मल्टीपल स्केलेरोसिस के साथ व्यक्तियों के लिए व्यापक Autopsy कार्यक्रम

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Neuroscience
 

Summary

मल्टीपल स्क्लेरोसिस कोई इलाज नहीं के साथ एक सूजन demyelinating रोग है। मस्तिष्क के ऊतकों का विश्लेषण रोग के रोगजनन को समझने के लिए महत्वपूर्ण सुराग प्रदान करता है। यहाँ हम कार्यप्रणाली और एमएस मस्तिष्क ऊतक क्लीवलैंड क्लिनिक में आपरेशन में एक अद्वितीय तेजी से autopsy कार्यक्रम के माध्यम से एकत्र के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण पर चर्चा.

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Dutta, R., Mahajan, K. R., Nakamura, K., Ontaneda, D., Chen, J., Volsko, C., Dudman, J., Christie, E., Dunham, J., Fox, R. J., Trapp, B. D. Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (149), e59511, doi:10.3791/59511 (2019).

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Abstract

हम एकाधिक स्क्लेरोसिस (एमएस) के साथ व्यक्तियों के लिए एक तेजी से ऊतक दान कार्यक्रम का वर्णन है कि वैज्ञानिकों और तकनीशियनों पर कॉल करने की आवश्यकता है 24/ प्रतिभागियों को उनके मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी दान करने के लिए सहमति. अधिकांश रोगियों एमएस उपचार और अनुसंधान के लिए क्लीवलैंड क्लिनिक Mellen केंद्र में न्यूरोलॉजिस्ट द्वारा पीछा किया गया. उनके नैदानिक पाठ्यक्रम और तंत्रिका संबंधी विकलांग अच्छी तरह से विशेषता है. मौत के तुरंत बाद, शरीर एमएस इमेजिंग सेंटर, जहां मस्तिष्क 3 टी चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) द्वारा situ में स्कैन किया जाता है के लिए ले जाया जाता है। शरीर तो autopsy कमरे में स्थानांतरित कर दिया है, जहां मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को हटा रहे हैं. मस्तिष्क दो गोलार्द्धों में विभाजित है। एक गोलार्द्ध तुरंत एक टुकड़ा बॉक्स में रखा जाता है और वैकल्पिक 1 सेमी-थिक स्लाइस या तो दो दिनों के लिए 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में तय कर रहे हैं या तेजी से सूखी बर्फ और 2-मेथिलब्यूटान में जमे हुए हैं। लघु-फिक्स्ड मस्तिष्क स्लाइस एक क्रायोप्रेक्षण समाधान में संग्रहीत किए जाते हैं और संवेदनशील एंटीजन के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण और इम्यूनोसाइटोकेमिकल का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है। जमे हुए स्लाइस -80 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है और आणविक, इम्यूनोसाइटोकेमिकल, और सीटू हाइब्रिडेशन/आरएनए स्कोप अध्ययन में उपयोग किया जाता है। अन्य गोलार्द्ध में रखा गया है 4% paraformaldehyde कई महीनों के लिए, टुकड़ा बॉक्स में रखा, 3 टी चुंबकीय अनुनाद (एमआर) स्कैनर में फिर से स्कैन और सेंटीमीटर मोटी स्लाइस में कटा हुआ. SITU एमआर छवियों में पोस्टमार्टम (एमआरआई) एमआरआई-पैथोलॉजी सहसंबंध ों की सुविधा के लिए 1 सेमी-थिक मस्तिष्क स्लाइस के साथ सह पंजीकृत हैं। सभी मस्तिष्क स्लाइस फोटो और मस्तिष्क सफेद पदार्थ घावों की पहचान कर रहे हैं. रीढ़ की हड्डी 2 सेमी खंडों में काट दिया जाता है। वैकल्पिक खंडों 4% paraformaldehyde या तेजी से जमे हुए में तय कर रहे हैं. पोस्टमार्टम एमएस ऊतकों की तेजी से खरीद एमएस दिमाग और रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क एमआरआई असामान्यताएं के रोग सहसंबंध के रोग और आणविक विश्लेषण की अनुमति देता है. इन तेजी से संसाधित पोस्टमार्टम ऊतकों की गुणवत्ता (आमतौर पर मौत के 6 एच के भीतर) एमएस अनुसंधान के लिए महान मूल्य की है और कई उच्च प्रभाव खोजों में हुई है.

Introduction

एक रोग का अध्ययन करने के लिए सबसे अच्छा तरीका है रोगग्रस्त ऊतक ही जांच करने के लिए है। यह उन लोगों के लिए चुनौतियों को प्रस्तुत करता है जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की बीमारियों का अध्ययन करते हैं। रोगग्रस्त मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के बायोप्सी बेहद दुर्लभ हैं और आमतौर पर अटूट मामलों को शामिल करते हैं। सीएनएस रोगों के साथ व्यक्तियों के लिए Autopsy दरों में नाटकीय रूप से हाल के वर्षों में कमी आई है, और जब प्रदर्शन किया, वे अक्सर ऊतकों की तेजी से खरीद प्रदान नहीं करते. इन चुनौतियों के परिणामस्वरूप रोग केंद्रित मस्तिष्क बैंकों की स्थापना हुई है, जिसमें एकाधिक स्क्लेरोसिस (एमएस) वाले व्यक्तियों से ऊतकों को इकट्ठा करने पर ध्यान केंद्रित किया गया है। एमएस सीएनएस की एक सूजन मध्यस्थता रोग है कि myelin, oligodendrocytes (myelin बनाने कोशिकाओं), न्यूरॉन्स, और axons को नष्ट कर देता है. एमएस रोगियों के बहुमत एक द्वि-फासिक रोग पाठ्यक्रम है कि चर वसूली के साथ तंत्रिका संबंधी विकलांगता के bouts के साथ शुरू होता है कि अंततः एक धीरे-धीरे प्रगतिशील रोग है कि प्रकृति1में neurodegenerative होने की संभावना है में विकसित है. दान एमएस दिमाग के बहुमत के लिए, मौत और ऊतक प्रसंस्करण के बीच पोस्टमार्टम अंतराल (पीएमआई) 24 एच से अधिक है। जबकि इन ऊतकों एमएस दिमाग में रोग परिवर्तन के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान की है, वे और अधिक उन्नत आणविक अध्ययन है कि रोग pathophysiology में शक्तिशाली अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं के लिए अनुकूल नहीं हैं. यह विशेष रूप से जीन प्रोफाइलिंग अध्ययन के लिए मामला है, जो बरकरार आरएनए की आवश्यकता है.

ऊपर चर्चा की सीमाओं को दूर करने के लिए, हम एक तेजी से ऊतक दान कार्यक्रम है कि एमआरआई के लिए अनुमति देता है विकसित किया है / इस प्रोटोकॉल आधुनिक आणविक अध्ययन के लिए उपयुक्त अच्छी तरह से संरक्षित ऊतकों प्रदान करता है और एमएस दिमाग में मस्तिष्क विकृति और एमआरआई असामान्यताएं की सीधी तुलना की अनुमति देता है. क्लीवलैंड क्लिनिक मल्टीपल स्केलेरोसिस ऊतक दान कार्यक्रम 20 से अधिक वर्षों के लिए अस्तित्व में किया गया है। इस तेजी से ऊतक दान कार्यक्रम एमएस और अन्य जुड़े autoimmune तंत्रिका विज्ञान की स्थिति के साथ व्यक्तियों से दिमाग और रीढ़ की हड्डी की खरीद. कार्यक्रम के लिए मौत के 6 एच के भीतर situ MRIs में प्राप्त करना है, ऊतक प्रसंस्करण के लिए मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को हटाने के बाद.

भर्ती
दान या तो रोगियों से सीधे प्राप्त पूर्व-मर्तियों की सहमति के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं (पूर्व सहमति) या मौत के बाद रिश्तेदारों के अगले से. पूर्व सहमति रोगियों आम तौर पर क्लीवलैंड, ओहियो में मल्टीपल स्केलेरोसिस उपचार और अनुसंधान के लिए Mellen केंद्र में नैदानिक आबादी से पहचान कर रहे हैं. हालांकि तेजी से ऊतक दान कार्यक्रम में भर्ती में वरीयता रोगियों को जो अनुदैर्घ्य अनुसंधान अध्ययन में पीछा किया गया है के लिए दिया जाता है, यह केंद्र में देखा सभी रोगियों के लिए खुला है. प्रतिभागियों को जो मौत से पहले दाखिला परिवार के सदस्यों या देखभाल प्रदाताओं के लिए निर्देश दिया जाता है अनुसंधान टीम से संपर्क करें, या तो मौत के समय या जब मौत आसन्न माना जाता है. व्यक्तियों के लिए दूसरी विधि ऊतक दान कार्यक्रम में प्रवेश करने के लिए अगले रिश्तेदार ों द्वारा सहमति के माध्यम से मौत के समय में है. ओहियो के राज्य में मौतों की आवश्यकता है एक संघीय आदेश ित करने वाले अंग खरीद संगठन LifeBanc, जो पूर्वोत्तर ओहियो के 20 काउंटियों में चल रही है के लिए भेजा जा करने के लिए. LifeBanc एमएस के निदान के लिए सभी मौतों स्क्रीन, जो अंग दान के लिए एक बहिष्कार है. व्यवस्था LifeBanc के लिए किए गए थे एमएस ऊतक दान कार्यक्रम से सभी मौतों के लिए जांचकर्ताओं को सूचित एमएस क्लीवलैंड क्लिनिक से एक 75 मील के दायरे के भीतर होने वाली एमएस के एक संबद्ध निदान के साथ. रिश्तेदार और अस्पताल के कर्मचारियों के अगले तो ऊतक दान कार्यक्रम स्टाफ द्वारा संपर्क कर रहे हैं और सहमति मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के दान के लिए प्राप्त की है. जीवनत्याग के माध्यम से भर्ती-पूर्व-मर्तबा और पोस्टमार्टम के इन दो तरीकों का परिणाम प्रति वर्ष लगभग 10-12 मस्तिष्क दान होता है। समायोजन जीवनबैंक से प्राप्त रेफरल की संख्या का प्रबंधन करने के लिए मौत की ऊपरी आयु सीमा के लिए किया जाता है।

