Adaptando os ensaios de citotoxicidade in vivo para estudar Imunodominância em respostas de células T CD8+ específicas do tumor

Immunology and Infection

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Summary

Nós descrevemos aqui um ensaio in vivo cytometry-baseado do fluxo da matança que permita a examinação do immunodominance em respostas citotóxicas do linfócito de T (CTL) a um antígeno modelo do tumor. Nós fornecemos exemplos de como este ensaio elegante pode ser empregado para estudos mecanistic e para o teste da eficácia da droga.

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Choi, J., Meilleur, C. E., Haeryfar, S. M. M. Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses. J. Vis. Exp. (147), e59531, doi:10.3791/59531 (2019).

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Abstract

Carboxyfluoresceína éster succinimidílico (CFSE)-com base in vivo ensaios de citotoxicidade permitem a quantificação sensível e precisa de CD8+ citolítico T linfócitos (CTL) respostas eliciadas contra tumor e peptídeos derivados de patógenos. Oferecem diversas vantagens sobre ensaios tradicionais da matança. Primeiramente, permitem a monitoração do citotoxicidade CTL-negociado dentro dos órgãos lymphoid secundários arquitetonicamente intactos, tipicamente no spleen. Segundo, eles permitem estudos mecanísticos durante as fases de priming, efetor e recall de respostas CTL. Em terceiro lugar, eles fornecem plataformas úteis para testes de eficácia de vacina/drogas em um ambiente verdadeiramente in vivo. Aqui, nós fornecemos um protocolo aperfeiçoado para a examinação de respostas concomitantes do CTL de encontro a mais de um epítopo do peptide de um antígeno modelo do tumor (AG), a saber, o vírus do Simian 40 (SV40)-codificado grande T AG (T AG). Como a maioria das outras proteínas tumorais clinicamente relevantes, o T AG abriga muitos peptídeos potencialmente imunogênicos. Entretanto, somente quatro tais peptídeos induzem respostas detectáveis de CTL em camundongos C57BL/6. Estas respostas são organizadas consistentemente em uma ordem hierárquica baseada em sua magnitude, que forma a base para o "immunodominance TCD8 " neste sistema poderoso. Conformemente, a maioria da resposta t AG-específicaCD8 de t é focalizada de encontro a um único epítopo mapeado immunodominante quando os outros três epítopos forem reconhecidos e respondidos a somente fraca. A imunodominância compromete a amplitude das respostas antitumorais TCD8 e é, como tal, considerada por muitos como um impedimento para a vacinação bem-sucedida contra o cancro. Portanto, é importante compreender os fatores e mecanismos celulares e moleculares que ditam ou formam a imunodominância TCD8 . O protocolo que nós descrevemos aqui é costurado à investigação deste fenômeno no modelo da imunização de T AG, mas pode prontamente ser modificado e estendido aos estudos similares em outros modelos do tumor. Fornecemos exemplos de como o impacto das intervenções imunoterapêuticas experimentais pode ser medido usando ensaios de citotoxicidade in vivo.

Introduction

Células t CD8+ convencionais (tCD8) desempenham partes importantes na vigilância imune anticâncer. Eles funcionam principalmente na capacidade de linfócitos T citolíticos (CTLs) que reconhecem antígenos de peptídeos específicos do tumor ou associados (AGS) exibidos dentro da fenda fechada das moléculas de classe I do complexo de histocompatibilidade principal (MHC). CTLs totalmente armados utilizam seu arsenal citotóxico para destruir células malignas. O anticâncer TCD8 pode ser detectado na circulação ou mesmo dentro de massas primárias e metastáticas de muitos pacientes com câncer e animais portadores de tumor. No entanto, muitas vezes são anérgicos ou esgotados e não conseguem erradicar o cancro. Portanto, muitas modalidades imunoterapêuticas são projetadas para aumentar as frequências TCD8 anticâncer e para restaurar e impulsionar suas funções.

As proteínas tumorais abrigam muitos peptídeos, alguns dos quais podem ser imunogênicos e potencialmente imunoprotetores. Entretanto, as respostas TCD8 quantificáveis são eliciadas com magnitudes variáveis contra poucos peptídeos. Isso cria uma "hierarquia de imunodominância" entre os clones TCD8 1. Consequentemente, o imunodominante (ID) TCD8 ocupa fileiras hierárquicas proeminentes, que é julgada geralmente por sua abundância. Em contraste, células TCD8 cujo receptor de célula t (TCR) é específico para epítopos SUBDOMINANTES (DP) ocorrem em freqüências mais baixas. Nós e outros identificamos alguns dos fatores que ditam ou formam a imunodominância em respostas TCD8 . Estes incluem, entre outros, a modalidade da apresentação do AG ao TCD8 ingênuo (isto é, apresentação direta, Cruz-apresentação, cross-dressing)2,3,4, o tipo de pilhas AG-apresentando (APCs) participando da ativação TCD8 5, a abundância e estabilidade de proteínas AGS 6,7 e a eficiência e cinética de sua degradação por proteasomas7,8, o seletividade relativa do transportador associada ao processamento de AG (TAP) parapeptídeos9, a afinidade de peptídeos liberados para moléculas de MHC I9,10, a presença, as frequências precursoras e a diversidade de TCR de cognato tCD8 em pools de células t11,12,13, Cross-Competition entre as células t para acesso a APCs14,15, e a capacidade fratricida de TCD8 dos clones16. Além disso, a imunodominância TCD8 é submetida a mecanismos imunoregulatórios mediados por vários tipos de células supressoras, tais como células t regulatórias de ocorrência natural (ntreg)17, a molécula de superfície celular co-inibitória programada óbito-1 (PD-1)16, e certas enzimas intracelulares como a indolamina 2,3-dioxigenase (ido)18 e o alvo de mamíferos de rapamicina (mTOR)19. É importante notar, no entanto, que os fatores acima nem sempre respondem totalmente à imunodominância.

