कोशिका मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति तेजी से बढ़ जीवाणु vibrio natriegens का उपयोग

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Bioengineering
 

Summary

सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली शक्तिशाली और उच्च थ्रूपुट संश्लेषण और महत्वपूर्ण प्रोटीन की स्क्रीनिंग के लिए लागत कुशल उपकरण हैं । यहां, हम सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली की तैयारी का वर्णन तेजी से प्रोटीन प्लाज्मिड डीएनए, रैखिक डीएनए, और mrna टेंपलेट का उपयोग कर उत्पादन के लिए vibrio natriegens का उपयोग कर ।

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Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (145), e59495, doi:10.3791/59495 (2019).

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Abstract

मरीन बैक्टीरियम विब्रियो नेट्रिएंस ने अपनी तेजी से विकास दर के कारण जैव प्रौद्योगिकी के लिए एक उभरते हुए माइक्रोबियल मेजबान के रूप में काफी ध्यान दिया है । सामान्य प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करते हुए V. natriegens क्रूड सेल अर्क की तैयारी के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । इस उच्च उपज प्रोटोकॉल विशेष रूप से उपयोगकर्ता पहुंच और कम लागत के लिए अनुकूलित किया गया है । सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (cfps) या तो एक ९६-या ३८४-अच्छी तरह से प्रारूप में छोटे पैमाने पर 10 μl बैच प्रतिक्रियाओं में किया जा सकता है और > २६० μg/एमएल सुपर फ़ोल्डर gfp (sfgfp) की reproducibly पैदावार सांद्रता 3 एच के भीतर । कुल मिलाकर, क्रूड सेल निकालने की तैयारी और सीएफपी एक एकल प्रयोक्ता द्वारा 1 − 2 पूर्ण दिनों में प्राप्त किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल को आसानी से मौजूदा प्रोटीन संश्लेषण पाइपलाइन में एकीकृत करने के लिए जैव उत्पादन और सिंथेटिक जीव विज्ञान अनुप्रयोगों में अग्रिम की सुविधा कर सकते हैं ।

Introduction

सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण मूल्यवान प्रोटीन या पेप्टाइड्स1,2,3,4की अभिव्यक्ति के लिए एक बहुमुखी और लागत प्रभावी तरीका है । ऐतिहासिक दृष्टि से, सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण escherichia कोली अभिव्यक्ति प्रणालियों का उपयोग किया गया है; हालांकि, सेल-मुक्त अभिव्यक्ति के लिए चेसिस के रूप में उपन्यास संपत्तियों के साथ वैकल्पिक, गैर-मॉडल जीवों का उपयोग करने में हाल ही में वृद्धि हुई है5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. अद्वितीय चयापचय प्रोफाइल के साथ जीव ई. कोलाई सेल मुक्त प्रणालियों के लिए विकल्प के रूप में प्रधान उंमीदवार हैं । उदाहरण के लिए, समुद्री जीवाणु विब्रियो नेट्रिजन सभी ज्ञात जीवों का सबसे तेजी से बढ़ रहा है, जो 10 मिनट13से कम समय में मनाया जाने वाला दुगनी बार है । इस V. अनुसंधान और जैव प्रौद्योगिकी14,15,16,17,18के लिए एक उभरते माइक्रोबियल मेजबान के रूप में काफी ध्यान natriegens है । यह देखते हुए कि V. natriegens की तीव्र वृद्धि दर को प्रोटीन संश्लेषण और चयापचय क्षमता की उच्च दरों से जोड़ा गया है19,20,21, सेल मुक्त करने के लिए अपनी सेलुलर मशीनरी का दोहन संश्लेषण काफी तेजी से प्रोटीन उत्पादन और उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए टूलकिट का विस्तार हो सकता है.

हाल ही में, एक सेल मुक्त V. natriegens अभिव्यक्ति प्रणाली का प्रदर्शन किया गया है जो सुपर फ़ोल्डर gfp (sfgfp) के उत्पादन में सक्षम है > २६० μg/एमएल की सांद्रता पर एक T7 प्रवर्तक9के साथ 3 एच में । इस विधि के विकास का समग्र उद्देश्य एक उच्च सुलभ के साथ उपयोगकर्ताओं को प्रदान करने के लिए था, लागत कुशल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, और उच्च उपज सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली है कि समय की एक छोटी राशि में आम प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग कर तैयार किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल को हिला flasks में 1 एल संस्कृतियों का इस्तेमाल करता है, पल्स sonication द्वारा सेल lysis, और छोटे पैमाने पर बैच प्रतिक्रियाओं में एक ९६-या ३८४-अच्छी तरह से समानता और स्क्रीनिंग थ्रुपुट को अधिकतम करने के लिए प्रारूप. एक लंबे, निरंतर प्रोटीन अभिव्यक्ति 3 की पूरकता द्वारा संभव बनाया है-फॉस्फोग्लिसरिक एसिड (3-पीजीए) एक ऊर्जा स्रोत के रूप में8,22,23. सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल को पूरा करने पर, एक उपयोगकर्ता एक वांछित प्रोटीन या एक सेल मुक्त प्रारूप में प्रोटीन के सेट वी natriegens कच्चे सेल निकालने का उपयोग कर व्यक्त करने की क्षमता होगी ।

एक ग्लिसरोल स्टॉक से शुरू, V. natriegens कच्चे सेल निष्कर्षों १.० के ६०० एनएम (ओडी६००) पर एक ऑप्टिकल घनत्व पर काटा कोशिकाओं से तैयार कर रहे हैं । एक 1 एल संस्कृति निकालने के लगभग 2 − 3 मिलीलीटर निकलेगा, जो 25% क्रूड सेल निकालने पर ८०० से अधिक सेल-फ्री प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त है । प्रोटीन प्लाज्मिड डीएनए, रैखिक डीएनए, या एमआरएनए टेम्पलेट का उपयोग करके व्यक्त किया जा सकता है; हालांकि, अंतर्जात नाभिके द्वारा रेखीय डीएनए टेम् पलेट निम्नीकरण का उपयोग करते समय एक प्रमुख खामी बनी रहती है V. natriegens संस्कृतियों से शुरू, अनुप्रवाह अनुप्रयोगों के लिए useable प्रोटीन 1 − 2 पूरे दिन में एक एकल उपयोगकर्ता द्वारा प्राप्त किया जा सकता है ।

Protocol

1. V. natriegens की तैयारी क्रूड सेल अर्क – बैक्टीरियल कल्चर

  1. V. natriegens बैक्टीरियल विकास मीडिया LB-V2 तालिका 1के अनुसार तैयार करें । autoclaving द्वारा विकास मीडिया जीवाणुरहित । मीडिया को कक्ष तापमान (RT) तक पहुंचने की अनुमति दें । अतिरिक्त मीडिया RT पर संग्रहीत है ।
    सावधानी: उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (ppe) पहनें और एक ऑटोक्लेव संचालन करते समय प्रयोगशाला विशिष्ट निर्देशों से परामर्श करें ।
  2. 3 मिलीलीटर पौंड-V2 मीडिया के संरोपण करने के लिए वाइल्ड टाइप V. natriegens के ग्लिसरोल स्टॉक का उपयोग करें । २२५ आरपीएम पर मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बढ़ने ।
  3. 1 मिनट के लिए एक बेंच टॉप अपकेंद्रिप पर १०,६०० एक्स जी पर centrifugation द्वारा रातोंरात संस्कृति के 1 मिलीलीटर धो लें । महाप्राण के परिणामस्वरूप गोली और ताजा पौंड-V2 मीडिया के 1 मिलीलीटर में resuspend परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला ।
  4. एक autoclaved 4 एल में बाँझ कवर के साथ erlenmeyer फ्लास्क, ताजा LB-V2 विकास मीडिया के 1 एल जोड़ें । धोया रातोंरात संस्कृति के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर inoculate (1:1000 कमजोर पड़ने का अनुपात) । २२५ आरपीएम पर मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति बढ़ाएँ ।
    नोट: V. 1:1000 कमजोर पड़ने के अनुपात को बनाए रखते हुए नैरियेजेंस संस्कृतियों को ऊपर या नीचे बढ़ाया जा सकता है । उदाहरण के लिए, धोया रातोंरात संस्कृति के २५० मिलीलीटर के २५० μl जोड़ें एक 2 एल में ताजा पौंड-V2 विकास मीडिया के बाँझ कवर के साथ चकरा erlenmeyer फ्लास्क ।
  5. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर संस्कृति के ओडी६०० पर नजर रखें । जब संस्कृति ओडी६०० = १.० ± ०.२, फसल संस्कृति तक पहुँचता है ३,५०० एक्स जी पर centrifugation के माध्यम से 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर. बर्फ पर जगह गोली ।
    नोट: V. natriegens तेजी से बढ़ता है, तो संस्कृति की बंद निगरानी आवश्यक है । विकास के लिए आयुध डिपो६०० = १.० 1:1000 कमजोर पड़ने के अनुपात में लगभग 1.5 − 2 ज लेना चाहिए ।
  6. सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और तुरंत-८० डिग्री सेल्सियस पर परिणामी बैक्टीरियल गोली की दुकान या सीधे सेल lysis खंड 2 में वर्णित करने के लिए आगे बढ़ना ।
    नोट: यह कदम एक अच्छा रोक बिंदु है; हालांकि, यह सिफारिश की जाती है कि गोली तुरंत संसाधित हो या 1 − 2 दिनों के भीतर सर्वोत्तम परिणामों के लिए ।

