मानव मल माइक्रोबायोटा पर इंटरवेंशनल regimens के प्रभाव का अनुमान लगाने के लिए एक इन विट्रो बैच-संस्कृति मॉडल

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Immunology and Infection

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Summary

इस प्रोटोकॉल में मानव मल microbiota के एक इन विट्रो बैच संस्कृति किण्वन प्रणाली का वर्णन करता है, inulin का उपयोग कर (एक प्रसिद्ध prebiotic और सबसे व्यापक रूप से अध्ययन microbiota न्यूनाधिक में से एक) विशिष्ट के प्रभाव का आकलन करने में इस प्रणाली के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए मल microbiota संरचना और चयापचय गतिविधियों पर हस्तक्षेप.

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Ahmadi, S., Wang, S., Nagpal, R., Mainali, R., Soleimanian-Zad, S., Kitzman, D., Yadav, H. An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota. J. Vis. Exp. (149), e59524, doi:10.3791/59524 (2019).

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Abstract

कई मानव रोगों में आंत microbiome की उभरती भूमिका नए उपकरण, तकनीक और प्रौद्योगिकियों की एक सफलता की मांग. इस तरह के सुधार मानव स्वास्थ्य लाभ के लिए microbiome न्यूनाधिक के उपयोग को समझने की जरूरत है. तथापि, माइक्रोबायोम मॉडुलन को मान्य करने और संबंधित स्वास्थ्य लाभों की भविष्यवाणी करने के लिए न्यूनाधकों की बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग और अनुकूलन बड़ी संख्या में पशुओं और/अथवा मानव विषयों की आवश्यकता के कारण व्यावहारिक रूप से कठिन हो सकता है। यह अंत करने के लिए, इन विट्रो या पूर्व vivo मॉडल microbiome न्यूनाधिक की प्रारंभिक स्क्रीनिंग की सुविधा कर सकते हैं. इसमें, यह अनुकूलित है और एक पूर्व विवो मल microbiota संस्कृति प्रणाली है कि प्रोबायोटिक्स, prebiotics और अन्य खाद्य सामग्री सहित आंत microbiome न्यूनाधिक के विभिन्न हस्तक्षेप के प्रभाव की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का प्रदर्शन किया, एक तरफ से न्यूट्रिस्यूटिकल्स और दवाओं, विविधता और मानव आंत microbiota की संरचना पर. Inulin, सबसे व्यापक रूप से अध्ययन prebiotic यौगिकों और microbiome न्यूनाधिक में से एक, एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है यहाँ स्वस्थ मल microbiota संरचना और इसकी चयापचय गतिविधियों पर इसके प्रभाव की जांच करने के लिए, इस तरह के मल पीएच और कार्बनिक एसिड के मल के स्तर के रूप में लैक्टेट और लघु श्रृंखला फैटी एसिड (SCFAs) सहित. प्रोटोकॉल मल microbiota प्रोफाइल पर न्यूनाधिक के विभिन्न हस्तक्षेप के प्रभाव का आकलन करने के उद्देश्य से अध्ययन के लिए और उनके स्वास्थ्य प्रभावों की भविष्यवाणी करने के लिए उपयोगी हो सकता है.

Introduction

मानव माइक्रोबायोटा एक जटिल समुदाय है जिसमें बैक्टीरिया, आर्किया, वायरस और यूकैरियोटिक सूक्ष्मजीव1शामिल हैं, जो मानव शरीर में आंतरिक और बाह्य रूप से निवास करते हैं। हाल के सबूत पेट microbiota और आंत microbiome की मौलिक भूमिका की स्थापना की है (रोगाणुओं और उनके जीन मानव जठरांत्र संबंधी मार्ग में पाया के पूरे संग्रह) मोटापा सहित विभिन्न मानव रोगों में, मधुमेह, हृदय रोग, और कैंसर1,2,3. इसके अतिरिक्त, हमारे पेट में रहने वाले सूक्ष्मजीवों चयापचयों की एक विस्तृत स्पेक्ट्रम का उत्पादन जो काफी हमारे स्वास्थ्य को प्रभावित और भी कई रोगों के pathophysiology के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चयापचय कार्यों की एक किस्म के लिए योगदान कर सकते हैं4, 5.इस आंत माइक्रोबियल आबादी की संरचना और समारोह में असामान्य परिवर्तन (परेशान) को आम तौर पर "गट डिस्बिओसिस" कहा जाता है। Dysbiosis आमतौर पर मेजबान के एक अस्वास्थ्यकर राज्य के साथ जुड़ा हुआ है और इसलिए मेजबान के एक स्वस्थ नियंत्रण राज्य के साथ जुड़े सामान्य (homeostatic) माइक्रोबियल समुदाय से भेदभाव किया जा सकता है। आंत माइक्रोबायोम डिस्बिओसिस के विशिष्ट पैटर्न प्राय : विभिन्न रोगों में पाए जाते हैं1,2,3,6,7.