Aparte da biologia básica do immunodominance de TCD8 , a examinação deste fenômeno intrigante tem implicações importantes na imunologia e na imunoterapia do cancro. Primeiramente, um status da identificação não confere necessariamente em cima de um clone dado de TCD8 a habilidade de impedir a iniciação ou a progressão do tumor20. Se e como a identificação e o SD TCD8 contribuem à imunidade antitumoral podem depender do tipo e da extensão da malignidade e do sistema experimental empregado. Em segundo lugar, acredita-se que os clones de ID TCD8 podem ser "muito visíveis" para o sistema imunológico e, consequentemente,mais propensos a mecanismos de tolerância central e/ou periférica,16,21. Em terceiro lugar, os tumores heterogênicos podem conter as pilhas neoplásticas que evitam a deteção por muitos, se não a maioria, CTLs indicando somente um espectro estreito dos complexos do peptide: MHC. estas circunstâncias, as respostas de TCD8 da amplitude insuficiente são prováveis ter recursos para tais pilhas do tumor uma vantagem da sobrevivência, assim potenciando seu conseqüência22. É pelas razões acima que muitos a imunodominância da vista como um obstáculo ao sucesso TCD8-baseou a vacinação e as terapias de encontro ao cancro.

A inoculação de camundongos C57BL/6 com vírus Simian 40 (SV40)-células transformadas que expressam grande tumor AG (T AG) fornece um poderoso sistema pré-clínico para estudar imunodominância TCD8 . Este modelo oferece vários benefícios. Primeiramente, os epítopos peptídicos desta oncoproteína clinicamente relevante são bem caracterizados nesta cepa do camundongo23 (tabela 1). Segundo, os epítopos de T AG, que são chamados de sites I, II/III, IV e V, ativam as respostas TCD8 que são consistentemente organizadas na seguinte ordem hierárquica: site iv > > site i ≥ site II/iii > ≫ site V. consequentemente, o local IV específico tCD8 montar a resposta mais robusta para T AG. Em contrapartida, os sítios I e II/III são subdominantes, e o TCD8 específico do sítio V é menos abundante e geralmente apenas detectável na ausência de responsividade a outros epítopos23,24. Em terceiro lugar, a linha celular T AG+ tumoral utilizada no protocolo aqui descrito, ou seja, células fibrosarcoma C57SV, e aquelas utilizadas em nossas investigações prévias16, 17,18,19 ,25,26, são transformados com fragmentos de SV40 subgenômica25. Conseqüentemente, são incapazes de montar e liberar os virions SV40 que poderiam potencialmente infectar APCs do anfitrião. Além disso, as células C57SV são desprovidas de moléculas coestimulatórias clássicas como CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) e CD137 ligantes (4-1BBL)16. Os atributos acima tornam estas linhas ideais para o exame de in vivo TCD8 ativação via Cross-priming. O priming cruzado é um caminho importante na indução de respostas TCD8 , especialmente aquelas lançadas contra células tumorais de origem não hematopoiética que falham diretamente em Prime as células t ingênuas25.

As frequências e/ou funções antitumorais TCD8 podem ser monitoradas pela coloração de tetrâmero de MHC I, coloração intracelular para citocinas efetoras (por exemplo, interferão [IFN]-γ) ou moléculas líticas (por exemplo, perforina), ensaios imunoenzimáticos (ELISPOT) e ex ensaios de citotoxicidade vivo. Desde a sua criação nos anos 199027,28, carboxyfluoresceína éster succinimidil (CFSE)-com base em ensaios de matança in vivo permitiram a avaliação de respostas citotóxicas mediadas por CTLs antiviral29,30 , 31, CTLs antitumoral16,32, pilhas naturais do assassino (NK)33, pilhas naturais invariantes de glycolipid-reactivas do assassino T (iNKT)34, e preexistente e de novo doador-específico dos aloanticorpos26. Conseqüentemente, suas aplicações podem ser do interesse a um Readership largo, incluindo mas não limitado aos investigadores que trabalham nas áreas da imunologia do tumor e da imunoterapia, da imunidade do antipatógeno, e do projeto preventivo e terapêutico da vacina.

Para avaliar a citotoxicidade mediada por células em cenários típicos, duas populações de esplenócitos ingênuos que exibem um AG irrelevante ou um cognato AG (s) são rotulados com duas doses diferentes de CFSE, misturadas em números iguais e injetadas em ingênuo (controle) ou assassino ratos abrigando células. A presença/ausência de cada população-alvo é então examinada por citometria de fluxo.

