En in vitro-batch-kultur model til at estimere virkningerne af interventionelle regimer på human fecal microbiota

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokol beskriver en in vitro batch-kultur fermenterings system af humant fækal mikrobiota, ved hjælp af inulin (en velkendt prebiotiske og en af de mest udbredte studerede mikrobiota modulatorer) at demonstrere brugen af dette system til at anslå virkningerne af specifikke interventioner på fækal mikrobiota sammensætning og metaboliske aktiviteter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ahmadi, S., Wang, S., Nagpal, R., Mainali, R., Soleimanian-Zad, S., Kitzman, D., Yadav, H. An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota. J. Vis. Exp. (149), e59524, doi:10.3791/59524 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den nye rolle, som tarm mikrobiomet spiller i flere menneskelige sygdomme, kræver et gennembrud af nye værktøjer, teknikker og teknologier. Sådanne forbedringer er nødvendige for at dechifrere udnyttelsen af mikrobiome modulatorer til gavn for menneskers sundhed. Men den omfattende screening og optimering af modulatorer til validering af mikrobiome modulation og forudsige relaterede sundhedsmæssige fordele kan være praktisk vanskeligt på grund af behovet for et stort antal dyr og/eller menneskelige. Med henblik herpå kan in vitro-eller ex vivo-modeller lette den foreløbige screening af mikrobiome modulatorer. Heri, det er optimeret og demonstreret en ex vivo fækal mikrobiota kultur system, der kan anvendes til at undersøge virkningerne af forskellige interventioner af Gut mikrobiome modulatorer herunder probiotika, prebiotics og andre fødevareingredienser, bortset fra nutraceuticals og narkotika, om mangfoldigheden og sammensætningen af den humane tarm mikrobiota. Inulin, en af de mest udbredte undersøgte prebiotiske forbindelser og mikrobiome modulatorer, bruges som et eksempel her for at undersøge dens virkning på den sunde fækale mikrobiota sammensætning og dens metaboliske aktiviteter, såsom fækal pH og fækale niveauer af organiske syrer herunder laktat og kortkædede fedtsyrer (SCFAs). Protokollen kan være nyttig for undersøgelser, der har til formål at anslå virkningerne af forskellige interventioner af modulatorer på fækale mikrobiota profiler og at forudsige deres sundhedsmæssige konsekvenser.

Introduction

Den humane mikrobiota er et komplekst fællesskab bestående af bakterier, archaea, vira og eukaryote mikrober1, der bebor den menneskelige krop internt og eksternt. Nylige beviser har fastlagt den grundlæggende rolle, som Gut mikrobiota og tarm mikrobiome (hele samlingen af mikrober og deres gener findes i den menneskelige mave-tarmkanalen) i forskellige sygdomme hos mennesker, herunder fedme, diabetes, hjerte-kar-sygdomme, og kræft1,2,3. Derudover producerer de mikroorganismer, der lever i vores tarm, et bredt spektrum af metabolitter, som i væsentlig grad påvirker vores helbred og kan også bidrage til patofysiologien af flere sygdomme samt en række metaboliske funktioner4, 5. unormale ændringer (perturbationer) i sammensætningen og funktionen af denne Gut mikrobielle population er generelt betegnes som "Gut dysbiosis". Dysbiosis er normalt forbundet med en usund tilstand af værten og dermed kan differentieres fra den normale (homeostatisk) mikrobielle samfund forbundet med en sund kontroltilstand af værten. Specifikke mønstre af Gut mikrobiome dysbiosis findes ofte i forskellige forskellige sygdomme1,2,3,6,7.