दान की खरीद
कार्यक्रम 24 एच कवरेज, 365 दिन ऊतक खरीद के लिए ऊतक दान कार्यक्रम के सदस्यों द्वारा एक वर्ष की आवश्यकता है. एक केंद्रीकृत ऊतक दान अधिसूचना ईमेल / पेजर /मोबाइल डिवाइस पाठ अधिसूचना प्रणाली ऊतक दान को कवर नैदानिक टीम द्वारा प्रयोग किया जाता है। LifeBanc ऊतक दान कार्यक्रम के लिए पर कॉल कर्मियों से संपर्क करने के लिए नंबर प्रदान की जाती है. सदस्यों को अस्पताल प्रदाताओं द्वारा मृत्यु की सूचना दी जाती है /पूर्व-सहमति वाले (पूर्व-सहमति) या जीवनबैंक और अन्य रेफरल स्रोतों द्वारा। सबसे पहले, मौत और ऊतक दान करने के लिए व्यवहार्यता के समय का एक दृढ़ संकल्प किया जाता है. मौत तो स्थितियों है कि संभावित रूप से गरीब गुणवत्ता ऊतक में परिणाम के लिए जांच कर रहे हैं, लंबे समय तक पूर्व-मर्चन हाइपोक्सिया सहित, बड़े पैमाने पर विनाशकारी मस्तिष्क ऊतक (उदाहरण के लिए, बड़े इंट्राक्रैनियल हेमोरेज, व्यापक द्वि-अर्धगोल स्ट्रोक, व्यापक ट्यूमर बोझ), लंबे समय तक वेंटीलेटर समर्थन (और 3 दिन), और vsoactive एजेंटों के लंबे समय तक उपयोग (gt; 3 दिन) मौत से पहले. जब एक चिकित्सा परीक्षक एक मौत में शामिल है, अध्ययन न्यूरोलॉजिस्ट चिकित्सा परीक्षक की जिम्मेदारी समझौता किए बिना समय पर ऊतकों को प्राप्त करने के लिए एक रास्ता तलाशने के लिए चिकित्सा परीक्षक के साथ बात कर सकते हैं। यदि व्यवहार्य ऊतक मौजूद महसूस किया जाता है, तो लिखित सहमति प्राप्त की जाती है (यदि पूर्व-मरहम नहीं प्राप्त किया जाता है) और शरीर के परिवहन के लिए तैयारियां की जाती हैं। एक पहले से अनुबंध decedent परिवहन सेवा तो क्लीवलैंड क्लिनिक में एमआरआई सुविधाओं के लिए परिवहन के लिए संपर्क किया है. देखभाल यह सुनिश्चित करने के लिए की जाती है कि शरीर कमरे के तापमान पर रहता है और प्रशीतन में नहीं रखा जाता है, क्योंकि शरीर के कम तापमान एमआरआई संकेत विशेषताओं में परिवर्तन के साथ जुड़े होते हैं।

नैदानिक इतिहास
नैदानिक इतिहास एमएस के निदान पर विवरण शामिल है, लक्षणकी शुरुआत, उपचार का इस्तेमाल किया, नैदानिक और पैरा-नैदानिक परीक्षण के परिणाम (संभावित क्षमता, मस्तिष्कमेरु द्रव परिणाम, ऑप्टिकल सामंजस्य टोमोग्राफी), एकाधिक काठिन्य कार्यात्मक समग्र , और विस्तारित विकलांगता स्थिति पैमाने (EDSS; वास्तविक या अनुमानित), जो चिकित्सा रिकॉर्ड (जहां उपलब्ध है) से एकत्र किए जाते हैं, और रिश्तेदारों के अगले साक्षात्कार का सीधा साक्षात्कार करते हैं। प्री-मॉर्टम एमआरआई भी एकत्र किया जाता है।

Protocol

इस प्रोटोकॉल क्लीवलैंड क्लिनिक संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया है और क्लीवलैंड क्लिनिक मानव अनुसंधान नैतिकता समिति के दिशा निर्देशों का पालन करता है.

1. सीटू एमआरआई में

  1. एमआरआई सूट करने के लिए दाता शरीर ले लो और एमएस इमेजिंग सुविधा में एक 2 एच एमआरआई इमेजिंग प्रोटोकॉल का संचालन। एक 3 टी या 7 टी छविर पर एमआरआई आचरण.
    नोट: प्राथमिकता 3T को दी जाती है क्योंकि अधिकांश विरासत डेटा 3 T पर किया गया है, लेकिन जब उपलब्ध नहीं होता है, इमेजिंग 7T के साथ आयोजित की जाती है। नामित कोर अनुक्रम सभी मामलों के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं (तालिका 1) और अतिरिक्त अनुक्रम है कि वर्तमान अनुसंधान हितों पर निर्भर करता है अगर समय परमिट (मौत के बाद कम से कम 12 एच प्राप्त करने के द्वारा प्रतिबंधित) किया जाता है. तालिका 1 कोर अनुक्रमों का वर्णन करता है।

2. ऑटोप्सी

नोट: इन सीटू एमआरआई के बाद, शरीर को प्रयोगशाला के सदस्यों द्वारा एक डिनर और ऊतक प्रसंस्करण द्वारा मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी निष्कर्षण के लिए मुर्दाघर में ले जाया जाता है।

