ASP, GLN, GLU, GLY, 그의 IIE, 리스, 메트로, 페, 프로, 백 산, 목, 발, TRP, TYR 레이, 그리고 CYS. 각 아미노산을 추가한 후 소용돌이 마스터 솔루션을 혼합. 표 2 에 나열 된 볼륨 아미노산 마스터 믹스의 2.4 mL를 만들 것입니다.
    3. 4 아미노산 마스터 믹스 x 2 mL 튜브에 200 μ aliquots 나눕니다. 플래시 동결 각 약 수 단계 2.12에서에서 수행 합니다. 즉시 사용까지-80 ° C에서 냉동 실에 넣으십시오.
  4. 반응 준비 플라스 미드 DNA 템플렛의 생산
    참고: 이 시스템에서 셀 무료 단백질 표정은 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질 (GFP) 식 벡터 T7-pJL1-sfGFP (테이블의 재료)를 사용 하 여 최적화 되었습니다. 셀 무료 반응 효율성과 복제 및 다른 단백질 시퀀스의 표현에 대 한 pJL1 백본 컨트롤로이 플라스 미드를 사용 하는 것이 좋습니다. 다른 플라스 미드 DNA 템플릿은 사용할 수 있습니다; 그러나, 그것은 중요 전사 T7 발기인 순서 및 T7 RNA 중 합 효소의 존재에 의해 제어 됩니다. 어떤 플라스 미드 DNA 템플렛 변형된 대장균 에서 대규모 생산에 대 한 간단한 프로토콜은 아래 설명 되어 있습니다.
    1. 제조 업체의 지시 (자료 테이블)에 의하여 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 원하는 벡터를 정화.
      참고: 가능한 플라스 미드 DNA 템플렛을 집중 셀 무료 반응의 꽉 볼륨 제약에 맞게 것이 좋습니다. 일반적으로, 750−1500 ng/μ 일 재고에 대 한 목표.
  5. 반응 준비 mRNA 서식 파일의 생산
    참고: 이 섹션은 선택 사항입니다. 단백질 표정 mRNA 템플릿이 나열된 T7 RNA 중 합 효소 (자료 테이블)에 의해 플라스 미드 T7-pJL1-sfGFP의 생체 외 녹음에서 생성 된 사용 하 여 테스트 되었습니다.
    1. 플라스 미드 표 3에서 생체 외 녹음 방송 반응 구성 요소를 사용 하 여 관심사의 단백질을 암호화 하는 DNA에서에서 mRNA 템플릿을 준비 합니다. 품 어는 thermocycler에서 37 ° C에서 1 시간에 대 한 반응.
      참고: 충분 한 자료를 생성 하는 동시에 이러한 반응의 8−10x를 수행 하는 것이 좋습니다.
    2. 모든 녹음 방송 반응 풀. 제조 업체의 지시 (자료 테이블)에 의하여 mRNA 정화와 집중 장치 키트를 사용 하 여 정화. 살 균 디 물으로 mRNA 템플릿을 elute. 사용까지-80 ° C에서 mRNA 서식 파일을 저장 합니다.