2. V. natriegens कच्चे सेल निष्कर्षों की तैयारी – सेल lysis

  1. बाँझ विआयनीकृत में 1 तालिका के अनुसार S30 lysis बफर तैयार (DI) पानी और ७.७ करने के लिए पीएच समायोजित हिमनदीय एसिटिक एसिड का उपयोग.
    सावधानी: glacial एसिटिक एसिड पीएच समायोजित जब उचित ppe के साथ संभाला जाना चाहिए ।
  2. शांत S30 lysis बफर एक रेफ्रिजरेटर में या सेल lysis प्रक्रिया शुरू करने से पहले बर्फ पर लगभग 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ।
    नोट: एक त्वरित शांत नीचे के लिए, lysis बफर-20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है । बफ़र को फ़्रीज़ करने की अनुमति न दें ।
  3. 10 − 20 मिनट या पूरी तरह से गल जाने तक बर्फ पर सेल छर्रों को रखें । सभी छर्रों resuspend एक ही एल संस्कृति से जिसके परिणामस्वरूप ठंडा S30 lysis बफर के 10 मिलीलीटर का उपयोग कर, तो एक ५० मिलीलीटर ट्यूब के लिए स्थानांतरण निलंबन । यदि छर्रों फ्रीजर में-८० डिग्री सेल्सियस पर कदम १.६ में जमे हुए नहीं हैं, सीधे resuspension करने के लिए आगे बढ़ें ।
    नोट: S30 lysis बफर की जरूरत के रूप में शुरू में resuspend छर्रों के लिए इस्तेमाल की मात्रा बढ़ाएं ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ३,५०० एक्स जी पर अपकेंद्रिज निलंबन । पेलेट को परेशान किए बिना महाप्राण को छोडना । एक दूसरी बार ठंडा S30 lysis बफर के 10 मिलीलीटर का उपयोग कर गोली धो लें । बर्फ पर जगह गोली ।
  5. एक ठंडे कमरे में, ५० मिलीलीटर ट्यूब में पेलेट के लिए ठंडा S30 lysis बफर के ५०० μl जोड़ें । एक चौड़े बोर पिपेट टिप का प्रयोग, गोली resuspend और ध्यान से एक 2 मिलीलीटर ट्यूब के लिए पूरे गोली निलंबन हस्तांतरण ।
    नोट: यदि एक व्यापक बोर पिपेट उपलब्ध नहीं है, कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए एक 1 मिलीलीटर पिपेट टिप के अंत में कटौती करने के लिए गोली हस्तांतरण के लिए बोर वृद्धि हुई है ।
    1. काफी मात्रा में वृद्धि के बिना संभव के रूप में ज्यादा गोली के रूप में स्थानांतरण; हालांकि, गोली sonicated होना करने के लिए पर्याप्त तरल में सस्पेंड किया जाना चाहिए, के रूप में 2 मिलीलीटर ट्यूब में एक समरूप निलंबन द्वारा संकेत दिया । 2 मिलीलीटर ट्यूब को अधिक न भरें । निलंबन १.५ मिलीलीटर से अधिक नहीं होना चाहिए; यदि आवश्यक हो तो कई ट्यूबों में विभाजित ।
  6. बर्फ पर सेल पेलेट रखें और ठंडे कमरे में काम करें । बर्फ के साथ एक ६०० मिलीलीटर बीकर भरें और बर्फ के शीर्ष पर एक 2 मिलीलीटर ट्यूब होल्डर रखें
    नोट: यह बीकर के पक्ष के पास ट्यूब धारक जगह करने के लिए उपयोगी है, तो गोली निलंबन sonication प्रगति की निगरानी करने के लिए बर्फ में दिखाई देगा ( चित्रा 1देखें) ।
  7. भंवर 2 मिलीलीटर ट्यूब में गोली निलंबित संक्षेप में कोशिकाओं homogenize, झटका ट्यूबों टोपी के तल पर किसी भी कोशिकाओं को हटाने के लिए, और टोपी के साथ ट्यूब धारक में जगह खुली । निलंबन में कम sonicator टिप इतना है कि यह सिर्फ तरल सतह के नीचे है ।
  8. एक 1/8 इंच टिप व्यास के साथ एक sonicator और जांच का उपयोग कर चित्र 2 में दर्शाया गया के रूप में sonication सेट अप तैयार करें । sonicator नियंत्रण में इनपुट निम्न सेटिंग्स: 20 kHz आवृत्ति और ५०% आयाम, समय पर पल्स: 10 एस, पल्स बंद समय: ६० एस.
  9. तीन चक्रों के लिए पल्स sonication प्रोटोकॉल चलाएँ । यदि पेलेट सस्पेंशन की कुल मात्रा > ५०० μl है, तो पल्स sonication प्रोटोकॉल को छह बार चलाएं ।
    नोट: आम तौर पर, 3 − 6 दालें लाइसे करने के लिए पर्याप्त हैं V. natriegens छर्रों; sonicator के आधार पर अतिरिक्त दालों की आवश्यकता हो सकती है । sonication के दौरान, ट्यूब के नीचे करने के लिए तय हो सकता है कि किसी भी गोली लाइसे करने के लिए जांच को स्थानांतरित करने के लिए समायोजन दस्ता मंच का उपयोग करें । ट्यूब धारक से हटाया जा सकता है और संक्षेप में vortexed को फिर से दालों के बीच में निलंबन homogenize । sonicated कोशिकाओं की वांछित स्थिरता के लिए नीचे चर्चा देखें ।
    सावधानी: sonicator सक्रिय होने पर उचित सुनवाई संरक्षण पहनें ।
  10. sonication के बाद, १६,००० एक्स जी पर अपकेंद्री क्रूड सेल निकालने 30 − 45 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या जब तक lysate किसी भी सेलुलर मलबे से मुक्त है के रूप में चित्र 3में दर्शाया गया है ।
  11. एक ठंडे कमरे में, पेलेट परेशान बिना नई 2 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए परिणामी supernatants के aliquot ५० μl ।
    नोट:
    नई 2 मिलीलीटर ट्यूबों में accidently स्थानांतरित किया जाता है कि किसी भी मलबे तेजी से उच्च उपज प्रोटीन संश्लेषण के लिए निकालने की क्षमता को कम करेगा ।
    1. वैकल्पिक रूप से, एक अलग 2 मिलीलीटर ट्यूब में पोस्ट-lysis प्रोटीन परिमाणन के लिए सेल निकालें के 10 μl को अलग सेट करें (नीचे दिए गए चरण २.१३ देखें) ।
  12. फ्लैश फ्रीज एक सूई स्ट्रिंग के रूप में चित्र 4में चित्रित के साथ एक ट्यूब धारक में ट्यूब रखकर कच्चे सेल के अर्क । एक देवर तरल नाइट्रोजन युक्त में ट्यूब जलमग्न और तुरंत में एक फ्रीजर में जगह-८० ° c उपयोग तक ।
    सावधानी: लैब कोट, सुरक्षा चश्मा, चेहरा ढाल, cryogen एपरन, और दस्ताने सहित तरल नाइट्रोजन से निपटने के लिए उपयुक्त ppe का प्रयोग करें ।
  13. वैकल्पिक रूप से, सेल lysate के कुल प्रोटीन यों तो 10 μl का उपयोग करके कदम 2.11.1 से अलग सेट 1x फास्फेट में नमूना 1:100 पतला-buffered खारा (pbs) और ऐसे ब्रैडफोर्ड परख के रूप में किसी भी मानक कुल प्रोटीन यों तो परख का उपयोग कर, bicinchoninic एसिड परख (बीसीए), आदि ।

