快速生长的纳氏弧菌的无细胞蛋白表达

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Bioengineering
 

Summary

无细胞表达系统是用于高吞吐量合成和筛选重要蛋白质的功能强大且经济高效的工具。在这里, 我们描述了使用纳利根弧菌快速生产的无细胞蛋白表达系统的制备, 使用质粒 dna, 线性 dna 和 mrna 模板。

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Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (145), e59495, doi:10.3791/59495 (2019).

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Abstract

海洋细菌由于其快速生长速度, 作为生物技术的新微生物宿主, 受到了人们的广泛关注。介绍了利用常用实验室设备制备纳里根粗细胞提取物的一般方案。这种高产协议经过专门针对用户的可访问性和降低成本进行了优化。无细胞蛋白合成 (cfps) 可在96或384井格式的小规模10μl 批处理反应中进行, 可重复产生浓度 > 260μml 超级文件夹 gfp (sfgfp), 时间为3小时。可在1-2天内由单个用户完成。该协议可以很容易地集成到现有的蛋白质合成管道, 以促进生物生产和合成生物学应用的进步。

Introduction

无细胞蛋白合成是一种通用且经济高效的方法, 用于表达有价值的蛋白质或肽1,2,3,4。从历史上看, 无细胞蛋白的合成是使用大肠杆菌表达系统进行的;然而, 最近在使用具有新特性的替代非模型生物作为无细胞表达 567、8、9的底盘方面出现了激增的情况,10,11,12. 具有独特代谢特征的生物是无大肠杆菌系统的主要替代品。例如, 海洋细菌弧菌是所有已知生物中生长最快的, 观测到的加倍时间不到 10分钟13。作为 14151617、18的新兴微生物宿主, 这引起了人们的极大关注。鉴于纳特里根的快速生长速度与蛋白质合成率和代谢效率高有关19,20,21, 利用其细胞机制无细胞合成可能会显著扩大快速蛋白质生产和高通量筛选的工具包。

最近, 一个无细胞 v . natriegens表达系统已被证明能够产生超夹 gfp (sfgfp) 的浓度为 > 260μgml 在3小时与 t7 启动子 9.开发这种方法的总体目标是为用户提供一个高度可访问性、经济高效、可重复、高效的无细胞蛋白表达系统, 该系统可在短时间内使用普通实验室设备制备。该协议利用摇瓶中的1升培养物、脉冲超声的细胞裂解和96或384孔格式的小规模批处理反应, 以最大限度地提高并行度和筛选吞吐量。通过补充 3-磷酸甘油 (3-pga) 作为能量来源8,22,23, 可以进行长时间、持续的蛋白质表达。成功完成此协议后, 用户将有能力使用v. natriegens粗细胞提取物以无细胞格式表达所需的蛋白质或一组蛋白质。

从甘油库存开始,在光学密度为1.0 的 600 nm (od600) 下采集的细胞中提取出的纳提根细胞提取物。1升培养将产生约2-3 毫升的提取物, 这足以满足超过800细胞自由反应在25% 粗细胞提取物。蛋白质可以使用质粒 dna、线性 dna 或 mrna 模板来表达;然而, 在使用野生 v. natriegens 无细胞系统9时, 内源性核酸酶的线性 dna 模板降解仍然是一个主要缺点。从v. natriegens培养开始, 一个用户可以在1-2天内实现可用于下游应用的蛋白质。

Protocol

1.纳氏菌粗细胞提取物的制备-细菌培养

  1. 根据表 1制备 v . natriegens细菌生长介质 lb-v2。通过高压灭菌对生长介质进行灭菌。允许介质达到室温 (rt)。将多余的媒体存储在 rt。
    注意事项:使用高压灭菌器时, 请佩戴适当的个人防护设备 (ppe), 并参考实验室的具体说明。
  2. 使用野生 v. natriegens的甘油库存接种 lb-v2 培养基的3毫升。在30°c 下生长过夜, 而在225转/分晃动。
  3. 在台式离心机上离心 10, 600 x, 将隔夜培养物的1毫升洗干净 1分钟, 在不干扰产生的颗粒的情况下, 在1毫升新鲜的 lb-v2 培养基中重新悬浮。
  4. 在蒸压4升令人困惑的 erlenmeyer 烧瓶与无菌盖, 添加1升新鲜的 lb-v2 生长介质。使用1毫升的洗净隔夜培养 (1:1000 稀释率) 进行接种。在30°c 下生长培养, 在225转/分晃动时。
    请注意:保持1:1000 稀释率的同时, 可以向上或向下扩张或降低自然培养物。例如, 在2升令人困惑的 erlenmeyer 烧瓶中, 将250μl 的洗净隔夜培养添加到250毫升的新鲜 lb-v2 生长介质中。
  5. 使用分光光度计监测培养物的 od600 。当培养达到 od600 = 1.0±0.2 时, 在4°c 下, 以 3 , 500 x g 离心收获培养20分钟。把颗粒放在冰上。
    请注意:自然生长迅速, 因此有必要密切监测这种文化。在1:1000 稀释率下, 到 od600 = 1.0 的生长应花费约1.5-2 小时。
  6. 吸收上清液并立即将生成的细菌颗粒储存在-80°c, 或直接进行第2节所述的细胞裂解。
    请注意:这一步是一个很好的停靠点;但是, 建议立即或在1-2天内处理颗粒, 以获得最佳效果。