Fermentering af ufordøjet mad, især de fermenterbare kulhydrater/fibre, af Gut mikrobiota ikke kun giver energi, men også producerer divergerende metabolitter, herunder kortkædede fedtsyrer (scfas), lactat, formate, carbondioxid, metan, brint og ethanol6. Desuden producerer Gut mikrobiota også en række andre bioaktive stoffer såsom folat, biotin, trimethylamin-N-oxid, serotonin, tryptophan, gamma-aminosmørsyre, dopamin, noradrenalin, acetylcholin, histamin, deoxycholic Acid og 4-ethylphenyl sulfat. Dette sker primært gennem udnyttelse af iboende metaboliske strømme inden for værten-Microbe niche, som bidrager i flere krops processer, metaboliske funktioner og epigenetiske ændringer1,8,9, 10. Virkningerne af forskellige interventioner på sådanne mikrobielle produkter forbliver imidlertid ukendte eller uklare på grund af manglen på enkle, effektive og reproducerbare protokoller. Den menneskelige tarm mikrobiota sammensætning er et yderst komplekst og mangfoldigt økosystem, og derfor er mange spørgsmål om dets rolle i menneskers sundhed og sygdoms patologi stadig ubesvarede. Virkningerne af mange almindelige tarm mikrobiome modulatorer (fx probiotika, prebiotics, antibiotika, fækal transplantation og infektioner) på sammensætningen og metaboliske funktioner i tarm mikrobiota forbliver stort set undvigende. Desuden er undersøgelse og validering af disse virkninger in vivo vanskelig, især fordi de fleste af de næringsstoffer og metabolitter, der produceres af tarmen mikrobiota absorberes eller bortskaffes samtidigt og hurtigt i tarmen; Derfor er det stadig en praktisk udfordring at måle produktionen, mængden og forarbejdningen af disse metabolitter (f. eks. SCFAs) in vivo. Fysiologiske modeller såsom dyr og mennesker er afgørende for at bestemme rollen for Gut-mikrobiom og dets graduering på værts sundheden, men disse kan ikke være egnede til storstilet screening af forskellige typer af mikrobiome modulatorer på grund af etiske, monetære eller tidsmæssige begrænsninger. Med henblik herpå kan in vitro-og/eller ex vivo-modeller, såsom dyrkning af Gut mikrobiota in vitro og derefter intervenere med forskellige mikrobiota-modulatorer, tilbyde tids-og pengebesparende muligheder og kan derfor give mulighed for foreløbig eller storstilet screening af forskellige komponenter (såsom probiotika, prebiotics, og andre interventionelle forbindelser) til at undersøge/forudsige deres virkninger på fækal mikrobiota mangfoldighed, sammensætning og metaboliske profiler. Undersøgelser, der anvender sådanne in vitro-og ex vivo-systemer i tarm mikrobielle stoffer, kan fremme en yderligere forståelse af værts-mikrobiom-interaktioner, som bidrager til at være vært for sundhed og sygdom, og kan også føre til at finde nye terapier, der er målrettet mod mikrobiomet, til forbedre Host sundhed og forebygge og behandle forskellige sygdomme1.

Selv om in vitro Gut mikrobiota kultur systemer ikke rigtig kan replikere de faktiske tarm betingelser, har flere laboratorier bestræbt sig på at udvikle sådanne modeller, hvoraf nogle er blevet fundet praktisk gennemførligt til en vis grad og er blevet anvendt med succes til forskellige formål. En af de seneste Gut modeller er simulatoren af den menneskelige tarm mikrobielle økosystem, som efterligner hele menneskelige mave-tarmkanalen, herunder maven, tyndtarmen, og forskellige regioner i tyktarmen. Men sådanne teknisk komplekse modeller er muligvis ikke tilgængelige for andre forskningsfaciliteter på verdensplan. Der er derfor stadig et kritisk behov for udvikling af nye alternative modeller, der er relativt enkle, overkommelige og praktiske for laboratorier, som studerer mikrobiome modulatorer og deres virkninger på tarm mikrobiota og værts sundhed. Derfor ville brugen af et in vitro (eller ex vivo) fækale mikrobiota-kultur system være nyttigt til at studere virkningerne af sådanne interventioner11,12. Specifikt, virkningen af forskellige prebiotics på mikrobiota fermenterings kapacitet i form af periodiske ændringer i tarm mikrobiota mangfoldighed og sammensætning, fækal pH, og niveauerne af mikrobielle metabolitter, herunder SCFAs og lactat kan undersøgt 13. heri, ved hjælp af inulin (en af de mest udbredte undersøgt prebiotiske komponenter) som et eksempel på mikrobiome modulator, en trin-for-trin protokol af denne simple ex vivo mikrobiota batch-kultur system er beskrevet for at demonstrere dets anvendelse til at anslå ændringer i fækale mikrobiota og mikrobielle metabolitter efter intervention med mikrobiome modulatorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsigtig: Se de relevante materiale sikkerheds data blade, og følg instruktionerne og retningslinjerne for passende biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) træning. Følg alle dyrknings trinene i forhold til standardreglerne for biosikkerhed, og brug et BSL-2 kabinet med aseptiske forhold. Desuden, fækale prøver fra forskellige modeller og mennesker kan have en potentiel risiko for spredning af mikrobielle bårne sygdomme. Straks søge lægehjælp i tilfælde af skade og infektion. Desuden bør brugen af prøver fra mennesker og dyre afføring godkendes gennem institutionelle etiske komitéer og skal være i overensstemmelse med protokollerne om anvendelse af prøver og emne oplysninger.