  1. मुर्दाघर में शरीर के आगमन से पहले निम्नलिखित चरणों का पालन करें। दो घंटे पहले, 4% paraformaldehyde के 3 एल (पीएफए) और ऊतक भंडारण के लिए लेबल कंटेनर और बैग तैयार करते हैं. 8% पीएफए के 3 एल तैयार करें और 8% पीएफए के 1.5 एल को 4% पीएफए के लिए पतला करें। शेष 8% पीएफए को दिन 2 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में रखें।
  2. मुर्दाघर के लिए यात्रा करने से पहले, सूखी बर्फ (बड़े ब्लॉक फिट और छोटे छर्रों के लिए टूट) के साथ 50% क्षमता के लिए 2 यात्रा कूलर भरें।
  3. मुर्दाघर में, 2-मेथिलब्यूटेन और सूखी बर्फ के साथ एक स्टेनलेस स्टील कंटेनर आधे रास्ते को भरें और ऊतक को ठंड के लिए तैयारी में एक ढक्कन के साथ कवर करें।
  4. वजन और तस्वीर मस्तिष्क एक बार diener द्वारा हटा दिया.
  5. पीएफए से भरे कंटेनर में किसी भी संलग्न ड्यूरा को रखें।
  6. सेरिब्रम और brainstem से सेरेब्रम अलग और सेरेब्रम तस्वीर.
  7. ऑप्टिक नसों, chiasm, और ट्रैक्ट की पहचान और एक जांच और चिमटी का उपयोग कर अलग. संरचना को स्कैल्पल के साथ पुन: काटना.
    नोट: ऑप्टिक तंत्रिका के एक तरफ के दूरस्थ खंड पहचान के लिए हिगिन्स स्याही का उपयोग कर चिह्नित किया गया है।
  8. मस्तिष्क गोलार्द्धों longitudinally अलग और प्रत्येक गोलार्द्ध व्यक्तिगत रूप से तस्वीर.
  9. बाएं गोलार्द्ध के लिए प्राथमिक मोटर प्रांतस्था (पीएमसी) इंक, यह फिर से तस्वीर, और यह लंबे समय से तय करने के लिए एक 3.3 एल कंटेनर में जगह है. मस्तिष्क निर्धारण के लिए प्रारंभ समय दस्तावेज़.
  10. दाएँ गोलार्द्ध के लिए पीएमसी पर हस्ताक्षर किए जा सकते हैं या एक्साइज किया जा सकता है।
    1. यदि एक्साइज किया जा रहा है, तो पहले कवर मेनिंग्स को हटा दें।
    2. फिर से फोटो खिंचवाने या पीएमसी को निकाला गया।
    3. यदि पीएमसी को एक्साइज किया जाता है, तो 6 समान आकार के वर्गों में कटौती करें।
    4. प्रत्येक अनुभाग के रोस्ट्रल पहलू को इंक करें।
    5. शॉर्ट-फिक्सेशन के लिए पीएफए से भरे कंटेनरों में विषम संख्या वाले अनुभागों को रखें।
    6. स्नैप फ्रीज भी संख्या वर्गों और कूलर #1 में सील फ्रीजर बैग में जगह है।
  11. दाएँ गोलार्द्ध को पीछे की ओर काटकर 1 सेमी-थिक कोरोनल खंडों में काटें।
    1. दस्तावेज़ सकल असामान्यताओं (उदा., काटने कलाकृति, रक्तस्राव, और घावों).
    2. शॉर्ट-फिक्सेशन के लिए पीएफए से भरे कंटेनरों में विषम संख्या वाले अनुभागों को रखें।
    3. स्नैप फ्रीज भी संख्या वर्गों और सील फ्रीजर बैग में जगह है।
    4. मस्तिष्क निर्धारण समय केदस्तावेज़ अंत |
  12. सेरिबैलम से brainstem अलग और कम तय करने के लिए एक पीएफए से भरे कंटेनर में जगह.
    1. पृथक सेरेबेलर दीर्घकोश रूप से गोलार्द्धों।
    2. प्रत्येक गोलार्द्ध को 4 समान रूप से मोटी धनुर्धर खंडों में काटें।
    3. फोटो मध्ये व पार्श्वभूमी.
    4. शॉर्ट-फिक्सेशन के लिए पीएफए से भरे कंटेनर में बाएं सेरेबेलर अर्धगोलीय स्लाइस रखें।
    5. स्नैप फ्रीज सही सेरेबेलर अर्धगोलीय स्लाइस और कूलर #1 में सील फ्रीजर बैग में जगह है।
  13. diener से तंत्रिका जड़ों के साथ रीढ़ की हड्डी प्राप्त करें.
    1. रीढ़ की हड्डी dura मेटर निकालें और पीएफए के साथ एक कंटेनर में ड्यूरा की दुकान.
    2. अलग बाएँ और दाएँ पूर्वकाल और पीछे की तंत्रिका जड़ों. रीढ़ की हड्डी से काटे गए बाएं पूर्वकाल और पीछे की तंत्रिका जड़ों को काटें और कम-निर्धारण के लिए पीएफए भरे कंटेनर में रखें।
    3. रीढ़ की हड्डी से सही पूर्वकाल और पीछे की तंत्रिका जड़ों में कटौती, स्नैप फ्रीज, सील फ्रीजर बैग में जगह है, और फिर #2 कूलर में जगह है।
    4. रीढ़ की हड्डी के पुच्छ-सबसे 20 सेमी की फोटो। काठ की वृद्धि का स्थान दस्तावेज़ करें.
    5. कॉर्ड के 2 सेमी अनुप्रस्थ खंडों को पुच्छ से रोस्ट्रल तक ले जाने के लिए काटें।
    6. प्रत्येक कट अनुभाग के रोस्ट्रल पहलू को इंक करें।
    7. शॉर्ट-फिक्सेशन के लिए पीएफए से भरे कंटेनरों में विषम संख्या वाले अनुभागों को रखें।
    8. स्नैप फ्रीज भी संख्या वर्गों, सील फ्रीजर बैग में जगह है, और फिर #2 कूलर में जगह है।
    9. रीढ़ की हड्डी निर्धारण और किसी भी सकल असामान्यताओं के लिए शुरू समय दस्तावेज़.
    10. रीढ़ की हड्डी के शेष रोस्ट्रल भाग की फोटो।
    11. गर्भाशय ग्रीवा वृद्धि की स्थिति दस्तावेज़. शेष रीढ़ की हड्डी के लिए चरणों 2.13.5-2.13.8 का पालन करें।
  14. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में लेबल बक्से में मुर्दा जगह जमे हुए ऊतक के बाद। नियत ऊतक को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  15. 24 एच पोस्ट-ऑटोप्सी (दिन 2) में शेष 8% पीएफए को 4% तक पतला कर दिया।
  16. ताजा पतला 4% पीएफए के साथ निर्धारण कंटेनरों में 4% पीएफए बदलें।
  17. 60 एच पोस्ट-ऑटोप्सी में ग्लूटारैल्डिहाइड से 4% पीएफए में 2.5% ग्लूटारैल्डिहाइड का समाधान तैयार करते हैं, पीएफए, डी एच2ओ और सोरेनसन के बफर (क्रम में मिश्रण द्वारा तैयार: 0.2 एम फॉस्फेट बफर पीएच 7.4, पॉलीविनाइलपिरलिडोन 1% डब्ल्यू/ 30% v/v).
  18. शॉर्ट-फिक्सेशन कंटेनर्स से उपयोग किए गए 4% पीएफए को निकालें।
  19. सोरेनसन बफर में कुल्ला ऊतक और यह cryoprotection समाधान में जगह (glycerol 20%, 0.4 एम Sorenson बफर 20%, और 0.02% सोडियम azide में dH2हे).
  20. फोटो कम तय मस्तिष्क स्लाइस, सेरिबैलम, brainstem और मोटर प्रांतस्था (यदि लागू हो).
  21. एक स्केलपेल ब्लेड के साथ प्रत्येक 2 सेमी कम तय रीढ़ की हड्डी अनुभाग से 2 मिमी मोटी अनुप्रस्थ वर्गों में कटौती।
  22. 2 एमएल प्रस्फुरेशन शीशियों में वर्गों रखें और 4% पीएफए में 2.5% glutaraldehyde के समाधान के साथ भरें।
  23. शेष अनुभाग को मूल 20 एमएल प्रस्फुरेशन शीशी पर वापस करें। Sorenson बफर के साथ कुल्ला अनुभाग और cryoprotection समाधान के साथ बदलें.

3. पैथोलॉजी

नोट: दाएँ गोलार्द्ध के लघु-फिक्स्ड स्लाइस के साथ-साथ लंबे समय से तय बाएं गोलार्द्ध (कई महीनों के लिए 4% पीएफए में रखा गया) या तो 30 डिग्री मीटर वर्गों में कटौती कर रहे हैं (मुक्त फ़्लोटिंग के रूप में संदर्भित) या पैराफिन में एम्बेडेड और 12-14 डिग्री वर्गों के रूप में कटौती (के रूप में संदर्भित पैराफिन-एम्बेडेड)। इन वर्गों demyelinating घावों और प्रमुख हिस्टोसंगतता जटिल द्वितीय (MHC-II) diaminobenzidine (DAB) विधि का उपयोग कर प्रतिरक्षा गतिविधि के लिए पता लगाने के लिए प्रोटीओलिपिड प्रोटीन (पीएलपी) के साथ आम तौर पर संसाधित कर रहे हैं। इन प्रोटोकॉलों का मानकीकरण किया गया है और कई प्रकाशनों2,3,4,5,6,7,8,9 में उपयोग किया गया है , 10 , 11 , 12.

  1. फ्री-फ्लोटिंग (30 डिग्री मी) DAB-एविडिन-बायोटिन कॉम्प्लेक्स (एबीसी) ऊतक दाग
    1. cryostorage समाधान से वर्गों निकालें, एक छह अच्छी तरह से थाली के लिए वर्गों हस्तांतरण, और उन्हें धोने के लिए 3x 5 मिनट प्रत्येक 1x फॉस्फेट बफर नमकीन पीएच 7.0 (पीबीएस) के 2 एमएल में प्रत्येक के लिए। जब छह अच्छी तरह से थाली में अगले अच्छी तरह से स्थानांतरित करने के लिए उपयोग देखभाल ऊतक आंसू नहीं है. प्रत्येक धोने और ऊष्मायन कदम के दौरान, एक शेकर पर छह अच्छी तरह से प्लेट जगह है और ऊतक धीरे हिला करने के लिए अनुमति देते हैं।
      नोट: ऊतक वर्गों छोटी मात्रा में और बड़े प्लेटों में incubated (यानी, 12- और 24 अच्छी प्लेटें) सतह और किनारे फाड़ प्रदर्शन करते हैं.
    2. 10 लाख मीटर साइट्रेट बफर (पीएच 6.0) के लगभग 30 एमएल युक्त एक ग्लास बीकर में माइक्रोवाविंग वर्गों द्वारा प्रतिजन पुनर्प्राप्ति करें। सुनिश्चित करें कि ऊतकों को 2-3 मिनट के लिए एक तूलिका और माइक्रोवेव वर्गों के साथ जोड़ कर जोड़ नहीं रहे हैं या जब तक साइट्रेट बफर फोड़ा शुरू होता है। वर्गों कमरे के तापमान ($ 20 मिनट) को ठंडा करने के लिए अनुमति दें।
    3. स्थानांतरण वर्गों एक छह अच्छी तरह से थाली के लिए वापस और धोने वर्गों 3x के लिए 5 मिनट PBS के 2 एमएल में प्रत्येक / 3% एच22के 2 एमएल में इनक्यूबेटिंग वर्गों द्वारा ब्लॉक अंतर्जात peroxidases (आरटी) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए Triton X-100/
    4. PBS/0.3% Triton X-100 के 2 एमएल में प्रत्येक 5 मिनट के लिए 3x धो अनुभाग. आरटी में 1 एच के लिए 3% सामान्य बकरी सीरम के 2 एमएल में ब्लॉक वर्गों /
    5. सूजन का पता लगाने के लिए माइक्रोग्लिया और माइलिन एपिटोप के खिलाफ निर्देशित प्राथमिक एंटीबॉडी में रात भर 5 दिनों (एंटीबॉडी पर निर्भर करता है) वर्गों को इनक्यूबेट करें सूजन का पता लगाने के लिए (एमएचसीआईआई) और डेमिलीनेशन (पीएलपी) (सामग्री की तालिकादेखें ) 4 डिग्री सेल्सियस पर।
      नोट: सुनिश्चित करें कि इस चरण या बाद के चरणों में इनक्यूबेट करते समय अनुभागों को जोड़ नहीं दिया जाता है क्योंकि यह दाग के शून्य होने वाले वर्गों के भीतर के क्षेत्रों को ले जाएगा।
    6. 1x पीबीएस के 2 एमएल में प्रत्येक 5 मिनट के लिए वर्गों 3x धोलो. फिर माध्यमिक biotinylated एंटीबॉडी में वर्गों incubate (सामग्री की तालिकादेखें ) RT में 1 एच के लिए. अगले धोने कदम से पहले लगभग 45 मिनट के लिए इनक्यूबेशन के दौरान Avidin-बायोटिन कॉम्प्लेक्स (एबीसी) समाधान तैयार एबीसी परिसरों के रूप में अनुमति देने के लिए।
    7. 1x पीबीएस के 2 एमएल में प्रत्येक 5 मिनट के लिए वर्गों 3x धोलो. फिर आरटी में 1 एच के लिए एबीसी में वर्गों incubate।
    8. 1x पीबीएस के 2 एमएल में वर्गों को 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार धोएं। फ़िल्टर्ड DAB (2 एमएल/वेल/अनुभाग) में इनक्यूबेट अनुभाग ों में H2O2 (1:500 DAB में 30% H2O2) का उत्पादन तब तक जब तक रंग पर्याप्त रूप से विकसित नहीं होता है ($3-8 min)।
    9. 1x पीबीएस के 2 एमएल में प्रत्येक 5 मिनट के लिए वर्गों 3x धोलो. संकेत बढ़ाने के लिए (वैकल्पिक), osmicate का उपयोग कर 0.04% OsO4 ($ 30 s).
    10. 1x पीबीएस में प्रत्येक 5 मिनट के लिए तीन बार वर्गों धो। व्यक्तिगत रूप से, छह अच्छी तरह से प्लेट से प्रत्येक अनुभाग को 1x पीबीएस से भरा एक छोटा कंटेनर में स्थानांतरित करें और ऊतक अनुभाग को कांच की स्लाइड पर यथासंभव फ्लैट रखें।
    11. धीरे से पीबीएस से बाहर स्लाइड उठा, जबकि ऊतक अनुभाग सुनिश्चित करने के रूप में संभव के रूप में फ्लैट है. दो पेंट ब्रश का उपयोग करना, धीरे समतल और स्लाइड पर ऊतक बाहर खिंचाव और कागज तौलिया के साथ अतिरिक्त पानी दूर डब. ग्लिसरोल (या एक समकक्ष बढ़ते मीडिया) के साथ ऊतक वर्गों माउंट और स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप सील।