3. सेल मुक्त प्रतिक्रिया घटकों की तैयारी

  1. सामान्य प्रतिक्रिया अवयव
    1. ५० मिलीलीटर ट्यूबों में एमजी-ग्लूटामेट और के-ग्लूटामेट के काम के शेयरों को तैयार करें, क्रमशः १०० मिमी और २००० मिमी की सांद्रता पर बाँझ डि पानी के साथ ।
    2. ५०% (w/v) पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी)-८००० के एक काम स्टॉक को एक २५० एमएल बीकर को बाँझ डि पानी के १०० एमएल जोड़कर तैयार करें । बीकर में एक छोटे चुंबकीय उत्तेजक प्लेस । बाहर वजन ५० जी खूंटी-८००० और बीकर में १०० मिलीलीटर पानी के लिए जोड़ें ।
    3. १०० डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक गर्म हलचल थाली पर बीकर प्लेस और खूंटी-८००० जब तक २५० rpm पर हलचल समाधान में है । की अनुमति दें खूंटी-८००० तरल मिश्रण करने के लिए स्थानांतरित करने से पहले शांत करने के लिए ५० मिलीलीटर ट्यूबों.
  2. ऊर्जा समाधान मास्टर मिक्स
    1. कोह छर्रों के १४० जी जोड़कर ५०० मिलीलीटर बाँझ DI पानी के लिए koh के एक 5 मीटर समाधान तैयार करें ।
      सावधानी: एक रासायनिक हुड में इस समाधान को तैयार है और जब मजबूत ठिकानों से निपटने ppe पहनते हैं । समाधान गर्म हो जाएगा तो बोतल कैप दबाव निर्माण को रोकने के लिए ढीला होना चाहिए । उपयोग करने से पहले KOH समाधान को RT तक पहुंचने की अनुमति दें ।
    2. एक १०० मिलीलीटर की बोतल के लिए hepes के २०.८५ जी जोड़कर एक १७५० मिमी hepes-KOH बफर तैयार करें । धीमी गति से बाँझ डि पानी जोड़ें जब तक मात्रा तक पहुँचता है ४० मिलीलीटर. भंवर बोतल hepes भंग करने के लिए । ८.० करने के लिए पीएच को समायोजित करने के लिए 5 एम KOH समाधान का उपयोग करें और फिर ५० एमएल के लिए समाधान की मात्रा लाने के लिए ।
      सावधानी: KOH उचित ppe के साथ संभाला जाना चाहिए जब पीएच समायोजन ।
    3. शेष 10x ऊर्जा मास्टर मिक्स शेयर घटक तालिका में संकेत दिया सांद्रता में 2 बाँझ DI पानी और बर्फ पर प्रत्येक शेयर जगह. १०० मिमी एटीपी, gtp, ctp, और RT पर utp स्टॉक्स और बर्फ पर जगह thaw ।
      नोट: एक thermomixer ३७ डिग्री सेल्सियस और ३५० rpm के लिए सेट अभिकर्मकों को समाधान में भंग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है यदि आवश्यक हो । अधिक गरम न करें या थर्मोमिक्सर पर अभिकर्मकों को समय की विस्तारित अवधि के लिए छोड़ें ।
    4. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में, आदेश और मात्रा तालिका 2में निर्दिष्ट करने के लिए अनुसार प्रत्येक ऊर्जा समाधान मास्टर मिक्स घटक जोड़ें । प्रत्येक घटक जोड़ा जाता है के बाद समाधान भंवर । यह 10x ऊर्जा समाधान मास्टर मिश्रण के 5 मिलीलीटर कर देगा ।
    5. 2 मिलीलीटर ट्यूब में २०० μl aliquots में 10x ऊर्जा समाधान मास्टर मिश्रण फूट डालो । फ्लैश प्रत्येक aliquot के रूप में कदम २.१२ में प्रदर्शन फ्रीज । तुरंत उंहें-८० ° c फ्रीजर में जगह का उपयोग करें ।
  3. एमिनो एसिड मास्टर मिक्स
    1. ताजा 4x एमिनो एसिड मास्टर मिश्रण तैयार करने के लिए, आरटी पर प्रत्येक एमिनो एसिड शेयर विगलन द्वारा शुरू और फिर बर्फ पर प्रत्येक रखने. एक भंवर और/या thermomixer ३७ डिग्री सेल्सियस और ३५० rpm पर सेट का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए सभी एमिनो एसिड शेयरों पूरी तरह से भंग कर रहे हैं ।
      नोट: cysteine पूरी तरह से भंग नहीं हो सकता है; यह एक निलंबन के रूप में एमिनो एसिड मास्टर मिश्रण करने के लिए जोड़ा जा सकता है । अधिक गरम न करें या थर्मोमिक्सर पर अभिकर्मकों को समय की विस्तारित अवधि के लिए छोड़ें ।
    2. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में, बाँझ डि पानी के लिए उपयुक्त मात्रा अमीनो एसिड जोड़ें ताकि प्रत्येक के अंतिम एकाग्रता 8 मिमी निम्नलिखित क्रम में है: ALA, arg, एसीएन, एएसपी, gln, gln, गली, उनके, iie, lys, मिले, PHE, प्रो, सेर, thr, वैल, टीआरपी, tyr , leu, और cys । प्रत्येक एमिनो एसिड जोड़ने के बाद, भंवर मास्टर मिक्स समाधान. मात्रा तालिका 2 में सूचीबद्ध एमिनो एसिड मास्टर मिक्स की २.४ मिलीलीटर कर देगा ।
    3. 2 मिलीलीटर ट्यूबों में २०० μl aliquots में 4x एमिनो एसिड मास्टर मिश्रण फूट डालो । फ्लैश प्रत्येक aliquot के रूप में कदम २.१२ में प्रदर्शन फ्रीज । तुरंत में एक फ्रीजर में जगह-८० ° c उपयोग तक ।
  4. अभिक्रिया-तैयार प्लाज्मिड डीएनए टेम्पलेट का उत्पादन
    नोट: सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति इस प्रणाली में सुपर फ़ोल्डर हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (gfp) अभिव्यक्ति वेक्टर T7-pJL1-sfgfp (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर अनुकूलित किया गया है । यह सेल मुक्त प्रतिक्रिया दक्षता और क्लोनिंग और अन्य प्रोटीन दृश्यों की अभिव्यक्ति के लिए pJL1 रीढ़ के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस प्लाज्मिड उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. अन्य प्लाज्मिड डीएनए टेम्पलेट्स इस्तेमाल किया जा सकता है; तथापि, यह ध्यान रखें कि प्रतिलेखन एक T7 promotion अनुक्रम और T7 आरएनए polymerase की उपस्थिति द्वारा नियंत्रित किया जाता है के लिए महत्वपूर्ण है. परिवर्तित ई. कोलाई से किसी भी प्लाज्मिड डीएनए टेंपलेट के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक सरल प्रोटोकॉल के नीचे वर्णित है ।
    1. निर्माता के निर्देश के अनुसार एक प्लाज्मिड शुद्धि किट का उपयोग वांछित वेक्टर शुद्ध (सामग्री की तालिका).
      नोट: जितना संभव हो प्लाज्मिड डीएनए टेम्पलेट का ध्यान केंद्रित करने से सेल-फ्री प्रतिक्रिया की तंग मात्रा की कमी को पूरा करने की सिफारिश की जाती है । सामान्य तौर पर, 750 − 1500 एनजी/μl कार्य स्टॉक का लक्ष्य रखें ।
  5. अभिक्रिया-तैयार मृणा खाके का उत्पादन
    नोट: यह अनुभाग वैकल्पिक है । प्रोटीन एक्सप्रेशन का परीक्षण किया गया है, जो कि सूचीबद्ध T7 आरएनए पॉलीमरेज़ (सामग्रियों की तालिका) द्वारा प्लाज्मिड T7-pJL1-एसएफजीएफपी के विट्रो ट्रांसक्रिप्शन में से उत्पन्न mrna टेम्पलेट का उपयोग कर रहा है ।
    1. प्लाज्मिड डीएनए से mrna टेंपलेट तैयार ब्याज का प्रोटीन तालिका 3में इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया घटकों का उपयोग कर एंकोडिंग । एक thermocycler में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इंसेबेट प्रतिक्रियाओं ।
      नोट: यह करने के लिए सिफारिश की है 8 − 10x इन प्रतिक्रियाओं के समानांतर में पर्याप्त सामग्री उत्पन्न करने के लिए.
    2. सभी प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं पूल । निर्माता के निर्देश (सामग्री तालिका) के अनुसार एक mrna शोधन और संसांद्रक किट का उपयोग कर शुद्ध । बाँझ DI पानी में elute मृना टेंपलेट । का उपयोग जब तक-८० डिग्री सेल्सियस पर एमएनए टेम्पलेट स्टोर.