अपाच्य भोजन का किण्वन, विशेष रूप से किण्वित कार्बोहाइड्रेट/फाइबर, आंत माइक्रोबायोटा द्वारा न केवल ऊर्जा पैदा करता है बल्कि लघु-श्रृंखला फैटी एसिड (एससीएफएस) सहित अलग-अलग चयापचयों का उत्पादन भी करता है, लैक्टेट, फोरमेट, कार्बन डाइऑक्साइड, मीथेन, हाइड्रोजन, और इथेनॉल6| इसके अलावा, आंत microbiota भी फोलेट, बायोटिन, trimethylamine-एन-ऑक्साइड, सेरोटोनिन, tryptophan, गामा-aminobutyric एसिड, डोपामाइन, norepinephrine, एसिटाइलकोलिन, हिस्टामाइन के रूप में अन्य bioactive पदार्थों की एक संख्या का उत्पादन डिऑक्सीकॉलिक एसिड, और 4-एथिलफेनिल सल्फेट। यह मुख्य रूप से मेजबान-माइक्रोब आला के भीतर आंतरिक चयापचय फ्रलक्स के उपयोग के माध्यम से होता है, जो शरीर की कई प्रक्रियाओं, चयापचय कार्यों और एपिजेनेटिक परिवर्तन1,8,9, में योगदान देता है 10| हालांकि, ऐसे माइक्रोबियल उत्पादों पर विभिन्न हस्तक्षेपों के प्रभाव आसान, कुशल और पुन: उत्पादन योग्य प्रोटोकॉल की कमी के कारण अस्पष्ट या अस्पष्ट बने हुए हैं। मानव आंत microbiota संरचना एक अत्यंत जटिल और विविध पारिस्थितिकी तंत्र है, और इसलिए, मानव स्वास्थ्य और रोग विकृति में अपनी भूमिका के बारे में कई सवाल अभी भी अनुत्तरित रह. आंतों microbiota की संरचना और चयापचय कार्यों पर कई आम आंत microbiome न्यूनाधिक (उदा., प्रोबायोटिक्स, prebiotics, एंटीबायोटिक दवाओं, मल प्रत्यारोपण और संक्रमण) के प्रभाव काफी हद तक मायावी रहते हैं। इसके अलावा, विवो में इन प्रभावों की परीक्षा और सत्यापन मुश्किल है, विशेष रूप से क्योंकि आंत microbiota द्वारा उत्पादित पोषक तत्वों और चयापचयों के अधिकांश अवशोषित या एक साथ और तेजी से पेट में का निपटारा कर रहे हैं; इसलिए, इन चयापचयों के उत्पादन, राशि और प्रसंस्करण को मापने (जैसे, SCFAs) विवो में अभी भी एक व्यावहारिक चुनौती बनी हुई है। वास्तव में, इस तरह के जानवरों और मानव विषयों के रूप में शारीरिक मॉडल आंत microbiome और मेजबान स्वास्थ्य पर इसके मॉडुलन की भूमिका का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन इन के कारण microbiome न्यूनाधिक के विभिन्न प्रकार के बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है नैतिक, मौद्रिक या समय की कमी। इस अंत में, इन विट्रो और/या पूर्व विवो मॉडल, जैसे कि इन विट्रो में आंत माइक्रोबायोटा की culturing और फिर विभिन्न microbiota न्यूनाधिक के साथ हस्तक्षेप, समय और पैसे की बचत के अवसरों की पेशकश कर सकते हैं और इसलिए प्रारंभिक या बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए अनुमति दे सकते हैं विभिन्न घटकों (जैसे प्रोबायोटिक्स, prebiotics, और अन्य interventional यौगिकों) मल microbiota विविधता, संरचना और चयापचय प्रोफाइल पर उनके प्रभाव की जांच करने के लिए / आंत microbiome के इस तरह के इन विट्रो और पूर्व vivo प्रणालियों का उपयोग कर अध्ययन मेजबान microbiome बातचीत है कि स्वास्थ्य और रोग की मेजबानी के लिए योगदान की आगे समझ की सुविधा हो सकती है, और यह भी उपन्यास चिकित्सा है कि लक्ष्य microbiome खोजने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं मेजबान स्वास्थ्य में सुधार और रोकने के लिए और विभिन्न रोगों का इलाज1.

हालांकि इन विट्रो आंत microbiota संस्कृति प्रणालियों वास्तव में वास्तविक आंतों की स्थिति को दोहराने नहीं कर सकते हैं, कई प्रयोगशालाओं के लिए इस तरह के मॉडल विकसित करने का प्रयास किया है, जिनमें से कुछ कुछ हद तक व्यावहारिक पाया गया है और सफलतापूर्वक के लिए इस्तेमाल किया गया है विभिन्न प्रयोजनों के लिए. हाल ही में आंत मॉडल में से एक मानव आंत्र Microbial पारिस्थितिकी तंत्र का सिम्युलेटर है, जो पूरे मानव जठरांत्र संबंधी मार्ग mimics, पेट सहित, छोटी आंत, और बृहदान्त्र के विभिन्न क्षेत्रों. हालांकि, इस तरह के तकनीकी रूप से जटिल मॉडल दुनिया भर में अन्य अनुसंधान सुविधाओं के लिए सुलभ नहीं हो सकता है। इसलिए, वहाँ अभी भी नए वैकल्पिक मॉडल है कि अपेक्षाकृत सरल, सस्ती और microbiome न्यूनाधिक और आंत microbiota और मेजबान स्वास्थ्य पर उनके प्रभाव का अध्ययन प्रयोगशालाओं के लिए व्यावहारिक हैं के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है. अतः इन विट्रो (या पूर्व विवो) मल माइक्रोबायोटा संस्कृति प्रणाली का उपयोग ऐसे हस्तक्षेपों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होगा11,12. विशेष रूप से, आंत microbiota विविधता और संरचना में आवधिक परिवर्तन के मामले में microbiota किण्वन क्षमता पर विभिन्न prebiotics के प्रभाव, मल पीएच, और SCFAs और लैक्टेट सहित माइक्रोबियल चयापचयों के स्तर का अध्ययन किया जा सकता है 13. इस में, माइक्रोबायोम न्यूनाधिक के एक उदाहरण के रूप में इनुलिन (सबसे व्यापक रूप से अध्ययन किए गए प्रीबायोटिक घटकों में से एक) का उपयोग करते हुए, इस सरल पूर्व विवो माइक्रोबायोटा बैच-कल्चर सिस्टम के चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल का अनुमान लगाने के लिए इसका उपयोग प्रदर्शित करने के लिए वर्णित है माइक्रोबायोम न्यूनाधिक के साथ हस्तक्षेप के बाद मल माइक्रोबायोटा और माइक्रोबियल चयापचयों में परिवर्तन।