Temos otimizado e empregado in vivo ensaios de matança em nossos estudos sobre imunodominância em ambas as respostas antiviral e antitumoral TCD8 12,16,17. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a avaliação simultânea de respostas do ID e do SD TCD8 aos Epitopes de t AG, que podem prontamente ser adotados para investigações similares em outros sistemas experimentais. Nós igualmente fornecemos os resultados representativos que demonstram que o esgotamento da pilha de nTreg e o bloqueio PD-1 podem seletivamente realçar a citotoxicidadeCD8-induzida da identificação tCD8-e do SD t, respectivamente. No final, discutiremos várias vantagens de ensaios de matança in vivo, bem como algumas de suas limitações inerentes.

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Protocol

Os experimentos aqui descritos seguem protocolos de uso animal aprovados por entidades institucionais e aderentes às diretrizes nacionais estabelecidas.

1. inoculação de C57BL/6 camundongos com T AG-expressando células tumorais

  1. Cresça a linha celular SV40 do fibrosarcoma C57SV (ou uma linha celular similar de T AG+ aderente) no meio modificado da águia de Dulbecco (DMEM) com 4,5 g/l D-glucose e l-Glutamine (1x) e suplementado com 1 milímetro piruvato de sódio e 10% calor-inactivated soro bovino fetal (FBS) em frascos tratados com cultura tecidual a 37 ° c em atmosfera umidificada contendo 10% de CO2.
  2. Uma vez que as pilhas se tornam inteiramente confluentes ou ligeiramente overconfluent, remova delicadamente e rejeite o meio e enxague o monocamada com o soro fisiológico fosfato-tamponado pré-aquecido (PBS).
    Nota: a expressão máxima de T AG é alcançada quando as células T AG+ atingem 100% de confluência.
  3. Dentro de um armário biológico da segurança, adicione o Trypsin-EDTA pre-aquecido (0,25%) para cobrir a monocamada à temperatura ambiente até que as células sejam desalojadas em manchas. Toque os lados do balão (s) de cultura várias vezes para liberar as células aderentes restantes.
    Nota: se necessário e para agilizar o processo de tripsinização, transfira o (s) balão (es) para uma incubadora de 37 ° c. As células desalojadas adoptarão rapidamente uma forma arredondada um microscópio de luz. Esta etapa deve durar aproximadamente 5 min.
  4. Adicionar 5 mL de meio DMEM e dissociar os aglomerados para preparar uma suspensão de célula única, introduzindo a pipetagem do conteúdo de cada balão para cima e para baixo.
  5. Transfira a suspensão celular através de um filtro de células com poros de 70 μm em um tubo.
  6. Girar para baixo o tubo em 400 x g por 5 min a 4 ° c.
  7. Descarte o sobrenadante. Resuspend pilhas peletizadas em 10 mL de PBS frio estéril.
  8. Repita as etapas 1,6 e 1,7 duas vezes.
  9. Contagem de células usando um Hemocytometer. Prepare uma suspensão uniforme contendo 4 x 107 células/ml de PBS estéril.
  10. Injetar 500 μL da suspensão acima intraperitonealmente (i.p.) em cada adulto (6-12-semana-velho) do sexo masculino ou feminino C57BL/6 mouse.

2. regimes de tratamento

  1. Regime de tratamento para examinar a contribuição das células nTreg para a imunodominância TCD8
    1. Quatro dias antes do condicionamento in vivo de C57BL/6 camundongos com células C57SV (passo 1,10), injetar cada animal uma vez i.p. com 0,5 mg de um anticorpo monoclonal de baixa endotoxina, azida-livre CD25 (mAb) (clone PC-61.5.3), que esgota as células nTreg, ou com um isotipo IgG1 de rato controle (por exemplo, clone KLH/G1-2-2, clone HRPN, ou clone TNP6A7).
  2. Regime de tratamento para testar o significado in vivo de PD-1-PD-L1 (2) interações em moldar TCD8 immunodominance
    Nota: o acoplamento de PD-1 por PD-L1 frequentemente, mas não sempre, Media a coinibição e/ou a exaustão de TCD8AG-específico. Portanto, o tratamento com anti-PD-1 pode ser realizado em paralelo com a administração de mAbs anti-PD-L1 e anti-PD-L2 para revelar a interação intercelular exata envolvida em um fenômeno biológico.

3. preparação de esplenócitos alvo

  1. Euthanize o sexo-combinou C57BL/6 ratos (6-12 semanas da idade) que servirão como doadores do splenocyte pela deslocação cervical.
  2. Posicione cada rato com o seu abdômen virado para cima dentro de um armário de segurança biológico. Pulverize a pele com 70% (v/v) EtOH. Usando fórceps e tesouras estéreis, levante a pele e faça uma pequena incisão na linha média ventral. Em seguida, corte a pele em uma forma de cruz-like para expor o peritônio.
  3. Usando fórceps, puxe o peritônio de uma forma tenda-like sem arrebatar qualquer um dos órgãos internos. Corte o peritônio aberto para expor a cavidade peritoneal e retire suavemente o baço.
  4. Coloque o baço (s) dentro de um moedor de tecido dounce de 15 mL contendo 5 mL de PBS estéril. Aplique a pressão manual usando o êmbolo de vidro do moedor até que o tecido esplênico se dissipa em uma suspensão de células homogênea vermelha.
    Nota: dependendo do número de animais receptores por grupo experimental, vários baços de rato doadores podem ser necessários para a preparação da célula alvo. Até 3 baços podem ser homogeneizados juntos dentro de um moedor de 15 mL.
  5. Transfira o homogeneado para um tubo de 15 mL. Girar para baixo o tubo em 400 x g por 5 min a 4 ° c.
  6. Descarte o sobrenadante. Ressuspender as células peletizadas em 4 mL de tampão de lisagem de cloreto de amônio-potássio (ACK) por 4 min para eliminar os eritrócitos.
    Nota: esta é uma etapa sensível ao tempo. A superexposição de esplenócitos ao tampão de lisagem ACK aumentará sua fragilidade e as tornará suscetíveis à morte celular não específica.
  7. Para cada tubo, adicionar 8 mL de RPMI 1640 médio contendo 10% FBS calor-inactivated, L-alanyl-L-glutamina, 0,1 mM mínimo Essential Media (MEM) aminoácidos não essenciais, 1 mM piruvato de sódio, 10 mM HEPES, e 1x penicilina/estreptomicina, que será doravante refere-se ao meio RPMI completo (tabela de materiais).
  8. Transfira o conteúdo através de 70 μm de poros de um filtro de células para um novo tubo de 15 mL.
  9. Girar para baixo o tubo em 400 x g por 5 min a 4 ° c.
  10. Descarte o sobrenadante. Resuspend pilhas peletizadas em 12 mL de RPMI completo.
  11. Divida a suspensão do splenocyte em 3 porções iguais (4 mL cada) em 3 tubos separados.

4. revestimento splenocytes alvo com irrelevantes e Cognate peptídeos

  1. Rotule os tubos de acordo com os peptídeos que serão usados para pulsar os esplenócitos alvo. Os esplenócitos do controle serão pulsados com um peptide irrelevante, e cada população de esplenócitos cientes do alvo será pulsada com um peptide sintético que corresponde ao epítopo mapeado immunodominante t AG-derivado (local IV) ou a um epítopo mapeado subdominante de t AG (local mim ou local II/III) (tabela 1).
    Nota: a escolha de peptídeos irrelevantes depende da configuração experimental e da estirpe do rato utilizada em cada investigação. Os autores usam frequentemente GB498-505 (um epítopo mapeado immunodominante do peptide de h-2Kb-restrito do vírus de palavra simples de herpes [HSV]-1) e/ou GP33-41 (um epítopo immunodominante do peptide de h-2Db-restrito de Lymphocytic vírus coriomeningitis ([LCMV]) em camundongos C57BL/6 (tabela 1). Estes peptídeos são escolhas ideais porque: (i) eles são derivados de patógenos não encontrados anteriormente no modelo de mouse descrito aqui; (II) semelhantes aos peptídeos derivados de T AG, gB498-505 e GP33-41 são restritos e se ligam a moléculas H-2b . Em ensaios de matança "Three-Peak" in vivo, cada um dos dois picos que correspondem às células-alvo cognato pode representar os esplenócitos pulsados com um peptide immunodominante ou subdominante. A escolha de cada conjunto de peptídeos varia de acordo com os objetivos de cada experimento. Veja a Figura 1 e a Figura 2 como exemplos dessa variação. Para o restante deste protocolo, os sítios I e IV derivados de T AG representarão peptídeos subdominantes e imunodominantes, respectivamente.
  2. Pulse o conteúdo de cada tubo rotulado com 1 μM do respectivo peptídeo durante 1 h a 37 ° c e 5% CO2.
  3. Use um filtro de célula separado (com poros de 70 μm) para cada tubo para remover aglomerantes e detritos, se necessário.
  4. Girar para baixo o tubo em 400 x g por 5 min a 4 ° c. Descarte o sobrenadante.
  5. Resuspend células peletizadas em 12 mL de PBS frio estéril e repita o passo 4,4 mais uma vez.
    Nota: é importante remover o máximo de FBS possível porque FBS pode ligar CFSE na próxima etapa.

5. etiquetando os esplenócitos do alvo com CFSE

  1. Resuspend o esplenócitos peptídeo-pulsado em 4 ml do PBS estéril.
  2. Adicionar CFSE em 0, 25 μM, 0,25 μM, e 2 μM nos tubos contendo peptídeos irrelevantes-, local I-e local IV-esplenócitos pulsado, respectivamente.
    Nota: para conseguir uma rotulagem CFSE uniforme, segure cada tubo em um ângulo de 45 ° antes de adicionar o CFSE ao lado ligeiramente acima da suspensão da célula seguida imediatamente por vortexing suave. Isso garantirá o aparecimento de histogramas suaves no final. As variações batch-to-batch e dependentes da idade nas intensidades do CFSE não são incomuns. Conseqüentemente, um pode precisar de experimentar com doses diferenciais de CFSE antes de decidir em concentrações óptimas a ser usadas.
    PRECAUÇÃO: o CFSE é tóxico em concentrações superiores a 5 μM.
  3. Coloque os tubos dentro de uma incubadora de 37 ° c por 15 min e inverta-os uma vez a cada 5 min.
  4. Adicione 3 mL de FBS calor-inactivated a cada tubo para parar a reação de CFSE. Cubra o conteúdo com PBS estéril.
  5. Girar para baixo o tubo em 400 x g por 5 min a 4 ° c. Descarte o sobrenadante.
  6. Resuspend células peletizadas em 12 mL de PBS estéril e repita o passo 5,5.

6. exame da rotulagem de CFSE adequada/igual de populações de Esplócito alvo

  1. Resuspend pilhas peletizadas em 3 mL de PBS.
  2. Vórtice os tubos suavemente. Transferir 10 μL, cada um, de CFSEbaixo, CFSEintermediário (int), e suspensõeselevadas da pilha de CFSE em um tubo da separação da pilha da fluorescência-Activated do poliestireno da redondo-parte inferior de 5 ml que contem 200 μL de PBS.
  3. Interrogue células usando um citometro de fluxo equipado com um laser de 488 nm. Desenhe uma porta de linfócitos com base nas propriedades de dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC) das células antes de adquirir 5000 eventos caindo dentro do portão de linfócitos no canal FL-1.
  4. Dentro da população ' Parent ' CFSE+ , desenhe portas adicionais do histograma para identificar subpopulações de CFSELow, CFSEinte CFSEHigh .
  5. Confirme números de eventos iguais ou quase iguais dentro dos três portões. Se necessário, ajuste os números das células nos tubos ' fonte ' (passo 6,1) antes de misturar e injetar esplenócitos alvo em camundongos ingênuos e aprontado na seção 7.

7. injeção de células-alvo com rótulo CFSE em recipientes ingênuos e T-AG-primed

  1. Agite suavemente os tubos de origem. Transfira as três suspensões de células marcadas com CFSE em proporções iguais em um novo tubo.
  2. Cubra o conteúdo com PBS estéril.
  3. Girar para baixo o tubo em 400 x g por 5 min a 4 ° c. Resuspend células peletizadas com PBS estéril.
  4. Contagem de células em Tripan azul por um hemocitômetro para garantir a viabilidade celular de pelo menos 95%.
  5. Ajuste o volume para injetar 1 x 107 células alvo misturadas/200 μl PBS intravenosamente (i.v.), através da veia da cauda, em cada rato C57Bl/6 receptor.
    Nota: Guarde as células no gelo entre as injeções. Misture suavemente as células-alvo antes de cada injeção. Registre a hora exata da injeção para cada rato, que determinará quando o animal precisará de ser eutanasiado. É importante manter a duração da citotoxicidade in vivo consistente entre todos os animais no mesmo experimento.

8. aquisição de dados

  1. Duas ou quatro horas após a injeção de células alvo CFSE-rotuladas, eutanizar os camundongos receptores por luxação cervical.
    Nota: a duração da citotoxicidade in vivo pode variar dependendo do sistema experimental empregado, a imunogenicidade do alvo AGS, a abundância antecipada de TCD8 antígeno-específico do peptídeo no baço, e a robustez de sua função lítica entre outros fatores.
  2. Remova e processe cada baço separadamente como nos passos 3.2 − 3.9.
  3. Descartar o sobrenadante e suspender as células peletizadas em 3 mL de PBS.
    Nota: Tome o cuidado extra para segurar o tecido splenic e as preparações da pilha em 4 ° c ou no gelo antes das análises se. Isto é para prevenir a continuação da citotoxicidade ex vivo.
  4. Transfira aproximadamente 1 x 107 pilhas de cada Spleen processado em um tubo limpo de FACS.
  5. Interrogue as células imediatamente usando um citometro de fluxo equipado com um laser de 488 nm. Desenhe um portão de linfócitos com base nas propriedades do FSC e SSC das células.
  6. Identifique os esplenócitos do CFSE- receptor e o CFSE+ pilhas de alvo transferidas. Desenhe portões adicionais que acomodam distintas CFSEbaixo, CFSEint, e CFSEalta populações de células-alvo.
  7. Adquira um total de 2000 CFSE eventosbaixos no canal FL-1.

9. análise de dados

  1. Calcule a Lise específica de cada população de células alvo cognato usando a seguinte fórmula:
    % Citotoxicidade específica =Equation
    onde x = CFSEint/alto número de evento em t AG-primed mouse, y = CFSE número de eventobaixo em t AG-primed mouse, a = CFSEint/ número de evento alto em mouse ingênuo, e b = CFSEbaixo evento número no rato ingênuo.
    Nota: em ensaios de citotoxicidade "Three-Peak" em que a Lise específica de mais de uma população-alvo cognato é avaliada, não é apropriado usar freqüências da pilha do alvo. Isso é simplesmente porque a frequência de uma população de células-alvo cognato é influenciada não só pela percentagem dos controles irrelevantes, mas também pelo dos outros splenocytes alvo cognato. Portanto, os números de evento dentro de cada portão devem ser usados na fórmula acima para calcular com precisão a lise de cada população de células-alvo cognato (ou CFSEint ou CFSE célulasaltas ) contra controles CFSEbaixa .

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Representative Results

O objetivo do experimento cujos resultados estão representados na Figura 1 foi determinar se a presença e as funções das células nTreg formam ou alteram a hierarquia de imunodominância de tCD8específico t AG. C57BL/6 camundongos foram injetados i.p. com PBS ou com 0,5 mgs de um CD25 mAb (clone PC-61.5.3 [PC61]) quatro dias antes de receberem 2 x 107 C57SV células tumorais i.p. Em experimentos separados, um controle de isotipo de rato IgG1 foi usado em vez de PBS. A depleção de células de nTreg bem-sucedida por PC61 foi confirmada por citometria de fluxo17.

Nove dias após a inoculação da pilha C57SV, um ponto de tempo em que T AG-específico TCD8 respostas alcangam seu máximo23, cada animal recebeu uma injeção i.v. de uma suspensão da pilha que contem 3 populações distintas de pilhas alvo CFSE-etiquetadas. As células-alvo de controle foram esplenócitos singeneicos, concomitantemente pulsado com dois peptídeos irrelevantes (GP33-41 e GB498-505) e rotulados com uma dose baixa de CFSE (0, 2 μm). Para preparar as células-alvo cognadas, os esplenócitos ingênuos sinogênicos foram pulsados com peptídeo do sítio derivado de T AG I ou peptídeo IV do local (tabela 1) e posteriormente rotulados com cfse em 0,2 μm e 2 μm, respectivamente. As células-alvo controle e cognato foram lavadas e misturadas em números iguais (em uma proporção de 1:1:1) antes de serem injetados em camundongos ingênuos (controle) e T AG-primed C57BL/6. Duas horas após a injeção da pilha do alvo, os ratos foram sacrificados para seu spleen em que a presença/ausência de pilhas alvo CFSE-etiquetadas foi determinada pela citometria do fluxo. As células-alvo foram distinguidas com base em suas intensidades de coloração CFSE diferenciais.

Como esperado, picos quase iguais correspondentes às células alvo de controle e cognato foram detectáveis em camundongos ingênuos (Figura 1, painel esquerdo). Em contrapartida, as células-alvo de exibição do local IV foram quase completamente ausentes em camundongos T AG-primed, independentemente de seu tratamento prévio com PC61 ou PBS (Figura 1). Curiosamente, a depleção de células nTreg por PC61 aumentada in vivo de Lise mediada por CTL do local I-células alvo pulsada17. Estes resultados alertaram-nos concluir que as pilhas de nTreg inibem seletivamente o local I-Cytotoxicity específico. Conseqüentemente, os agentes desactivação/inativando da pilha de ntreg podem realçar a função efetor citolítica de CTLs que reconhecem determinados Epitopes tumor-derivados.

A configuração acima fornece um exemplo de como os ensaios de citotoxicidade in vivo podem ser utilizados para testar simultaneamente a função lítica de clones de ID e SD CTL no mesmo animal.

Figure 1
Figura 1: análise citofluoriométrica representativa da citotoxicidade mediada por TCD8contra epítopos derivados de t AG na presença ou ausência de células nTreg. Os esplenócitos do alvo pulsada com os peptídeos do controle, o local I ou o local IV, que foram etiquetados diferencialmente com CFSE, foram seguidos pela citometria do fluxo no spleen de um rato ingênuo (painel esquerdo), de um rato AG-primed PBS-injetado de T (painel médio), e de um PC61 (NTI-CD25)- injetado (nTreg-esgotado) T AG-primed mouse (painel direito). A porcentagem de mortes específicas de células-alvo foi calculada usando a fórmula descrita no protocolo, e os números representativos são mostrados. Este número é adotado, com permissão, de Haeryfar et al.17. Copyright 2005. A associação americana de imunologistas, Inc. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em uma investigação mais recente, perguntamos se o bloqueio PD-1 afeta a ' amplitude ' da resposta TCD8 à t AG16 (Figura 2). Esta era uma pergunta clìnica relevante à luz dos benefícios terapêuticos observados de PD-1-baseou ' inibidores do Checkpoint ' em diversas malignidades. Embora tais inibidores sejam pensados para trabalhar primeiramente invertendo a exaustão da pilha de T, nós éramos curiosos saber se interferir com as interações PD-1-PD-L1 pode adicionalmente ampliar (ou estreito) respostas de TCD8 anticâncer. Em nosso modelo do reconhecimento de t AG, as experiências intracelular da mancha do citocinas (CI) revelaram que o tratamento com o anti-PD-1 ou o anti-PD-L-1 expande seletivamente o IFN-γ-produzindo TCD8 que reconhece os locais I e II/III16. Em seguida, ampliamos nosso estudo para examinar a função efetora citolítica in vivo desses camundongos CTLs. C57BL/6 foram injetados i.p. com 100 μg de um mAb anti-PD-1 (clone RMP1-14) ou um controle de isotipo de em camundongo IgG2a de rato (clone 2A3) duas horas antes da inoculação da célula C57SV. Camundongos receberam duas doses adicionais de anti-PD-1 ou isotipo três e seis dias após a injeção de células tumorais. No dia 9 pós-escorvamento, foram administradas coortes de camundongos ingênuos e primados, via veias laterais da cauda, uma mistura celular contendo números iguais de CFSEbaixa (dose de rotulagem cfse: 0, 25 μm), CFSEint (dose de rotulagem CFSE: 0,25 μm) e CFSEHi (CFSE dose de rotulagem: 2 μm) os esplenócitos ingênuos syngeneic pulsada com GB498-505, local II/III, e local I, respectivamente. Quatro horas mais tarde, os animais foram eutanasiados, e as pilhas alvo CFSE-etiquetadas foram controladas cytofluorimetrically em seu spleen. São ilustradas as parcelas representativas do FACS (Figura 2a) e os dados de 3 animais por coorte (Figura 2b). Quando o bloqueio PD-1 não afetou a resposta do ID TCD8 de encontro ao local IV16, os locais I-e II/III-respostas específicas do SD foram revigorados. Nós concluímos assim que interferir com as interações PD-1-PD-L1 pode induzir o epítopo que espalha no anticâncer respostasCD8 de T.