4. पैराफिन-एम्बेडेड हेमीगोलिक धाराएं: DAB दाग

  1. 5-10 मिनट के लिए एक 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में स्लाइड बंद पिघल पैराफिन।
  2. 5 मिनट प्रत्येक के लिए xylene 3x में incubating द्वारा वर्गों de-paraffinize.
  3. 100% पर वर्गीकृत इथेनॉल में पुनः हाइड्रेट ऊतक (2x 5 मिनट प्रत्येक के लिए), 95% (2x 5 मिनट के लिए), 70% (2x 5 मिनट प्रत्येक के लिए), और 50% (1x के लिए 5 मिनट प्रत्येक). PBS में स्लाइड कवर करें.
  4. 10 एमएम साइट्रेट बफर (पीएच 6.0) के बीकर में माइक्रोवाविंग स्लाइड द्वारा एंटीजन पुनः प्राप्त करें।
  5. 1x पीबीएस (3x के लिए 5 मिनट प्रत्येक) में स्लाइड धो एक बार कमरे के तापमान को ठंडा. 3% एच2ओ 2 में ऊतक इनक्यूबेटकर द्वारा ब्लॉक अंतर्जात peroxidases2/1% Triton-X 100/
  6. 1x पीबीएस में ऊतक धोने के लिए तीन बार 5 मिनट प्रत्येक. 1 एच के लिए पीबीएस में 6% सामान्य बकरी सीरम के साथ ब्लॉक ऊतक।
  7. कमरे के तापमान पर पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी (सामग्री की तालिकादेखें) में इनक्यूबेट वर्गों रात भर (अधिकतम 20 ज)।
  8. 1x पीबीएस में प्रत्येक 5 मिनट के लिए वर्गों 3x धो। फिर इसी द्वितीयक एंटीबॉडी में वर्गों को इनक्यूबेट करें (सामग्री की तालिकादेखें ) पीबीएस में आरटी में 1 एच के लिए।
  9. ऊष्मायन के दौरान अगले धोने के कदम से पहले लगभग 45 मिनट एबीसी समाधान तैयार करें।
  10. 1x पीबीएस में प्रत्येक 5 मिनट के लिए वर्गों 3x धोएं और फिर आरटी में 1 एच के लिए एबीसी में इनक्यूबेट करें।
  11. 1x पीबीएस में प्रत्येक 5 मिनट के लिए धारा 3x धो एं.
  12. फ़िल्टर्ड में इनक्यूबेट वर्गों (0.45 मीटर फिल्टर छिद्र आकार) DAB युक्त एच22 (1:500 DAB में 30% एच22 के कमजोर पड़ने) जब तक रंग पर्याप्त रूप से विकसित करता है ($3-8 मिनट).
  13. 1x पीबीएस में धाराओं (3x 5 मिनट) धोएं। संकेत को बढ़ाने के लिए, osmicate का उपयोग कर 0.04% osmium tetroxide (OsO4; लगभग 30 s).
  14. 1x पीबीएस में वर्गों (3x 5min) धो.
  15. इथेनॉल 50% (1x 5min), 70% (1x 5min), 95% (2x 5min), 100% (2x 5 मिनट), और 100% xylene (1x 5min) की एक वर्गीकृत श्रृंखला में निर्जलीकरण ऊतक. जाइलीनों को वाष्पित होने दें।
  16. toluene आधारित तेजी से सूखी बढ़ते मीडिया के साथ माउंट वर्गों. एंटी-ऑक्सीडेंट होते हैं कि Formulations दाग विरंजन को रोकने के लिए सिफारिश कर रहे हैं। बाद के भंडारण के लिए एक उस्तरा के साथ स्लाइड किनारों से अतिरिक्त बढ़ते मीडिया निकालें।

5. एमआरआई/पैथोलॉजी सहसंबंध

नोट: पैथोलॉजी के साथ एमआरआई को सहसंबंधित करने के लिए, हम पहले लंबे समय से तय बरकरार मस्तिष्क गोलार्द्ध के पूर्व विवो एमआरआई प्रदर्शन (ऊपर चरण 2.9) एमआरआई-दृश्य मार्करों टुकड़ा करने का संकेत के साथ एक समायोज्य बॉक्स में टुकड़ा टुकड़ा करने का संकेत. हम तो मस्तिष्क टुकड़ा और तस्वीर 1 सेमी स्लाइस व्यक्तिगत मस्तिष्क स्लाइस करने के लिए situ एमआरआई के सह पंजीकरण सक्षम करने के लिए. हम तो एमआरआई निर्देशित विश्लेषण प्रदर्शन कर सकते हैं, जहां ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) एमआरआई पर पहचान कर रहे हैं ऊतक विश्लेषण प्रत्यक्ष. हम हिस्टोपैथोलॉजी-गाइडेड विश्लेषण भी कर सकते हैं, जहां आरओआई की पहचान ऊतक पर की जाती है (जैसे, सफेद पदार्थ के घाव, बिना डीमाइएलिनेशन के सफेद पदार्थ, आदि) और फिर सह-स्थानीयकृत एमआरआई उपायों की विशेषता (तालिका1)।

