评估介入疗法对人体粪便微生物群影响的体内批处理培养模型

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

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Summary

该协议描述了人类粪便微生物群的体外批量培养发酵系统,使用硫素(一种众所周知的益生菌和研究最广泛的微生物群调制器之一)来证明该系统在估计特定效果时的使用粪便微生物群成分和代谢活动的干预措施。

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Ahmadi, S., Wang, S., Nagpal, R., Mainali, R., Soleimanian-Zad, S., Kitzman, D., Yadav, H. An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota. J. Vis. Exp. (149), e59524, doi:10.3791/59524 (2019).

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Abstract

肠道微生物群在几种人类疾病中正在显现的作用要求新的工具、技术和技术取得突破。需要进行这种改进,以破译微生物调节剂的利用,为人类健康带来益处。然而,大规模筛选和优化调制器以验证微生物群落调制和预测相关健康益处可能实际上很困难,因为需要大量的动物和/或人类受试者。为此,体外或体外模型可促进微生物调节剂的初步筛选。在此,它被优化和演示了一个前体粪便微生物群培养系统,可用于检查肠道微生物调节剂的各种干预措施的影响,包括益生菌,益生菌和其他食品成分,除了营养药物和药物,关于人类肠道微生物群的多样性和组成。Inulin 是研究最广泛的益生菌和微生物重组剂之一,这里以它为例,研究其对健康粪便微生物群成分及其代谢活动(如粪便 pH 和有机酸的粪便水平)的影响包括乳酸和短链脂肪酸(SCFA)。该议定书可能有助于旨在估计调制器不同干预措施对粪便微生物群谱的影响和预测其健康影响的研究。

Introduction

人类微生物群是一个复杂的群落,由细菌、古生物、病毒和真核微生物1组成,存在于人体内外。最近的证据已经确立了肠道微生物群和肠道微生物群(人类胃肠道中发现的微生物及其基因的全部集合)在各种人类疾病中的基本作用,包括肥胖、糖尿病、心血管疾病,和癌症1,2,3。此外,生活在我们肠道中的微生物产生广泛的代谢物,这显著影响我们的健康,也可以促进几种疾病的病理生理学以及各种代谢功能4,5.肠道微生物群的组成和功能异常变化(扰动)通常被称为"胃发育不良"。肌张力障碍通常与宿主的不健康状态相关,因此可以与与宿主的健康控制状态相关的正常(静静)微生物群落区分开来。肠道微生物群发育不良的特定模式通常存在于各种不同的疾病1,2,3,6,7。

肠道微生物群发酵未消化的食物,特别是可发酵的碳水化合物/纤维,不仅产生能量,还产生发散代谢物,包括短链脂肪酸(SCFAs)、乳酸、甲酸盐、二氧化碳、甲烷、氢气和乙醇6.此外,肠道微生物群还产生一些其他生物活性物质,如叶酸、生物素、三甲基胺-N-氧化物、血清素、色氨酸、伽马-氨基丁酸、多巴胺、去甲肾上腺素、乙酰胆碱、组胺、脱氧胆酸和4-乙基苯硫酸盐。这主要通过利用宿主-微生物利基内的内在代谢通量,这在几个身体过程,代谢功能和表观遗传变化1,8,9, 10.然而,由于缺乏简单、高效和可重复的协议,各种干预措施对此类微生物产品的影响仍然不明朗或不明确。人类肠道微生物群是一个极其复杂和多样化的生态系统,因此,关于其在人类健康和疾病病理学中的作用的许多问题仍未得到解答。许多常见的肠道微生物重组剂(如益生菌、益生菌、抗生素、粪便移植和感染)对肠道微生物群的组成和代谢功能的影响仍然在很大程度上难以实现。此外,在体内对这些影响的检查和验证是困难的,特别是因为肠道微生物群产生的大多数营养物质和代谢物在肠道中同时和迅速被吸收或处置;因此,测量体内这些代谢物(例如SCFA)的生产、量和处理仍然是一个实际挑战。事实上,动物和人类受试者等生理模型对于确定肠道微生物群系及其调节对宿主健康的作用至关重要,但由于道德、金钱或时间限制。为此,体外和/或体外模型,如在体外培育肠道微生物群,然后干预不同的微生物群调制器,可以提供节省时间和资金的机会,因此可以允许初步或大规模筛选各种成分(如益生菌、益生菌和其他介入化合物),以检查/预测其对粪便微生物群多样性、组成和代谢特征的影响。使用肠道微生物群的体外和体外系统的研究可有助于进一步理解宿主-微生物群相互作用,这些相互作用有助于宿主健康和疾病,还可能导致找到针对微生物群的新疗法。改善宿主健康,预防和治疗各种疾病1。

虽然体外肠道微生物群培养系统无法真正复制实际肠道条件,但一些实验室已努力开发这种模型,其中一些模型已在某种程度上被发现可行,并已成功用于不同的目的。最近的肠道模型之一是人类肠道微生物生态系统的模拟器,它模仿整个人类胃肠道,包括胃、小肠和结肠的不同区域。然而,这种技术上复杂的模型可能无法供全世界其他研究设施使用。因此,对于研究微生物调节剂及其对肠道微生物群和宿主健康的影响的实验室来说,仍然迫切需要开发相对简单、负担得起和实用的新替代模型。因此,使用体外(或活体)粪便微生物培养系统将有助于研究这种干预措施11、12的效果。具体来说,可以研究不同益生菌对微生物群发酵能力的影响,包括肠道微生物群多样性和成分的周期性变化、粪便pH和微生物代谢物的水平,包括SCFA和乳酸盐13.本文,以硫素(最广泛研究的益生菌成分之一)作为微生物群落调制器的范例,描述了这个简单的前体微生物群组培养系统的分步协议,以证明其用于估计使用微生物调节剂干预后,粪便微生物群和微生物代谢物的变化。

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Protocol

注意:查阅相应的材料安全数据表,并遵循相应的生物安全 2 级 (BSL-2) 培训的说明和指南。按照标准生物安全规则执行所有培养步骤,并使用无菌条件使用 BSL-2 机柜。此外,来自不同模型和人类受试者的粪便样本可能具有传播微生物传播疾病的潜在风险。发生任何伤害和感染时,立即寻求医疗援助。此外,人类和动物粪便样本的使用应经机构道德委员会批准,并必须符合使用样本和主题信息的协议。

1. 文化媒体的筹备

  1. 培养文化媒体,准备九类库存解决方案
    1. 溶液A(1,000 mL):溶解5.4克氯化钠(NaCl)、2.7克磷酸二氢钾(KH2PO 4)、0.16克氯化钙二水合物(CaCl2+2H2O)、0.12克氯化镁六氟化(MgCl2#6H2O),0.06 克氯化锰四水合物 (MnCl2+4H2O),0.06 g 氯化钴六氟化氢 (CoCl2+6H2O) 和 5.4 g 硫酸铵 (NH4)2SO4,在去离子化水中,使总体积达到1000 mL。
    2. 溶液B(1,000 mL):在去离子水中溶解2.7克磷酸氢钾(K2HPO4),使总体积达到1000mL。
    3. 微量矿物溶液(1,000 mL):溶解500毫克乙烯二胺-四乙酸二水合物(Na2EDTA),200毫克硫酸盐七分硫酸盐(FeSO4+7H2O),10毫克硫酸锌七分水合物(ZnSO4#7H2O), 3 毫克锰 (II) 氯化四水合物 (MnCl2+4H2O), 30 毫克磷酸 (H3PO4),20 毫克 CoCl2+6H2O, 1 毫克氯化杯二水合物 (CuCl2*2H2O),2毫克镍(II)氯化物六合物(NiCl2+6H2O)和3毫克氧化水钠(Na2MoO4+2H2O),使总体积达到1,000 mL。
      注:此解决方案对光敏感,因此可确保储存在深色/黑色或铝包装管/瓶中。
    4. 水溶性维生素溶液(1,000 mL):在脱离子水中溶解100毫克盐酸(硫胺-HCl)、100毫克D-泛酸、100毫克烟酸、100毫克丙二恶烷、5毫克P-氨苯甲酸和0.25毫克维生素B12,使总体积达到1,000 mL。
    5. 叶酸:生物素溶液(1,000 mL):在脱离子水中溶解10毫克叶酸、2毫克D-生物素和100毫克碳酸氢铵(NH4HCO3),使总体积达到1,000mL。
    6. 核黄素溶液(1,000 mL):在5mM HEPES(1.19 g/L)溶液中溶解10毫克核黄素,使总体积达到1,000 mL。
    7. 和敏溶液(10 mL):在10mM氢氧化钠(NaOH)(0.4克/升)溶液中溶解5,000毫克的赫敏,使总体积达到10 mL。
    8. 短链脂肪酸混合(10 mL):结合2.5 mL的N-valerate、2.5 mL的异型酸盐、2.5 mL的异丁酸和2.5 mL:DL-β-甲基丁酸。
      注:建议在烟气罩中使用此解决方案,以避免异味和烟雾。
    9. Resazurin (1,000 mL): 在去离子水中溶解 1 克雷沙林,使总体积达到 1,000 mL。
  2. 用于体外厌氧发酵的介质
    1. 要制备这种介质,混合330 mL溶液A、330 mL溶液B、10 mL微量矿物溶液、20 mL水溶性维生素溶液、5 mL叶酸:生物素溶液、5 mL核黄素溶液;2.5 mL 的赫敏溶液、0.4 mL 的短链脂肪酸混合物、1 mL 的 Resazurin、0.5 g 酵母提取物、4 克碳酸钠 (Na2CO 3)、0.5 g 半胱氨酸 HCl-H2O 和 0.5 g 的胰腺素,以及 296.1 mL 的蒸馏水。
    2. 检查 pH 值并确保 pH 值在 7.0 左右,如果没有,则用 1 N HCl 或 1 N NaOH 调节 pHH 值。使用无菌工作站下的瓶子过滤器对介质进行真空过滤消毒。
    3. 或者,将所有成分(维生素和赫敏溶液除外)和高压灭菌器在121°C下混合20分钟,使其冷却至室温。同时,使用0.22 μm膜过滤器过滤灭菌维生素和hemin溶液,并在点胶前将其添加到高压灭菌和冷却介质中。

2. 厌氧室和所需材料的制备

  1. 在实验开始前至少 48 小时,将发酵实验所需的所有材料、溶液和工具保存在厌氧室内,以确保与工具和缓冲液/溶液中的可溶性氧气相关的任何残留氧气去除所有材料,使之适应设定的厌氧条件。
    注:厌氧室内所需的材料(实验开始前48小时):(一)发酵介质;(ii) 厌氧溶液(根据第4.1节制备)、(iii)涡旋器、(iv)称量平衡、(v)穆斯林奶酪布、(vi)剪刀、(vii)漏斗、(八)1.5、2.0、15、50 mL管、(七)移管器(2、20、200和1,000 μL)和兼容的管头、(x)枪移液器和移液器(5 和 10 mL)、(xi) 纸组织、(xii) 标记、(xiii) 管代表不同的管、(xiv) 垃圾箱、(xv) O2指示器和 (xvi) 70% 乙醇喷雾瓶(消毒剂)。

3. 管材和纤维的制备

  1. 重量300毫克的硫氨酸,并转移到50 mL管,然后无菌添加26 mL的发酵培养物已经准备和存储在厌氧室。为每个粪便样品类型和实验管准备一个空白管(根据被测试的化合物的数量),以三联体形式。
  2. 在开始发酵实验之前,将这些管子留在厌氧室内约24小时,以便样品水化。确保接种时管温为37°C,因此将培养管内封闭在厌氧室内。

4. 接种的准备

  1. 厌氧稀释溶液(发酵实验前至少48小时):在脱离子水中溶解5克NaCl、2g葡萄糖和0.3克半胱氨酸-HCl,使总体积达到1,000mL。高压灭菌,并在使用前至少48小时将其储存在厌氧室中。
  2. 粪便接种制备(在发酵实验当天):在50 mL锥形管中称量5克新鲜粪便样品,加入厌氧稀释溶液,最终体积为50 mL(1:10 w/v),涡旋15分钟或直到完全均质。通过4层无菌奶酪布(高压灭菌)过滤均质混合物,并立即用于在含有介质的管中接种。
    注:如果实验目标是比较给定化合物/成分对整体健康与患病粪便微生物群的影响,则可以汇集一组受试者的粪便样本。

5. 发酵和取样

  1. 根据第 4.2 节制备管,用 4 mL 的稀释和过滤粪便接种空气/控制和实验管接种。在厌氧室内以37°C孵育接种管。通过轻轻反转来重新悬浮纤维和接种,每小时摇动一次管。
  2. 根据需要经常采集样品,例如,在发酵过程中每小时采集0、3、6、9和24小时,从各自的发酵管中抽取2 mL等分样品到2 mL管中。
  3. 使用实验室 pH 计测量等分物的 pH 值(通过直接在样品中插入 pH 电极);在4°C下将剩余的样品在14,000 x g下离心10分钟。立即将上清液和颗粒冻结在液氮中,在卡入冻结后,将上清液储存在-80°C的微生物群分析中,用于SCFA分析和颗粒。

6. 短链脂肪酸(SCFA)和乳酸定量

注:微生物菌培养的上清酸酯和乳酸盐可以精确地根据其他13、14、15、16详细的方法进行测量。

  1. 简单地说,解冻第5节中从冰上的控制和处理样品中获得的捕捉冷冻上生物,并在冰上执行所有进一步的处理步骤。通过 0.45 μm 膜过滤器过滤上清液,并使用带 DAD 探测器的 HPLC 系统测量无细胞样品和乳酸盐的浓度,该系统配有 HPX-87H 柱。每个样品使用10μL的注入体积,并使用H2 SO 4(0.005 N)在35°C下以0.6 mL/min的流速将柱排空。

7. 粪便微生物群落分析

注:按照其他地点7、13、14、17详述的方法和管道进行微生物群落分析。

  1. 简单地说,使用粪便DNA提取试剂盒13从大约200毫克的粪便浆粒中提取基因组DNA。
  2. 根据其他地方描述的方法,使用地球微生物群落项目协议18中描述的引物序列,使用条形码引物,放大细菌16S rRNA基因的超可变区域。
  3. 用磁性纯化珠子净化产生的放大器,并通过皮科格林或同等方法进行量化。将纯化的PCR产品以等摩尔浓度和顺序在音序器13上。
  4. 使用微生物生态学定量洞察 (QIIME) 软件,使用卡波拉索等人19.

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Representative Results

该规程用于演示特定益生菌(即,在粪便pH值的变化以及乳酸和SCFA在健康人类受试者粪便中的浓度变化方面,硫素对微生物群组合物和代谢活动的影响)。不同的时间点后处理与硫宁)。粪便pH、乳酸和SCFA的粪便水平(图1)和微生物群组合物(图2图3)在0(基线)、9和24小时孵育时测量,无论是否使用硫素。研究结果表明,粪便微生物群成分及其代谢活性在体外发酵过程中如何调节,无论是否进行硫素治疗。

Figure 1
图1:粪便pH(a)、乳酸(b)和短链脂肪酸(即醋酸酯(c)、丙酸酯(d)和丁酸(e)在0(基线)、9和24小时厌氧发酵中随叶酸或不含醇酸的变化。此处显示的值是三元样品的平均 = SEM。*P < 0.05, =P < 0.01, =P < 0.001, 与基线。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:人体粪便中微生物群落多样性和成分的变化,在0(基线)、9和24小时厌氧发酵时,有或无硫氨酸。(a) 使用原理坐标分析 (PCoA) 可视化的 beta-多样性的加权和 (b) 未加权的 Beta 多样性测量。(c-f)α-多样性(即植物遗传多样性)指数(PD全树(c);物种丰富性(赵1;d;观察到的可操作分类单位数(OTUs,e );和物种均匀度(山农指数,f)。 主要植物的相对丰度 (g) 和属 (h).此处显示的值是三元样品的平均 = SEM。*P < 0.05, =P < 0.01, 与基线。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:在9小时和24小时孵育(INU)或无(CTL)中,肠道微生物群的线性鉴别性分析(LDA)效应大小(LEfSe)分析。从 16S 序列的 LEfSe 分析中得出的分类表(相对丰度 = 0.5%)表示不同样本组之间的不同丰分的分类。每个点的亮度与其效果大小成正比(即,分类丰度)。此处仅显示超过 LDA 阈值 >2.4 的税位。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

此处介绍的体外粪便浆发酵模型是一个简单的单组模型,用于近似不同基质和微生物菌株(如益生菌和益生菌)对人类粪便微生物群的组成及其影响代谢活动在粪便pH和SCFA水平方面。本文介绍的结果表明,与未经处理的粪便微生物群培养相比,接种硫素可降低粪便pH值,并显著提高经尿酸处理的粪便标本中的SCFA和乳酸水平(图1)。此外,肠道微生物群特征在经处理的样品和未经处理的样品之间也显得不同(图2图3)。这些数据说明了这个系统如何反映丁林对粪便微生物群多样性和组成的影响及其代谢活动。此外,根据特定的实验目标和假设,也可以使用此系统测量各种其他因素。此外,除了16S rRNA基因测序外,其他分析,如全微生物元基因组测序(使用全基因组测序仪)或qPCR和培养方法,针对特定的单一或多属、物种和菌株(例如,双歧杆菌、乳酸杆菌、阿克克曼西亚、肠杆菌、梭菌等)也可以执行。此外,还可以根据实验要求和可用性利用用于分析 SCFA 的不同色谱程序,如 LC-MS、GC、GC-MS、GC-FID 和 HPLC。然而,应当指出,这些程序的样品制备可能因操作20所需的工具和条件而异。

虽然使用新鲜粪便标本会产生最佳的可重复效果;然而,捕捉冷冻粪便样本(如本文介绍的实验中使用的)也可以有效地使用,因为大多数细菌可以从它恢复一旦复苏到体温,不再发生分解后冻结21。当不可能在实验计划当天从特定捐赠者获得新鲜粪便样本,或者在需要复制实验时从同一捐赠者那里获得新鲜粪便样本时,使用冷冻样本可能特别有利。然而,应当注意的是,粪便样品应使用液氮进行冷冻,并立即储存在-80°C,直到进一步使用。此外,为了避免冷冻粪便样本暴露给空气(氧气),样品应尽快/从冷冻室中取出后立即转移到厌氧室并立即使用(应避免重复解冻)。所有后续实验,包括样品解冻、接种制备和加工,都应在厌氧室内进行。

大肠营养发酵过程中的肠道有机环境和pH值非常重要,特别是鉴于pH异常降低表明由于基质的利用而增加酸度。因此,更快速的pH降低可以对应于更快速的基材利用率22。虽然在此模型中,pHA 尚未得到控制,但是,强烈建议采用相同的未经处理的控制进行直接比较。由于肠道微生物群发酵难多糖而在结肠中产生的SCFA可以进一步影响与维持宿主健康有关的各种机制。这些代谢物有助于葡萄糖生成和脂质生物合成,作为结肠细胞的能量来源,也可以有健康的好处,包括免疫调节,控制/改善肠道屏障功能,和神经调节23, 24,25,26.此外,SCFA 还已知影响多种生物途径,包括激素、内分泌素系统、细胞增殖和死亡、骨骼健康、矿物质吸收、肠道活动、肠道 pH 和对肠道微生物群的反转效应和微生物代谢功能。因此,了解肠道/粪便SCFA的轮廓和浓度可能是评估特定微生物群落调节剂6的疗效的一个重要组成部分。当然,除了SCFA,肠道微生物群还产生许多其他重要的代谢物(例如铵、维生素、组胺)。因此,在这种体外发酵实验中收集的上清标本也可以进行全球代谢组学分析,以发现受特定微生物组调节剂影响的新型肠道微生物微生物衍生代谢物。

本文介绍的系统具有操作简便、简单、成本效益和实验设置的一般可采用性等优点。但是,也没有什么限制。例如,该系统与上游消化系统(如唾液、胃、小肠)中益生菌(或其他干预措施)在暴露于大肠微生物群之前的相互作用无关。然而,这些步骤可以根据具体的实验要求采用和纳入。此外,如果使用特定基质(包括全食物或可消化食物),可能需要在发酵前进行酸性和/或酶水解过程,因为只有此类食物的消化不良部分到达结肠,由较低部分发酵肠道微生物群。此外,肠道微生物群的组成可能因发酵过程中的特定培养条件而改变。例如,据观察,长达9小时的孵育,微生物群的变化更接近于正常比在24小时。然而,在24小时孵育后,虽然pH和SCFA水平显著增加,肠道微生物群组成表明蛋白杆菌数量增加,而微生物多样性减少。然而,目前还不清楚微生物代谢物的积累与降低的粪便pH如何与特定的微生物群特征相关。

总之,本文描述了一种模拟前生物群生态系统的简单方案。该系统使研究人员能够测试不同的干预措施,以调节微生物群的多样性,组成和代谢功能,可以影响宿主肠道和整体健康的不同特征。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者感谢糖尿病、肥胖和代谢中心以及临床和转化科学中心、威克森林医学院、国防部的资助(资助编号:W81XWH-18-0118) 提供的资金支持,克米特·格伦·菲利普斯二世心血管医学主席;国家卫生研究院资助了克劳德·佩珀老人美国中心(由P30AG12232资助);R01AG18915;R01DK114224和临床和转化科学中心(临床研究单位,由UL1TR001420资助),也得到了感谢的认可。我们还感谢志愿者提供粪便样本,以及我们的其他实验室成员在实验中的技术支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) Sigma-Aldrich 217255
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 TGI C2388 Toxic
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) Sigma-Aldrich C3306 Irritating
Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) Sigma-Aldrich 255599
Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) Acros organics 2063450000 Toxic, Irritating
Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C121800
D-biotin Sigma-Aldrich B4501
D-Pantothenic acid Alfa Aesar A16609
Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) Biorad 1610729
DL-α-methylbutyrate Sigma-Aldrich W271918
Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) Sigma-Aldrich F8263 Toxic
Folic acid Alfa Aesar J62937
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Hemin Sigma-Aldrich H9039
Hepes Alfa Aesar A14777
Isobutyrate Alfa Aesar L04038
Isovalerate Alfa Aesar A18642
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) Sigma-Aldrich M8266
Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) Sigma-Aldrich 221279
Niacin (Nicotinic acid) Sigma-Aldrich N4126
Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) Alfa Aesar A14366 Toxic
N-valerate Sigma-Aldrich 240370
P-aminobenzoic acid MP China 102569 Toxic, Irritating
Phosphoric Acid (H3PO4) Sigma-Aldrich P5811
Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5504
Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) Sigma-Aldrich 1551128
Pyridoxine Alfa Aesar A12041
Resazurin Sigma-Aldrich R7017
Riboflavin Alfa Aesar A11764
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich 1613757
Sodium chloride (NaCl) Fisher BioReagents 7647-14-5
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Chemicals S320
Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) Acros organics 206375000
Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) Acros organics 148991000
Trypticase BD Biosciences 211921
Vitamin B12 Sigma-Aldrich V2876
Yeast extract Sigma-Aldrich 70161
Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) Sigma-Aldrich Z0251
0.22 µm membrane filter
AMPure magnetic purification beads Agencourt
Anaerobic chamber with incubatore Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA
Bottle filter Corning
Cheesecloth
Illumina MiSeq sequencer Miseq reagent kit v3
pH meter
Qiagen PowerFecal kit Qiagen
Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software
Qubit-3 fluorimeter InVitrogen
Vortex Thermoscientific
Waters-2695 Alliance HPLC system Waters Corporation

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References

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