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Protocol

चेतावनी: उपयुक्त सामग्री सुरक्षा डेटा शीट्स से परामर्श करें और उपयुक्त जैव सुरक्षा स्तर 2 (BSL-2) प्रशिक्षण के लिए निर्देशों और दिशानिर्देशों का पालन करें। मानक जैव सुरक्षा नियमों के अनुसार सभी culturing चरणों का पालन करें और aseptic शर्तों का उपयोग कर एक बीएसएल-2 कैबिनेट का उपयोग करें। इसके अलावा, विभिन्न मॉडलों और मानव विषयों से मल के नमूनों में माइक्रोबियल जनित रोगों के फैलने का संभावित खतरा हो सकता है। तुरंत किसी भी चोट और संक्रमण की घटना में चिकित्सा सहायता लेनी. इसके अलावा, मानव और पशु मल के नमूनों के उपयोग को संस्थागत नैतिक समितियों के माध्यम से अनुमोदित किया जाना चाहिए और नमूनों और विषय की जानकारी का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल के अनुरूप होना चाहिए।

1. संस्कृति मीडिया की तैयारी

  1. संस्कृति मीडिया की तैयारी, शेयर समाधान के नौ प्रकार के तैयार
    1. हल ए (1,000 एमएल): 5.4 ग्राम सोडियम क्लोराइड (NaCl), 2.7 ग्राम पोटेशियम डाइहाइड्रोजन फॉस्फेट (KH2PO4), 0.16 ग्राम कैल्शियम क्लोराइड डाइहाइड्रेट (CaCl2$2H2O), 0.12 ग्राम मैग्नीशियम क्लोराइड हेक्साहाइड्रेट (MgCl 2) को भंग करें। मैंगनीजक्लोराइड टेट्राहाइड्रेट (MnCl2$4H2O), 0.06 ग्राम कोबाल्टस क्लोराइड हेक्साहाइड्रेट (CoCl2$6H2O), और 5.4 ग्राम अमोनियम सल्फेट (एनएच4)2SO4, deionized पानी में 1,000 एमएल करने के लिए कुल मात्रा बनाने के लिए।
    2. हल बी (1,000 एमएल): 2ण्7 ग्राम पोटेशियम हाइड्रोजन फॉस्फेट (K2HPO4) को डिओनीकृत जल में घोलकर कुल मात्रा को 1000 एमएल तक घोल दें।
    3. ट्रेस खनिज समाधान (1,000 एमएल): 500 मिलीग्राम डाइसोडियम एथिलीनडायमिन-टेट्रासेटेट डाइहाइड्रेट (Na2EDTA), 200 मिलीग्राम लौह सल्फेट हेप्टाहाइड्रेट (फेसो4जेड 7एच2ओ), 10 मिलीग्राम जिंक सल्फेट हेप्टाहाइड्रेट (जेन्सो4 मैंगनीज (II) क्लोराइड टेट्राहाइड्रेट (MnCl2$4H2O), 30 मिलीग्राम फॉस्फोरिक एसिड (एच3पीओ4), 20 मिलीग्राम CoCl2$6H2O, 1 मिलीग्राम cupric क्लोराइड डाइहाइड्रेट (CuCl2) 2एच2व्), 2 मिलीग्राम निकल (II) क्लोराइड हेक्साहाइड्रेट (निसीएल2जेड 6 एच2ओ) और 3 मिलीग्राम सोडियम मोलिबडेट डाइहाइड्रेट (ना2एमओओ4जेड 2 एच 2 एच2ओ) को निष्क्रिय पानी में 1,000 एमएल तक कुल मात्रा बनाने के लिए।
      नोट: यह समाधान प्रकाश संवेदनशील है, इसलिए यह सुनिश्चित करें कि अंधेरे/काले या एल्यूमीनियम लिपटे ट्यूबों/bottles में संग्रहीत किया जाए।
    4. पानी में घुलनशील विटामिन समाधान (1,000 एमएल): थायमिन हाइड्रोक्लोराइड के 100 मिलीग्राम भंग (थामिन-एचसीएल), 100 मिलीग्राम डी-पैन्टोथेनिक एसिड, 100 मिलीग्राम नियासिन, 100 मिलीग्राम पाइरिडोक्सिन, 5 मिलीग्राम पी-एमिनोबेजोइक एसिड और 0.25 मिलीग्राम विटामिन बी 12 की मात्रा को डीऑन में कुल मात्रा में बनाने के लिए 1,000 एमएल.
    5. फोलेट: बायोटिन घोल (1,000 एमएल): 10 मिलीग्राम फोलिक एसिड, 2 मिलीग्राम डी-बायोटिन और 100 मिलीग्राम अमोनियम बाइकार्बोनेट (एनएच4एचसीओ3) को डिओनीकृत पानी में घोल कर कुल मात्रा को 1,000 एमएल तक घोल दें।
    6. रिबोफ्लेविन विलयन (1,000 एमएल): कुल मात्रा को 1,000 एमएल तक बनाने के लिए 5 एमएम हैप्स (1.19 ग्राम/एल) घोल में 10 मिलीग्राम रिबोफ्लेविन को भंग करें।
    7. हेमिन विलयन (10 एमएल): कुल मात्रा को 10 एमएल तक बनाने के लिए 10 उम सोडियम हाइड्रॉक्साइड (नाओएच) (0ण्4 ग्राम) विलयन में 5,000 मिलीग्राम हीमिन को भंग करें।
    8. लघु-श्रृंखला फैटी अम्ल मिश्रण (10 एमएल): एन-वेलेरेट के 2.5 एमएल, आइसोवेलेरेट का 2.5 एमएल, आइसोब्यूरेट का 2.5 एमएल और 2.5 एमएल: डीएल-जेड-मेथिलब्यूरेट का मिश्रण।
      नोट: गंध और धुएं से बचने के लिए इस समाधान को धूआं हुड में उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    9. Resazurin (1,000 एमएल): deonized पानी में resazurin के 1 ग्राम भंग और 1,000 एमएल के लिए कुल मात्रा बनाते हैं.
  2. इन विट्रो अवायवीय किण्वन के लिए प्रयोग किया जाने वाले मध्यम
    1. इस मीडिया को तैयार करने के लिए, समाधान ए के 330 एमएल, समाधान बी के 330 एमएल, ट्रेस खनिज समाधान के 10 एमएल, 20 एमएल पानी में घुलनशील विटामिन समाधान, 5 एमएल फोलेट: बायोटिन समाधान, 5 एमएल रिबोफ्लेविन समाधान का मिश्रण करें; 2.5 एमएल हेमिन घोल, 0.4 एमएल लघु शृंखला फैटी एसिड मिश्रण, 1 एमएल रीसाजुरिन, 0.5 ग्राम खमीर निकालने, 4 ग्राम सोडियम कार्बोनेट(ना2सीओ3),0.5 ग्राम Cysteine HCl-H2 O, और 0.5 ग्राम ट्रिप् टिकेस, और 296.1 एमएल आतिदार पानी जोड़ें।
    2. पीएच की जाँच करें और सुनिश्चित करें कि यह 7.0 के आसपास है, यदि नहीं, तो 1 N HCl या 1 N NaOH के साथ पीएच समायोजित करें. aseptic कार्य केंद्र के तहत एक बोतल फिल्टर का उपयोग कर मीडिया छानने वैक्यूम द्वारा बाँझ.
    3. वैकल्पिक रूप से, सभी घटकों (विटामिन और हेमिन समाधान को छोड़कर) और 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेव मिश्रण और यह कमरे के तापमान को ठंडा करते हैं। इसके साथ ही, 0.22 डिग्री झिल्ली फिल्टर का उपयोग करके विटामिन और हेमिन समाधानों को फिल्टर-स्टरलाइज़ करें और वितरण से पहले ऑटोक्लेव्ड और ठंडा मीडिया में इन्हें जोड़ें।