  1. एमआरआई आधारित आरओआई की पहचान
    नोट:
    पिछले अध्ययनों में, हम सफेद बात11, 12,13,14,15 और ग्रे बात16,17में ROIs की पहचान की है, 18नीचे दिया गया उदाहरण श्वेत-पदार्थ विश्लेषण के लिए है।
    1. खंड T2 hyperintense घावों पर situ MRIs (चरण 1.1 से), शुरू में एक स्वचालित एल्गोरिथ्म द्वारा संसाधित, और फिर अनुभवी उपयोगकर्ताओं द्वारा मैन्युअल रूप से सही.
    2. टी 2 घावों के भीतर खंड T1 hypointense घावों एक संकेत तीव्रता से कम या आसपास के सामान्य दिखने मस्तिष्क के ऊतकों के संकेत तीव्रता के 80% के बराबर के साथ voxels के रूप में.
    3. चुंबकन हस्तांतरण अनुपात (एमटीआर) एक 80% सीमा के साथ नक्शे में खंड hypointense क्षेत्रों.
    4. उपरोक्त खंडों का उपयोग करते हुए तीन वर्गीकरण बनाएँ: (क) टी 2-केवल घाव जो T2-भारित/FLAIR स्कैन पर असामान्य हैं लेकिन T1-भारित या एमटीआर स्कैन पर सामान्य हैं, (ख) T2T1MTR घावों, जो सभी T2-भारित/FLAIR, T1-भारित, और एमटीआर स्कैन पर असामान्य हैं; और (ग) सामान्य दिखने वाले सफेद पदार्थ (NAWM), जो सभी T2-भारित/FLAIR, T1-भारित, और एमटीआर स्कैन पर सामान्य हैं।
      नोट: स्लाइस का हमारा चयन सभी तीन क्षेत्रों के हित प्रकार के अस्तित्व पर आधारित है (T2-केवल, T2T1MTR, और NAWM) एक ही स्लाइस पर.
    5. विभिन्न दिमाग और विभिन्न मस्तिष्क स्थानों से उत्पन्न होने वाली परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए प्रत्येक ROI के लिए सामान्यीकृत तीव्रता की गणना करें।
  2. मस्तिष्क स्लाइस के लिए situ एमआरआई के सह-पंजीकरण
    1. एक चाकू मस्तिष्क टुकड़ा करने के लिए डाला जा सकता है, जहां स्लॉट स्थानीयकरण एमआरआई के प्रति संवेदनशील मार्करों की चार पंक्तियों के साथ एक कस्टम टुकड़ा बॉक्स में निश्चित मस्तिष्क गोलार्द्ध स्कैन. 1 मिमी isotropic संकल्प निश्चित मस्तिष्क और मार्करों के सभी को कवर के साथ एक T1 भारित 3 डी MPRAGE अधिग्रहण प्रदर्शन.
      नोट: यह पोस्ट-फिक्सेशन एमआरआई कहा जाता है और केवल मस्तिष्क स्लाइस करने के लिए insitu एमआरआई के सह पंजीकरण के लिए एक मध्यवर्ती कदम के रूप में प्रयोग किया जाता है।
    2. स्कैनिंग के तुरंत बाद, 1 सेमी अलग स्थित स्लॉट में मस्तिष्क गोलार्द्ध टुकड़ा, लगभग में जिसके परिणामस्वरूप 15 स्लाइस.
    3. दोनों पूर्वकाल और पीछे की ओर पर मस्तिष्क स्लाइस फोटो.
    4. निम्नलिखित चरणों के साथ इन सीटू एमआरआई और मस्तिष्क स्लाइस की तस्वीरों को सह-पंजीकृत करें।
      1. पोस्ट-फिक्सेशन और सीटू एमपीआरईएजी के विभाजन के लिए, पूर्व-प्रक्रिया दोनों पोस्ट-फिक्सेशन और तीव्रता गैर-एकरूपता19के लिए सीटू एमपीआरई एम आई ज ।
        1. मस्तिष्क और पूर्व प्रसंस्कृत पोस्ट-फिक्सेशन MPRAGE से मार्करों की चार पंक्तियों को खंड.
        2. गोलार्द्ध के बाद निर्धारण एमआरआई20केलिए इसी खंड,21 situ MPRAGE में पूर्व संसाधित से.
      2. एफएसएल फ़्लर्ट22का उपयोग करते हुए रैखिक पंजीकरण प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला के माध्यम से मस्तिष्क-निष्कर्षित और पोस्ट-फिक्सेशन एमआरआई को 12 डिग्री-ऑफ-फ्रीडम (affine पंजीकरण) तक की एक श्रृंखला के माध्यम से सह-पंजीकृत करें। स्केलिंग और कतरनी घटक निर्धारण संकुचन के प्रभाव के लिए खाते हैं।
      3. विभाजित मार्करों का उपयोग कर अधिकतम अनुमानित तीव्रता का योग को कम से कम करके टुकड़ा विमान की सामान्य दिशा का पता लगाएं। ये पुन: अभिविन्यास कोण पिछले चरण से प्राप्त रूपांतरण मैट्रिक्स में शामिल किए गए हैं।
      4. नेत्रहीन एक घर में छवि दर्शक है कि गहराई और सामान्य वैक्टर के उन्मुखीकरण को बदलने के लिए अनुमति देता है का उपयोग कर निश्चित पीछे मस्तिष्क स्लाइस की तस्वीरों के लिए एमआरआई छवियों मैच. छोटे संशोधनों की जरूरत है क्योंकि मस्तिष्क टुकड़ा करने अपूर्ण है.
      5. मस्तिष्क स्लाइस की तस्वीरों के रूप में एक ही टुकड़ा करने वाले स्थानों के लिए situ MRIs में बदलने के लिए प्रत्येक स्लाइस के लिए AFFINE छवि परिवर्तन13 लागू करें।

Representative Results

जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, मस्तिष्क गोलार्द्ध के लगभग आधे जमे हुए है और डीएनए, आरएनए, या प्रोटीन का उपयोग आणविक अध्ययन के लिए उपलब्ध है. ऐतिहासिक रूप से, पोस्टमार्टम मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग कर अध्ययन के लिए पूर्व-मर्तियों, उम्र, लिंग, ऊतक पीएच, MRNA अखंडता (RIN), पोस्टमार्टम अंतराल (पीएमआई), नैदानिक निश्चितता, comorbidsubstance उपयोग, और पूर्व दवा उपचार से प्रभावित होना दिखाया गया है स्थिति23| मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग कर अध्ययन के आधार पर, डीएनए और प्रोटीन आरएनए की तुलना में कम हद तक प्रभावित प्रतीत होता है. हमारे अनुभव के आधार पर, आरएनए अलगाव और बहाव विश्लेषण, तथापि, सबसे पूर्व पोस्टमार्टम की स्थिति और मस्तिष्क के ऊतकों के पोस्टमार्टम अंतराल से प्रभावित पाया गया है. इसलिए हम पोस्टमार्टम एमएस ऊतकों का उपयोग कर आरएनए आधारित विश्लेषण के संचालन के लिए पीछा किया जा करने के लिए शर्तों में से कुछ पर चर्चा.

हमारे सभी अध्ययनों के लिए, के बाद मस्तिष्क autopsy में एकत्र किया जाता है, यह कटा हुआ है (1 सेमी मोटी) और फिर या तो में तय 4% paraformaldehyde में आकृतिविज्ञान अध्ययन के लिए या तेजी से जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए जमे हुए. सभी ऊतक ब्लॉकों ऊपर वर्णित के रूप में PLP का उपयोग कर immunostaining द्वारा demyelination के लिए विशेषता है. एक प्रतिनिधि विश्लेषण योजना चित्र 1में दिखाई गई है। सफेद पदार्थ घावों की उपस्थिति के लिए ऊतक खंडों की जांच की जाती है (चित्र 1क)। चयनित क्षेत्र प्रतिरक्षा क्रियाकलाप के लिए दागदार होते हैं (चित्र 1ख) और विमीयन (चित्र 1ग) . जमे हुए ऊतक क्रायओस्टैट पर लगाए जाते हैं (चित्र 1D) और जमे हुए 30 डिग्री खंड काट दिए जाते हैं। इसके बाद 3-4 बाद के खंडों का संग्रह, आस-पास के ऊतकों से अलगाव, और डीएनए, आरएनए, या प्रोटीन अलगाव के लिए भंडारण किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए हमने डी एन ए24,25, आरएनए5,6,7,8,9 के साथ - साथ प्रोटीन26को सफलतापूर्वक अलग कर दिया है . जबकि एमएस दिमाग से आरएनए का विश्लेषण अध्ययन के कुछ से प्रमुख निष्कर्षों पर चर्चा कर रहे हैं, यहाँ आरएनए पोस्टमार्टम एमएस दिमाग के विश्लेषण से संबंधित मुद्दों में से कुछ हैं.

Figure 1
चित्र1: MRNA विश्लेषण के लिए नमूना संग्रह. (ए) ऑटोप्सी ऊतक का चयन विश्लेषण के लिए किया जाता है। ऊतक के क्षेत्रों का चयन किया जाता है और ऊतक के एक हिस्से को एक्साइज किया जाता है। सभी वर्गों के साथ दाग रहे हैं (बी) MHC-II (मुख्य हिस्टो संगतता परिसर (MHC) वर्ग द्वितीय HLA-DR CR3/43) एंटीबॉडी भड़काऊ गतिविधि का पता लगाने के लिए और के साथ (सी ) proteolipid प्रोटीन (PLP) प्रकाशित प्रोटोकॉल का उपयोग कर myelin स्थिति का निर्धारण करने के लिए. माइलिन स्थिति के आधार पर, ब्लॉक एक स्केलपेल (डी)द्वारा रन बनाए जाते हैं। खंड (60 डिग्री मी) काट रहे हैं () और क्षेत्रों है कि पहले से रन बनाए गए हैं हटा रहे हैं, ट्यूबों में अलग, और लेबल (एफ) . ऊतक का उचित संग्रह सुनिश्चित करने के लिए हर 5 वर्गों के बाद पीएलपी और एमएचसी-II दाग दोहराए जाते हैं। सामान्य दिखने सफेद बात (NAWM) नोट किया है और सफेद पदार्थ घावों (WML) लाल रंग में उल्लिखित हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एमएस10के घावों में Axonal ट्रांससेक्शन| इस कार्यक्रम का एक प्रारंभिक वैज्ञानिक ध्यान demyelinated सफेद पदार्थ घावों के सेलुलर घटकों की विशेषता पर था. स्थानीयकृत एंटीजनों में गैर-फॉस्फोरिलेट न्यूरोफिलामेंट (एनएफएस) था। अधिकांश एनएफ मायलिनित एक्सॉन्स में फॉस्फोरिनकिए होते हैं। demyelination पर, एक्सॉन्स dephosphorylated हैं. हमने डेमाइलिनेटाड एक्सॉन्स में गैर-फॉस्फोरीलेटाहुआ एनएफ की अपेक्षित अभिव्यक्ति का पता लगाया। तीव्र एमएस घावों में, इनमें से कई demyelinated axons axonal वापसी बल्ब के रूप में समाप्त हो गया (चित्र 2A),जो transected axons के निकट छोर को प्रतिबिंबित. सन्निकट सामान्य क्षेत्र 10 की तुलना में तीव्र घावों में पारवहनअक्ष1110 मिमी3 से अधिक होते हैं . इन टिप्पणियों में मदद की एमएस अनुसंधान में एक प्रतिमान बदलाव है कि एमएस के साथ व्यक्तियों में स्थायी तंत्रिका विज्ञान विकलांगता के प्रमुख कारण के रूप में neurodegeneration विशेषता की ओर क्षेत्र ले जाया गया.

Figure 2
चित्रा 2: भड़काऊ demyelination के दौरान Axonal transection. अक्षीय ट्रान्सेक्शन सूजन demyelination के दौरान होता है (, arrowheads) और टर्मिनल axonal ovoids के गठन लाती है (, तीर). जब मात्रानिर्धारित (बी), transected axons एमएस घावों में प्रचुर मात्रा में हैं और घाव की भड़काऊ गतिविधि के साथ सहसंबंधित करने के लिए दिखाई देते हैं। पैनल एक Trape एट अल से पुनरुत्पादित10 अनुमति के साथ. लाल: प्रोटीओलिपिड प्रोटीन, हरा: एंटी नॉनफॉस्फोरिलेटन्यूरोलैमेंट। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पुराने एमएस दिमाग में पुनर्विवाह3| एमएस के प्रारंभिक चरणों के दौरान रेमिनेलेशन मजबूत हो सकता है। कई पुराने एमएस घावों, हालांकि, remyelinated नहीं कर रहे हैं. हमने जांच की कि क्या ओलिगोडेनड्रोसाइट संतति कोशिकाओं (OPCs) की उपस्थिति या नए ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स की पीढ़ी लंबे समय से demyelinated सफेद पदार्थ घावों के remyelination सीमा. जबकि OPC घनत्व अक्सर कम हो गया था, वे सभी लंबे समय से demyelinated घावों3में मौजूद थे. कई पुराने एमएस घावों में नव-उत्पन्न ओलिगोडेनड्रोसाइट्स भी मौजूद थे। ओलिगोडेनड्रोसाइट प्रक्रियाओं से संबंधित है, लेकिन myelinate demyelinated axons नहीं किया (चित्र 3) . इन अध्ययनों से संकेत मिलता है कि OPCs और नए oligodendrocytes का उत्पादन करने की उनकी क्षमता पुरानी सफेद पदार्थ घावों के remyelination सीमित नहीं कर रहे हैं. हम hypothesized है कि लंबे समय से demyelinated axons, जो अक्सर dystrophic दिखाई दिया, नव उत्पादित oligodendrocytes द्वारा remyelination के लिए ग्रहणशील नहीं थे.

Figure 3
चित्र 3: एक्सॉन ्स्स से जुड़े ओलिगोडेनड्रोसाइट्स के पूर्व-माइलिनिंग की प्रक्रिया। पीएलपी एंटीबॉडी (पैनलए , बीमें लाल) और न्यूरोफिलामेंट एंटीबॉडी (पैनल ए, बी में हरे रंग) के साथ दाग एमएस घावों के confocal micrographs दिखाए जाते हैं। एक पुरानी एमएस घाव में demyelinated axons (पैनल ए में हरे) के क्षेत्र में एक पूर्व myelinating oligodendrocyte (पैनल ए में लाल) (एसवीजेड) demyelinated axons के क्षेत्र में विस्तारित प्रक्रियाओं. इन प्रक्रियाओं में से कई (पैनल ए में तीर) axons के आसपास सर्पिल, के रूप में उच्च आवर्धन (पैनल बी) में दिखाया गया है. स्केल बार 20 डिग्री (A) और 5 डिग्री मी (B) का प्रतिनिधित्व करते हैं. अनुमति के साथ चांग एट अल3 से पुन: उत्पादित. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एमएस6में Mitochondrial रोग| हम पुरानी एमएस रोगियों से प्राप्त तेजी से जमे हुए मोटर प्रांतस्था में न्यूरोनल जीन परिवर्तन के लिए एक निष्पक्ष खोज प्रदर्शन किया (चित्र 4A). इस डेटा सेट की एक निष्पक्ष खोज एमएस में 23 परमाणु-एनकोडेड माइटोकोंड्रियाल एम.आर.एन.ए.एन.एस. में महत्वपूर्ण कटौती की पहचान की गई (चित्र 4 बी)। इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और सीटू हाइब्रिडाइजेशन का उपयोग करते हुए अध्ययनों को प्रमाणित करने से संकेत मिलता है कि ये जीन कॉर्टिकल प्रक्षेप न्यूरॉन्स में अत्यधिक समृद्ध थे (चित्र 4C) और यह कि माइटोकोंड्रिया प्रक्षेपण एक्सॉन्स से अलग ग्लाइकोलिसिस कम प्रदर्शित करता है ( चित्र 4D). इस कागज mitochondrial रोग पर ध्यान केंद्रित उत्प्रेरित और एमएस में axonal अध: पतन के लिए एक प्रमुख योगदानकर्ता के रूप में एटीपी उत्पादन कम.

Figure 4
चित्र 4: माइक्रोएरे डेटा और डाउनस्ट्रीम सत्यापन तकनीकएमएस मोटर प्रांतस्था में प्रदर्शन किया। (ए) नियंत्रण (सी 1-सी 6) और एसपीएमएस (एमएस1-एमएस6) मोटर कॉर्टेक्स नमूनों से काफी परिवर्तित ट्रांसक्रिप्ट्स की पदानुक्रमिक क्लस्टरिंग, रोग से संबंधित जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का अलग से समर्थन करती है। एमएस मोटर प्रांतस्था में घटी हुई प्रतिलिपिके ंं छब्बीस इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (बी) से संबंधित थे। Mitochondrial जटिल मैं (NDUFA6) MRNA न्यूरॉन्स में कमी आई थी (एन $ 55-130)एमएस मोटर प्रांतस्था में ( सीआईआई ) नियंत्रण की तुलना में (सीआईआई), जबकि PLP MRNA घनत्व नियंत्रण के बीच समान थे (CIII) और एमएस (CIV) सेरेब्रल कॉर्टेक्स. इलेक्ट्रॉन परिवहन परिसरों की गतिविधि I और III में एमएस रोगियों की मोटर प्रांतस्थासे माइटोकोंड्रिल समृद्ध भिन्नों में कमी आई गई (द र् 3) (घ ) अनुमति के साथ दत्ता एट अल6 से reprinted. त्रुटि पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं; सीआई-4 में स्केल बार 25 डिग्री सेल्सियस * पी एंड एलटी; 0.05 छात्रों की टी-टेस्ट है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एमएस8में संज्ञानात्मक रोग के रोगजनन| एमएस रोगियों के चालीस से 60% संज्ञानात्मक गिरावट और कम कार्यकारी समारोह है. हमने हिप्पोकैम्पस की पहचान की, जो एमएस में डिमाइलिनेशन के लिए एक आम साइट के रूप में स्मृति/लर्निंग की एक कार्यात्मक साइट है। हम अगले myelinated और demyelinated हिप्पोकैम्पी में न्यूरॉन जीन अभिव्यक्ति की तुलना में और स्मृति में शामिल न्यूरॉन mRNAs एन्कोडिंग प्रोटीन में महत्वपूर्ण कमी पाया / हम का प्रदर्शन है कि microRNAs का चयन demyelinated हिप्पोकैम्पस में वृद्धि कर रहे हैं और इन microRNAs ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति को कम कर सकते हैं कि प्रदर्शन द्वारा इन आंकड़ों का विस्तार किया. हम पुनरुत्पादित और कृंतक मॉडल में इन टिप्पणियों का विस्तार किया है. हम अगले myelinated और demyelinated हिप्पोकैम्पी में न्यूरॉन जीन अभिव्यक्ति की तुलना में और स्मृति में शामिल न्यूरॉन MRNA एन्कोडिंग प्रोटीन में महत्वपूर्ण कमी पाया /

Figure 5
चित्र 5: ऊतक संग्रह, हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण, और एमएस हिप्पोकैम्पस में जीन अभिव्यक्ति अध्ययन। हिप्पोकैम्पस युक्त मस्तिष्क स्लाइस autopsy के दौरान चयन कर रहे हैं (एक) और हिप्पोकैम्पस और आसपास के क्षेत्र को हटा दिया जाता है (लाल बॉक्स) आगे विश्लेषण के लिए. पीएलपी के लिए इम्यूनोस्टेनिंग ने सभी नियंत्रण (बी) और 40% एमएस हिप्पोकैम्पी (सी) में माइलिन का संरक्षण दिखाया . एमएस हिप्पोकैम्पी (डी) के 60% में व्यापक demyelination पाया गया था. जब नियंत्रण हिप्पोकैम्पी (, जी, मैं) की तुलना में , CA1 , CA3 , या DEmyelinated एमएस हिप्पोकैम्पी (एफ, एच, जे) के CA4 क्षेत्रों में महत्वपूर्ण न्यूरॉन हानि का पता नहीं लगाया गया था , जैसा कि हूर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा दिखाया गया है। माइलिन (माइलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी), हरे रंग (एसएमआई32, लाल) के लिए डबल-लेबलिंग इम्यूनोफ्लोरेसेंस ( एस डीलीनेटाडहिप्पोकैम्पस की तुलना में एमएस डेमाइलिनेनेट हिप्पोकैम्पस में ) के सापेक्ष संरक्षण के साथ माइलिन (एल) की हानि दिखाई गई ( MBP, कश्मीर; SMI32, एम). MRNA अभिव्यक्ति के स्तर की दोहरी क्लस्टरिंग myelin स्थिति के आधार पर असतत समूहों में नमूने की व्यवस्था की (myelinated और demyelinated) और स्थान (हिप्पोकैम्पस बनाम मोटर प्रांतस्था)(हे). उच्च MRNA स्तर लाल और नीले रंग से संकेत दिया जाता है कम अभिव्यक्ति के स्तर को दर्शाता है. पैनल सी-ओ अनुमति के साथ दत्ता एट अल8 से अनुकूलित। B-D: 2 मिमी, ई-जे: 100 डिग्री, K-N: 50 $m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

एमआरआई परिवर्तन के पैथोलॉजिकल संबंधित12| जबकि एमआरआई एमएस निदान और उपचार के लिए प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण सूचक है, और यह भी एमएस रोग प्रगति के एक predictor है, एमआरआई परिवर्तन के रोग सहसंबंध ों खराब समझ रहे हैं. हमारे पोस्टमार्टम एमआरआई अध्ययन दो एमआरआई ROIs पर ध्यान केंद्रित किया है. सेरेब्रल सफेद-मटर ROIs कि केवल T2 hyperintense थे (T2 केवल) और ROIs कि T1 hypointensity का एक संयोजन था, T2 hyperintensity, और कम चुंबकन हस्तांतरण अनुपात (MTR) (T2T1MTR). मस्तिष्क सफेद बात T2 के लगभग 45% T2-केवल ROIs myelinated थे, उनके गैर विशिष्ट प्रकृति की पुष्टि. इसके विपरीत, T2T1MTR ROIs के 83% लंबे समय से demyelinated थे और ब्लैक होल के रूप में दिखाई दिया. T1 और एमटीआर मान अर्द्ध मात्रात्मक हैं और उनके मूल्यों T2T1MTR ROIs में बड़े पैमाने पर विविध. यदि myelin की हानि इन एमआरआई परिवर्तन के लिए केवल योगदानकर्ता है, तो मूल्यों स्थिर होना चाहिए. सूजन demyelinated axons दोनों T1 और एमटीआर मूल्यों के साथ सहसंबद्ध.

Figure 6
चित्र 6: चुंबकन अंतरण अनुपात (एमटीआर) और T1 विपरीत अनुपात रैखिक रूप से पुराने एमएस घावों में Na+/K+ ATPase-सकारात्मक एक्सॉन के प्रतिशत के साथ सहसंबंधित होते हैं। कालक्रम से दागी घावों को ना+/K+ ATPase (हरा ) के लिए दाग दिया गया है , जो तंत्रिका -लिटेंस (लाल) में लगभग 100% () से शून्य (बी) तक भिन्न होता है. ना+ /K+ ATPase के बिना कई axons व्यास (बी) में वृद्धि हुई थी. Na+/K+ ATPase-सकारात्मक axons के प्रतिशत की तुलना में लंबे समय से demyelinated एमएस घावों मात्रात्मक पोस्टमार्टम एमटीआर के साथ सहसंबद्ध (पी एंड एलटी; 0.0001, सी) और T1 विपरीत अनुपात (p और lt; 0.0006, डी)। प्रत्येक डेटा बिंदु एक घाव से है और प्रत्येक अद्वितीय रंग प्रतीक संयोजन का अध्ययन दिमाग में से एक को दर्शाता है. तराजू सलाखों $ 5 डिग्री मीटर की अनुमति के साथ युवा एट अल से पुनरुत्पादित.12. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तंत्रिकाजनन demyelination11के स्वतंत्र| ऐतिहासिक रूप से, एमएस में neurodegeneration demyelination से परिणाम करने के लिए सोचा गया है. ब्रेन इमेजिंग अध्ययन, तथापि, संभावना है कि neurodegeneration और demyelination स्वतंत्र घटनाओं हो सकता है उठाया है. हमने हाल ही में एमएस रोगियों की एक उपजनसंख्या की पहचान की है जो रीढ़ की हड्डी और सेरेब्रल कॉर्टेक्स के demyelination है, लेकिन मस्तिष्क सफेद पदार्थ की नहीं. हम myelocortical एमएस (MCMS) के रूप में इस एमएस उपप्रकार गढ़ा. MCMS मामलों मस्तिष्क सफेद पदार्थ demyelination और cortical न्यूरॉन हानि के बीच संबंधों की जांच करने के लिए एक मंच प्रदान की. नियंत्रण cortices की तुलना में, cortical न्यूरॉन हानि काफी विशिष्ट एमएस cortices की तुलना में MCMS cortices में अधिक से अधिक था. नियंत्रण मस्तिष्क ऊतक क्लीवलैंड क्लिनिक में पैथोलॉजी विभाग से प्राप्त किया गया था. इस अध्ययन demyelination के अभाव में neurodegeneration के लिए पहला रोग सबूत प्रदान करता है.

Figure 7
चित्रा 7: मस्तिष्क सफेद पदार्थ demyelination की अनुपस्थिति में तंत्रिका हानि. विशिष्ट एमएस () होने के रूप में वर्गीकृत एक व्यक्ति से एक cresyl बैंगनी - दाग कोरोनल अर्धगोलीय खंड . पांच लेबल वाले क्षेत्रों में से प्रत्येक में कॉर्टिकल परतों III, V, और VI में न्यूरोनल घनत्व की तुलना की गई थी। 60 डिग्री मीटर2 (पीला) से अधिक क्षेत्र वाले तंत्रिकाओं को बेहतर लौकिक प्रांतस्था (बी) से एक प्रतिनिधि छवि में दिखाया गया है। PLP के लिए लेबलिंग और demyelinated घावों के वितरण (सफेद पदार्थ demyelination नीले रंग में प्रकाश डाला है; subpial demyelination गुलाबी में प्रकाश डाला है) विशिष्ट एमएस के साथ व्यक्तियों से अर्धगोलीय वर्गों में (सी) और myelocortical एमएस ( डी ) ) दिखाए जाते हैं। कम cortical न्यूरॉन घनत्व और वृद्धि हुई मस्तिष्क सफेद पदार्थ घाव मात्रा के बीच एक महत्वपूर्ण संबंध ठेठ एमएस में पाया गया था, लेकिन myelocortical एमएस में नहीं (); डैश्ड रेखाएँ 95% विश्वास अंतराल (सीआई) इंगित करती हैं। IFG ] अवर ललाट gyrus. STG - बेहतर लौकिक gyrus. इन्नी - अवर इन्सुला। INs - बेहतर insula. सीजी - सिंगुलेट gyrus. अनुमति के साथ Trap एट अल11 से पुन: उत्पादित. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुक्रम अवधि अनुक्रम विवरण अनुक्रम उपयोग
0:09 स्थानीयनिवासी बाद के दृश्यों के लिए स्थानीयकरण
9:14 3 डी मैग्नेटाइजेशन तैयार तेजी से ढाल गूंज (MPRAGE) मस्तिष्क संरचनाओं के संरचनात्मक इमेजिंग Volumetric आकलन
5:14 3 डी द्रव क्षीण व्युत्क्रम वसूली (FLAIR) लेसन पहचान लेशन विभाजन Volumetric घाव आकलन
2:35 2 डी टी 2 भारित लेसन पहचान लेशन विभाजन Volumetric घाव आकलन
5:12 चुंबकन हस्तांतरण पूर्व नाड़ी के साथ 3 डी ढाल-recalled गूंज , (एमटी-ऑन) सामान्य दिखने और lesional ऊतक में myelin सामग्री का पूर्ण उपाय
5:12 चुंबकन हस्तांतरण पूर्व नाड़ी के बिना 3 डी ढाल-recalled गूंज , (एमटी-ऑफ)
0:27 प्रसार टेन्सर इमेजिंग (DTI) फ़ील्ड मैपिंग मस्तिष्क ऊतक अखंडता को प्रतिबिंबित करने के लिए सोचा मस्तिष्क के ऊतकों में पानी प्रसार के उपाय.
10:27 प्रसार टेन्सर इमेजिंग (डीटीआई) बहु-खोल
1:18 प्रसार टेन्सर इमेजिंग (डीटीआई) बहु-खोल
39:48:00 SUBTOTAL: कोर

तालिका 1: पोस्टमार्टम इमेजिंग प्रोटोकॉल.

Discussion

हम एक प्रोटोकॉल है कि तेजी से खरीद और एमएस के साथ 150 से अधिक व्यक्तियों से ऊतक प्रक्रिया करने के लिए इस्तेमाल किया गया है का वर्णन. इस प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि वैज्ञानिकों कि ऊतक का उपयोग भी प्रोटोकॉल की स्थापना और ऊतक संग्रह प्रदर्शन के आरोप में हैं. यह व्यक्तिगत अनुसंधान परियोजनाओं की वैज्ञानिक आवश्यकताओं को पूरा करने में लचीलापन प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल के कई पहलुओं की उपयोगिता में वृद्धि. रोगियों को आम तौर पर अच्छी तरह से मौत से पहले विशेषता है, उनमें से कई के रूप में हमारे केंद्र में न्यूरोलॉजिस्ट द्वारा पीछा किया गया है. एक महत्वपूर्ण कदम ऊतक दान के प्रसंस्करण के तुरंत बाद मौत है, जो कुछ अन्य मस्तिष्क बैंकों की तुलना में जमे हुए ऊतक की गुणवत्ता बढ़ जाती है. यह आणविक अध्ययन है कि ट्रांसक्रिप्शनल और अनुवाद जीन उत्पादों में परिवर्तन का वर्णन करने में महान मूल्य के हैं सक्षम बनाता है, जो हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोसाइटोकेमिकल टिप्पणियों के substantiation के लिए आवश्यक हैं. कई मामलों में रूपात्मक/प्रतिरक्षा रासायनिक और आणविक डेटा का उपयोग करने से निष्कर्ष की विश्वसनीयता में वृद्धि होती है। यह सबसे अच्छा सेरेब्रल कॉर्टेक्स में mitochondrial जीन परिवर्तन और demyelinated हिप्पोकैम्पी में न्यूरॉन जीन परिवर्तन के हमारे विवरण से सचित्र है. उपन्यास जीन रूपरेखा प्रोटोकॉल एक तेजी से दर से विकसित किया जा रहा है और हमारे बैंक में जमे हुए ऊतक ऊतक और एकल सेल विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता आरएनए प्रदान करना चाहिए.

हमारे प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण पहलू कम तय मस्तिष्क स्लाइस है. इन ऊतकों को 30 मीटर-थिक, फ्री-फ्लोटिंग सेक्शन में काटा जाता है। इन वर्गों confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए तीन आयामों में दो या दो से अधिक प्रतिजनों का विश्लेषण करने के लिए आदर्श होते हैं. अच्छे उदाहरण पुरानी एमएस घावों में dystrophic axons के साथ पूर्व myelinating oligodendrocyte प्रक्रियाओं की बातचीत में शामिल हैं, साथ ही transected axonal वापसी बल्ब के लिए एकल axonal कनेक्शन की पहचान. यह 7 m-thick पैराफिन वर्गों, जहां 3 डी छवियों संभव नहीं हैं के नियमित उपयोग के विपरीत है. पैराफिन-एम्बेडेड ऊतकों में कुछ प्रश्नों के लिए बहुत महत्व है, विशेष रूप से अर्धगोलीय 7 मीटर-थिक वर्गों में न्यूरोनल घनत्व का परिमाणीकरण। हमारे ऊतक प्रसंस्करण प्रोटोकॉल, इसलिए, विविध रहे हैं और निश्चित और तेजी से जमे हुए ऊतकों को आश्वस्त करने के लिए लचीलापन प्रदान करते हैं।

हमारे प्रोटोकॉल की एक और अनूठी विशेषता situ मस्तिष्क एमआरआई में पोस्टमार्टम है. ब्रेन एमआरआई एमएस रोग के एक अपूरणीय biomarker हैं. इसलिए, असामान्य एमआरआई संकेतों के रोग संबंधी को स्थापित करना आवश्यक है। हमारे अध्ययनों से पता चला है कि दोनों T2 केवल और T2T1MTR ROIs अक्सर myelinated हैं. यह खोज अधिक विशिष्ट इमेजिंग तौर तरीकों कि मज़बूती से myelinated और demyelinated मस्तिष्क सफेद पदार्थ के बीच अंतर के लिए की जरूरत का समर्थन करता है. एमआरआई myelin का पता लगाने के लिए संवेदनशील प्रतीत होता है, लेकिन हमारे अध्ययनों से पता चलता है कि T1/T2/MTR का एक संयोजन भी myelination की पहचान करने के लिए विशिष्ट नहीं है. हमारे पोस्टमार्टम प्रोटोकॉल नए इमेजिंग रूपरेखा की क्षमता के परीक्षण के लिए एक आदर्श मंच प्रदान करता है myelinated और demyelinated मस्तिष्क सफेद पदार्थ के बीच अंतर. एमआरआई भी नैदानिक अभ्यास में बुनियादी विज्ञान के परिणामों के अनुवाद के लिए आदर्श वाहन प्रदान करता है, हमारे translational अनुसंधान में एमआरआई के उपयोग और रहने वाले रोगियों में इसके व्यापक नैदानिक उपयोग को देखते हुए.

जबकि कम काटने और लंबे समय से तय के रूप में अच्छी तरह से जमे हुए स्लाइस विभिन्न अध्ययनों के लिए कई मोड में ऊतक प्रसंस्करण के लिए एक लाभ प्रदान करता है, इस विधि के साथ कुछ सीमाएं हैं. किसी संरचना की संपूर्णता का मूल्यांकन सीमित किया जा सकता है क्योंकि इसके भागों को आसन्न स्लाइस पर अलग तरीके से संसाधित किया जा सकता है. ऊतक बैंक की बड़ी मात्रा, तथापि, कई विषयों में ब्याज की एक संरचना की जांच करने के लिए नमूना सुधार करने की क्षमता प्रदान करता है. पोस्टमार्टम ऊतकों का उपयोग अध्ययन करने के लिए एक और सामान्य सीमा है कि वे पार अनुभागीय हैं. समय और परिवर्तन की प्रगति के बारे में निष्कर्ष इस संदर्भ में व्याख्या की जरूरत है. रोगियों है कि उनके ऊतकों दान करने के लिए एक चयन पूर्वाग्रह हो सकता है, जो एमएस के साथ सभी रोगियों के लिए डेटा के सामान्यीकरण को सीमित कर सकते हैं. चूंकि अधिकांश दाताओं उन्नत एमएस की जटिलताओं से मर जाते हैं, यह एमएस के पहले के चरणों में उन लोगों के लिए इन रोगियों से निष्कर्षों extrapolate करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है. फिर भी, हमें उन युवा रोगियों से ऊतक मिले हैं जो गैर-एमएस से संबंधित स्थितियों (यानी तीव्र मायोकार्डियल इंफार्क्शन, ड्रग ओवरडोज, आत्महत्या) से मर गए थे। हमारे प्रोटोकॉल के दायरे में अन्य अंगों के नमूने शामिल नहीं हैं (उदा., जठरांत्र और अस्थि मज्जा) जो एमएस में फंसाया गया है. हमें विश्वास है कि कार्यक्रम की ताकत बहुत अपनी सीमाओं पल्ला झुकना.

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

लेखक भी संपादकीय सहायता के लिए डॉ क्रिस्टोफर नेल्सन को धन्यवाद देना चाहूंगा। autopsy कार्यक्रम भाग में R35 अनुदान NS097303 BDT के लिए समर्थन किया है. आरडी की प्रयोगशाला में कार्य एनआईडीएस (NS096148) और राष्ट्रीय मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसायटी, यूएसए (आरजी 5298) से अनुदान द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Biotinylated goat anti-mouse IgG Vector Laboratories BA-9200 1:500 dilution for hemispheric; 1:1,000 for 30µm free-floating.
RRID: AB_2336171
Biotinylated goat anti-rabbit IgG Vector Laboratories BA-1000 1:500 dilution.
Biotinylated goat anti-rat IgG Vector Laboratories BA-9400 1:500 dilution for hemispheric; 1:1,000 for 30µm free-floating.
RRID: AB_2336208
Glial fibrillary acid protein (GFAP) Dako Z0334 1:700 dilution for hemispheric.
RRID: AB_10013382
HuR, mouse IgG, 3A2 clone Santa Cruz SC-5261 1:500 for 30µm free floating.
RRID: AB_627770
Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43 Dako Mo746 1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30 µm free floating.
RRID: AB_2313661
Non-phosphorylated neurofilament (SMI32) Biolegend 801701 1:5,000 dilution for hemispheric; 1:2,500 for 30 µm free-floating.
RRID: AB_2564642
Phosphorylated neurofilament (SMI31) Biolegend 801601 1:5,000 dilution for hemispheric; 1:2,500 for 30 µm free-floating.
RRID: AB_2564641
Proteolipid protein (PLP) Gift from Wendy Macklin 1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available.
Reagents
125 mm filter paper Whatman 1452-125 For filtering PFA.
50% Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320 Electron microscopy grade.
Cytoseal ThermoScientific 8310-16
Ethylene glycol Fisher Chemical BP230-4
Glycerol Sigma-Aldrich G7893 400 mL/2 L Cryoprotection solution.
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized Millipore-Sigma SLHV033RB
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 19200 Prills form.
Polyvinylpyrolidone (PVP-40) Fisher Chemical BP220-212
Sodium azide Fisher Chemical S227I 2 g/2 L Sorenson's buffer.
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S0876 98.8 g/2 L Sorenson's buffer.
Sodium phosphate mono basic monohydrate Sigma-Aldrich S9638 14.352 g/2 L Sorenson's buffer.
Sucrose Sigma-Aldrich PVP40-500G
VectaStain ABC Kit Vector Laboratories PK-6100 1:1,000 dilution of A and B.
RRID: AB_2336819
Waterproof drawing black ink Higgins 44201
Xylene Fisher Chemical X3S Histological grade.
Equipment
3T MRI Magnetom Prisma Siemens Healthineers
7T MRI Agilent 830AS Siemens Healthineers

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References

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