1. forberedelse af kultur medier

  1. Forberedelse af kultur medierne, Forbered ni typer af stamopløsninger
    1. Opløsning A (1.000 mL): opløsningen opløses 5,4 g natriumchlorid (NaCl), 2,7 g kaliumdihydrogenphosphat (KH2po4), 0,16 g Calciumchloriddihydrat (CaCl2· 2h2O), 0,12 g Magnesiumchloridhexahydrat (mgcl2 · 6h2o), 0,06 g mangan klorid tetrahydrat (mncl2· 4h2o), 0,06 g cobaltøs Chloridhexahydrat (cocl2· 6h2o) og 5,4 g ammoniumsulfat (NH4)2so4, i deioniseret vand for at gøre total volumen til 1.000 mL.
    2. Opløsning B (1.000 mL): opløses 2,7 g kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4) i deioniseret vand for at gøre total volumen til 1000 mL.
    3. Trace mineral opløsning (1.000 mL): opløses 500 mg dinatriumethylenediamin-tetraacetat dihydrat (na2EDTA), 200 mg ferrosulfat heptahydrat (FeSO4· 7h2O), 10 mg zinksulfat heptahydrat (znso4 · 7h2o), 3 mg mangan (II) klorid tetrahydrat (mncl2· 4h2o), 30 mg fosforsyre (H3po4), 20 mg cocl2· 6h2o, 1 mg Brugte kobberchlorid-chloriddihydrat (CuCl2 · 2H2o), 2 mg nikkel (II) chloridhexahydrat (nicl2· 6h2o) og 3 mg Natriummolybddihydrat (na2Moo4· 2H2O) i deioniseret vand for at gøre total volumen til 1.000 ml.
      Bemærk: Denne løsning er lysfølsom, derfor sikre at blive opbevaret i mørke/sort eller aluminium indpakket rør/flasker.
    4. Vandopløselig vitamin opløsning (1.000 mL): Opløs 100 mg thiaminhydrochlorid (thiamin-HCl), 100 mg D-pantothensyre, 100 mg niacin, 100 mg pyridoxin, 5 mg P-aminobenzoinsyre og 0,25 mg vitamin B12 i deioniseret vand for at gøre total volumen til 1.000 mL.
    5. Folat: biotin opløsning (1.000 mL): 10 mg folinsyre opløses, 2 mg D-biotin og 100 mg ammoniumbicarbonat (NH4HCO3) i deioniseret vand for at gøre total volumen til 1.000 ml.
    6. Riboflavin opløsning (1.000 mL): 10 mg riboflavin opløses i 5 mM HEPES (1,19 g/L) opløsning for at gøre total volumen til 1.000 mL.
    7. Hemin opløsning (10 mL): opløses 5.000 mg Hemin i 10 mM natriumhydroxid (NaOH) (0,4 g/L) opløsning for at gøre total volumen til 10 mL.
    8. Kortkædede fedtsyremix (10 mL): Kombiner 2,5 mL N-valat, 2,5 mL isovalerate, 2,5 mL isobutyrat og 2,5 mL: DL-α-methylbutyrat.
      Bemærk: Denne løsning anbefales at bruge i røg Hood for at undgå lugt og røg.
    9. Resazurin (1.000 mL): 1 g resazurin opløses i deioniseret vand, og det samlede rumfang skal være 1.000 mL.
  2. Medium anvendes til in vitro anaerob fermentering
    1. Til klargøring af dette medie blandes 330 mL opløsning A, 330 mL opløsning B, 10 mL Trace mineral opløsning, 20 mL vandopløselig vitamin opløsning, 5 mL folat: biotin opløsning, 5 mL riboflavin opløsning; 2,5 mL Hemin opløsning, 0,4 mL kortkædede fedtsyremix, 1 mL Resazurin, 0,5 g gærekstrakt, 4 g natriumcarbonat (na2co3), 0,5 g cystein HCL-H2O og 0,5 g Trypticase, og tilsæt 296,1 ml destilleret vand.
    2. Kontroller pH og sørg for, at det er omkring 7,0, hvis ikke, justere pH med 1 N HCl eller 1 N NaOH. Sterilisere ved vakuum filtrering af mediet ved hjælp af et flaske filter under den aseptiske arbejdsstation.
    3. Alternativt kan du blande alle komponenterne (undtagen vitamin-og hemin-opløsninger) og autoklave ved 121 °C i 20 minutter og lade den køle ned til stuetemperatur. Samtidig filtreres-sterilisere vitamin-og hemin opløsninger ved hjælp af 0,22 μm membranfiltre og tilføje disse til autoklave og afkølet medier før dispensering.