4. 수행 셀 무료 단백질 Eexpression 반응 사용 하 여 natriegens 대 원유 추출

  1. 플라스 미드 또는 선형 DNA 템플렛을 사용 하 여 셀 무료 단백질 표정
    1. -80 ° C 냉동 고에서 에너지 솔루션 마스터 믹스 x 10 및 아미노산 마스터 믹스 aliquots x 4 제거 RT에서 해 동 하 고 얼음에. -20 ° C 냉동 고에서 T7 RNA 중 합 효소, RNase 억제제 주식을 제거 하 고 얼음에. DNA 템플렛 RT와 얼음에 녹여
    2. 얼음에 2 mL 튜브에 다음과 같은 순서로 각 구성 요소를 추가 하 여 표 4 에 의하여 셀 무료 반응 마스터 믹스를 준비: 아미노산 마스터 믹스, 에너지 솔루션 마스터 믹스, Mg-조미료, K-조미료, DNA, 페그-8000, T7 RNA 중 합 효소, 템플릿과 RNase 억제제입니다. 부드럽게 마스터 믹스에 각 추가 후에 튜브를 터치 합니다.
      참고: 선형 서식 파일 셀 무료 단백질 식에 사용할 경우 단백질의 플라스 미드를 감지할 서식 파일에 비해 더 많은 자료를 생성 하는 5−10x를 추가 합니다.
    3. Natriegens 대 원유 세포 lysate 10−20 분 해 동 때까지 준비 단계-80 ° C 냉동 고 및 장소에서 2.12 얼음에에서 제거 합니다. 적절 한 볼륨 원유 셀 표 4 에 의하여 셀 무료 반응 마스터 혼합 추출 하 고 부드럽게 flicking 또는 아래로 pipetting 믹스를 추가 합니다.
    4. Thermocycler를 사용 하 여 끝점 셀 무료 단백질 표정
      1. 10 μ 96 또는 384 잘 PCR 접시의 바닥에 셀 무료 반응 마스터 믹스의 플라스틱 사이 PCR 접시에 각 전송 튜브를 부드럽게 터치 하 여 마스터 믹스 믹스.
        참고: 셀 무료 반응 마스터 혼합 반응 재현성 및 모든 샘플에 단백질 세포 자유로운 표현의 극대화를 항상 잘 혼합 한다.
    5. 짧게 1000 x g 10에서 격판덮개 원심 우물의 측에 갇혀 될 수 있습니다 어떤 마스터 믹스 수영장 s. 증발을 방지 하 고 다음 PCR 플레이트 thermocycler 105 ° c.에서 설정 온수 뚜껑 26 ° C에서 설정에 접시 접착제로 우물을 봉인
      참고: 열 배급 조차와 thermocycler의 온수 뚜껑 크게 단백질 식 수율을 향상 시킵니다.
    6. 3 h의 최소 셀 무료 반응을 품 어. 부 화, 후 표현한 단백질 정화, 계량, 고 다운스트림 프로세스에 대 한 사용.
      참고: 표현한 단백질 사용자의 선택의 방법을 사용 하 여 셀 무료 반응에서 직접 측정할 수 있습니다. 예를 들어 외부 표준 곡선을 사용 하 여 형광 단백질을 측정할 수 있습니다 또는 셀 무료 반응에 방사선된 아미노산을 사용 하는 경우 방사능 측정 될 수 있다. 자외선 보이는 분광학 또는 총 단백질 분석 실험은 일반적으로 권장 되지 않습니다 직접 초기 정화 없이 셀 무료 반응에서 단백질 생산을 측정.
    7. 또는, 플레이트 리더를 사용 하 여 셀 무료 단백질 식 활동을 모니터링 합니다.
      1. 투명 유리 바닥으로 검은 384-잘 분석 결과 접시의 바닥에 셀 무료 반응 마스터 믹스의 10 μ 플라스틱 얼음에 분석 결과 접시를 유지 또는 전체 운동 프로 파일을 얻을 수 있도록 마스터 믹스를 추가 하는 동안 추운 방에 작동. 증발을 방지 하 고 다음 시험 접시 26 ° c.에 설정 플레이트 리더를 분명 플레이트 접착제로 우물을 봉인
    8. 표현한 단백질에 해당 하는 적절 한 형광 여기/방출 파장을 모니터링 하는 동안 h 3−6에 대 한 셀 무료 반응을 품 어. 예를 들어 모니터에 전 / Em 485 nm/528 nm sfGFP에 대 한 =.
  2. MRNA의 서식 파일을 사용 하 여 셀 무료 단백질 표정
    1. 해 동 mRNA 템플릿 단계 3.5.2 RT와 얼음에 장소에서에서 준비.
    2. 수행 단계 4.1.1 4.1.6 이전에 지정 된 선형 또는 표 4 를 사용 하 여 mRNA 서식 파일에 대 한 대체 셀 무료 반응 마스터 믹스를 준비 하는 플라스 미드 DNA 템플렛.

5. sfGFP와 natriegens V. 셀-무료 반응의 교정

참고: 이 섹션은 선택 사항입니다. 최적의 셀 무료 반응 이온 농도 세포 세포의 용 해에 대 한 사용 조건에 따라 각 원유 추출 준비를 위해 약간 달라질 수 있습니다. 옵션 셀 무료 반응 이온 교정 프로토콜 반응 수율은 예상 보다 훨씬 낮은 경우에 sfGFP를 사용 하 여 아래 설명 된 (농도 < 1.0 μ g/mL)를 수행 하십시오.