2. एनारोबिक चैंबर और आवश्यक सामग्री की तैयारी

  1. प्रयोग के प्रारंभ होने से कम से कम 48 एच के अंदर अवायवीय कक्ष के अंदर किण्वन प्रयोग के लिए आवश्यक सभी सामग्री, समाधान और उपकरण रखें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि बफर्स/समाधानों में उपकरणों और घुलनशील ऑक्सीजन से संबद्ध कोई अवशिष्ट ऑक्सीजन है हटा दिया और सभी सामग्री सेट अवायवीय स्थितियों के लिए acclimateized हैं.
    नोट: अवायवीय कक्ष के अंदर आवश्यक सामग्री (48 h प्रयोग शुरू करने के लिए पहले): (i) किण्वन मीडिया; (ii) अवायवीय विलयन (खंड 4-1 के अनुसार तैयार), (पपप) भंवर, (iv) वजन संतुलन, (iv) मलमल पनीर वस्त्र, (vii) कैंची, (vii) कीप, (viii) 1.5, 2.0, 15, 50 एमएल ट्यूब, (ix) पाइप (2, 20, 200 और 1,00) युक्त ीली बंदूक, (2) पाइप्ट और पिपेट (5 और 10 एमएल), (xi) कागज के ऊतकों, (xii) मार्कर, (xiii) ट्यूब विभिन्न ट्यूबों के लिए खड़ा है, (xiv) अपशिष्ट बॉक्स, (xv) हे2 सूचक और (xvi) 70% इथेनॉल स्प्रे बोतल (disinfectant).

3. ट्यूब और फाइबर की तैयारी

  1. वजन 300 मिलीग्राम inulin और एक 50 एमएल ट्यूब के लिए स्थानांतरण किण्वन मीडिया के 26 एमएल के aseptically इसके अलावा पहले से ही तैयार है और अवायवीय कक्ष में संग्रहीत द्वारा. प्रत्येक मल नमूना प्रकार और प्रयोगात्मक ट्यूब (ओं) के लिए एक खाली ट्यूब तैयार (परीक्षण किया जा रहा यौगिकों की संख्या के अनुसार), trilicate में.
  2. किण्वन प्रयोग शुरू करने से पहले नमूनों के जलयोजन की अनुमति देने के लिए लगभग 24 ज के लिए अवायवीय कक्ष के अंदर इन ट्यूबों को छोड़ दें। सुनिश्चित करें कि टीका के समय ट्यूब का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस है, इसलिए अवायवीय कक्ष के भीतर संलग्न इनक्यूबेटर में ट्यूब लाएं।

4. इनोकुलम की तैयारी

  1. एनारोबिक तनुता समाधान (कम से कम 48 ज किण्वन प्रयोग से पहले): 5 ह नाक्वल, 2 ह ग्लूकोज और 0.3 ह साइस्टीन-एचसीएल को डीऑनीकृत जल में घोल दें और कुल मात्रा को 1,000 एमएल तक बना लें। ऑटोक्लेव और उपयोग करने से पहले कम से कम 48 एच अवायवीय कक्ष के अंदर स्टोर करें।
  2. मल इनोकुलम तैयारी (किण्वन प्रयोग के दिन): 50 एमएल शंकु ट्यूब में ताजा मल के नमूने का वजन 5 ग्राम, 50 एमएल (1:10 w/v) के अंतिम खंड के लिए अवायवीय कमजोर पड़ने का समाधान जोड़ें और 15 मिनट के लिए या पूरी तरह से homogenized तक भंवर। बाँझ चीज़पोश (ऑटोक्लेव्ड) की 4 परतों के माध्यम से homogenized मिश्रण फ़िल्टर और मीडिया युक्त ट्यूबों में टीका लगाने के लिए तुरंत इसका इस्तेमाल करते हैं।
    नोट: विषयों के एक समूह से मल नमूने जमा किया जा सकता है अगर प्रयोगात्मक उद्देश्य सामान्य रूप से समग्र स्वस्थ बनाम रोगग्रस्त मल microbiota पर एक दिया यौगिक के प्रभाव की तुलना करने के लिए है /

5. निषेचन और नमूना

  1. धारा 4-2 के अनुसार ट्यूब तैयार करें और 4 एमएल पतला और फ़िल्टर किए गए मल इनोकुलम के साथ रिक्त/नियंत्रण और प्रयोगात्मक ट्यूबों को टीका लगाएं। अवायवीय कक्ष के अंदर 37 डिग्री सेल्सियस पर टीका तली को इनक्यूबेट करें। फाइबर और इनोकुलम को फिर से निलंबित करने के लिए धीरे से पलटने से ट्यूब को हर घंटे एक बार हिलाएं।
  2. के रूप में अक्सर की जरूरत के रूप में नमूने ले लीजिए, उदाहरण के लिए, प्रति घंटा करने के लिए 0, 3, 6, 9 और 24 ज किण्वन के दौरान एक 2 एमएल alicot नमूना लेने के द्वारा एक 2 एमएल ट्यूब से एक 2 एमएल ट्यूब में बाहर.
  3. एक प्रयोगशाला पीएच मीटर का उपयोग कर alicots के पीएच उपाय (सीधे नमूने में पीएच इलेक्ट्रोड डालने से); 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 14,000 x g पर शेष नमूना अपकेंद्रित्र। तुरंत तरल नाइट्रोजन में supernatant और गोली फ्रीज, और तस्वीर ठंड के बाद, SCFAs विश्लेषण और -80 डिग्री सेल्सियस पर microbiome विश्लेषण के लिए गोली के लिए supernatant की दुकान.

6. लघु चेन फैटी एसिड (SCFAs) और लैक्टेट क्वांटिफिकेशन

नोट: माइक्रोबायोम संस्कृति के अधिनान्तेश में एससीएफए और लैक्टेट को अन्य त्रयोदियों के अनुसार मापा जा सकता है , जो कहीं और13,14,15,16में दी गई है .

  1. संक्षेप में, बर्फ पर नियंत्रण और उपचार के नमूने से अनुभाग 5 में प्राप्त तस्वीर जमे हुए supernatants thaw और बर्फ पर सभी आगे प्रसंस्करण कदम बाहर ले. एक 0.45 डिग्री झिल्ली फिल्टर के माध्यम से supernatant फ़िल्टर और 210 एनएम पर DAD डिटेक्टर के साथ HPLC प्रणाली का उपयोग SCFAs और लैक्टेट की सांद्रता को मापने के लिए सेल मुक्त नमूने का उपयोग करें, एक HPX-87H स्तंभ के साथ सुसज्जित. प्रत्येक नमूने के लिए 10 डिग्री सेल्सियस की इंजेक्ट मात्रा का उपयोग करें और 35 डिग्री सेल्सियस पर 0ण्6 एमएल/न्यूनतम की प्रवाह दर पर कॉलम को हल करने के लिए H2SO4 (0.005 N) का उपयोग करें।

7. मल माइक्रोबायोम विश्लेषण

नोट: माइक्रोबायोम विश्लेषण करने के तरीकों और पाइप लाइन का विस्तार से कहीं और7,13,14,17.

  1. संक्षेप में, एक मल डीएनए निष्कर्षण किट13का उपयोग करके मल घोल छर्रों के लगभग 200 मिलीग्राम से जीनोमिक डीएनए निकालें।
  2. पृथ्वी माइक्रोबायोम परियोजना प्रोटोकॉल18में वर्णित प्राइमर अनुक्रमों का उपयोग करते हुए, कहीं 13 में वर्णित विधि के अनुसार बारकोड्ड प्राइमर का उपयोग करके जीवाणु 16S RRNA जीन के अतिचरीय क्षेत्र को बढ़ाना .
  3. चुंबकीय शुद्धि मोती के साथ जिसके परिणामस्वरूप amplicons को शुद्ध और Picogreen या एक समकक्ष विधि द्वारा परिमाणित. शुद्ध PCR उत्पादों को एक अनुक्रमक13पर समान मोलर सांद्रता और अनुक्रम में पूल करें।
  4. द्वारा वर्णित विधियों के अनुसार माइक्रोबायल पारिस्थितिकी (QIIME) सॉफ़्टवेयर में मात्रात्मक इनसाइट्स का उपयोग करके डी-मल्टीप्लेक्सिंग, गुणवत्ता फ़िल्टरिंग और क्लस्टरिंग, वर्गीकरण असाइनमेंट और डे-मल्टीप्लेक्स के लिए परिणामी अनुक्रमों को संसाधित करें और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण Caporaso एट अल19.

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Representative Results

प्रोटोकॉल का उपयोग एक विशिष्ट प्रीबायोटिक के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है (यानी, मल पीएच में परिवर्तन और स्वस्थ मानव विषयों के मल में लैक्टेट और एससीएफएस की एकाग्रता के मामले में माइक्रोबायोटा संरचना और चयापचय गतिविधियों पर इनुलिन inulin के साथ उपचार के बाद विभिन्न समय अंक). मल पीएच, लैक्टेट और एससीएफएस के मल स्तर (चित्र 1) और माइक्रोबायोटा संरचना (चित्र 2 और चित्र 3) को 0 (बेसलाइन), 9 और 24 ह इनुलिन के साथ या बिना ऊष्मायन के मापे जाते हैं। परिणाम प्रदर्शित कैसे मल microbiota संरचना और इसकी चयापचय गतिविधियों के साथ या inulin उपचार के बिना इनुलिन उपचार के साथ या बिना इनट्रो किण्वन में संग्राहक रहे हैं.

Figure 1
चित्र 1: मल पीएच (क), लैक्टेट (ख) और लघु-श्रृंखला फैटी एसिड में परिवर्तन अर्थात् एसीटेट (ग), प्रोपिओनेट (घ) और ब्यूट्रीट (ई) मानव मल में 0 (बेसलाइन), 9 और 24 ज के साथ या बिना इनुलिन के अवायवीय किण्वन। यहाँ प्रस्तुत मूल्यों का मतलब है - triplicate नमूनों की SEM. * पी एंड टी एल टी; 0.05, * *पी एंड एलटी; 0.01, * *पी एंड एलटी; 0.001, बनाम आधार रेखा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: 0 (बेसलाइन), 9 और 24 ज में मानव मल में माइक्रोबायोटा विविधता और संरचना में परिवर्तन, 9 और 24 ज अवायवीय किण्वन के साथ या बिना इनुलिन के। () भारित और () बीटा-विविधता के अभारित यूनिरैक उपाय सिद्धांत समन्वय विश्लेषण (पीसीओए) का उपयोग करके विज़ुअलाइज़ किए गए हैं। (-) अल्फा-विविधता के सूचकांक अर्थात जातिवृत् तीय विविधता (पीडी पूरे पेड़ (); प्रजातियों की समृद्धि (चाओ1; ; परिचालन वर्गीकरण इकाइयों की संख्या में मनाया (OTUs, ई); और प्रजातियों समानता (शैनन सूचकांक, )). प्रमुख फिला () और वंश () की सापेक्ष बहुतायत . यहाँ प्रस्तुत मूल्यों का मतलब है - triplicate नमूनों की SEM. * पी एंड टी एल टी; 0.05, * *पी एंड एलटी; 0.01, बनाम आधार रेखा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: रैखिक भेदभाव विश्लेषण (एलडीए) प्रभाव आकार (LEfSe) आंत microbiota परिवर्तन के विश्लेषण के बाद 9 एच और 24 एच के साथ ऊष्मायन (INU) या बिना (CTL) inulin. 16S दृश्यों के एलईएफई विश्लेषण से व्युत्पन्न वर्गीकरण क्लैडोग्राम (संबंधित बहुतायत - 0.5%) नमूनों के विभिन्न समूह के बीच अंतर प्रचुर मात्रा में टैक्सा का प्रतिनिधित्व. प्रत्येक बिंदु की चमक इसके प्रभाव आकार (यानी, टैक्सोन बहुतायत) के लिए आनुपातिक है। केवल टैक्सा पासिंग एलडीए थ्रेशोल्ड मान का gt;2.4 यहाँ दिखाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत इन विट्रो मल घोल किण्वन मॉडल मानव मल माइक्रोबायोटा की संरचना पर विभिन्न substrates और माइक्रोबियल उपभेदों (जैसे, prebiotics और प्रोबायोटिक्स) के प्रभाव का अनुमान लगाने के लिए एक सरल एकल बैच मॉडल है और साथ ही इसके मल पीएच और एससीएफएस के स्तर के संदर्भ में चयापचय गतिविधियों। यहाँ प्रस्तुत परिणामों से पता चलता है कि इनुलिन का टीका मल पीएच को कम करता है और गैर-उपचारित मल माइक्रोबायोटा संस्कृति की तुलना में इनुलिन उपचारित मल नमूने में एससीएफएस और लैक्टेट के स्तर को काफी बढ़ा देता है (चित्र 1)। इसके अतिरिक्त, आंत माइक्रोबायोटा हस्ताक्षर भी इनुलिन उपचारित और अनुपचारित नमूनों के बीच भिन्न प्रतीत होता है (चित्र2 तथा चित्र 3)। ये डेटा उदाहरण देते हैं कि यह प्रणाली मल माइक्रोबायोम विविधता और संरचना के साथ-साथ इसकी चयापचय गतिविधियों पर इनुलिन के प्रभाव को कैसे प्रतिबिंबित कर सकती है। इसके अलावा, विशिष्ट प्रयोगात्मक उद्देश्यों और hypotheses के आधार पर, अन्य कारकों की एक किस्म भी इस प्रणाली का उपयोग कर मापा जा सकता है. इसके अलावा, 16S rRNA जीन अनुक्रमण के अलावा, इस तरह के पूरे माइक्रोबियल मेटाजेनोम अनुक्रमण के रूप में अन्य विश्लेषण (पूरे जीनोम अनुक्रमक का उपयोग कर) या क्षपीसीआर और संस्कृति विशिष्ट एकल या कई वंश, प्रजातियों और उपभेदों पर लक्षित तरीकों (जैसे, द्वि-जीवाणु, लैक्टोबैसिली, अक्करमैनिया, एंटोबैक्टीरिया,क्लोस्ट्रिया, आदि) भी मार डाला जा सकता है. इसके अतिरिक्त, एससीएफए के विश्लेषण के लिए विभिन्न क्रोमैटोग्राफी प्रक्रियाओं, जैसे एलसी-एमएस, जीसी,जीसी-एफआईडी, और एचपीएलसी का भी प्रयोगात्मक आवश्यकता और उपलब्धता के आधार पर शोषण किया जा सकता है। फिर भी, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इन प्रक्रियाओं के लिए नमूना तैयारी उपकरणों और ऑपरेशन20के लिए आवश्यक शर्तों के अनुसार भिन्न हो सकते हैं.

हालांकि ताजा मल नमूना का उपयोग सबसे अच्छा reproduible परिणाम उपज होगा; हालांकि, स्नैप जमे हुए मल नमूने (जैसा कि यहां प्रस्तुत प्रयोग में इस्तेमाल किया जाता है) का भी प्रभावशाली ढंग से उपयोग किया जा सकता है क्योंकि अधिकांश बैक्टीरिया को शरीर के तापमान में पुनर्जीवित होने के बाद इसे से पुनर्जीवित किया जा सकता है और ठंड21के बाद कोई और अपघटन नहीं होता है। जमे हुए नमूने का उपयोग विशेष रूप से फायदेमंद हो सकता है जब यह प्रयोग की योजना बनाई दिन पर विशिष्ट दाता (ओं) से ताजा मल नमूने प्राप्त करने के लिए असंभव है, या एक ही दाता से जब एक प्रयोग दोहराया जा करने की जरूरत है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए, तथापि, कि मल के नमूने तरल नाइट्रोजन का उपयोग कर जमे हुए तस्वीर और तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए जब तक आगे का उपयोग करें. इसके अलावा, हवा (ऑक्सीजन) के लिए जमे हुए मल के नमूनों के जोखिम से बचने के लिए, नमूनों को जितनी जल्दी हो सके अवायवीय कक्ष में स्थानांतरित किया जाना चाहिए / तुरंत फ्रीजर से बाहर निकलने के बाद और तुरंत इस्तेमाल किया (बार-बार थिंग से बचा जाना चाहिए)। नमूना thawing सहित सभी बाद के प्रयोगों, inoculum तैयारी और प्रसंस्करण अवायवीय कक्ष के अंदर किया जाना चाहिए.

आंत्र कार्बनिक पर्यावरण और पीएच बड़ी आंत में पोषक किण्वन के दौरान विशेष रूप से तथ्य यह है कि एक असामान्य रूप से कम पीएच सब्सट्रेट उपयोग के कारण वृद्धि हुई अम्लता इंगित करता है के मद्देनजर बहुत महत्वपूर्ण हैं. अतः अधिक तीव्र पीएच कमी अधिक तीव्र उपस्तर उपयोग22के अनुरूप हो सकती है। हालांकि, इस मॉडल में, पीएच नियंत्रित नहीं किया गया है, तथापि, समान गैर इलाज नियंत्रण के शामिल किए जाने अत्यधिक प्रत्यक्ष तुलना करने के लिए सिफारिश की है. आंत microbiota द्वारा अपाच्य polysaccharides के किण्वन का एक परिणाम के रूप में बृहदान्त्र में उत्पादित SCFAs आगे मेजबान स्वास्थ्य के रखरखाव से संबंधित विविध तंत्र को प्रभावित कर सकते हैं. इन चयापचयों gluconeogenesis और लिपिड biosynthesis में योगदान, coloncytes के लिए एक ऊर्जा स्रोत के रूप में कार्य, और भी प्रतिरक्षा मॉडुलन सहित स्वास्थ्य लाभ हो सकता है, नियंत्रित / सुधार आंत बाधा कार्यों, और neuromodulation23, 24,25,26. इसके अलावा, SCFAs भी हार्मोन सहित कई जैविक रास्ते को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है, endocannabinoid प्रणाली, सेल प्रसार और मौत, हड्डी स्वास्थ्य, खनिज अवशोषण, आंत गतिशीलता, आंतों पीएच, और आंत microbiome पर व्युत्क्रम प्रभाव और माइक्रोबियल चयापचय समारोह. इसलिए, विशिष्ट माइक्रोबायोटा न्यूनाधिक 6 की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करते समय आंतों/फेकलएससीएफए की प्रोफाइल और सांद्रता का ज्ञान एक महत्वपूर्ण घटक हो सकता है। बेशक, SCFAs के अलावा, आंत microbiome भी कई अन्य महत्वपूर्ण चयापचयों (जैसे, अमोनियम, विटामिन, हिस्टामाइन) का उत्पादन करता है। इसलिए, इस तरह के इन विट्रो किण्वन प्रयोगों के दौरान एकत्र supernatant नमूनों भी वैश्विक metabolomics विश्लेषण के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है उपन्यास आंत microbiome व्युत्पन्न चयापचयों कि विशिष्ट microbiome न्यूनाधिक से प्रभावित किया जा सकता है की खोज करने के लिए.

यहाँ वर्णित प्रणाली में कई फायदे हैं, जैसे आसानी, सादगी, लागत प्रभावशीलता, और प्रयोगात्मक सेट-अप की सामान्य स्वीकार्यता। हालांकि, वहाँ कुछ सीमाएं हैं के रूप में अच्छी तरह से. उदाहरण के लिए, सिस्टम बड़ी आंत के माइक्रोबायोटा के संपर्क में आने से पहले ऊपरी पाचन तंत्र (उदाहरण के लिए, लार, पेट, छोटी आंत) में प्रीबायोटिक्स (या अन्य हस्तक्षेपों) की बातचीत से संबंधित नहीं है। तथापि, ऐसे कदम विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार अपनाए जा सकते हैं और उन्हें शामिल किया जा सकता है। इसके अलावा, एक अम्लीय और/ आंत माइक्रोबायोटा. इसके अलावा, आंत microbiota की संरचना किण्वन के दौरान विशिष्ट संस्कृति की स्थिति के कारण बदलाव हो सकता है. उदाहरण के लिए, यह देखा गया कि 9 ज ऊष्मायन तक, माइक्रोबायोटा परिवर्तन 24 ज की तुलना में सामान्य के बहुत करीब हैं। हालांकि, 24 एच ऊष्मायन के बाद, हालांकि पीएच और एससीएफए के स्तर में काफी वृद्धि हुई, आंत माइक्रोबायोटा संरचना से पता चला कि प्रोटीओबैक्टीरिया की संख्या में वृद्धि हुई है, जबकि माइक्रोबियल विविधता कम हो गई है। हालांकि, यह अज्ञात रहता है कि कैसे ठीक और बारीकी से कम मल पीएच के साथ माइक्रोबियल चयापचयों की वृद्धि हुई संचय विशिष्ट microbiota हस्ताक्षर के साथ जुड़ा हुआ है.

संक्षेप में, पूर्व vivo microbiota पारिस्थितिकी तंत्र अनुकरण करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित है. प्रणाली शोधकर्ताओं microbiota विविधता, संरचना और चयापचय समारोह है कि मेजबान आंतों और समग्र स्वास्थ्य की विविध सुविधाओं को प्रभावित कर सकते हैं के मॉडुलन के लिए विभिन्न हस्तक्षेप का परीक्षण करने के लिए सक्षम बनाता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों आभारी मधुमेह के लिए केंद्र से धन समर्थन स्वीकार करते हैं, मोटापा और चयापचय और नैदानिक और अनुवाद विज्ञान केंद्र, जागो वन चिकित्सा स्कूल, रक्षा धन विभाग (अनुदान संख्या: W81XWH-18-1-0118), हृदय चिकित्सा में Kermit ग्लेन फिलिप्स द्वितीय कुर्सी; स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों क्लाउड डी काली मिर्च पुराने अमेरिकियों केंद्र (P30AG12232 द्वारा वित्त पोषित); R01AG18915; R01DK114224 और नैदानिक और अनुवाद विज्ञान केंद्र (क्लिनिकल अनुसंधान इकाई, UL1TR001420 द्वारा वित्त पोषित), भी शुक्र है स्वीकार किया है. हम भी मल के नमूने प्रदान करने के लिए स्वयंसेवकों को धन्यवाद, और उनके तकनीकी के लिए हमारे अन्य प्रयोगशाला के सदस्यों को इस प्रयोग के दौरान मदद करता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) Sigma-Aldrich 217255
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 TGI C2388 Toxic
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) Sigma-Aldrich C3306 Irritating
Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) Sigma-Aldrich 255599
Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) Acros organics 2063450000 Toxic, Irritating
Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C121800
D-biotin Sigma-Aldrich B4501
D-Pantothenic acid Alfa Aesar A16609
Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) Biorad 1610729
DL-α-methylbutyrate Sigma-Aldrich W271918
Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) Sigma-Aldrich F8263 Toxic
Folic acid Alfa Aesar J62937
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Hemin Sigma-Aldrich H9039
Hepes Alfa Aesar A14777
Isobutyrate Alfa Aesar L04038
Isovalerate Alfa Aesar A18642
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) Sigma-Aldrich M8266
Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) Sigma-Aldrich 221279
Niacin (Nicotinic acid) Sigma-Aldrich N4126
Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) Alfa Aesar A14366 Toxic
N-valerate Sigma-Aldrich 240370
P-aminobenzoic acid MP China 102569 Toxic, Irritating
Phosphoric Acid (H3PO4) Sigma-Aldrich P5811
Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5504
Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) Sigma-Aldrich 1551128
Pyridoxine Alfa Aesar A12041
Resazurin Sigma-Aldrich R7017
Riboflavin Alfa Aesar A11764
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich 1613757
Sodium chloride (NaCl) Fisher BioReagents 7647-14-5
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Chemicals S320
Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) Acros organics 206375000
Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) Acros organics 148991000
Trypticase BD Biosciences 211921
Vitamin B12 Sigma-Aldrich V2876
Yeast extract Sigma-Aldrich 70161
Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) Sigma-Aldrich Z0251
0.22 µm membrane filter
AMPure magnetic purification beads Agencourt
Anaerobic chamber with incubatore Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA
Bottle filter Corning
Cheesecloth
Illumina MiSeq sequencer Miseq reagent kit v3
pH meter
Qiagen PowerFecal kit Qiagen
Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software
Qubit-3 fluorimeter InVitrogen
Vortex Thermoscientific
Waters-2695 Alliance HPLC system Waters Corporation

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References

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