2. klargøring af anaerob kammer og nødvendigt materiale

  1. Opbevar alle materialer, opløsninger og værktøjer, der er nødvendige til fermenterings eksperimentet inde i det anaerobe kammer, mindst 48 h før eksperimentet påbegyndes for at sikre, at eventuel resterende ilt i forbindelse med værktøj og opløseligt ilt i buffere/opløsninger fjernes, og alle materialer er akklimatiseret til de indstillede anaerobe forhold.
    Bemærk: Nødvendige materialer inde i det anaerobe kammer (48 h tidligere eksperiment til start): (i) fermenterings medier; II) anaerob opløsning (fremstillet i henhold til punkt 4,1) III) vortexer, (IV) vejning, (v) Muslin-oste klude, (vi) saks, (VII) tragt, (VIII) 1,5, 2,0, 15, 50 ml rør, (IX) pipette (2, 20, 200 og 1.000 μl) og kompatible pipet spidser, (x) pistol pipet og pipetter (5 og 10 mL), (XI) papirvæv, (XII) markører, (XIII) rør står for forskellige rør, (XIV) affaldsboks, (XV) O2 indikator og (xvi) 70% ethanol sprayflaske (desinfektionsmiddel).

3. fremstilling af rør og fibre

  1. Vægt 300 mg inulin og overførsel til et 50 mL rør efterfulgt af aseptisk tilsætning af 26 mL fermenterings medie, der allerede er forberedt og opbevaret i det anaerobe kammer. Der fremstilles et blankt rør til hver fækal prøvetype og eksperimentelle tube (er) (afhængigt af antallet af testede forbindelser), i tre eksemplarer.
  2. Lad disse rør inde i det anaerobe kammer i ca. 24 timer for at tillade hydrering af prøver, før fermenterings forsøget påbegyndes. Sørg for, at rørtemperaturen er 37 °C på tidspunktet for inokulering, og Bring derfor rørene i inkubator indesluttet i det anaerobe kammer.

4. klargøring af inoculum

  1. Anaerob fortyndings opløsning (mindst 48 h før fermenterings forsøget): 5 g NaCl opløses, 2 g glucose og 0,3 g cystein-HCl i deioniseret vand, og det samlede rumfang skal være 1.000 mL. Autoklave og opbevar det inde i det anaerobe kammer mindst 48 h før brug.
  2. Fækal inokulum præparat (på dagen for fermenterings forsøget): vejer 5 g frisk fækal prøve i et 50 ml konisk rør, tilsæt anaerob fortyndings opløsning til en endelig volumen på 50 ml (1:10 w/v) og vortex i 15 min eller indtil fuldstændig homogeniseret. Filtrer den homogeniserede blanding gennem 4 lag steril ostelærred (autoclaved), og brug den straks til inokulering i de rør, der indeholder mediet.
    Bemærk: Fækal prøverne fra en gruppe af kan samles, hvis det eksperimentelle mål er at sammenligne effekten af en given sammensatte/ingrediens på samlet sund versus syge fækale mikrobiota i almindelighed.

5. gæring og prøvetagning

  1. Forbered rør i henhold til afsnit 4,2 og inokulere blank/kontrol og eksperimentelle rør med 4 mL fortyndet og filtreret fækal inoculum. De inokulerede rør inkuberes ved 37 °C inde i det anaerobe kammer. Ryst rørene en gang hver time ved at invertere forsigtigt for at re-suspendere fibrene og inoculum.
  2. Indsamle prøver så ofte som nødvendigt, for eksempel, time til 0, 3, 6, 9 og 24 h under gæring ved at tage en 2 ml alikvot prøve ud i et 2 ml rør fra respektive fermenterings slanger.
  3. Måle pH-værdien af aliquoterne ved hjælp af en laboratorie-pH-måler (ved direkte indsættelse af pH-elektroden i prøven) den resterende prøve centrifugeres ved 14.000 x g i 10 minutter ved 4 °c. Supernatanten og pellet væsken fastfryses straks i flydende nitrogen, og efter snap frysning opbevares supernatanten til SCFAs-analyse og pellet til mikrobiome analyse ved-80 °C.

6. kortkædede fedtsyrer (SCFAs) og laktat kvantificering

Bemærk: Scfas og lactat i supernatanten af mikrobiome kultur kan måles nøjagtigt efter metoderne beskrevet andetsteds13,14,15,16.