A configuração acima representa ensaios in vivo da matança que permitem a quantificação da citotoxicidade eliciada por dois clones do SD CTL no mesmo animal.

Figure 2
Figura 2: a citotoxicidade in vivo de tCD8 t AG-específico em camundongos anti-PD-1-tratados. (A) parcelas representativas do histograma demonstram picos de CFSE correspondentes aos esplenócitos-alvo pulsados com um peptídeo irrelevante (CFSELow), site II/III (CFSEint) e site I (CFSEHigh) em camundongos T AG-primed que receberam um isotipo (painel esquerdo) ou um mAb de bloqueio PD-1 (painel direito). (B) a porcentagem de mortes específicas de cada população de células-alvo cognatos foi calculada usando os números de evento CFSE+ em camundongos T AG-primed (n = 3 por grupo) e os receptores ingênuos (não mostrados) e a fórmula descrita no protocolo. As barras de erro representam erros padrão da média (SEM) e * * denota uma diferença estatística com p < 0, 1 por teste tde Student não pareado. Este número é adotado, com permissão, de Memarnejadian et al.16. Copyright 2017. A associação americana de imunologistas, Inc. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fonte do antígeno da proteína Peptídeo epitope Designação Seqüência Restrição MHC I
SV401 grande T AG2 T AG206-215 Site I SAINNYAQKL H-2Db
SV40 grande T AG T AG223-231 Site II/III CKGVNKEYL H-2Db
SV40 grande T AG T AG404-411 Site IV VVYDFLKC H-2Kb
SV40 grande T AG T AG489-497 Site V QGINNLDNL H-2Db
HSV-13 glicoproteína B gB498-505* gB498-505 SSIEFARL H-2Kb
Glicoproteína LCMV4 GP33-41* GP33-41 O KAVYNFATC H-2Db
1 da Vírus Simian 40
2 o seu Grande antígeno do tumor
3 º de Herpes simplex virus tipo 1
4 º de Vírus da Coriomeningitis linfocítica
* usado como um peptídeo irrelevante

Tabela 1. Peptídeos introduzidos neste protocolo

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Discussion

Os ensaios de citotoxicidade in vivo baseados em CFSE oferecem várias vantagens em relação aos ensaios de matança tradicionais, como o cromo radioativo (51CR) e os ensaios de liberação de lactato desidrogenase colorimétrica (LDH). Primeiramente, permitem a monitoração da função de CTL dentro de um órgão lymphoid secundário arquitetonicamente intacto.

Em segundo lugar, o assassinato específico de células-alvo em ensaios de citotoxicidade in vivo reflete o número absoluto de TCD8específico de AG, que geralmente é, mas nem sempre, uma função das frequências tCD8 presentes no baço. Isto é em contraste com 51CR/LDH ensaios de liberação em que um número constante de células são empregadas como uma fonte de efetoras TCD8. Consequentemente, 51ensaios de liberação de CR/LDH não conseguem estimar de forma confiável o número total de TCD8 específico de AG que pode estar disponível para o hospedeiro para eliminar as células tumorais ou para combater infecções. Isto é importante desde que em muitos casos e em circunstâncias, o tamanho e o celularidade de órgãos/tecidos lymphoid secundários que acomodam TCD8 AG-específico são alterados. Por exemplo, um cenário hipotético pode ser previsto em que uma infecção viral eleva o número total de TCD8 específico para peptídeo X enquanto também expandindo vários outros clones tCD8 abrigando outras especificidades. Em conseqüência, a freqüência do TCd8 X-específico entre o tCD8 splenic total pode não aumentar, neste caso um ensaio da liberação do Cr/LDH 51não será útil. Como um outro exemplo, Nós demonstramos recentemente que determinados superantígenos bacterianos expandem a memória TCD8 específico para NP147-155, um epítopo immunodominante do peptide de vírus da gripe a em ratos de Balb/c, que correlacionaram bem com o aumento Lise in vivo do NP147-155-células-alvo pulsadas31. Desde que a exposição aos superantígenos provoca a proliferação de pilha de T não-especificamente, seria altamente improvável demonstrar a citotoxicidade NP147-155-specific substancial usando 51ensaios da liberação de CR/LDH.

Em terceiro lugar, células-alvo pulsadas com peptídeos que se ligam à mesma molécula de classe I de MHC podem ser marcadas com diferentes doses de CFSE, misturadas e usadas em ensaios de citotoxicidade in vivo. A análise concomitante das funções de CTL para tais peptídeos não é uma opção em 51ensaios de liberação de CR/LDH.

Em quarto, os ensaios de citotoxicidade in vivo permitem estudos mecanísticos durante as fases de priming, efetor e RECALL das respostas da CTL. Por exemplo, a inoculação de células tumorais ou a vacinação antitumoral pode ser realizada em camundongos geneticamente alterados para avaliação da indução da CTL. Além disso, os esplenócitos dos ratos do Knock-in e do knock-out do gene podem ser usados como pilhas do alvo durante a fase efetor. Finalmente, vários agentes (por exemplo, inibidores farmacológicos e candidatos a medicamentos) podem ser administrados antes da escorva, durante a fase efetora, ou ambos. Conseqüentemente, os ensaios in vivo da citotoxicidade fornecem uma plataforma poderosa para o teste da eficácia da droga/vacina em um ajuste verdadeiramente in vivo. Neste corpo de trabalho, fornecemos exemplos de intervenções imunológicas que impulsionam as respostas in vivo da CTL (Figura 1 e Figura 2).

Como outros ensaios rotineiramente usados da matança, os ensaios in vivo da citotoxicidade não fornecem nenhuma informação direta a respeito da habilidade dos CTLs de recicl de um alvo a outro antes que se tornem esgotados. Além disso, nós testamos vários tipos de células tumorais como células-alvo potenciais em ensaios de citotoxicidade in vivo, embora sem sucesso até agora. Isto é simplesmente porque as pilhas do tumor não alcangam o spleen pelo menos em números detectáveis depois que são injetados i.v. Portanto, depender de esplenócitos do mouse como células-alvo pode ser considerada uma limitação inerente de ensaios de citotoxicidade in vivo. Destaca-se, no entanto, que os esplenócitos alvo transferidos adoptivamente podem ser facilmente encontrados em vários outros órgãos (além do baço), por exemplo, no fígado. Conseqüentemente, a função AG-específica de CTL pode ser avaliada em órgãos ou em tecidos múltiplos.

Nós otimizamos os ensaios de citotoxicidade in vivo para o exame de imunodominância em t AG-specific tCD8 respostas16,17. Inúmeras ferramentas e reagentes estão disponíveis para estudar essas respostas nos contextos de imunidade e terapia antitumorais. A linha celular do fibrosarcoma usada no protocolo descrito aqui (isto é, C57SV pilhas) não dá a ascensão aos tumores em ratos imuno-competentes. Conseqüentemente, é uma ferramenta útil em investigar a vacinação antitumoral. A transformação neoplástica de T AG-conduzida em tecidos seletos gerou diversos modelos valiosos do cancro autóctone. Por exemplo, camundongos SV11 que desenvolvem papilomas do plexo choróide dentro de seus ventrículos cerebrais35 não abrigam tCD8 endógeno t AG específico, porque essas células são selecionadas contra e excluídas no timo. Entretanto, transferir C57Bl/6 esplenócitos em ratos sublemente irradiados, tumor-tendo SV11 conduz ao controle prolongado dos tumores, que é relatado alegadamente associado com o escorva in vivo do local IV-específico TCD836,37 . No adenocarcinoma transgénico do modelo38da próstata do rato (tramp), o local IV-a resposta específica diminui afastado com progressão da malignidade. Entretanto, as pilhas TCD8 específicas do local de outra maneira immunorecessiva escapam a seleção negativa no timo e igualmente evitam mecanismos periféricos da tolerância21. Isso proporciona amplas oportunidades para intervenções terapêuticas experimentais que giram em torno das funções TCD8 específicas do site V. Os ensaios de citotoxicidade in vivo devem revelar-se informativos no estudo e potencialmente reverter a tolerância imunológica em vários sistemas de modelos, incluindo no modelo de reconhecimento T AG.

O immunodominance é uma característica consistente de respostas de TCD8 geradas não somente de encontro aos AGS do tumor mas igualmente para Epitopes patógenos-derivados. Na verdade, já utilizamos ensaios de citotoxicidade in vivo para estudar imunodominância em respostas anti-influenza T CD812. Conseqüentemente, o ensaio aperfeiçoado descrito neste protocolo pode ser modificado e usado em uma escala larga de aplicações imunológicas.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo canadense institutos de pesquisa em saúde (CIHR) concede MOP-130465 e PJT-156295 para SMMH. JC é parcialmente apoiado por uma rainha Elizabeth II bolsa de pós-graduação em ciência e tecnologia do Ministério de formação, faculdades e universidades de Ontário. CEM foi um receptor de uma bolsa de pós-graduação Alexander Graham Bell Canada (doutorado) do Conselho de ciências naturais e engenharia de pesquisa do Canadá (NSERC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Thermo Fisher Scientific 25200-056
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher Scientific A1049201
Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3) Bio X Cell BE0012
Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14) Bio X Cell BE0146
CFSE Thermo Fisher Scientific C34554
DMEM (1X) Thermo Fisher Scientific 11965-092
Fetal bovine serum (FBS) Wisent Bioproducts 080-150 Heat-inactivate prior to use
GlutaMAX (100X) Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (1M) Thermo Fisher Scientific 15630080 10 mM final concentration
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)  Thermo Fisher Scientific 11140-050
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Stock is 100X
Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2) SouthernBiotech 0116-01 Isotype control
Rat IgG1 (clone HRPN) Bio X Cell BE0088 Isotype control
Rat IgG1 (clone TNP6A7) Bio X Cell BP0290 Isotype control
Rat IgG2a (clone 2A3) Bio X Cell BP0089 Isotype control
RPMI 1640 (1X) Thermo Fisher Scientific 11875-093
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360-070 1 mM final concentration

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