  1. Mg2 + 및 멸 균 디 물 100 mM Mg 조미료 및 2000 m m에서 표 5 에 지정 된 대로 K+ 이온 보정 솔루션 단계 3.1.1에서 K-조미료 주식 준비. 필요할 때까지 얼음에 교정 솔루션을 배치 합니다.
  2. 표 6에서 교정 지도 따라 384-잘 PCR 접시에 적절 한 우물에 Mg-조미료의 1 μ와 K-조미료 이온 보정 솔루션의 2 μ 플라스틱.
    1. 이 단계의 작업 순서는 다음과 같습니다: 피펫으로 Mg-조미료 이온 보정 솔루션 각각의 하단에 잘 이어서 잘의 측에 K-조미료 이온 보정 솔루션 우물에 이미 있는 액체를 건드리지 않고.
    2. 교정 셀 무료 반응 마스터 믹스를 준비 하는 동안 증발을 방지 하기 위해 플레이트 위에 접착제를 배치 하 여 우물을 봉인. 부드럽게 혼합 Mg과 K 조미료 교정 솔루션 384-잘 접시를 누릅니다.
      참고: 리피터 피 펫이 reproducibly 하 고 신속 하 게이 단계를 완료에 대 한 좋습니다.
  3. 표 5 2 mL 튜브에 T7-pJL1-sfGFP 플라스 미드 DNA 템플렛을 사용 하 여 지정 된 대로 보정 셀 무료 반응 마스터 믹스를 준비 합니다. 믹스 마스터를 다음과 같은 순서로 각 구성 요소를 추가: 아미노산 마스터 믹스, 에너지 솔루션 마스터 믹스, T7-pJL1-sfGFP DNA 템플렛, 페그-8000, T7 RNA 중 합 효소, 그리고 RNase 억제제. 부드럽게 터치 하는 각 구성 요소 추가 후 혼합 튜브.
    참고: Mg을 추가 하지 마십시오2 + 또는 K+ 를 보정 셀 프리 믹스 마스터.
  4. 접시에서 접착제를 제거 합니다. 신중 하 게 우물에 이미 있는 혼합된 이온 보정 솔루션을 건드리지 않고 우물의 측면에 교정 셀 무료 반응 마스터 믹스의 7 μ 플라스틱. 접착제와 우물을 봉인 하 고 부드럽게 이온 보정 솔루션 마스터 셀 프리 믹스를 섞어 384-잘 PCR 접시를 누릅니다.
    참고: 리피터 피 펫이 reproducibly 하 고 신속 하 게이 단계를 완료에 대 한 좋습니다.
  5. 짧게 원심 판 1000 x g 10에 대 한 s 우물의 측에 갇혀 될 수 있습니다 어떤 순수한 액체 수영장. 105 ° c.에서 설정 온수 뚜껑 26 ° C에서 설정 thermocycler 384-잘 접시를 넣습니다
  6. 3 h에 대 한 셀 무료 반응을 품 어. 부 화, 후 각의 내용을 멀티 채널 피 펫으로 유리 바닥으로 검은 384-잘 시험 접시에 전송과 읽기에서 sfGFP의 형광 전 / Em = 485 nm/528 nm 플레이트 리더를 사용 하 여 이온 농도 조합을 결정 하는 단백질의 높은 금액을 생성합니다.

Representative Results

Natriegens 대 식 세포-무료 시스템을 사용 하 여 단백질 생산에 대 한 설명된 프로토콜 단백질 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있는 문화의 접종에서 시작 하는 단일 사용자에 의해 1−2 일에 실행할 수 있습니다. 이 시간;의 상당 부분을 구성 하는 원유 셀 추출 물과 마스터 믹스 주식의 준비 그러나, 일단 준비, 대부분 벌크 시 약 저장된 장기 (표 7) 될 수 있으며, 필요에 따라 사용 시간을 단축 프로토콜을 완료 하는 데 필요 합니다.

설명 식 시스템 플라스 미드 DNA 템플렛 또는 mRNA 녹음 방송 생체 외에서 반응에 의해 생성 된 가장 사용 됩니다. 선형 DNA 단백질 생산을 위한 서식 파일로 사용할 수 있습니다, 하는 동안 그것은 상당히 낮은 양의 단백질 생성 합니다. 예를 들어 26 °C에서 최적의 반응 조건에서 단일 10 μ 셀 무료 반응을 생산할 수 > 260 μ g/mL 플라스 미드 DNA 템플렛의 0.3 pmol를 사용 하 여 3 시간에 sfGFP의 또는 mRNA 사본 (그림 5A의 14 pmol를 사용 하 여 sfGFP의 비교 > 125 μ g/mL B). 그러나, 선형 DNA의 0.3 pmol 훨씬 적은 단백질 (< 20 μ g/mL)을 생산할 예정 이다. 각 서식 파일 유형에 대 한 단백질의 대부분 1−1.5 h;에서 생산 됩니다. 그러나, 반응 3 시간 최소 실행 하는 것이 좋습니다. SfGFP의 셀 무료 반응 농도에 형광 측정 순화 sfGFP 표준 곡선을 사용 하 여 선형 회귀를 통해 결정 했다 전 / Em 485 nm/528 nm =.

단백질 생산의 수율은 칼륨과 마그네슘 이온의 농도 의해 영향을 크게 (+ K와 Mg2 +, 각각). 최적화 된 조건 하에서 최적의 마그네슘2 + 그리고 K+ 이온 농도 된다는 것 3.5 m m와 80 mM, 각각 발견 됐다 (그림 6A, B). 최적의 이온 농도에서 편차 감소 용량 감지할 수익률 단백질을 생산 하기 위해 셀 무료 식 시스템을 발생할 수 있습니다. 추가 교정 반응 수율은 예상 보다 훨씬 낮은 경우에 필요할 수 있습니다. 이온 보정에 대 한 선택적 프로토콜 섹션 5에에서 설명 되어 있습니다. 개별 세포 세포의 용 해 장비 및 조건에서 발생 한 원유 셀 추출 가변성에 대 한 보상에 일부 유연성에 대 한 수 있습니다.

Figure 1
그림 1: 쥡니다 플랫폼에 비 커와 튜브 홀더의 클로즈업 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 쥡니다 장비 설치 원유 셀의 준비에 대 한 추출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 쥡니다와 원심 분리 후 펠 릿의 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 플래시 추출 저장에 대 한 딥 동결. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 다른 서식 파일 형식을 사용 하 여 셀 무료 단백질 합성 natriegens 대 대표 결과. SfGFP 생산 mRNA 서식 파일의 농도 증가 뿐만 아니라 플라스 미드와 선형 DNA 템플렛 (0.3 pmol)의 아데닌 농도 사용 하 여의 (A) 끝점 시험 셀-무료 sfGFP 농도 정화 sfGFP의 표준 곡선을 사용 하 여 결정 했다 전에서 측정 / Em 10 μ 볼륨에 최적의 반응 조건에서 26 ° C에 외피의 180 분 후 485 nm/528 nm =. (B) sfGFP 생산 플라스 미드와 선형 DNA 템플렛의 아데닌 농도 사용 하 여 뿐만 아니라 서식 파일 mRNA의 농도 증가의 운동 분석 결과. sfGFP 측정에서 3 분 마다 찍은 전 / EM = 485 nm/528 nm 10 μ 볼륨에 최적의 반응 조건에서 총 보육 시간 180 분 이상. 끝점 및 운동 분석 실험에 대 한 샘플 했다 빈 셀 없는 반응 서식 파일 제외한 모든 구성 요소와 함께 보충을 사용 하 여 수정. 평균 및 표준 편차 표시 됩니다 (n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 대표 이온 농도 보정 결과. (A) natriegens 대 셀 무료 반응 Mg2 + 의 농도 증가 함께 보충 되었고 26 ° C에서 10 μ 반응에서 180 분 동안 incubated. K+ 의 총 농도 모든 Mg2 + 농도 대 한 160 m m 이었다. 셀-무료 sfGFP 농도 정화 sfGFP의 표준 곡선을 사용 하 여 결정 했다 전에서 측정 / Em 485 nm/528 nm =. (B) natriegens 대 셀 무료 반응 했다 K+ 의 농도 증가 함께 보충 및 10 μ 반응에서 180 분 동안 26 ° C에서 알을 품. Mg2 + 의 총 농도 모든 K+ 농도 대 한 3.5 m m 이었다. 두 교정에 대 한 샘플 했다 빈 셀 없는 반응 서식 파일 제외한 모든 구성 요소와 함께 보충을 사용 하 여 수정. 평균 및 표준 편차 표시 됩니다 (n = 3). 이 그림은 Wiegand 외.9에서 수정 되었습니다. Wiegand에서 허가로 증 쇄 디제이, 리, H.H., 오 스트로브, 명, 교회, G.M. 셀 무료 비 브리 오 natriegens 식 시스템을 구축. ACS 합성 생물학. 7 (10), 2475−2479 (2018). 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

테이블 1 A 파운드-V2 세균성 성장 매체의 준비
구성 요소 수량 (g) 최종 농도 (mM) 마지막 볼륨 (L)
국물 LB (밀러) 25 1
NaCl 11.69 200
MgCl2 2.20 23.1
KCl 0.31 4.2
테이블 다룹니다 S30A 세포의 용 해 버퍼의 준비
구성 요소 수량 (g) 최종 농도 (mM) 마지막 볼륨 (L)
트리 스 솔루션 (pH 8.0)-1m (mL) * 25 50 0.5
Mg-조미료 2.72 14
K-조미료 6.10 60
Dithiothreitol (DTT)-1m (mL) * 1 2

표 1: 파운드-V2 세균성 성장 매체의 1 리터와 S30A 세포 세포의 용 해 버퍼의 0.5 L의 준비에 대 한 시 약. Excel에서이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오. 

에너지 솔루션 마스터 믹스 x 10의 준비
구성 요소 사진 농도 (mM) 최종 농도 (mM) 수량 (µ L) 마지막 볼륨 (µ L)
HEPES 코 pH 8 1750 500 1428.57 5000
ATP 100 15 750.00
GTP 100 15 750.00
CTP 100 9 450.00
UTP 100 9 450.00
대장균 MRE 600에서에서 tRNA (mg/mL) * 100 2 100.00
코엔자임 A 하이드 레이트 200 2.6 65.00
나드 200 3.3 82.50
캠프 650 7.5 57.69
Folinic 산 100 0.7 35.00
Spermidine 1600 10 31.25
3-PGA 2000 300 750.00
살 균 이온된 수 49.99
아미노산 마스터 믹스 x 4의 준비
구성 요소 사진 농도 (mM) 최종 농도 (mM) 수량 (µ L) 마지막 볼륨 (µ L)
ALA 168 8 114.3 2400
ARG 168 8 114.3
ASN 168 8 114.3
ASP 168 8 114.3
GLN 168 8 114.3
GLU 168 8 114.3
GLY 168 8 114.3
그의 168 8 114.3
교육원 168 8 114.3
리스 168 8 114.3
만난 168 8 114.3
168 8 114.3
프로 168 8 114.3
SER 168 8 114.3
THR 168 8 114.3
168 8 114.3
TRP 168 8 114.3
티 르 168 8 114.3
레이 140 8 137.1
CYS 168 8 114.3
살 균 이온된 수 91.4

표 2: 에너지 솔루션 x 10의 5 mL의 준비에 대 한 시 약 마스터 믹스 및 아미노산 마스터 믹스 x 4의 2.4 mL.    Excel에서이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

생체 외 녹음 방송 반응에서 T7 RNA 중 합 효소
구성 요소 주식 (mM) 최종 농도 (mM) 수량 (µ L) 1x 반응 수량 (µ L) 50 x 반응
RNAPol 반응 버퍼 x 10 1.00 50
ATP 100 0.5 0.10 5
GTP 100 0.5 0.10 5
CTP 100 0.5 0.10 5
UTP 100 0.5 0.10 5
DNA 템플렛 (ng / µ L) * 1000 500 0.50 25
T7 RNA 중 합 효소 200 2.6 2.00 100
Rnase 억제제, Murine 200 3.3 0.50 25
살 균 이온된 수 15.60 780
반응 볼륨 (µ L): 20

표 3: 생체 외 녹음 구성 요소: mRNA 세대.    Excel에서이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

셀-무료 반응 마스터 믹스
구성 요소 사진 농도 (mM) 최종 농도 (mM) 수량 (µ L) 1x 반응 수량 (µ L) 50 x 반응
추출 (%) * 25 2.50 125.00
Mg-조미료 100 3.5 0.35 17.50
K-조미료 2000 80 0.40 20.00
아미노산 마스터 믹스 x 4 8.0 2 2.50 125.00
에너지 솔루션 마스터 믹스 x 10 1.00 50.00
플라스 미드 DNA (ng / µ L) * 1000 500 0.50 25.00
50% 말뚝-8000 (%) * 50 2 0.40 20.00
T7 RNA 중 합 효소 1.00 50.00
RNase 억제제, Murine 0.10 5.00
살 균 이온된 수 1.25 62.50
반응 볼륨 (µ L): 10
대체 셀 무료 반응 마스터 믹스 mRNA 서식 파일에 대 한
구성 요소 사진 농도 (mM) 최종 농도 (mM) 수량 (µ L) 1x 반응 수량 (µ L) 50 x 반응
추출 (%) * 25 2.50 125.00
Mg-조미료 100 3.5 0.35 17.50
K-조미료 2000 80 0.40 20.00
아미노산 마스터 믹스 x 4 8.0 2 2.50 125.00
에너지 솔루션 마스터 믹스 x 10 1.00 50.00
mRNA 템플릿 (ng / µ L) * 2000 4000 2.00 100.00
50% 말뚝-8000 (%) * 50 2 0.40 20.00
RNase 억제제, Murine 0.10 5.00
살 균 이온된 수 0.75 37.50
반응 볼륨 (µ L): 10

표 4: 최적화 된 natriegens 대 의 구성 요소 셀-무료 DNA 템플렛과 mRNA 서식 파일에 대 한 반응 마스터 믹스.    Excel에서이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

Mg 2 + 교정 수량 (µ L) 1x 반응 수량 (µ L) 1x 반응 수량 (µ L) 100 x 반응 수량 (µ L) 100 x 반응
최종 (mM) 주식 100 m m Mg-Glu diH 2 0 100 m m Mg-Glu 이온된 H2O
2.5 0 0.00 1.00 0 100
3.5 1 0.10 0.90 10 90
4.5 2 0.20 0.80 20 80
5.5 3 0.30 0.70 30 70
반응 볼륨 (µ L): 10
K + 교정 수량 (µ L) 1x 반응 수량 (µ L) 1x 반응 수량 (µ L) 100 x 반응 수량 (µ L) 100 x 반응
최종 (mM) 주식 2000 m m K-Glu diH 2 0 2000 m m K-Glu 이온된 H2O
40 30 0.15 1.85 12 148
80 70 0.35 1.65 28 132
160 150 0.75 1.25 60 100
320 310 1.55 0.45 124 36
반응 볼륨 (µ L): 10
이온 보정 셀 무료 반응 마스터 믹스
구성 요소 사진 농도 (mM) 최종 농도 (mM) 수량 (µ L) 1x 반응 수량 (µ L) 50 x 반응
추출 (%) * 25 2.50 125.00
Mg-조미료 변수 변수 1.00 50.00
K-조미료 변수 변수 2.00 100.00
아미노산 마스터 믹스 x 4 8.0 2 2.50 125.00
에너지 솔루션 마스터 믹스 x 10 1.00 50.00
플라스 미드 DNA (ng / µ L) * 1000 250 0.25 12.50
50% 말뚝-8000 (%) * 50 2 0.40 20.00
T7 RNA 중 합 효소 1.00 50.00
RNase 억제제, Murine 0.10 5.00
살 균 이온된 수 0.00 0.00
반응 볼륨 (µ L): 10

표 5: 이온 농도 보정 마스터 믹스.    Excel에서이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

CF 이온 교정 지도 40mm K+ 80mm K+ 160mm K+ 320 m m K+
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
2.5 m m Mg2 + A
3.5 m m Mg2 + B
4.5 m m Mg2 + C
5.5 m m Mg2 + D

표 6: 이온 교정 지도.    Excel에서이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보관 조건 및 선반 삶의 CF 구성 요소
구성 요소 저장 위치 수명
살 균 파운드-V2 성장 미디어 4 ° C 3-6 개월
Natriegens 대 원유 셀 추출 -80 ° C 1-3 주
100 m m Mg-조미료 방 온도 6 개월
2000 m m K-조미료 방 온도 6 개월
50% 말뚝-8000 방 온도 6 개월
에너지 솔루션 마스터 믹스 x 10 -80 ° C 3-6 개월
아미노산 마스터 믹스 x 4 -80 ° C 3-6 개월
플라스 미드/선형 DNA 템플렛 -20 ° C 6-12 개월
mRNA 템플릿 -80 ° C 3-4 주

표 7: 셀 무료 저장 조건 및 선반 생활.    Excel에서이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

이 프로토콜은 야생-타입 natriegens 대 와 세균성 성장 미디어 파운드 V2 소금 (자료 테이블)와 보완의 구성에 대 한 최적화 되었습니다. Natriegens 대 의 다른 긴장 마찬가지로 원유 셀 추출 셀 무료 반응;에 대 한 생성 하 경작 될 수 있습니다. 그러나, 그들의 사용이이 프로토콜의 추가 최적화를 해야합니다. 또한,이 셀 무료 단백질 표정 시스템 기본 에너지 재생 소스로 3 phosphoglyceric 산 (3-PGA)를 사용 하 여 최적화 되었습니다. 다른 재생 에너지를 사용할 수 있습니다; 그러나, 시 약 및 교정의 최적화 높은 저조한 단백질 식10,11를 얻을 필요가 있을 것 이다.

이 프로토콜의 몇 가지 중요 한 단계에 특정 관심 높은 저조한에 대 한 최대한 추출 생산성을 보장 것입니다 셀-무료 단백질 생산. 첫째, 원유 세포 추출 물 세포 배양 natriegens 대 성장;의 중간 지 수 단계에서 수확에서 준비 해야 합니다 문화 도달 OD600 단백질 수확량은 최대 1.0 ± 0.2 =. 광학 밀도의 범위에서 수확 하는 셀에서 셀 무료 단백질 생산 가능한 동안, 우리는 이전 발견 세포의 성장 지 수 상태에서 수확 훨씬 더 많은 단백질9항복. 조 셀 추출 성능에 광학 밀도의 관찰 된 효과 그 배치 문화 조건1에서 성장 하는 세포에서 파생 된 다른 셀 무료 식 시스템에 대 한 보고와 일치. Natriegens 대 는 빠른 속도로 성장 하기 때문에 그것은 밀접 하 게 모니터 문화 광학 밀도 중요입니다. 일반적으로, 그것은 natriegens 대 문화 reproducibly 1−1.5 h;이 프로토콜을 사용 하 여 내 1.0의 OD600 를 도달 해야 예상 그러나,의 사용과 같은 개별 성장 조건 대 비 당황 플라스 크, 어떤 영향을 미치는 폭 기, 또는 물 외피, 속도 안정성의 외피 온도 영향을 미치는, 대 공기 성장 시간을 변경할 수 있습니다 당황. 또한, 그것은 적어도 250 mL natriegens 대 1 L 당황 하 고 플라스 크에서 쉽게 조작 및 전송에 대 한 수확에 큰 셀 펠 릿을 위해 문화 일반적으로 것이 좋습니다. 이 원유 셀 추출 물 준비는 펠 릿에서 추출의 총 볼륨 생산 증가의 성공을 크게 향상 시킵니다. 작은 규모의 준비를 사용 하 여, 문화 및 시 약 조정할 수 있습니다 적절 하 게. 대규모 발효에 대 한 추가 문화 조건의 최적화 필요할 수 있습니다. 마지막으로, 높은 단백질 수율을 보장 하기 위해, 그것은 중요 한 셀 펠 릿, 수확 직후 또는-80 ° c.에 저장의 1−2 일 이내 처리 됩니다.

펄스 쥡니다에 의해 셀 펠 릿의 적절 한 세포 단백질 세포 자유로운 식의 성공에 중요 한 이며 종종 새로운 사용자를 위해이 프로토콜의 가장 어려운 부분입니다. 일반적으로, 잘 lysed 펠 릿 하 파편의 액체 추출의 중요 한 볼륨을 얻을 것입니다. 추출 물은 약간 점성 해야 하지만 저장소에 aliquoting 플래시 액체 질소에서 동결 전에 튜브 때 쉽게 pipetted. 그림 3 게시물 세포 원심 분리 단계 후 저조한 lysed 펠 릿 (그림 3B)에 비해 잘 lysed 펠 릿 (그림 3A)의 표현을 보여 줍니다. 완전 한 세포 세포의 용 해의 주요 표시 원유 셀 추출 총 단백질 농도 > 20 mg/mL 총계 단백질 분석 결과 (단계 2.13)에 의해 결정 되는. -쥡니다 또는 원유 셀 추출의 과도 한 난방 셀 무료 반응 하지 않고 확인할 수 없는 세포 기계를 손상 됩니다. 따라서, 다운스트림 단백질 식 응용 프로그램을 상당한 시간과 노력을 할애 하기 전에 제어 반응 추출 효율 테스트에 매우 유리 하다. 추가 최적화 다른 쥡니다 장비에 필요한 있을 수 있습니다, 하는 동안 설명 하는 펄스 쥡니다 단계 높은 우리 손에 재현 되었습니다.

선형 DNA 템플렛 PCR 증폭, 금지 효소 소화, 또는 상업적 유전자 합성에서 파생 된를 사용 하 여 크게 셀 무료 식 시스템24높은 처리량 및 빠른 단백질 생산을 위한 수 용량을 증가할 수 있다. PCR 증폭 선형 템플릿에서 단백질 생산 입증 되었습니다,이 반응의 수확량은 약 13.5-fold 낮은 아데닌 비율9서식 파일 DNA 플라스 미드를 사용 하 여 반응에 비해. 이것은 주로 생 nucleases 원유 세포 추출 물 natriegens 대 에 의해 저하 가능성이 있는 선형 DNA 템플렛의 불안정성. 람다 파지 단백질 GamS는 이전에 사용 된 선형 DNA 템플릿24,25를 보호 하기 위해, 하는 동안 natriegens 대 와 호환 되도록 추출9발견 했다. 또한, 선형 DNA 템플렛의 농도 증가 더 높은 단백질 생산량에 대 한 수 있습니다, 반면 원유 세포 추출 물에 그것의 빠른 저하 여전히 주요 문제 것입니다.

선형 DNA 템플릿 저하를 극복 하는 솔루션 선형 DNA의 생체 외 녹음에서 생성 된 mRNA 서식 파일 셀 무료 반응을 보충 될 수 있습니다. 다른 한편으로, RNase 억제제를 사용 하 여 mRNA 사본 저하에 대 한 중요 한 보호를 제공 하 고 감지할 수 단백질 수율 10 μ 셀 무료 반응 형식 (그림 5AB)에서 구할 수 있습니다. TA 결 찰을 통해 원형 템플릿으로 선형 DNA의 복제, 템플릿 저하 회피 TOPO 클로닝, 골든 게이트 어셈블리 또는 다른 재조합 방법을 사용할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 더 접근 nuclease 활동의 저해에 대 한 선형 DNA 템플렛을 사용 하 여 효율적인 단백질 표정에 필요한 있을 것입니다.

날짜 하려면, 몇 가지 다른 방법은 셀 무료 단백질 식9,10,,1126원유 추출의 준비에 대 한 제안 되었습니다. 이 프로토콜을 개발, 우리 사용자 접근성을 극대화, 전반적인 비용을 삭감 하 고 시간이 많이 걸리는 단계를 최소화 하고자 했다. 예를 들어 높은 단백질 수율 간단한 2 단계 쥡니다 원심 분리 과정을 사용 하 여 달성 되 고 셀 균질, 긴 투 석 단계 또는 실행 반응 필요 하지 않습니다. 그것은 시간의 짧은 기간에 실행을 간단 하 고 실험실 전문성의 높은 레벨을 필요로 하지 않습니다. 따라서, 그것은 변환 학술 연구 및 산업 공정 설계에 대 한 표준으로 셀 자유 식 용이 하 게 도울 수 있다.

이 프로토콜은 조사 및 natriegens 대, 독특한 생물 학적 특성을 가진 비 모델 생물의 유틸리티에 사용할 수 있는 도구 키트를 확장합니다. 높은 단백질 수율 세미-또는 완전히-연속 셀 무료 반응, 에너지 재생 허용을 사용 하 여 달성 될 수 있다 아미노산, 그리고 폐기물3,,527의 제거의 재공급. 또한, 야생-타입 natriegens V. DNAse 불충분 또는 RNAse 한 종자를 생산 하기 위해의 공학, 해로운과 경쟁 변화 통로의 제거 및 추가 tRNAs 표현의 크게 향상 시킬 수 있는 단백질의 생산 이 시스템28,29. 우리가 그것의 급속 한 성장 기본 생물학 해명, natriegens V. 셀 무료 시스템의 추가 개발 수 있습니다 bioproduction 기능을 촉진과 치료 펩 티 드, 작은 분자, 및 합성의 강력한 표현 사용 재료입니다.

Disclosures

DJW, 아니, GMC이이 작품에 관련 된 특허를 신청 했 고.

Acknowledgments

이 작품은 일반 의료 과학의 국립 연구소 1U01GM110714-01 부의 에너지 드-FG02-02ER63445에 의해 투자 되었다. 저자 박사 리처드 Kohman, 닥터 제니 탐, 및 박사 에드거 Goluch이이 원고에 대 한 프로토콜 섹션을 생성에 도움이 되는 조언에 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Tubes Corning 352196
2 mL Tubes Eppendorf 22363352
384-well Black Assay Plates Corning 3544
384-well PCR Plates Eppendorf 951020702
50 mL Tubes Corning 352070
96-well PCR Plates Eppendorf 30129300
Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate Sigma A6885
Adenosine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler ThermoFisher 4388444
Assay Plate Adhesives BioRad MSB1001
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) Sigma/Roche 10127965001
Coenzyme A hydrate Sigma C4283
Cytidine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) Sigma P8877
Dewar Flask - 4L ThermoScientific 10-194-100C
DL-Dithiothreitol solution - 1 M Sigma 42816
Folinic acid calcium salt hydrate Sigma 47612
Glacial Acetic Acid Sigma A6283
Guanosine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
HEPES Sigma H3375
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate Sigma 49605
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma G1149
LB Broth (Miller) Sigma L3522
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Plasmid pJL1-sfGFP Addgene 69496
Plasmid Plus Maxi kit Qiagen 12963
Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 Sigma 89510
Potassium chloride (KCl) Sigma P9333
Potassium hydroxide Pellets Sigma/Roche 1050121000
Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ?-inch tip Qsonica 4422
RNA Clean and Concentrator Kit Zymo R1013
RNase Inhibitor, Murine NEB M0314
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit BR1401801
Sodium chloride (NaCl) Sigma S7653
Spermidine Sigma S0266
T7 RNA Polymerase NEB M0251
Tris Solution (pH 8.0) - 1 M Invitrogen AM9856
tRNA from E. coli MRE 600 Sigma/Roche 10109541001
Uridine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock ATCC 14048

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References

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