  1. Kortvarigt, tø de fastfrosne supernatanter, som er fremstillet i punkt 5, fra kontrol-og behandlingsprøver på is, og Udfør alle yderligere forarbejdningstrin på isen. Supernatanten filtreres gennem et 0,45 μm membranfilter, og der anvendes celle frie prøver til at måle koncentrationerne af SCFAs og lactat ved hjælp af HPLC-system med far-detektor ved 210 nm, der er udstyret med en HPX-87H-kolonne. Brug Injicér volumen på 10 μl for hver prøve, og brug H24 (0,005 N) til at elueres søjlen med en strømningshastighed på 0,6 ml/min ved 35 °c.

7. analyse af fækale Mikrobiome

Bemærk: Udfør mikrobiomomanalyse efter metoderne og rørledningen, som er beskrevet andetsteds7,13,14,17.

  1. Kort, uddrag genomisk DNA fra ca 200 mg fækale gylle pellets ved hjælp af en fækal DNA ekstraktion kit13.
  2. Amplificere den hypervariable region af bakterien 16S rRNA gen ved hjælp af de barkodede primere som pr den metode, der er beskrevet andetsteds13, ved hjælp af primer sekvenser som beskrevet i Jordens mikrobiome projekt protokol18.
  3. Rense de resulterende amplikoner med magnetisk rensning perler og kvantificere ved picogreen eller en tilsvarende metode. Opsamle de rensede PCR-produkter i lige molær koncentration og sekvens på en sequencer13.
  4. Behandl de resulterende sekvenser for de-multiplexing, kvalitets filtrering og klyngedannelse, taksonomisk tildeling og rarefaction og downstream analyser ved at bruge den kvantitative indsigt i mikrobiel økologi (QIIME) software som pr de metoder, der er beskrevet af Caporaso et al.19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen anvendes til at påvise virkningen af en specifik prebiotiske (dvs. inulin på mikrobiota sammensætning og metaboliske aktiviteter i form af ændringer i fækal ph og koncentrationen af lactat og scfas i afføring af raske humane personer over forskellige tidspunkter efter behandling med inulin). Fækal pH, fækale niveauer af lactat og SCFAs (figur 1), og mikrobiota sammensætning (figur 2 og figur 3) måles ved 0 (baseline), 9 og 24 h inkubation med eller uden inulin. Resultaterne viser, hvordan fækal mikrobiota sammensætning og dens metaboliske aktiviteter er moduleret under in vitro-gæring med eller uden inulin behandling.

Figure 1
Figur 1: ændringer i fækal pH (a), lactat (b) og kortkædede fedtsyrer, dvs. acetat (c), propionat (d) og butyrat (e) i humane afføring ved 0 (baseline), 9 og 24 timer anaerob gæring med eller uden inulin. Værdier, der præsenteres her, er middelværdien ± SEM af tre triplicatprøver. * P < 0,05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001, vs. baseline. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: ændringer i mikrobiota mangfoldighed og sammensætning i humane afføring ved 0 (baseline), 9 og 24 h af anaerob gæring med eller uden inulin. a) vægtede ogb) Uvægtede unifrac-målinger af beta-diversitet visualiseret ved anvendelse af princip koordinat analyse (pcoa). (c-f) Indekser for Alpha-diversitet dvs. Fylogenetisk diversitet (PD hele træet (c); Arts rigdom (Chao1; d); observeret antal operationelle taksonomiske enheder (Otu'er, e) og Arts jævnhed (Shannon index, f)). Relativ overflod af større slægt (g) og slægtning (h). Værdier, der præsenteres her, er middelværdien ± SEM af tre triplicatprøver. * P < 0,05, * *P < 0,01, vs. baseline. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: lineær diskriminant Analysis (LDA) effekt størrelse (LEfSe) analyse af Gut mikrobiota ændringer efter 9 h og 24 h inkubation med (Inu) eller uden (CTL) inulin. Taksonomisk cladogram afledt af LEfSe-analyse af 16S-sekvenser (relativ forekomst ≥ 0,5%) repræsenterer den differentielt rigelige taxa mellem forskellige grupper af prøver. Lysstyrken for hver prik er proportional med dens effekt størrelse (dvs. den systematisk enhed overflod). Kun taxa, der passerer LDA-tærskelværdi på > 2.4, vises her. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vitro fækal gylle fermenterings model præsenteret her er en simpel single-batch model til at tilnærme virkningerne af forskellige substrater og mikrobielle stammer (f. eks prebiotics og probiotika) på sammensætningen af human fækal mikrobiota samt dens metaboliske aktiviteter i form af fækal pH og SCFAs niveauer. Resultaterne præsenteres heri viser, at inokulering af inulin nedsætter fækal pH og øger niveauet af SCFAs og lactat i inulin-behandlet fækal model i forhold til ikke-behandlede fækale mikrobiota kultur (figur 1). Desuden synes Gut mikrobiota signaturen også at være forskellig mellem inulin-behandlede og ubehandlede prøver (figur 2 og figur 3). Disse data eksemplificere, hvordan dette system kan afspejle virkningerne af inulin på fækal mikrobiom mangfoldighed og sammensætning samt dets metaboliske aktiviteter. Desuden kan en række andre faktorer, afhængigt af specifikke eksperimentelle mål og hypoteser, også måles ved hjælp af dette system. Desuden er der foruden 16S rRNA-gensekvensering andre analyser, såsom hel mikrobiel metagenome sekventering (anvendelse af hele genom sequencer) eller qPCR og dyrkningsmetoder, der er målrettet mod specifikke enkelt eller flere slægter, arter og stammer (f. eks. bifidobakterier, lactobacilli, Akkermansia, enterobacteriacaea, Clostridia, etc.) kan også udføres. Desuden kan forskellige kromatografiske procedurer til analyse af SCFAs, såsom LC-MS, GC, GC-MS, GC-FID og HPLC, også udnyttes på grundlag af forsøgs krav og tilgængelighed. Det skal dog bemærkes, at prøveforberedelsen af disse procedurer kan variere alt efter de instrumenter og betingelser, der er nødvendige for operation20.