4. प्रदर्शन सेल मुक्त प्रोटीन eexpression प्रतिक्रियाओं का उपयोग कर V. natriegens क्रूड निकालें

  1. सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति प्लाज्मिड या रैखिक डीएनए टेंपलेट का उपयोग
    1. निकालें 10x ऊर्जा समाधान मास्टर मिक्स और 4x एमिनो एसिड मास्टर मिक्स aliquots से-८० ° c फ्रीजर, आरटी पर गल, और बर्फ पर जगह. -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर और बर्फ पर जगह से T7 आरएनए पोलीमरेज़ और rnase अवरोधक शेयरों निकालें । आरटी पर thaw डीएनए टेंपलेट और बर्फ पर जगह है ।
    2. तालिका 4 के अनुसार एक सेल मुक्त प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण तैयार करने के लिए निम्नलिखित क्रम में प्रत्येक घटक एक 2 मिलीलीटर ट्यूब के लिए बर्फ पर जोड़कर: एमिनो एसिड मास्टर मिक्स, ऊर्जा समाधान मास्टर मिक्स, एमजी-ग्लूटामेट, कश्मीर-ग्लूटामेट, डीएनए टेम्पलेट, खूंटी-८०००, T7 आरएनए पॉलीमरेज़, और rnase अवरोधक धीरे मास्टर मिश्रण करने के लिए प्रत्येक के अलावा ट्यूब झटका ।
      नोट: यदि रैखिक टेम्पलेट को सेल-मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए उपयोग किया जाना है, तो प्रोटीन की प्रशंसनीय पैदावार प्राप्त करने के लिए प्लाज्मिड टेम्पलेट की तुलना में 5 − 10x अधिक सामग्री जोड़ें ।
    3. निकालें V. natriegens क्रूड सेल lysate से कदम २.१२ में तैयार-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर और 10 − 20 मिनट के लिए बर्फ पर जगह तक thawed । तालिका 4 के अनुसार सेल मुक्त प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण करने के लिए उपयुक्त मात्रा में कच्चे तेल की कोशिका निकालने जोड़ें और धीरे flicking या ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण ।
    4. अंत सूत्री कोशिका मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति thermocycler का उपयोग
      1. एक ९६-या ३८४-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के नीचे करने के लिए सेल मुक्त प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण के पिपेट 10 μl । पीसीआर प्लेट में प्रत्येक स्थानांतरण के बीच में, धीरे ट्यूब flicking द्वारा मास्टर मिश्रण मिश्रण ।
        नोट: सेल मुक्त प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण अच्छी तरह से सभी नमूनों में प्रतिक्रिया reproducibility और सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति को अधिकतम करने के लिए हर समय मिलाया जाना चाहिए ।
    5. संक्षेप में 10 एस के लिए १,००० एक्स जी पर प्लेट सेंट्रेसेज किसी भी मास्टर मिश्रण है कि कुओं के किनारों पर अटक हो सकता है पूल करने के लिए । वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक प्लेट चिपकने वाला कुओं को सील करें और फिर पीसीआर प्लेट को १०५ डिग्री सेल्सियस पर सेट किए गए गर्म ढक्कन के साथ 26 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोसाइक्लियर में रखें ।
      नोट: यहां तक कि गर्मी वितरण और एक thermocycler के गरम ढक्कन बहुत प्रोटीन अभिव्यक्ति पैदावार में सुधार ।
    6. 3 ज की एक ंयूनतम के लिए सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं सेते हैं । ऊष्मायन के बाद, व्यक्त प्रोटीन शुद्ध किया जा सकता है, quantified, और बहाव प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया.
      नोट: व्यक्त प्रोटीन सीधे उपयोगकर्ता की पसंद की एक विधि का उपयोग कर सेल मुक्त प्रतिक्रिया में मात्रा निर्धारित जा सकता है । उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक बाहरी मानक वक्र का उपयोग कर मात्रा निर्धारित जा सकता है या रेडियोधर्मिता अगर सेल मुक्त प्रतिक्रिया में एक radiolabeled एमिनो एसिड का उपयोग कर मापा जा सकता है. यूवी दृश्य स्पेक्ट्रोस्कोपी या कुल प्रोटीन assays आम तौर पर सीधे एक प्रारंभिक शुद्धि के बिना सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं में प्रोटीन उत्पादन को मापने के लिए सिफारिश नहीं कर रहे हैं ।
    7. वैकल्पिक रूप से, मॉनिटर सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति कैनेटीक्स एक थाली रीडर का उपयोग कर ।
      1. पिपेट 10 μl सेल-मुक्त प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण के नीचे करने के लिए एक काला ३८४-अच्छी तरह से साफ गिलास नीचे से परख थाली । बर्फ पर परख थाली रखें या एक ठंडे कमरे में काम करते हुए मास्टर मिक्स जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें कि पूर्ण काइनेटिक प्रोफ़ाइल प्राप्त की है । सील एक स्पष्ट थाली चिपकने वाला के साथ कुओं वाष्पीकरण को रोकने के लिए और फिर एक थाली 26 डिग्री सेल्सियस पर सेट रीडर में परख थाली जगह है ।
    8. व्यक्त प्रोटीन के अनुरूप उपयुक्त फ्लोरोसेंट उत्तेजन/उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य की निगरानी करते हुए 3 − 6 ज के लिए सेल-फ्री प्रतिक्रियाओं को सेते हैं । उदाहरण के लिए, पूर्व में मॉनिटर/Em = ४८५ एनएम/528 एनएम sfgfp के लिए ।
  2. सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति mrna टेंपलेट का उपयोग
    1. गल mrna आर टी और बर्फ पर जगह पर 3.5.2 कदम में तैयार टेंपलेट ।
    2. चरण 4.1.6 चरण के माध्यम से 4.1.1 के रूप में पहले रेखीय या प्लाज्मिड डीएनए टेंपलेट के लिए निर्दिष्ट तालिका 4 का उपयोग करने के लिए एक वैकल्पिक सेल-mrna टेंपलेट के लिए मुक्त प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण तैयार करते हैं ।

5. V. natriegens सेल के अंशांकन-sfgfp के साथ नि: शुल्क प्रतिक्रियाओं

नोट: यह अनुभाग वैकल्पिक है । इष्टतम सेल मुक्त प्रतिक्रिया आयन एकाग्रता थोड़ा प्रत्येक कच्चे तेल निकालने के लिए सेल lysis के लिए इस्तेमाल किया शर्तों के आधार पर तैयार करने के लिए भिंन हो सकते हैं । वैकल्पिक सेल मुक्त प्रतिक्रिया आयन अंशांकन sfgfp का उपयोग नीचे वर्णित प्रोटोकॉल प्रदर्शन पर विचार करें यदि प्रतिक्रिया पैदावार की अपेक्षा काफी कम कर रहे है (सांद्रता < १.० μg/एमएल) ।

  1. मिलीग्राम2 + और k+ आयन अंशांकन समाधान के रूप में तालिका 5 में निर्दिष्ट के रूप में १०० मिमी मिलीग्राम-ग्लूटामेट और २,००० मिमी K-ग्लूटामेट शेयर 3.1.1 कदम में तैयार से बाँझ DI पानी में तैयार. जरूरत होने तक बर्फ पर अंशांकन समाधान रखें ।
  2. तालिका 6 में अंशांकन मानचित्र के बाद, मिलीग्राम-ग्लूटामेट के 1 μl और K-ग्लूटामेट आयन अंशांकन समाधान के 2 μl में उपयुक्त कुओं में एक ३८४-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट ।
    1. इस चरण के संचालन का क्रम निम्नानुसार है: पिपेट मिलीग्राम-ग्लूटामेट आयन अंशांकन समाधान के नीचे में एक अच्छी तरह से कश्मीर द्वारा पीछा किया-ग्लूटामेट आयन अंशांकन समाधान के पक्ष में ठीक से पहले ही कुएं में मौजूद तरल को छूने के बिना.
    2. अंशांकन सेल मुक्त प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण की तैयारी करते हुए वाष्पीकरण को रोकने के लिए थाली के शीर्ष पर एक चिपकने वाला रखकर कुओं को सील. धीरे मिलीग्राम-और कश्मीर-ग्लूटामेट अंशांकन समाधान मिश्रण करने के लिए ३८४-well प्लेट नल.
      नोट: एक पुनरावर्तक पिपेट अत्यधिक और शीघ्रता से इस चरण को पूरा करने के लिए अनुशंसित है ।
  3. एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में T7-pJL1-sfgfp प्लाज्मिड डीएनए टेम्पलेट का उपयोग कर तालिका 5 में निर्दिष्ट के रूप में अंशांकन सेल मुक्त प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण तैयार करें । मास्टर मिक्स करने के लिए निम्न क्रम में प्रत्येक घटक जोड़ें: एमिनो एसिड मास्टर मिक्स, ऊर्जा समाधान मास्टर मिक्स, T7-pJL1-sfgfp डीएनए टेम्पलेट, खूंटी-८०००, T7 आरएनए पॉलीमरेज़, और rnase अवरोधक. धीरे से प्रत्येक घटक के अलावा मिश्रण करने के लिए ट्यूब झटका ।
    नोट: मिलीग्राम2 + या K+ अंशांकन सेल मुक्त मास्टर मिश्रण करने के लिए जोड़ नहीं है.
  4. थाली से चिपकने वाला निकालें । ध्यान से पिपेट 7 μl अंशांकन सेल-मुक्त प्रतिक्रिया मास्टर के कुओं में पहले से ही मौजूद मिश्रित आयन अंशांकन समाधान को छूने के बिना कुएं के किनारों पर मिश्रण । चिपकने के साथ कुओं reseal और धीरे आयन अंशांकन समाधान के साथ सेल मुक्त मास्टर मिश्रण मिश्रण करने के लिए ३८४-well पीसीआर प्लेट नल.
    नोट: एक पुनरावर्तक पिपेट अत्यधिक और शीघ्रता से इस चरण को पूरा करने के लिए अनुशंसित है ।
  5. संक्षेप में यह प्लेट १,००० एक्स जी के लिए 10 एस के लिए पूल किसी भी अमिश्रित तरल है कि हो सकता है कुओं के किनारों पर अटक गया है । १०५ डिग्री सेल्सियस पर सेट एक गर्म ढक्कन के साथ 26 डिग्री सेल्सियस पर एक thermocycler सेट में ३८४-अच्छी तरह थाली रखें ।
  6. 3 ज के लिए सेल-फ्री प्रतिक्रियाओं को सेते हैं । ऊष्मायन के बाद, एक अच्छी तरह से एक काले ३८४-अच्छी तरह से परख प्लेट के लिए एक बहु चैनल पिपेट के साथ कांच के साथ की सामग्री हस्तांतरण और पूर्व में sfgfp की प्रतिदीप्ति पढ़ें/Em = ४८५ एनएम/528 एनएम एक थाली पाठक का उपयोग करने आयन एकाग्रता संयोजन है कि निर्धारित करने के लिए प्रोटीन की सबसे अधिक मात्रा में पैदावार ।

Representative Results

वी. natriegens सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग कर प्रोटीन उत्पादन के लिए वर्णित प्रोटोकॉल 1 − 2 दिनों में एक एकल उपयोगकर्ता द्वारा निष्पादित किया जा सकता है, संस्कृति के टीका से शुरू करने के लिए बहाव अनुप्रयोगों के लिए उपलब्ध प्रोटीन । क्रूड सेल निष्कर्षों और मास्टर मिक्स शेयरों की तैयारी इस समय का एक महत्वपूर्ण हिस्सा शामिल; हालांकि, एक बार तैयार, सबसे थोक अभिकर्मकों को लंबे समय तक संग्रहीत किया जा सकता है (तालिका 7) और जरूरत के रूप में इस्तेमाल किया, प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए आवश्यक वक्त छोटा.

वर्णित अभिव्यक्ति प्रणाली सबसे अच्छा प्लाज्मिड डीएनए टेम्पलेट या एमएनए विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाओं में द्वारा उत्पन्न के साथ प्रयोग किया जाता है । जबकि रैखिक डीएनए भी प्रोटीन उत्पादन के लिए टेंपलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, यह प्रोटीन की काफी कम मात्रा में पैदावार । उदाहरण के लिए, 26 डिग्रीसेल्सियस पर इष्टतम प्रतिक्रियाओं की स्थिति में, एक एकल 10 μl सेल-मुक्त प्रतिक्रिया का उत्पादन कर सकते हैं > २६० μg/मिलीलीटर sfgfp का उपयोग कर 3 घंटे में ०.३ pmol के प्लाज्मिड डीएनए टेम्पलेट या एक तुलनीय > १२५ μg/एमएल का उपयोग कर 14 pmol के mrna ट्रांसक्रिप्ट , ख). हालांकि, रैखिक डीएनए के ०.३ pmol काफी कम प्रोटीन का उत्पादन होगा (< 20 μg/एमएल) । प्रत्येक टेम्पलेट प्रकार के लिए, प्रोटीन का बहुमत 1 − 1.5 h के भीतर उत्पादित किया जाएगा; हालांकि, यह अनुशंसित है कि प्रतिक्रिया न्यूनतम 3 घंटे के लिए चलाया जाता है । सेल मुक्त रिएक्शन sfgfp की सांद्रता रैखिक प्रतिगमन के माध्यम से निर्धारित किया गया एक शुद्ध sfgfp मानक वक्र पूर्व में प्रतिदीप्ति को मापने का उपयोग कर = ४८५ एनएम/528 एनएम ।

प्रोटीन उत्पादन की उपज काफी पोटेशियम और मैग्नीशियम आयनों की एकाग्रता से प्रभावित है (K+ और मिलीग्राम2 +, क्रमशः). अनुकूलित शर्तों के तहत, यह पाया गया कि इष्टतम मिलीग्राम2 + और K+ आयन सांद्रता होगा ३.५ मिमी और ८० मिमी, क्रमशः (चित्रा 6a, बी). इष्टतम आयन सांद्रता से विचलन सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली के लिए एक घटी हुई क्षमता में परिणाम के लिए प्रशंसनीय पैदावार के साथ प्रोटीन का उत्पादन हो सकता है । अतिरिक्त अंशांकन आवश्यक हो सकता है अगर प्रतिक्रिया पैदावार उम्मीद से काफी कम कर रहे हैं. आयन अंशांकन के लिए एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल खंड 5 में वर्णित है । यह एक अलग सेल lysis उपकरण और शर्तों से किए गए क्रूड सेल निकालने परिवर्तनशीलता के लिए प्रतिकारी में कुछ लचीलापन के लिए अनुमति देता है ।

Figure 1
चित्रा 1: sonication मंच पर बीकर और ट्यूब धारक के एक करीबी दृश्य । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: क्रूड सेल निकालने की तैयारी के लिए Sonication उपकरण सेटअप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: sonication और अपकेंद्रीकरण के बाद गोली का एक दृश्य । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: निकालने के भंडारण के लिए फ्लैश ठंड डुबकी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: V. natriegens के लिए प्रतिनिधि परिणाम सेल-नि: शुल्क प्रोटीन संश्लेषण विभिन्न प्रकार के टेम्पलेट का उपयोग कर. () प्लाज्मिड और रैखिक डीएनए टेम्पलेट (०.३ pmol) के equimolar सांद्रता का उपयोग करते हुए sfgfp उत्पादन का समापन बिंदु परख और साथ ही mrna टेम्पलेट की सांद्रता में वृद्धि. सेल मुक्त sfgfp एकाग्रता शुद्ध sfgfp के एक मानक वक्र का उपयोग कर निर्धारित किया गया था पूर्व में मापा/Em = ४८५ एनएम/528 एनएम ऊष्मायन के १८० मिनट के बाद 26 डिग्री सेल्सियस पर इष्टतम प्रतिक्रिया शर्तों में 10 μl मात्रा में । () प्लाज्मिड और रैखिक डीएनए टेंपलेट के equimolar सांद्रता का उपयोग कर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से mrna टेंपलेट की सांद्रता बढ़ाने sfgfp उत्पादन की गतिज परख । sfgfp माप पूर्व में हर 3 मिनट में लिया गया था/EM = ४८५ एनएम/528 एनएम पर कुल ऊष्मायन समय के १८० मिनट 10 μl मात्रा में इष्टतम प्रतिक्रिया की स्थिति में । समापन बिंदु और काइनेटिक assays दोनों के लिए, नमूने खाली थे सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं का उपयोग कर टेंपलेट को छोड़कर सभी घटकों के साथ पूरक । माध्य और मानक विचलन (n = 3) दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: आयन एकाग्रता अंशांकन के लिए प्रतिनिधि परिणाम. () वि. स. नेरियेजेंस सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं मिलीग्राम की सांद्रता में वृद्धि के साथ पूरक थे2 + और के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर incubated १८० 10 μl प्रतिक्रियाओं में मिनट. K+ की कुल एकाग्रता सभी मिलीग्राम2 + सांद्रता के लिए १६० मिमी था. सेल मुक्त sfgfp एकाग्रता शुद्ध sfgfp के एक मानक वक्र का उपयोग कर निर्धारित किया गया था पूर्व में मापा/ () V. natriegens सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं के बढ़ते सांद्रता के साथ पूरक थे+ और 10 μl प्रतिक्रियाओं में १८० मिनट के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर incubated. एमजी 2 की कुल एकाग्रता+ सभी K+ सांद्रता के लिए ३.५ मिमी था. दोनों कैलिब्रेशन के लिए, नमूने खाली थे कक्ष मुक्त प्रतिक्रियाओं का उपयोग कर टेंपलेट को छोड़कर सभी घटकों के साथ पूरक । माध्य और मानक विचलन (n = 3) दिखाए जाते हैं । यह आंकड़ा wiegand एट अल.9से संशोधित किया गया है । wiegand, शलया, ली, एच एच, ostrov, एन, चर्च, G.M. से अनुमति के साथ reprinted एक सेल मुक्त vibrio natriegens अभिव्यक्ति प्रणाली की स्थापना । ACS सिंथेटिक जीव विज्ञान. 7 (10), 2475 − 2479 (२०१८) । कॉपीराइट २०१८ अमेरिकी रासायनिक सोसायटी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

तालिका 1 A LB-V2 बैक्टीरियल ग्रोथ मीडिया की तैयारी
घटक मात्रा (छ) अंतिम एकाग्रता (मिमी) अंतिम खंड (एल)
पौंड शोरबा (मिलर) 25 1
Nacl ११.६९ २००
mgcl2 २.२० २३.१
KCl ०.३१ ४.२
तालिका 1 B S30A lysis बफर की तैयारी
घटक मात्रा (छ) अंतिम एकाग्रता (मिमी) अंतिम खंड (एल)
Tris समाधान (pH ८.०)-1 M (mL) * 25 ५० ०.५
मिलीग्राम-ग्लूटामेट २.७२ 14
K-ग्लूटामेट ६.१० ६०
डाइथायोथ्रिटॉल (डीटीटी)-1 मी (एमएल) * 1 2

तालिका 1: LB-V2 बैक्टीरियल विकास मीडिया और S30A के एल के 1 l की तैयारी के लिए अभिकर्मकों के ०.५ सेल lysis बफ़र । इस फ़ाइल को Excel में डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । 

10x ऊर्जा समाधान मास्टर मिक्स की तैयारी
घटक स्टॉक एकाग्रता (मिमी) अंतिम एकाग्रता (मिमी) मात्रा (μl) अंतिम मात्रा (μl)
हेप्स-कोह पीएच 8 १७५० ५०० १४२८.५७ ५०००
एटीपी १०० 15 ७५०.००
Gtp १०० 15 ७५०.००
Ctp १०० 9 ४५०.००
Utp १०० 9 ४५०.००
ई. कोलाई mre ६०० से trna (एमजी/ १०० 2 १००.००
सहएंजाइम एक हाइड्रेट २०० २.६ ६५.००
Nad २०० ३.३ ८२.५०
शिविर ६५० ७.५ ५७.६९
फोलिनिक अम्ल १०० ०.७ ३५.००
स्पर्मिडीन १६०० 10 ३१.२५
3-पीजीए २००० ३०० ७५०.००
बाँझ विआयनित जल ४९.९९
4x एमिनो एसिड मास्टर मिक्स की तैयारी
घटक स्टॉक एकाग्रता (मिमी) अंतिम एकाग्रता (मिमी) मात्रा (μl) अंतिम मात्रा (μl)
Ala १६८ 8 ११४.३ २४००
Arg १६८ 8 ११४.३
Asn १६८ 8 ११४.३
Asp १६८ 8 ११४.३
gln १६८ 8 ११४.३
ग्लू १६८ 8 ११४.३
गली १६८ 8 ११४.३
उसका १६८ 8 ११४.३
आईआईई १६८ 8 ११४.३
Lys १६८ 8 ११४.३
मिले १६८ 8 ११४.३
Phe १६८ 8 ११४.३
प्रो १६८ 8 ११४.३
Ser १६८ 8 ११४.३
Thr १६८ 8 ११४.३
Val १६८ 8 ११४.३
टीआरपी १६८ 8 ११४.३
TYR १६८ 8 ११४.३
लियू १४० 8 १३७.१
cys १६८ 8 ११४.३
बाँझ विआयनित जल ९१.४

तालिका 2:10x ऊर्जा समाधान मास्टर मिक्स और 4x एमिनो एसिड मास्टर मिक्स की २.४ मिलीलीटर की 5 मिलीलीटर की तैयारी के लिए अभिकर्मकों ।    इस फ़ाइल को Excel में डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

T7 आरएनए पॉलीमरेज़ इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाओं
घटक स्टॉक (मिमी) अंतिम एकाग्रता (मिमी) मात्रा (μl) 1x अभिक्रिया मात्रा (μl) 50x प्रतिक्रियाओं
10x rnapol प्रतिक्रिया बफर १.०० ५०
एटीपी १०० ०.५ ०.१० 5
Gtp १०० ०.५ ०.१० 5
Ctp १०० ०.५ ०.१० 5
Utp १०० ०.५ ०.१० 5
डीएनए टेंपलेट (एनजी/ १००० ५०० ०.५० 25
T7 आरएनए पॉलीमेरेज़ २०० २.६ २.०० १००
्नेस अवरोधक, मूरीन २०० ३.३ ०.५० 25
बाँझ विआयनित जल १५.६० ७८०
रिएक्शन वॉल्यूम (μl): 20

तालिका 3: एमआरएनए पीढ़ी के लिए विट्रो ट्रांसक्रिप्शन घटकों में ।    इस फ़ाइल को Excel में डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

सेल-फ्री रिएक्शन मास्टर मिक्स
घटक स्टॉक एकाग्रता (मिमी) अंतिम एकाग्रता (मिमी) मात्रा (μl) 1x अभिक्रिया मात्रा (μl) 50x प्रतिक्रियाओं
निकालें (%) * 25 २.५० १२५.००
मिलीग्राम-ग्लूटामेट १०० ३.५ ०.३५ १७.५०
K-ग्लूटामेट २००० ८० ०.४० २०.००
4x एमिनो एसिड मास्टर मिक्स ८.० 2 २.५० १२५.००
10x ऊर्जा समाधान मास्टर मिक्स १.०० ५०.००
प्लाज्मिड डीएनए (एनजी/ १००० ५०० ०.५० २५.००
५०% खूंटी-८००० (%) ५० 2 ०.४० २०.००
T7 आरएनए पॉलीमेरेज़ १.०० ५०.००
्नेस अवरोधक, मूरीन ०.१० ५.००
बाँझ विआयनित जल १.२५ ६२.५०
रिएक्शन वॉल्यूम (μl): 10
वैकल्पिक सेल मुक्त प्रतिक्रिया एमएनए टेंपलेट के लिए मास्टर मिक्स
घटक स्टॉक एकाग्रता (मिमी) अंतिम एकाग्रता (मिमी) मात्रा (μl) 1x अभिक्रिया मात्रा (μl) 50x प्रतिक्रियाओं
निकालें (%) * 25 २.५० १२५.००
मिलीग्राम-ग्लूटामेट १०० ३.५ ०.३५ १७.५०
K-ग्लूटामेट २००० ८० ०.४० २०.००
4x एमिनो एसिड मास्टर मिक्स ८.० 2 २.५० १२५.००
10x ऊर्जा समाधान मास्टर मिक्स १.०० ५०.००
mrna टेंपलेट (एनजी/ २००० ४००० २.०० १००.००
५०% खूंटी-८००० (%) ५० 2 ०.४० २०.००
्नेस अवरोधक, मूरीन ०.१० ५.००
बाँझ विआयनित जल ०.७५ ३७.५०
रिएक्शन वॉल्यूम (μl): 10

तालिका 4: ऑप्टिमाइज़ की गई V. natriegens सेल-डीएनए टेंपलेट और mrna टेंपलेट के लिए नि: शुल्क प्रतिक्रिया मास्टर मिक्स के अवयव ।    इस फ़ाइल को Excel में डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