2.纳氏菌粗细胞提取物的制备–细胞裂解

  1. 根据表1在无菌去离子化 (di) 水中制备 s30 裂解缓冲液, 并使用冰醋酸将 ph 值调整到7.7。
    注意事项:在调整 ph 值时, 应使用适当的 ppe 处理冰醋酸。
  2. 冷却 s30 裂解缓冲液约4°c 在冰箱或冰上开始细胞裂解过程之前。
    请注意:为了快速冷却, 可以将裂解缓冲液放置在-20°c。不要让缓冲区冻结。
  3. 将细胞颗粒放在冰上10-20分钟或直到完全解冻。使用10毫升的冷 s30 裂解缓冲液, 将同一1升培养产生的所有颗粒重新悬浮, 然后将悬浮液转移到50毫升管中。如果在步骤1.6 中的-80°c 时没有将颗粒冷冻在冰柜中, 请直接重新悬浮。
    请注意:增加 s30 裂解缓冲液的体积, 以便根据需要最初重新悬浮颗粒。
  4. 离心机悬浮液在 4°c 下以 3, 500 x g 的速度进行10分钟。在不干扰颗粒的情况下吸收上清液。使用10毫升的冷 s30 裂解缓冲液第二次清洗颗粒。把颗粒放在冰上。
  5. 在冷室内, 在50毫升管的颗粒中加入500μl 的冷 s30 裂解缓冲液。使用宽孔移液器尖端, 重新悬浮颗粒, 并小心地将整个颗粒悬浮液转移到2毫升管。
    请注意:如果没有宽孔移液器, 请使用剪刀剪下1毫升移液器尖端的末端, 以增加用于颗粒转移的孔。
    1. 在不显著增加体积的情况下, 尽可能多地转移颗粒;然而, 颗粒应重新悬浮在足够的液体, 以超声, 表明在2毫升管中的均匀悬浮液。不要过量填充2毫升管。悬浮液不应超过1.5 毫升;如有必要, 可分成多个管。
  6. 把细胞颗粒放在冰上, 在寒冷的房间里工作。在600毫升的烧杯上装满冰, 并在冰上放置一个2毫升的管架.
    请注意:将管架放置在烧杯侧面附近是很有帮助的, 因此在冰层中可以看到颗粒悬浮液, 以监测超声检查的进展 (见图 1)。
  7. 涡旋悬浮颗粒在2毫升管短暂的均质细胞, 轻拍管, 以删除任何细胞的底部的顶部, 并放置到管持有人与盖开放。将声纳尖端降低到悬浮液中, 使其正好位于液体表面之下。
  8. 使用直径为1.5 英寸的声纳和探头准备声纳设置, 如图 2所示。在声纳控制中输入以下设置:20 khz 频率和50% 振幅, 脉冲开启时间: 10秒, 脉冲关闭时间: 60秒。
  9. 运行脉冲声纳协议三个周期。如果颗粒悬浮液的总体积 > 500μl, 则运行脉冲超声协议6次。
    请注意:一般情况下, 3-6 脉冲足以裂解 v . natriegens颗粒;根据声纳的不同, 可能需要额外的脉冲。在超声过程中, 使用调整旋钮平台上下移动探头, 以将可能已沉淀到管底的任何颗粒。管可以从支架中取出, 并短暂涡旋, 使悬浮物在脉冲之间重新均质。有关所需的声纳细胞一致性, 请参见下面的讨论。
    注意事项:当声纳处于活动状态时, 应佩戴适当的听力保护。
  10. 在超声之后, 离心机粗细胞提取物在 16, 000 x g处, 在4°c 或直到裂解物不含任何细胞碎片, 时间为 30-45分钟, 如图 3所示。
  11. 在一个寒冷的房间里, 在不干扰颗粒的情况下, 将产生的上清液的50μl 加入新的2毫升管。
    注:
    任何碎片, 意外地转移到新的2毫升管将大大降低提取物的能力, 高产化蛋白质合成。
    1. (可选) 在单独的 2 ml 管中留出10μl 细胞提取物, 用于裂解后蛋白质的定量 (见下文第2.13 步)。
  12. 闪存冻结粗电池提取物通过将管安装在管支架与浸渍串连接, 如图 4所示。将管道浸入含有液氮的杜瓦, 并立即放置在-80°c 的冰柜中, 直至使用。
    注意事项:使用适当的 ppe 处理液氮, 包括实验室涂层、安全眼镜、面罩、冷冻围裙和手套。
  13. (可选) 使用步骤2.11.1 中预留的10μl 对细胞裂解液的总蛋白进行量化, 方法是稀释样品1:100 在1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中, 并使用任何标准的总蛋白质定量检测, 如布拉德福德检测、双联酸分析 (bca) 等。

3. 无细胞反应成分的制备

  1. 一般反应成分
    1. 在50毫升管中制备镁谷氨酸和 k-谷氨酸的工作库存, 并采用无菌 di 水, 浓度分别为 100 mm 和 2000 mm。
    2. 在250毫升烧杯中加入100毫升无菌 di 水, 准备 50% (w/v) 的聚乙二醇 (peg)-8000 的工作库存。将一个小的磁力搅拌器放入烧杯中。称量50克 pag-8000, 并加入烧杯中的100毫升水。
    3. 将烧杯放在设定为100°c 的加热搅拌板上, 并在250转/分搅拌, 直到 pg-8000 在溶液中。在转移到50毫升管之前, 允许 pg-8000 液体混合物冷却。
  2. 能源解决方案主组合
    1. 在500毫升无菌 di 水中加入140克 koh 颗粒, 制备 koh 的5m 溶液。
      注意事项:在化学罩中准备此解决方案, 并在处理坚固的底座时佩戴个人防护设备。溶液会变热, 所以瓶盖必须松动, 以防止压力积聚。在使用前, 允许 koh 解决方案到达 rt。
    2. 准备一个 1750 mm hepes-koh 缓冲液, 添加20.85 克 hepes 到一个100毫升的瓶子。慢慢加入无菌 di 水, 直到体积达到40毫升。涡流瓶溶解 hepes。使用 5m koh 溶液将 ph 值调整为 8.0, 然后使溶液体积达到50毫升。
      注意事项:调整 ph 值时, 应使用适当的 ppe 处理 koh。
    3. 按照表 2所示浓度在无菌 di 水中制备剩余的10倍能量主混合库存成分, 并将每个库存放在冰上。解冻 rt 上的 100 mm atp、gtp、ctp 和 utp 股票, 并将其放置在冰上。
      请注意:如有必要, 可将热敏仪设置为37°c 和 350 rpm, 用于将试剂溶解到溶液中。不要过热或长时间将试剂留在热敏器上。
    4. 在15毫升管中, 按照表 2中规定的顺序和体积添加每个能量溶液主混合组件。添加每个组件后, 将解决方案变涡。这将使5毫升的10倍能源解决方案主混合。
    5. 在2毫升管中, 将10倍能量溶液主混合分成200μl 的 aliquots。闪光灯冻结步骤2.12 中执行的每个等位。立即将其放入-80°c 的冰柜中, 直至使用。
  3. 氨基酸主要混合
    1. 要准备新鲜的4倍氨基酸主混合物, 首先解冻 rt 的每个氨基酸库, 然后将每个氨基酸放入冰上。使用在37°c 和350转每分钟设置的涡流和/或热母, 以确保所有氨基酸库存完全溶解。
      请注意:半胱氨酸可能不能完全溶解;它可以作为悬浮液添加到氨基酸主混合物中。不要过热或长时间将试剂留在热敏器上。
    2. 在一个15毫升的管子里在无菌 di 水中添加适当的体积氨基酸, 使每个水的最终浓度为 8 mm, 顺序如下: ala、arg、asn、asp、gln、glu、gly、his、ie、lys、met、phe、pro、ser、thr、val、trp、tyr, 低浓铀和 cys。加入每个氨基酸后, 旋涡主混合溶液。表 2中列出的体积将构成2.4 毫升的氨基酸主混合物。
    3. 在2ml 管中将4倍氨基酸主混合分成200μl 的等价物。闪光灯冻结步骤2.12 中执行的每个等位。立即放入-80°c 的冰柜中, 直至使用。
  4. 反应准备质粒 dna 模板的制作
    请注意:利用超文件夹绿色荧光蛋白 (gfp) 表达载体 t7-pjl1-sfgfp (材料表) 对该系统中的无细胞蛋白表达进行了优化。建议使用这种质粒作为无细胞反应效率的控制, 并使用 pjl1 主干克隆和表达其他蛋白质序列。其他质粒 dna 模板可供使用;然而, 重要的是要注意的是, 转录是由 t7 启动子序列和 t7 rna 聚合酶的存在控制。下面介绍了从转化后的大肠杆菌中大规模生产任何质粒 dna 模板的简单协议。
    1. 根据制造商的说明 (材料表) 使用质粒纯化试剂盒纯化所需的载体。
      注: 建议尽可能地浓缩质粒 dna 模板, 以满足无细胞反应的紧密体积约束。一般情况下, 目标是 750-1500 ng/l 的工作库存。
  5. 反应就绪 mrna 模板的制作
    请注意:此部分是可选的。蛋白质表达已使用由列出的 t7 rna 聚合酶 (材料表) 进行的质粒 t7-pjl1-sfgfffp 的体外转录所产生的 mrna 模板进行了测试。
    1. 使用表 3中的体外转录反应成分, 从质粒 dna 中制备 mrna 模板, 对感兴趣的蛋白质进行编码。在37°c 时在热环器中孵化反应1小时。
      请注意:建议同时对这些反应进行 8−10x, 以产生足够的材料。
    2. 汇集所有转录反应。根据制造商的指示 (材料表) 使用 mrna 纯化和集中器套件进行纯化。elute mrna 模板转化为无菌 di 水。将 mrna 模板存放在-80°c, 直至使用。

4. 使用v. natriegens粗提取物进行无细胞蛋白表达反应

  1. 质粒或线性 dna 模板的无细胞蛋白表达
    1. 从-80°c 的冰柜中取出10倍能量溶液主混合和4倍氨基酸母料, 在 rt 解冻, 并放置在冰上。从-20°c 的冰柜中取出 t7 rna 聚合酶和 rnase 抑制剂库存, 放在冰上。在 rt 解冻 dna 模板, 并将其放置在冰上。
    2. 按照表 4的顺序, 在冰上的2毫升管中加入每个成分, 准备一个无细胞反应母型混合物: 氨基酸主混合物、能量溶液主混合物、镁谷氨酸、k-谷氨酸、dna 模板、pg-8000、t7 rna 聚合酶和 rnase抑制剂.轻轻轻拍管后, 每次加入主混音。
      请注意:如果线性模板用于无细胞蛋白表达, 添加5−10x 更多的材料相比质粒模板, 以获得可观的蛋白质产量。
    3. 从-80°c 的冰柜中取出步骤2.12 中制备的天然细胞裂解液, 并放置在冰上 10-20分钟, 直到解冻。按照表4的规定, 将适当体积的粗细胞提取物添加到无细胞反应主混合中, 然后通过上下闪烁或移液轻轻混合。
    4. 利用热环素表达端点无细胞蛋白
      1. 移液器10μl 的无细胞反应主混合到96或384孔 pcr 板的底部。在每次转移到 pcr 板之间, 轻轻地滑动管子, 将主混合物混合。
        请注意:无细胞反应主混合物应在任何时候都很好地混合, 以最大限度地提高所有样品中的反应重现性和无细胞蛋白的表达。
    5. 简单地离心板在 1, 000 x克的10 s, 以汇集任何可能已被卡在井边的主混合物。用板胶粘剂密封水井, 防止蒸发, 然后将 pcr 板放入26°c 设置的热环器中, 热盖设置在105°c。
      请注意:热环素的均匀分布和加热盖大大提高了蛋白质的表达率。
    6. 将无细胞反应孵化至少3小时。孵育后, 表达的蛋白质可以纯化、定量, 并用于下游工艺。
      请注意:表达的蛋白质可以直接量化在无细胞反应使用用户选择的方法。例如, 荧光蛋白可以使用外部标准曲线进行量化, 或者如果在无细胞反应中使用放射性标记氨基酸, 则可以测量放射性。一般不建议使用紫外可见光谱或总蛋白检测来直接测量无细胞反应中的蛋白质产生, 而无需进行初始纯化。
    7. 或者, 使用板式读取器监测无细胞蛋白表达动力学。
      1. 移液器10μl 的无细胞反应主混合到一个黑色384井检测板的底部与透明的玻璃底部。将检测板放在冰上或在寒冷的房间里工作, 同时加入主混合物, 以确保获得完整的动力学轮廓。用透明的板粘合剂密封油井, 以防止蒸发, 然后将检测板放入26°c 设置的板读取器中。
    8. 将无细胞反应培养 3-6小时, 同时监测与表达的蛋白质相对应的适当荧光兴奋发射波长。例如, 在 ex/em = 485 nm\ 528 nm 的 sfgfp 监视器。
  2. 利用 mrna 模板的无细胞蛋白表达
    1. 在 rt 3.5.2 并放置在冰上, 步骤制备解冻 mrna 模板。
    2. 使用表 4执行先前为线性或质粒 dna 模板指定的步骤4.1.1 步骤 4.1.6, 为 mrna 模板准备替代无细胞反应主混合物。

5. 用 sfgfp 校准 v. natriegens无细胞反应

请注意:此部分是可选的。根据细胞裂解的条件, 每一种粗提取物制备的最佳无细胞反应离子浓度会略有变化。如果反应产率明显低于预期 (浓度 < 1.0 微克/平方米), 请考虑使用 sfgfp 执行下面描述的可选无细胞反应离子校准协议。

  1. 从步骤3.1.1 中制备的 100 mm mM 谷氨酸和 2, 000 mm k-g化甲酸酯库存中, 根据表 5中的规定, 在无菌 di 水中制备 mM2 +和 k + 离子校准解决方案。将校准解决方案放在冰上, 直到需要为止。
  2. 按照表6中的校准图, 将 mg-谷氨酸的移液器1μl 和 k-谷氨酸离子校准溶液的2μl 放入384井 pcr 板中的适当井中。
    1. 此步骤的操作顺序如下: 将 mg-g化明离子校准溶液输送到每个井的底部, 然后将 k-谷氨酸离子校准溶液放入井壁一侧, 而不接触井中已存在的液体。
    2. 在准备校准无细胞反应主混合物时, 通过在板顶放置粘合剂来密封油井, 以防止蒸发。轻轻点击384个井板, 混合 mg 和 k-谷氨酸校准解决方案。
      请注意:强烈建议使用中继器快速完成此步骤。
  3. 使用 t7-pjl1-sfgp 质粒 dna 模板在2毫升管中制备表5中指定的校准无细胞反应主混合物。将每个成分添加到主混合中: 氨基酸主混合、能量溶液主混合、t7-pjl1-sfgffp dna 模板、pJL1、t7 rna 聚合酶和 rnase 抑制剂。轻轻轻触管混合后, 每个组件添加。
    请注意:不要将 mg2 +或 k+添加到校准无细胞主混音中。
  4. 从板材上取下粘合剂。小心移液器7μl 的校准细胞无反应主混合到井的两侧, 而无需接触混合离子校准解决方案已经存在于井中。用粘合剂重新密封水井, 轻轻点击384孔 pcr 板, 将无细胞主混料与离子校准溶液混合。
    请注意:强烈建议使用中继器快速完成此步骤。
  5. 简单地离心板 1, 000 x 克为10秒, 以汇集任何可能卡在井边的未混合液体。将384井板放入26°c 设置的热环器中, 加热盖设置在105°c。
  6. 将无细胞反应孵化3小时。孵育后, 将每口井的含量转移到一个带有玻璃底部的黑色384井检测板上, 并在 ex/em = 485 nm\ 528 nm 处阅读 sfgfp 的荧光, 使用板式读取器确定离子浓度组合, 以确定离子浓度的组合。产生最高数量的蛋白质。

Representative Results

所述的使用v. natriegens无细胞表达系统生产蛋白质的协议可在1-2天内由单个用户执行, 从培养接种到可用于下游应用的蛋白质。粗细胞提取物和主混合股票的制备占了相当一部分;然而, 一旦准备好, 大多数散装试剂可以长期储存 (表 7), 并根据需要使用, 从而缩短了完成协议所需的时间。

所描述的表达系统最好用于体外转录反应产生的质粒 dna 模板或 mrna。虽然线性 dna 也可以用作蛋白质生产的模板, 但它的蛋白质含量明显较低。例如, 在26°c的最佳反应条件下, 一次10μl 无细胞反应可在3小时内使用 0.3 pmol 的质粒 dna 模板或使用 14 pmol mrna 转录的类似 > 125μg/ml sfgffp 产生 > 260μg/ml, b)。然而, 0.3 pmol 的线性 dna 会产生明显较少的蛋白质 (< 20μg ml)。对于每个模板类型, 大部分蛋白质将在 1-1. 5小时内产生;但是, 建议至少运行3小时的反应。采用纯化的 sfgfp 标准曲线测定了 exce/em/528 nm 的荧光, 通过线性回归法测定了 sfgfp 的无细胞反应浓度。

钾和镁离子的浓度 (分别为 k+和 mg2 +) 对蛋白质生产产量有显著影响。在优化条件下, 发现最佳镁2 +和 k+离子浓度将分别为 3.5 mm 和 80 mm (图 6a. b)。偏离最佳离子浓度可能会导致无细胞表达系统产生产量可观的蛋白质的能力下降。如果反应产率明显低于预期, 则可能需要进行额外的校准。第5节介绍了离子校准的任择协议。这使得在补偿单个细胞裂解设备和条件所产生的粗细胞提取物的可变性方面具有一定的灵活性。

Figure 1
图 1: 声纳平台上烧杯和管架的特写视图.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 用于制备粗电池提取物的超声设备设置.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 超声和离心后的颗粒视图.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 用于提取存储的闪存冻结浸渍.请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 使用不同模板类型的无纳特里根细胞蛋白合成的代表性结果.(a) 利用等粒和线性 dna 模板 (0.3 pmol) 的等低浓度以及 mrna 模板浓度的增加对 sfgfp 的生产进行端点分析。在10μl 体积的最佳反应条件下, 在26°c 孵育180分钟后, 使用在 ex/em = 485 nm\ 528 nm 处测量的纯化 sfgfp 的标准曲线测定了无细胞 sfgfp 浓度。(b) 利用等摩尔浓度质粒和线性 dna 模板以及增加 mrna 模板浓度进行 sfgfp 生产动力学分析。在10μl 体积的最佳反应条件下, 每3分钟在 exceem = 485 nmm\ 528 nm 处进行一次 sfgfp 测量, 超过180分钟的总孵育时间。对于端点和动力学检测, 样品都是空白的, 使用无细胞反应进行修正, 并辅以除模板以外的所有成分。显示平均值和标准偏差 (n = 3)。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 离子浓度校准的代表性结果.(a)在10μl 反应中, 补充了 mg2+浓度的增加和在26°c 下孵育180分钟的无细胞反应。所有 mg2 +浓度的 k + 总浓度为 160 mm。在 ex/em = 485 nm\ 528 nm 测量的纯化 sfgfp 的标准曲线测定了无细胞 sfgfp 浓度。(b)10μl 反应中, 补充了增加 k+浓度和在26°c 孵育180分钟的无细胞反应。所有 k+浓度的镁2 +总浓度为 3.5 mm。对于这两种校准, 样品都是空白的, 使用无细胞反应补充除模板以外的所有组件。显示平均值和标准偏差 (n = 3)。这一数字已从 wiegand 等人的第9条修改。经 wiegand、d. j.、lee、h. h. h. h. h. h. h. h.、ostrov、n., church、g. m. 重新打印, 建立无细胞的弧菌自然表达系统。acs 合成生物学.7 (10)、2475-2479 (2018年)。版权所有2018美国化学学会。请点击这里查看此图的较大版本.

表 1 a lb-v2 细菌生长介质的制备
组件 数量 (g) 最终浓度 (mm) 最终卷 (l)
lb 肉汤 (米勒) 25 1
Nacl 11.69 200人
mgcl2 2.20 23。1
氯化钾 0.31 4。2
表 1 b s30a 裂解缓冲器的制备
组件 数量 (g) 最终浓度 (mm) 最终卷 (l)
tris 溶液 (ph 8.0)-1 m (ml) * 25 50 0。5
谷氨酸 2.72 14
k-谷氨酸 6.10 60
二硫醇 (dtt)-1 m (ml) * 1 2

表 1: 用于制备 lb-v2 细菌生长介质和0.5 升 s30a 细胞裂解缓冲液的试剂.请点击此处在 excel 中下载此文件. 

10倍能源解决方案主混合的制备
组件 库存集中度 (mm) 最终浓度 (mm) 数量 (μl) 最终体积 (μl)
hpes-koh ph 值8 1750 500元 1428.57 5000元
Atp 100元 15 750.00
gtp 100元 15 750.00
Ctp 100元 9 450.00
utp 100元 9 450.00
大肠杆菌mre 600 (mg/ml) * 100元 2 100.00
水合作酶 a 水合物 200人 2。6 6500
nad 200人 3。3 82.50
营地 650 7。5 57.69
叶酸 100元 0。7 35.00
斯珀米丁 1600 10 31.25
3-pga 2000年 300元 750.00
无菌水 49.99
4x 氨基酸主混合料的制备
组件 库存集中度 (mm) 最终浓度 (mm) 数量 (μl) 最终体积 (μl)
Ala 168 8 11。3 2400
精 氨 酸 168 8 11。3
asn 168 8 11。3
Asp 168 8 11。3
gln 168 8 11。3
谷氨酸 168 8 11。3
女孩 168 8 11。3
Ihs 168 8 11。3
撒谎 168 8 11。3
赖氨酸 168 8 11。3
遇到 168 8 11。3
pfe 168 8 11。3
pro 168 8 11。3
爵士 168 8 11。3
thr 168 8 11。3
瓦尔 168 8 11。3
trp 168 8 11。3
tyr 168 8 11。3
低浓铀 140 8 137。1
cys 168 8 11。3
无菌水 91。4

表 2: 用于制备10倍能量溶液主混合物和2.4 毫升4倍氨基酸主混合物的5毫升的试剂.   请点击此处在 excel 中下载此文件.

t7 rna 聚合酶体外转录反应
组件 库存 (mm) 最终浓度 (mm) 数量 (μl) 1x 反应 数量 (μl) 50x 反应
10倍 rnapol 反应缓冲器 1.00 50
Atp 100元 0。5 0.10 5
gtp 100元 0。5 0.10 5
Ctp 100元 0。5 0.10 5
utp 100元 0。5 0.10 5
dna 模板 (ng/μl) * 1000元 500元 0.50 25
t7 rna 聚合酶 200人 2。6 2.00 100元
rnase 抑制剂, murine 200人 3。3 0.50 25
无菌水 15.60 786
反应体积 (μl): 20

表 3: 用于 mrna 生成的体外转录成分.   请点击此处在 excel 中下载此文件.

无细胞反应主混合
组件 库存集中度 (mm) 最终浓度 (mm) 数量 (μl) 1x 反应 数量 (μl) 50x 反应
提取物 (%) * 25 2.50 125, 00
谷氨酸 100元 3。5 0.35 17.50
k-谷氨酸 2000年 80 0.40 20.00
4倍氨基酸主混合 8。0 2 2.50 125, 00
10倍能源解决方案主混音 1.00 50.00
质粒 dna (ngμl) * 1000元 500元 0.50 25.00
50% pag-8000 (%) * 50 2 0.40 20.00
t7 rna 聚合酶 1.00 50.00
rnase 抑制剂, murine 0.10 5.00
无菌水 1.25 62.50
反应体积 (μl): 10
mrna 模板的替代无细胞反应主混合
组件 库存集中度 (mm) 最终浓度 (mm) 数量 (μl) 1x 反应 数量 (μl) 50x 反应
提取物 (%) * 25 2.50 125, 00
谷氨酸 100元 3。5 0.35 17.50
k-谷氨酸 2000年 80 0.40 20.00
4倍氨基酸主混合 8。0 2 2.50 125, 00
10倍能源解决方案主混音 1.00 50.00
mrna 模板 (ngμ-l) * 2000年 4400 2.00 100.00
50% pag-8000 (%) * 50 2 0.40 20.00
rnase 抑制剂, murine 0.10 5.00
无菌水 0.75 37.50
反应体积 (μl): 10

表 4: dna 模板和 mrna 模板的优化 v. natriegens无细胞反应主组合的成分.   请点击此处在 excel 中下载此文件.

2 +校验 数量 (μl) 1x 反应 数量 (μl) 1x 反应 数量 (μl) 100x 反应 数量 (μl) 100x 反应
决赛 (mm) 股票 100 mm mg-glu 迪希20 100 mm mg-glu 去离子h2o
2。5 0 0.00 元 1.00 0 100元
3。5 1 0.10 0.90 10 90
4。5 2 0.20 0.80 20 80
5。5 3个 0.30 0.70 30 70
反应体积 (μl): 10
k+校验 数量 (μl) 1x 反应 数量 (μl) 1x 反应 数量 (μl) 100x 反应 数量 (μl) 100x 反应
决赛 (mm) 股票 2000 mm k-glu 迪希20 2000 mm k-glu 去离子h2o
40 30 0.15 1.85 12 148
80 70 0.35 1.65 28 132
160 150人 0.75 1.25 60 100元
320 310 1.55 0.45 124 36
反应体积 (μl): 10
离子校准无细胞反应主混合
组件 库存集中度 (mm) 最终浓度 (mm) 数量 (μl) 1x 反应 数量 (μl) 50x 反应
提取物 (%) * 25 2.50 125, 00
谷氨酸 变量 变量 1.00 50.00
k-谷氨酸 变量 变量 2.00 100.00
4倍氨基酸主混合 8。0 2 2.50 125, 00
10倍能源解决方案主混音 1.00 50.00
质粒 dna (ngμl) * 1000元 250人 0.25 12.50
50% pag-8000 (%) * 50 2 0.40 20.00
t7 rna 聚合酶 1.00 50.00
rnase 抑制剂, murine 0.10 5.00
无菌水 0.00 元 0.00 元
反应体积 (μl): 10

表 5: 离子浓度校准母版混合.   请点击此处在 excel 中下载此文件.

cf 离子校准图 40 mmk + 80毫卡卡 + 160 mmk + 320 mmk +
1 2 3个 4个 5 6 7。 8 9 10 11 12
2.5 mm mg2 + a 个
3.5 mmmg 2 + B
4.5 mm mg2 + C
5.5 mm mg2 + D

表 6: 离子校准图.   请点击此处在 excel 中下载此文件.

cf 组件的储存条件和保质期
组件 存储位置 保质期
无菌 lb-v2 生长介质 4°c 3-6
五、天然粗细胞提取物 -80°c 1-3周
100 mm mg-glutamate 房间温度 6个月
2000 mm k-glutamate 房间温度 6个月
50% pag-8000 房间温度 6个月
10倍能源解决方案主混音 -80°c 3-6
4倍氨基酸主混合 -80°c 3-6
塑料/线性 dna 模板 -20°c 6-12
mrna 模板 -80°c 3-4周

表 7: 无细胞储存条件和保质期.   请点击此处在 excel 中下载此文件.

Discussion

该协议针对野生 v和细菌生长介质进行了优化, 这些培养基由补充 v2 盐 (材料表) 的 lb 组成。其他菌株的纳利根可以同样培养产生粗糙的细胞提取物无细胞反应;但是, 它们的使用需要对该协议进行额外的优化。此外, 该无细胞蛋白表达系统已被优化使用 3-磷酸甘油 (3-更加 pga) 作为主要能源再生源。可使用其他能源再生源;然而, 试剂的优化和校准可能需要获得高产蛋白表达10,11

特别注意该协议中的几个关键步骤, 将确保高产无细胞蛋白生产的最大提取物生产率。首先, 必须从生长的中指数阶段收获的纳特里根细胞培养中制备粗细胞提取物;当培养物达到 od 600 = 1.0±0.2 时, 蛋白质产量最大。虽然无细胞蛋白的产生是可能的, 从在一系列光学密度下收获的细胞, 我们以前发现, 在指数状态下收获的细胞产生的蛋白质明显更多, 蛋白质9。光学密度对粗细胞提取性能的影响与从批培养条件1中生长的细胞中提取的其他无细胞表达系统的观察一致。由于v. natriegens生长速度快, 因此密切监测培养物的光学密度至关重要。一般来说, 使用该协议, 预计v. natriegens培养物应在 1-1. 5小时内可重现地达到1.0 的 od600 ;然而, 个别生长条件, 如使用困惑与非挡板烧瓶, 影响曝气, 或空气与水孵化, 影响孵化温度的速度和稳定性, 可能会改变生长时间。此外, 一般建议在1升的令人困惑的烧瓶中培养至少250毫升的 v. natriegens , 以确保在收获时有一个大的细胞颗粒, 以便于操作和转移。这大大提高了粗细胞提取物制备的成功率, 同时增加了从颗粒中产生的提取物的总量。使用较小的制备方法时, 可以适当调整培养条件和试剂。对于大规模发酵, 可能需要进一步优化培养条件。最后, 为了确保高蛋白质产量, 至关重要的是细胞颗粒在收获后立即进行处理, 或在-80°c 储存后1-2天内进行处理。

脉冲超声对细胞颗粒进行适当的裂解是无细胞蛋白表达成功的关键, 对于新用户来说, 通常是该协议中最困难的方面。通常情况下, 裂解良好的颗粒会产生大量的液体提取物, 没有碎片。提取物应略带粘性, 但在液氮闪存冻结前, 当进入存储管时, 可以很容易地进行移液。图 3描述了裂解良好的颗粒 (图 3a) 与裂解后离心步骤后裂解不良的颗粒 (图 3A) 的表示。完整细胞裂解的一个主要迹象是由总蛋白测定 (步骤 2.13) 确定的粗细胞提取物总蛋白浓度 > 20 mg/ml。过度超声或过度加热粗细胞提取物将损坏细胞机械, 而不进行无细胞反应就无法确定。因此, 在将大量时间和精力用于下游蛋白表达应用之前, 用控制反应测试提取效率是非常有益的。虽然对于不同的声纳设备可能需要额外的优化, 但所描述的脉冲超声步骤在我们手中具有高度的重现性。

使用从 pcr 扩增、限制性酶消化或商业基因合成中提取的线性 dna 模板, 可以显著提高无细胞表达系统中高通量和快速蛋白质生产能力24。虽然 pcr 扩增线性模板产生的蛋白质已经被证明, 但与在等摩尔比9处使用质粒 dna 模板的反应相比, 这些反应的产率大约低13.5倍。这主要是由于线性 dna 模板的不稳定性, 这可能是由存在于纳酸粗细胞提取物中的内源性核酸酶降解的。虽然 lambda 噬菌体蛋白 gams 以前曾被用来保护线性 dna 模板24,25, 但它被发现与v. natriegens提取物9不兼容。此外, 虽然增加线性 dna 模板的浓度可能会带来更高的蛋白质产量, 但其在粗细胞提取物中的快速降解仍将是一个主要问题。

克服线性 dna 模板降解的一种方法可能是补充线性 dna 体外转录产生的 mrna 模板的无细胞反应。另一方面, 使用 rnase 抑制剂可以显著防止 mrna 转录降解, 并且可以在10μl 无细胞反应格式中获得可观的蛋白质产量 (图 5a, b)。可采用 tta 结扎、topo 克隆、金门组装或其他重组方法将线性 dna 克隆到圆形模板中, 以避免模板的降解。然而, 进一步的方法来抑制核酸酶活性将是必要的, 有效的蛋白质表达使用线性 dna 模板。

目前为止, 已经提出了几种不同的方法来制备无细胞蛋白表达的粗提取物 9,10,11,26。在开发此协议时, 我们力求最大限度地提高用户的可访问性, 降低总体成本, 并最大限度地减少耗时的步骤。例如, 使用简单的两步声离心过程可实现较高的蛋白质产量, 并且不需要细胞均质机、冗长的透析步骤或径流反应。它很容易在短时间内执行, 不需要高水平的实验室专业知识。因此, 它可以帮助促进无细胞表达作为翻译学术研究和工业过程设计的标准。

该协议扩展了可用于研究和利用具有独特生物特性的非模型生物v. natriegens 的工具包。通过采用半连续或完全连续的无细胞反应, 可以实现更高的蛋白质产量, 从而实现能量再生、氨基酸的再供应和废品的去除 3,5,27.此外, 野生 v . natriegens的工程, 以产生 dnase 或 DNAse-缺乏菌株, 消除有害和竞争代谢途径, 并表达额外的 rna 可以大大提高蛋白质的生产这个系统28,29。当我们解开其快速增长背后的生物学, 进一步开发无纳泰格斯细胞系统可能会加速生物生产能力, 并使治疗肽、小分子和合成物质的有力表达材料。

Disclosures

djw、no 和 gmc 已提交了与这项工作相关的专利。

Acknowledgments

这项工作由国家普通医学研究所1u01g11014-01 和能源部 de-fg02-02er63445 资助。作者要感谢理查德·科曼博士、詹妮·谭博士和埃德加·戈鲁赫博士就构建这份手稿的协议部分提出了有益的建议。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Tubes Corning 352196
2 mL Tubes Eppendorf 22363352
384-well Black Assay Plates Corning 3544
384-well PCR Plates Eppendorf 951020702
50 mL Tubes Corning 352070
96-well PCR Plates Eppendorf 30129300
Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt monohydrate Sigma A6885
Adenosine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler ThermoFisher 4388444
Assay Plate Adhesives BioRad MSB1001
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) Sigma/Roche 10127965001
Coenzyme A hydrate Sigma C4283
Cytidine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) Sigma P8877
Dewar Flask - 4L ThermoScientific 10-194-100C
DL-Dithiothreitol solution - 1 M Sigma 42816
Folinic acid calcium salt hydrate Sigma 47612
Glacial Acetic Acid Sigma A6283
Guanosine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
HEPES Sigma H3375
L-Glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate Sigma 49605
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma G1149
LB Broth (Miller) Sigma L3522
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Plasmid pJL1-sfGFP Addgene 69496
Plasmid Plus Maxi kit Qiagen 12963
Poly(ethylene glycol) (PEG)-8000 Sigma 89510
Potassium chloride (KCl) Sigma P9333
Potassium hydroxide Pellets Sigma/Roche 1050121000
Q125 Sonicator and CL-18 probe with a ?-inch tip Qsonica 4422
RNA Clean and Concentrator Kit Zymo R1013
RNase Inhibitor, Murine NEB M0314
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit BR1401801
Sodium chloride (NaCl) Sigma S7653
Spermidine Sigma S0266
T7 RNA Polymerase NEB M0251
Tris Solution (pH 8.0) - 1 M Invitrogen AM9856
tRNA from E. coli MRE 600 Sigma/Roche 10109541001
Uridine 5'-triphosphate - 100 mM NEB N0450L
Vibrio natriegens (Wild-type) Lyophilized Stock ATCC 14048

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