Selv om brugen af frisk fækal prøve ville give de bedste reproducerbare resultater; dog kan snap frosne fækal prøve (som anvendes i forsøget præsenteret heri) også anvendes effektivt, da de fleste af bakterierne kan genoplives fra det, når genoplives til kropstemperatur og ikke mere nedbrydning sker efter frysning21. Det kan være særlig fordelagtigt at anvende frosset prøve, når det er umuligt at få friske fækale prøver fra specifikke donorer på den planlagte dag i forsøget eller fra den samme donor, når et eksperiment skal replikeres. Det skal dog bemærkes, at fækal prøverne skal fastfryses ved hjælp af flydende nitrogen og straks opbevares ved-80 °C indtil videre brug. For at undgå, at de frosne fækale prøver udsættes for luft (ilt), bør prøverne desuden overføres til det anaerobe kammer så hurtigt som muligt/umiddelbart efter, at de er taget ud af fryseren og brugt med det samme (gentagen optøning bør undgås). Alle efterfølgende eksperimenter, herunder prøve optøning, klargøring og behandling af inokulum, skal udføres inden for det anaerobe kammer.

Den intestinale organiske miljø og pH under næringsstof gæring i tyktarmen er meget vigtigt, især i betragtning af det faktum, at en unormalt nedsat pH indikerer øget surhedsgrad på grund af substrat udnyttelse. Derfor kan hurtigere pH-reduktion svare til hurtigere substrat udnyttelse22. Selv om pH-værdien i denne model ikke er blevet kontrolleret, anbefales det dog stærkt at foretage direkte sammenligninger, hvis den identiske ikke-behandlede kontrol medtages. Scfas fremstillet i tyktarmen som følge af gæring af ufordøjelige polysaccharider af Gut mikrobiota kan yderligere påvirke forskellige mekanismer i forbindelse med opretholdelsen af værten sundhed. Disse metabolitter bidrager til glukoneogenese og lipid biosyntese, fungerer som en energikilde for colonocytter, og kan også have sundhedsmæssige fordele, herunder immunmodulation, kontrollerede/forbedrede Gut barriere funktioner, og Neuro23, 24,25,26. Desuden er SCFAs også kendt for at påvirke flere biologiske veje, herunder hormoner, endocannabinoide system, celle spredning og død, knogle sundhed, mineral absorption, tarm motilitet, tarm pH, og invertere virkninger på tarm mikrobiome og mikrobiel metabolisk funktion. Derfor, viden om profilen og koncentrationerne af tarm/fækale scfas kan være en vigtig komponent, mens evaluere effekten af specifikke mikrobiota modulatorer6. Selvfølgelig, foruden SCFAs, tarm mikrobiome også producerer mange andre vigtige metabolitter (f. eks, ammonium, vitaminer, histamin). Derfor kan supernatanten-prøverne, der indsamles under sådanne in vitro-fermenterings forsøg, også evalueres for globale metabolomics-analyser for at opdage nye Gut-mikrobiom-afledte metabolitter, som kan påvirkes af specifikke mikrobiome modulatorer.