एमजी 2 + अंशांकन मात्रा (μl) 1x अभिक्रिया मात्रा (μl) 1x अभिक्रिया मात्रा (μl) 100x प्रतिक्रियाओं मात्रा (μl) 100x प्रतिक्रियाओं
अंतिम (मिमी) भंडार १०० मिमी मिलीग्राम-glu दीडीह 2 0 १०० मिमी मिलीग्राम-glu विआयनित एच2
२.५ 0 ०.०० १.०० 0 १००
३.५ 1 ०.१० ०.९० 10 ९०
४.५ 2 ०.२० ०.८० 20 ८०
५.५ 3 ०.३० ०.७० 30 ७०
रिएक्शन वॉल्यूम (μl): 10
+ अंशांकन मात्रा (μl) 1x अभिक्रिया मात्रा (μl) 1x अभिक्रिया मात्रा (μl) 100x प्रतिक्रियाओं मात्रा (μl) 100x प्रतिक्रियाओं
अंतिम (मिमी) भंडार २००० मिमी K-glu दीडीह 2 0 २००० मिमी K-glu विआयनित एच2
४० 30 ०.१५ १.८५ 12 १४८
८० ७० ०.३५ १.६५ 28 १३२
१६० १५० ०.७५ १.२५ ६० १००
३२० ३१० १.५५ ०.४५ १२४ ३६
रिएक्शन वॉल्यूम (μl): 10
आयन अंशांकन सेल-नि: शुल्क प्रतिक्रिया मास्टर मिक्स
घटक स्टॉक एकाग्रता (मिमी) अंतिम एकाग्रता (मिमी) मात्रा (μl) 1x अभिक्रिया मात्रा (μl) 50x प्रतिक्रियाओं
निकालें (%) * 25 २.५० १२५.००
मिलीग्राम-ग्लूटामेट चर चर १.०० ५०.००
K-ग्लूटामेट चर चर २.०० १००.००
4x एमिनो एसिड मास्टर मिक्स ८.० 2 २.५० १२५.००
10x ऊर्जा समाधान मास्टर मिक्स १.०० ५०.००
प्लाज्मिड डीएनए (एनजी/ १००० २५० ०.२५ १२.५०
५०% खूंटी-८००० (%) ५० 2 ०.४० २०.००
T7 आरएनए पॉलीमेरेज़ १.०० ५०.००
्नेस अवरोधक, मूरीन ०.१० ५.००
बाँझ विआयनित जल ०.०० ०.००
रिएक्शन वॉल्यूम (μl): 10

तालिका 5: आयन एकाग्रता अंशांकन मास्टर घोला जा सकता है.    इस फ़ाइल को Excel में डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

CF आयन अंशांकन मानचित्र ४० मिमी K+ ८० मिमी K+ १६० मिमी K+ ३२० मिमी K+
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
२.५ एमएम एमजी2 +
३.५ एमएम एमजी2 + बी
४.५ एमएम एमजी2 + सी
५.५ एमएम एमजी2 + डी

तालिका 6: आयन अंशांकन नक्शा.    इस फ़ाइल को Excel में डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

भंडारण की स्थिति और CF घटकों के शेल्फ जीवन
घटक संग्रहण स्थान शेल्फ जीवन
बाँझ पौंड-V2 विकास मीडिया 4 ° c 3-6 महीने
V. नैरियेजेंस क्रूड सेल निकालें -८० डिग्री सेल्सियस 1-3 सप्ताह
१०० मिमी मिलीग्राम-ग्लूटामेट कक्ष अस्थायी 6 महीने
२००० मिमी K-ग्लूटामेट कक्ष अस्थायी 6 महीने
५०% खूंटी-८००० कक्ष अस्थायी 6 महीने
10x ऊर्जा समाधान मास्टर मिक्स -८० डिग्री सेल्सियस 3-6 महीने
4x एमिनो एसिड मास्टर मिक्स -८० डिग्री सेल्सियस 3-6 महीने
प्लाज्मिड/रैखिक डीएनए टेम्पलेट -20 डिग्री सेल्सियस 6-12 महीने
मृणा खाके -८० डिग्री सेल्सियस 3-4 सप्ताह

तालिका 7: सेल मुक्त भंडारण की स्थिति और शेल्फ रहता है ।    इस फ़ाइल को Excel में डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित किया गया है वाइल्ड-प्रकार V. natriegens और बैक्टीरियल विकास मीडिया के शामिल पौंड का पूरक V2 लवण के साथ (सामग्री की तालिका). V. natriegens के अन्य उपभेदों इसी तरह सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं के लिए कच्चे तेल के अर्क उत्पन्न करने के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है; हालांकि, उनके उपयोग इस प्रोटोकॉल के अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता है । इसके अतिरिक्त, इस सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग कर अनुकूलित किया गया है 3-फ़ॉस्फोग्लिसरिक एसिड (3-पीजीए) प्राथमिक ऊर्जा उत्थान स्रोत के रूप में । अन्य ऊर्जा पुनर्जनन स्रोतों का उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, अभिकर्मकों और अंशांकन के अनुकूलन की संभावना उच्च उपज प्रोटीन अभिव्यक्ति10,11प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो जाएगा ।

इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरणों के लिए विशेष ध्यान उच्च उपज सेल मुक्त प्रोटीन उत्पादन के लिए अधिकतम निकालने उत्पादकता सुनिश्चित करेगा । सबसे पहले, क्रूड सेल निकालने V. natriegens कोशिका संस्कृतियों के विकास के एक मध्य घातीय चरण में काटा से तैयार किया जाना चाहिए; प्रोटीन उपज अधिक से अधिक है जब संस्कृतियों एक OD६०० = १.० ± ०.२ तक पहुंचने । जबकि सेल मुक्त प्रोटीन उत्पादन ऑप्टिकल घनत्व की एक सीमा पर काटा कोशिकाओं से संभव है, हम पहले से पाया है कि कोशिकाओं की वृद्धि उपज की एक घातीय राज्य में काफी अधिक प्रोटीन9काटा । क्रूड सेल निकालने के प्रदर्शन पर ऑप्टिकल घनत्व के मनाया प्रभाव उन के साथ संगत कर रहे है अंय सेल मुक्त अभिव्यक्ति बैच संस्कृति की स्थिति में वृद्धि हुई कोशिकाओं से व्युत्पंन सिस्टम के लिए रिपोर्ट1। क्योंकि वी natriegens एक तीव्र दर से बढ़ता है, यह बारीकी से ' संस्कृतियों ऑप्टिकल घनत्व की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है । सामान्य तौर पर, यह उम्मीद की जाती है कि वी. नेरिएजेंस संस्कृतियों को इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए 1 − 1.5 h के भीतर १.० के ओडी६०० तक पहुंचने का पुनरुत्पाद करना चाहिए; हालांकि, व्यक्तिगत विकास की स्थिति जैसे चकित बनाम गैर-चकित flasks का उपयोग, जो aeration को प्रभावित करता है, या हवा बनाम पानी ऊष्मायन, जो दर और ऊष्मायन तापमान की स्थिरता को प्रभावित करता है, विकास के समय को बदल सकता है । इसके अलावा, यह आम तौर पर संस्कृति के लिए सिफारिश की है एक 1 एल में सबसे कम २५० मिलीलीटर V. natriegens के चकरा हुआ फ्लास्क आसान हेरफेर और हस्तांतरण के लिए फसल पर एक बड़ी कोशिका गोली सुनिश्चित करने के लिए । यह बहुत कच्चे तेल निकालने की तैयारी की सफलता में सुधार के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक गोली से उत्पादित निकालने की कुल मात्रा बढ़ जाती है. छोटे पैमाने पर तैयारी का उपयोग करते समय, संस्कृति की स्थिति और अभिकर्मकों उचित रूप से समायोजित किया जा सकता है. बड़े पैमाने पर किण्वन के लिए, संस्कृति की स्थिति के आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है । अंत में, उच्च प्रोटीन उपज सुनिश्चित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि सेल छर्रों को कटाई के तुरंत बाद संसाधित किए जाते हैं, या 1 − 2 दिनों के भीतर-८० डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए ।