Det beskrevne system har mange fordele, såsom lethed, enkelhed, omkostningseffektivitet, og den generelle adoptabilitet af den eksperimentelle set-up. Men, der er få begrænsninger samt. For eksempel, systemet ikke vedrører samspillet mellem prebiotics (eller andre interventioner, der anvendes) i det øvre fordøjelsessystem (f. eks spyt, mave, tyndtarmen), før de udsættes for mikrobiota af tyktarmen. Sådanne foranstaltninger kan dog vedtages og indarbejdes i henhold til specifikke forsøgs krav. Det kan også være nødvendigt at udføre en sur og/eller enzymatisk hydrolyseproces før gæring, hvis der anvendes specifikke substrater, herunder hele fødevarer eller fordøjelig mad, fordi kun den ufordøjelige del af sådanne fødevarer når til tyktarmen, der skal fermenteres af den nedre Gut microbiota. Desuden kan sammensætningen af Gut mikrobiota skifte på grund af specifikke dyrkningsbetingelser under gæring. For eksempel blev det observeret, at op til 9 h inkubation, mikrobiota ændringer er meget tættere på normal end ved 24 h. Men efter 24 h inkubation, selv om ph og scfas niveauer steget betydeligt, Gut mikrobiota sammensætning viste, at proteobakterier tæller steg mens den mikrobielle mangfoldighed reduceret. Men, det er stadig ukendt, hvor præcist og tæt den øgede ophobning af mikrobielle metabolitter ledsaget med sænket fækal pH er forbundet med specifikke mikrobiota signaturer.