नाड़ी sonication द्वारा सेल गोली का उचित lysis सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है और अक्सर नए उपयोगकर्ताओं के लिए इस प्रोटोकॉल का सबसे कठिन पहलू है । आमतौर पर, एक अच्छी तरह से लीजड ड गोली तरल निकालने की एक महत्वपूर्ण मात्रा है कि मलबे से मुक्त है उपज जाएगा । निकालने के लिए थोड़ा चिपचिपा होना चाहिए, लेकिन आसानी से जब भंडारण ट्यूबों में तरल नाइट्रोजन में फ्लैश ठंड से पहले aliquoting पाइपटित किया जा सकता है । चित्रा 3 एक अच्छी तरह से लीजड ड गोली (चित्रा3a) के बाद एक खराब लीजड ड गोली की तुलना में दर्शाया गया है (चित्रा3a) पोस्ट के बाद lysis centrifugation कदम । पूरा सेल lysis का एक प्रमुख संकेत एक कच्चे तेल की कोशिका निकालने कुल प्रोटीन एकाग्रता > 20 मिलीग्राम/एमएल के रूप में एक कुल प्रोटीन परख द्वारा निर्धारित (चरण २.१३) । क्रूड सेल निकालने के अधिक sonication या अत्यधिक हीटिंग सेलुलर मशीनरी, जो एक सेल मुक्त प्रतिक्रिया प्रदर्शन के बिना निर्धारित नहीं किया जा सकता है नुकसान होगा । इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण समय और downstream प्रोटीन अभिव्यक्ति अनुप्रयोगों के लिए प्रयास समर्पित करने से पहले एक नियंत्रण प्रतिक्रिया के साथ निकालने दक्षता का परीक्षण करने के लिए बेहद फायदेमंद है. जबकि अतिरिक्त अनुकूलन अलग sonication उपकरण के लिए आवश्यक हो सकता है, पल्स sonication चरणों का वर्णन किया गया है हमारे हाथ में अत्यधिक reproducible ।

पीसीआर प्रवर्धन, प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट, या वाणिज्यिक जीन संश्लेषण से व्युत्पन्न रेखीय डीएनए टेम्पलेट का उपयोग सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली24में उच्च थ्रूपुट और तेजी से प्रोटीन उत्पादन के लिए क्षमता को काफी बढ़ा सकता है । जबकि पीसीआर प्रवर्धित रैखिक टेंपलेट से प्रोटीन उत्पादन का प्रदर्शन किया गया है, इन प्रतिक्रियाओं की उपज लगभग १३.५ है-equimolar अनुपात9में प्लाज्मिड डीएनए टेंपलेट का उपयोग प्रतिक्रियाओं की तुलना में कम गुना । यह मुख्य रूप से रैखिक डीएनए टेम्पलेट की अस्थिरता की वजह से है जो वी. नेट्रिजंस क्रूड सेल निकालने में मौजूद अंतर्जात नाभिको द्वारा नीचा होने की संभावना है । जबकि लैम्ब्डा फैज प्रोटीन gams पहले रैखिक डीएनए टेंपलेट की रक्षा के लिए इस्तेमाल किया गया है24,25, यह वी के साथ असंगत होना पाया गया था natriegens अर्क9. इसके अतिरिक्त, जबकि रैखिक डीएनए टेम्पलेट की एकाग्रता में वृद्धि एक उच्च प्रोटीन उपज के लिए अनुमति दे सकता है, क्रूड सेल निकालने में अपनी तेजी से गिरावट अभी भी एक बड़ी समस्या होगी.

रेखीय डीएनए टेंपलेट गिरावट पर काबू पाने के लिए एक समाधान के लिए सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं के साथ एमएनए रैखिक डीएनए के विट्रो प्रतिलेखन में उत्पंन टेंपलेट के पूरक हो सकता है । दूसरी ओर, एक rnase अवरोधक का उपयोग एमआरएनए ट्रांसक्रिप्ट क्षरण के खिलाफ महत्वपूर्ण सुरक्षा प्रदान करता है और प्रशंसनीय प्रोटीन पैदावार 10 μl सेल-फ्री रिएक्शन फॉर्मेट (चित्रा 5a, B) में प्राप्त किया जा सकता है । रैखिक डीएनए की क्लोनिंग टीए ligation, topo क्लोनिंग, गोल्डन गेट असेंबली, या अन्य पुनर्योजन तरीकों के माध्यम से एक परिपत्र टेम्पलेट में टेम्पलेट क्षरण को दरकिनार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । फिर भी, nuclease गतिविधि के निषेध के लिए और अधिक दृष्टिकोण कुशल प्रोटीन अभिव्यक्ति रैखिक डीएनए टेम्पलेट का उपयोग करने के लिए आवश्यक हो जाएगा.

तिथि करने के लिए, सेल मुक्त प्रोटीन अभिव्यक्ति9,10,11,26के लिए कच्चे तेल निकालने की तैयारी के लिए कई विभिन्न दृष्टिकोणों का प्रस्ताव किया गया है । इस प्रोटोकॉल को विकसित करने में, हम उपयोगकर्ता पहुंच को अधिकतम करने की मांग की, समग्र लागत को कम करने, और समय लेने वाले कदम कम । उदाहरण के लिए, एक उच्च प्रोटीन उपज एक सरल दो कदम sonication-centrifugation प्रक्रिया का उपयोग कर हासिल की है, और सेल homogenizers, लंबा डायलिसिस कदम या रन-ऑफ प्रतिक्रिया की आवश्यकता नहीं है । यह समय की एक छोटी अवधि में निष्पादित करने के लिए सरल है और प्रयोगशाला विशेषज्ञता के उच्च स्तर की आवश्यकता नहीं है । इस प्रकार, यह शोधों अकादमिक अनुसंधान और औद्योगिक प्रक्रिया डिजाइन के लिए एक मानक के रूप में सेल मुक्त अभिव्यक्ति की सुविधा में मदद कर सकते हैं ।

इस प्रोटोकॉल की जांच और V. natriegens, अद्वितीय जैविक गुणों के साथ एक गैर मॉडल जीव की उपयोगिता के लिए उपलब्ध टूलकिट फैलता है । उच्च प्रोटीन उपज अर्द्ध या पूरी तरह से सतत सेल मुक्त प्रतिक्रियाओं को रोजगार द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, ऊर्जा उत्थान के लिए अनुमति देने के लिए, अमीनो एसिड की reआपूर्ती, और अपशिष्ट उत्पादों को हटाने3,5,27। इसके अलावा, जंगली-प्रकार V. natriegens के इंजीनियरिंग dnase उत्पादन करने के लिए-या rnase कमी उपभेदों, हानिकारक और प्रतिस्पर्धा चयापचय रास्ते को हटाने, और अतिरिक्त trnas की अभिव्यक्ति बहुत में प्रोटीन के उत्पादन में वृद्धि कर सकता यह प्रणाली२८,२९. जैसा कि हम अपनी तेजी से विकास अंतर्निहित जीव विज्ञान जानने, V. natriegens के आगे विकास सेल मुक्त सिस्टम bioproduction क्षमताओं में तेजी लाने और चिकित्सीय पेप्टाइड्स की मजबूत अभिव्यक्ति सक्षम कर सकते हैं, छोटे अणुओं, और सिंथेटिक सामग्री.

Disclosures

djw, नहीं, और जीएमसी एक पेटेंट इस काम से संबंधित दायर की है ।

Acknowledgments

यह काम जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान 1u01gm110714-01 और ऊर्जा विभाग DE-FG02-02er63445 द्वारा वित्त पोषित किया गया । लेखक इस पांडुलिपि के प्रोटोकॉल खंड के निर्माण पर सहायक सलाह के लिए डॉ. रिचर्ड कोहमन, डॉ जेनी टैम, और डॉ एडगर गोल्च का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Tubes Corning 352196
2 mL Tubes Eppendorf 22363352
384-well Black Assay Plates Corning 3544
384-well PCR Plates Eppendorf 951020702
50 mL Tubes Corning 352070
96-well PCR Plates Eppendorf 30129300
Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate Sigma A6885
Adenosine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler ThermoFisher 4388444
Assay Plate Adhesives BioRad MSB1001
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) Sigma/Roche 10127965001
Coenzyme A hydrate Sigma C4283
Cytidine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) Sigma P8877
Dewar Flask - 4L ThermoScientific 10-194-100C
DL-Dithiothreitol solution - 1 M Sigma 42816
Folinic acid calcium salt hydrate Sigma 47612
Glacial Acetic Acid Sigma A6283
Guanosine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
HEPES Sigma H3375
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate Sigma 49605
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma G1149
LB Broth (Miller) Sigma L3522
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Plasmid pJL1-sfGFP Addgene 69496
Plasmid Plus Maxi kit Qiagen 12963
Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 Sigma 89510
Potassium chloride (KCl) Sigma P9333
Potassium hydroxide Pellets Sigma/Roche 1050121000
Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ?-inch tip Qsonica 4422
RNA Clean and Concentrator Kit Zymo R1013
RNase Inhibitor, Murine NEB M0314
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit BR1401801
Sodium chloride (NaCl) Sigma S7653
Spermidine Sigma S0266
T7 RNA Polymerase NEB M0251
Tris Solution (pH 8.0) - 1 M Invitrogen AM9856
tRNA from E. coli MRE 600 Sigma/Roche 10109541001
Uridine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock ATCC 14048

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