Kort sagt er en simpel protokol til simulering af det ex vivo mikrobiota økosystem beskrevet heri. Systemet gør det muligt for forskere at afprøve forskellige interventioner for graduering af mikrobiota mangfoldighed, sammensætning og metaboliske funktion, der kan påvirke forskellige funktioner i værten tarm og generelle sundhed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender taknemmeligt støtte fra Center for diabetes, fedme og metabolisme og det kliniske og translationelle videnskabscenter, Wake Forest School of Medicine, Department of Defense finansiering (tilskudsnummer: W81XWH-18-1-0118), Kermit Glenn Phillips II stol i hjerte-kar-medicin; National Institutes of Health finansierede Claude D. Pepper ældre amerikanere Center (finansieret af P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 og det kliniske og translationelle videnskabs Center (klinisk forskningsenhed, finansieret af UL1TR001420), er også heldigvis anerkendt. Vi takker også de frivillige for at levere fækale prøver, og vores andre Lab medlemmer for deres tekniske hjælper under dette eksperiment.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) Sigma-Aldrich 217255
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 TGI C2388 Toxic
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) Sigma-Aldrich C3306 Irritating
Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) Sigma-Aldrich 255599
Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) Acros organics 2063450000 Toxic, Irritating
Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C121800
D-biotin Sigma-Aldrich B4501
D-Pantothenic acid Alfa Aesar A16609
Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) Biorad 1610729
DL-α-methylbutyrate Sigma-Aldrich W271918
Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) Sigma-Aldrich F8263 Toxic
Folic acid Alfa Aesar J62937
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Hemin Sigma-Aldrich H9039
Hepes Alfa Aesar A14777
Isobutyrate Alfa Aesar L04038
Isovalerate Alfa Aesar A18642
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) Sigma-Aldrich M8266
Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) Sigma-Aldrich 221279
Niacin (Nicotinic acid) Sigma-Aldrich N4126
Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) Alfa Aesar A14366 Toxic
N-valerate Sigma-Aldrich 240370
P-aminobenzoic acid MP China 102569 Toxic, Irritating
Phosphoric Acid (H3PO4) Sigma-Aldrich P5811
Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5504
Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) Sigma-Aldrich 1551128
Pyridoxine Alfa Aesar A12041
Resazurin Sigma-Aldrich R7017
Riboflavin Alfa Aesar A11764
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich 1613757
Sodium chloride (NaCl) Fisher BioReagents 7647-14-5
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Chemicals S320
Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) Acros organics 206375000
Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) Acros organics 148991000
Trypticase BD Biosciences 211921
Vitamin B12 Sigma-Aldrich V2876
Yeast extract Sigma-Aldrich 70161
Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) Sigma-Aldrich Z0251
0.22 µm membrane filter
AMPure magnetic purification beads Agencourt
Anaerobic chamber with incubatore Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA
Bottle filter Corning
Cheesecloth
Illumina MiSeq sequencer Miseq reagent kit v3
pH meter
Qiagen PowerFecal kit Qiagen
Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software
Qubit-3 fluorimeter InVitrogen
Vortex Thermoscientific
Waters-2695 Alliance HPLC system Waters Corporation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31, (1), 69-75 (2015).
  2. Xu, Z., Knight, R. Dietary effects on human gut microbiome diversity. British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).
  3. Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The gut microbiota and Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimers Disease. 58, (1), 1-15 (2017).
  4. Clemente, J. C., Ursell, L. K., Parfrey, L. W., Knight, R. The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view. The Journal Cell. 148, (6), 1258-1270 (2012).
  5. Yadav, H., Jain, S., Marotta, F. Probiotics mediated modulation of gut flora might be biotherapeutical approach obesity and type 2 diabetes. Metabolomics : Open Access. 1, (3), 1-3 (2011).
  6. Ahmadi, S., et al. Dietary Polysaccharides in the Amelioration of Gut Microbiome Dysbiosis and Metabolic Diseases. Obesity and Control Theries: Open Access. 4, (3), (2017).
  7. Nagpal, R., et al. Obesity-Linked Gut Microbiome Dysbiosis Associated with Derangements in Gut Permeability and Intestinal Cellular Homeostasis Independent of Diet. Journal of Diabetes Research. 1-9 (2018).
  8. Paul, B., et al. Influences of diet and the gut microbiome on epigenetic modulation in cancer and other diseases. Journal of Clinical Epigenetics. 7, (1), 112 (2015).
  9. O’mahony, S., Clarke, G., Borre, Y., Dinan, T., Cryan, J. Serotonin tryptophan metabolism and the brain-gut-microbiome axis. Journal of Behavioural Brain Research. 277, 32-48 (2015).
  10. Sharon, G., et al. Specialized metabolites from the microbiome in health and disease. Journal of Cell Metabolism. 20, (5), 719-730 (2014).
  11. Faber, T. A., Bauer, L. L., Price, N. P., Hopkins, A. C., Fahey, G. C. In vitro digestion and fermentation characteristics of temulose molasses, a coproduct of fiberboard production, and select temulose fractions using canine fecal inoculum. Journal of Agricultural Food Chemistry. 59, (5), 1847-1853 (2011).
  12. Bourquin, L. D., Titgemeyer, E. C., Fahey, G. C. Vegetable fiber fermentation by human fecal bacteria: cell wall polysaccharide disappearance and short-chain fatty acid production during in vitro fermentation and water-holding capacity of unfermented residues. Journal of Nutrition. 123, (5), 860-869 (1993).
  13. Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short-chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8, (1), 12649 (2018).
  14. Nagpal, R., et al. Comparative microbiome signatures and short-chain fatty acids in mouse, rat, non-human primate and human feces. Frontiers in Microbiology. 9, 2897 (2018).
  15. Thangamani, S., Guinan, J., Wang, S., Yadav, H. Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids promote gastrointestinal colonization of Candida albicans. bioRxiv. 428474 (2018).
  16. Ahmadi, S., et al. Prebiotics from acorn and sago prevent high-fat diet-induced insulin resistance via microbiome-gut-brain axis modulation. The Journal of Nutritional Biochemistry. (2019).
  17. Nagpal, R., et al. Gut Microbiome Composition in Non-human Primates Consuming a Western or Mediterranean Diet. Frontiers in Nutrition. 5, 28 (2018).
  18. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6, (8), 1621-1624 (2012).
  19. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, (5), 335-336 (2010).
  20. Garcia-Villalba, R., et al. Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples. Journal of Seperation Science. 35, (15), 1906-1913 (2012).
  21. Lee, C. H., et al. Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315, (2), 142-149 (2016).
  22. Chen, M. -H., et al. In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus× giganteus by human fecal microbiota. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, (1), 262-267 (2015).
  23. Cook, S., Sellin, J. Short chain fatty acids in health and disease. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 12, (6), 499-507 (1998).
  24. Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders. Obesity. 26, (5), 792-800 (2018).
  25. Zou, J., et al. Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health. Cell Host & Microbe. 23, (1), e44 41-53 (2018).
  26. Dinan, T. G., Cryan, J. F. Gut–brain axis in 2016: Brain–gut–microbiota axis—mood, metabolism and behaviour. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14, (2), 69 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics