用于筛查绝经后心血管功能障碍的外源雌激素治疗的活体雌激素缺乏小鼠模型

Biochemistry

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Summary

临床上,更年期妇女雌激素缺乏可能加重脂质紊乱和动脉粥样硬化的发生率。我们通过在apoE-/-小鼠的双背侧切口,通过双边卵巢切除术建立了体内雌激素缺乏模型。小鼠模型适用于绝经后心血管功能障碍的外源雌激素治疗。

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Sun, B., Yin, Y. z., Xiao, J. An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause. J. Vis. Exp. (150), e59536, doi:10.3791/59536 (2019).

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Abstract

绝经后妇女患心血管疾病的风险比绝经前妇女大。与卵巢功能完整的雌性小鼠相比,雌性小鼠在失异时出现卵巢切除术(OVX)增加了主动脉动脉粥样硬化的病变。然而,缺乏涉及雌激素缺乏小鼠的实验室模型,这些小鼠具有动脉粥样硬化的易发性状态。这种缺陷是至关重要的,因为更年期妇女的临床雌激素缺乏可能加剧先前存在的或持续的脂质紊乱和动脉粥样硬化的发生率。在这项研究中,我们通过双背侧切口在脂蛋白E(apoE)-/-小鼠中通过双边卵巢切除术建立了体内雌激素缺乏小鼠模型。然后,我们比较17°-雌二醇和伪原蛋白素(PPD)(植物雌激素)通过薄杉醇传播的内给的影响。我们发现,虽然PPD对降低OVX apoE-/-小鼠的最终体重和血浆TG有一定作用,但它具有抗动脉粥样硬化和心脏保护能力,与17°雌二醇相当。PPD是一种植物雌激素,已报告发挥抗肿瘤的特性。因此,该方法适用于通过口服给雌激素筛选植物雌激素,以取代绝经后妇女的传统激素替代疗法,据报告,这种疗法具有潜在的有害肿瘤遗传能力。通过木耳传播的口服给政是无创的,使其广泛适用于许多患者。本文包含通过 apoE-/-小鼠和 Peroral 17°-雌二醇或植物雌激素激素通过薄荷传播的双背侧切口进行双边卵巢切除术的逐步演示。血浆脂质和心血管功能分析使用超声心动图跟踪。

Introduction

流行病学和临床研究显示,绝经后妇女患心血管疾病的风险比绝经前妇女1、2要大得多。激素替代疗法(HRT)可降低心血管疾病的相对风险至0.37-0.79 3。在其他并发症中,由心血管疾病引起的动脉粥样硬化是全世界4.然而,缺乏涉及雌激素缺乏小鼠出现动脉粥样硬化倾向状态的实验室模型。该协议提供了一个体内雌激素缺乏小鼠模型,用于筛查绝经后心血管功能障碍的外源性雌激素治疗。

先前的研究表明,在高胆固醇饮食中应用OVX在动脉粥样硬化啮齿动物中可以模仿绝经后妇女患有动脉粥样硬化5、6、7、8。一种类似更年期女性动脉粥样硬化状态的可重复和方便的动物模型是外源雌激素研究的基础。在这里,双侧侧切口的双边卵巢切除术被应用于动脉粥样硬化易脂蛋白E敲除(apoE-/-)小鼠9,10。与中腹或背侧切口相比,双背侧切口是一种更容易、更省时的方法,可以避免严重的腹腔粘附和炎症。通过薄荷传播(见材料表)的渗透管理是非侵入性和方便的,使其广泛适用作为一个长期管理模式11。慢释放颗粒植入也很受欢迎6。然而,植入物可能会加重感染的发生率,特别是在接受OVX的小鼠中。其他非侵入性管理模式,如口腔口和供水管理,也有许多缺点。口腔食道通常对小鼠造成压力,并可能导致食管损伤。通过饮用水管理激素是非常有益的;然而,添加DMSO作为乳化剂是不可避免的,因为外源雌激素不溶于水。在这里,我们选择通过长期给政用的薄荷替代17°-雌二醇或植物雌激素激素。

最近,HRT对绝经后妇女心血管系统的有益作用在妇女健康倡议(WHI)试验12中受到质疑。一方面,仅外源雌激素对心血管系统有有益的影响;另一方面,它可以与醋酸甲酰乙酰丙酮结合,增加心血管事件的风险。更严重的是,HRT可能导致乳房和子宫肿瘤进展,这种效果已经明显限制了其使用13,14。更多的兴趣集中在肿瘤细胞15、16、17中缺乏线粒体活性的外源雌激素的心血管保护作用上。对人类和动物的多项研究表明,具有与雌激素结构相似的植物雌激素在心血管保护方面可以发挥有益的作用。

因此,本工作的目标是(i) 通过双背侧切口在 apoE-/-小鼠中通过双边卵巢切除术建立体内雌激素缺乏小鼠模型,以及 (ii) 比较血管保护作用施用17°-雌二醇和伪丙二醇(PPD),通过薄荷传播。17°-雌二醇是一种外源雌激素,属于女性性激素6,11,19。PPD,一种来自迪奥斯科卡植物的类固醇皂苷和植物雌激素,以前曾被报道具有抗肿瘤的特性20。

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Protocol

所有动物护理和实验规程均经中国医学科学院动物护理与使用委员会和北京协和医学院批准(许可号:SYXK(北京)2013-0023)。apoE-/-小鼠的起源是C57BL/6J9,10。

1. 通过 apoE 中的双侧切口进行双边卵巢切除术-/-小鼠

  1. 在产间(年龄28天),用避免素(三溴二苯醚乙醇;200毫克/千克;腹内)麻醉雌性apoE-/-C57BL/6J小鼠。
    注:32个apoE-/-小鼠被随机分为4组:SHAM、OVX、OVX/E2和OVX/PPD组(n = 每组8个)。
  2. 将动物置于加热垫上的易发位置。在麻醉期间涂抹眼部润滑剂,保护眼睛。
  3. 将体温保持在36~0.5°C以内。将镇痛卡洛芬的5mg/kg体重分皮下至小鼠颈部的侧向。
  4. 从 iliac 峰顶上切下 3 x 5 cm2小鼠区域头象。在用3 x 5 cm2孔径手术片覆盖动物之前,用碘彻底清洁剃光区域,然后使用70%乙醇清洁。在实验过程中使用无菌仪器和手套。
  5. 使用剪刀和钳子使切口1厘米横向到中线和1厘米侧到成本肋骨。
  6. 用钳子模糊地解剖皮下组织。
  7. 使用解剖护目镜(见材料表)识别腹腔内的白色脂肪组织。
  8. 使用微剪刀和微钳通过筋膜进行0.5-1厘米切口,直到腹腔到达。
    注:对于假操作的团体,直接关闭伤口。使用单丝缝合线分别缝合肌肉层和皮肤。
  9. 当可以看到腹腔内的白色脂肪组织时,用微钳抓住脂肪组织,然后轻轻地将其拉出。可以看到一个粉红色的桑形卵巢,包裹着腹腔的脂肪组织。
  10. 使用单丝缝合线将 0.5-1 厘米近端容器和子宫角倾斜。使用微剪刀取出卵巢,并将剩余的组织放回腹腔。
    注:OVX手术的主要不良症状是输尿管结扎,导致OVX手术小鼠死亡率高。这可以通过使用解剖护目镜识别组织来避免。
  11. 把伤口关上使用单丝缝合线分别缝合肌肉层和皮肤。
  12. 使用剪刀和钳子使另一个切口 1 厘米横向到中线和 1 厘米横向到另一侧的成本肋骨。重复上述步骤(1.5 至 1.11)。
  13. 让动物从麻醉中醒来。另外,在手术后的第一天保持鼠标。
  14. 在恢复阶段经常清洁或更换保持架。
  15. 手术后约24小时,再施用5毫克/千克的镇痛卡洛芬皮下体重。

2. 通过黑桃传播对17°-雌二醇或PPD的口服管理

  1. 彻底溶解芝麻油中的17°-雌二醇或PPD,然后将芝麻油与薄荷粉混合(见材料表)。每只30克小鼠的每日份量包含3μg的17μ-雌二醇或15μg的PPD,4μL的芝麻油,和60毫克的薄荷传播。准备安慰剂每30克小鼠含有4μL芝麻油和60毫克的薄荷蔓延。
    注:17-雌二醇或PPD的每日分管部分基于先前的研究6、11和初步实验。
  2. 在OVX一周后,用高胆固醇饮食(1.25%胆固醇,0%的乔拉)喂小鼠12周。研究中使用的一种典型的实验治疗方案如图1所示。
  3. 在第4周,在2-5只小鼠的口服前5天,训练小鼠食用含有约30毫克薄荷的安慰剂,为2-5只小鼠传播5天。在头3天,在家里的笼子里对老鼠进行分组训练。在训练的第四天和第五天将小鼠放在单独的笼子里,每天提供与实验情况相似的部分。
  4. 在过去9周中,将小鼠放入单独的笼子,然后每天为每个喂食场合提供薄荷的扩散部分。
    注:每日份量含有17μ-雌二醇(0.1毫克+千克-1)或PPD(0.5毫克+千克-1),分别通过OVX/E2和OVX/PPD组传播的栗子;每日份量含有无激素的薄荷,在SHAM和OVX组传播。

3. 使用微超声系统测定Intima-媒体厚度和心脏功能障碍

  1. 超声学生物显微镜
    1. 终止前一天,使用微超声系统(见材料表)检查宫内介质厚度和心脏功能障碍,如前所述21。
    2. 在检查之前,给每只小鼠注射200毫克/千克的腹内注射,作为麻醉剂(n = 每组8只小鼠)。
    3. 小心地细细地把每只老鼠的颈毛洗过。自由应用暖超声传输凝胶,以确保最佳的图像质量。
    4. 以 12.7 mm 对焦和 40 μm 的分辨率,通过 30 MHz 扫描头获取主动脉根和上升主动脉的基线超声图像。
    5. 使用带铅 II 配置的心电图进行监测。
    6. 在 systole 的一个平面中捕获上升主动脉、主动脉拱和胸腔头动脉分支的右半身长轴图像(图 3)。
  2. 内蒂玛介质和最大斑块厚度的测量
    1. 轻松调整传感器与动脉部位之间的距离,以获得清晰的图像。
    2. 将 10 s cine 循环以数字方式存储,以便离线检查在图像分析系统上。
    3. 手动选择最佳的冻结帧超声图像,以便进行进一步测量。检查升序主的次要曲率中的图像。如果可以看到上升主塔中的斑块,则测量最大斑块厚度。如果无法看到上升主塔中的斑块,则测量最大 IMT。
    4. 测量 IMT(血管发光-中间接口和中间-机会界面之间的距离)。测量最大斑块厚度(血管流明和冒险层边界之间的最粗距离)。
    5. 来自三个病变部位的平均数据(图3)。
  3. 使用超声心动图确定心脏功能障碍
    注:
    使用微超声系统通过超声检查心脏功能,如前所述22。
    1. 将超声波束指向心脏,靠近毛细管肌肉。
    2. 实现基于二维心电图的千赫兹可视化。
    3. 使用 30 MHz 扫描头在左心室进行体内异胸超声心动图。
    4. 从 M 模式跟踪以数字方式测量与心脏功能相关的参数。
    5. 平均三到五个心脏周期的数据(表1)。
  4. 观察员内和观察员间变异性
    1. 要验证观察者内变异性,请由一个操作员在两个不同场合分析数据。
    2. 要评估观察者间的可变性,请由不同的运算符分析数据。

4. 每周体重测量和血浆总胆固醇 (TC) 和甘油三酯 (TG) 测定

  1. 每周体重测量
    1. 从 -1 周到第 12 周,每周测量一次体重。
      注:n = 每组8只小鼠。
  2. 等离子体制备
    1. 在通过心脏内穿刺采集血液样本之前,准备注射器和管子。使用 EDTA 作为抗凝剂。将 10 μL 的 0.5 m EDTA 添加到每 2 mL 注射器中,并在每根 1.5 mL 管中加入 8 μL 0.5 m EDTA。
    2. 在第12周,在一夜禁食后,用苯(三溴二苯乙醇;200毫克/千克;腹内)对小鼠进行麻醉。
      注:n = 每组3个小鼠。
    3. 用70%乙醇准备腹腔胸腔区域。
    4. 使用剪刀和钳子打开胸腔,切断肋骨,直到跳动的心脏暴露。
    5. 将 25 G 针头插入右心室。缓慢吸气,直到血液开始流入注射器。
      注:我们使用一次性注射器在无菌条件下与25G针(见材料表)。
    6. 继续吸气,稳定,均匀的压力。如果没有血,重新定位针头并重复吸入。
    7. 在收集所需的血量之前,让小鼠进行深度麻醉。通常,可以采集高达 1 mL 的血液。在这种深层麻醉条件下,通过宫颈错位使小鼠安乐死。
    8. 将血液样本放入1.5 mL管中,彻底倒置血液,以确保将EDTA混合到血液中。然后立即将血液样本放在冰上。
    9. 在收集后 30 分钟内在 4°C 下 400 x g下进行 20 分钟的离心样品。
    10. 仔细收集上清液。将等离子样品储存在-80°C。
  3. 为 TC 或 TG 内容测量构建标准曲线
    1. 对于 TC 标准曲线,准备各种浓度的胆固醇标准:0 mmol/L、0.52 mmol/L、1.03 mmol/L、2.07 mmol/L、4.14 mmol/L、6.20 mmol/L、8.27 mmol/L 和 10.34 mmol/L. 测量每个胆固醇标准。为每个胆固醇标准设置平均 O.D.。作为垂直 (Y) 轴值,将浓度设置为水平 (X) 轴值。使用统计软件创建标准曲线。
    2. 对于 TG 标准曲线,准备各种浓度的 TG 标准:0 mmol/L、0.45 mmol/L、0.90 mmol/L、1.81 mmol/L、3.62 mmol/L、5.42 mmol/L、7.23 mmol/L 和 9.04 mmol/L. 测量 O.将每个 TG 标准的平均 O.D. 设置为垂直 (Y) 轴值;将浓度设置为水平 (X) 轴值。使用统计软件创建标准曲线。
      注:本研究对标准曲线构造采用了四参数物流曲线拟合(4-pl)。在测量等离子样品之前,请检查标准曲线,并确保 r2大于 0.995。
  4. TC 含量测量
    1. 将 TC 测定试剂盒中的彩色试剂瓶 (25 mL) 标记为"TC 工作解决方案"。
    2. 短暂涡旋冷藏样品。在蒸馏水中制备稀释:在80μL蒸馏水中20μL的血浆。短暂涡旋稀释。
    3. 在 96 孔板的适当孔中加入 2.5 μL 的胆固醇标准(5.17 mmol/L)或稀释血浆的 2.5 μL 或 2.5 μL 蒸馏水(空白)。建议进行三次处理。
    4. 对所有油井添加250μL的颜色试剂。
    5. 在37°C孵育10分钟。
    6. 打开微孔板读卡器,让 10 分钟预热。
    7. 从培养箱中取出板,并在 510 nm 处读取微孔板读片器。确保微小井或板底部分别无气泡或灰尘。
    8. 计算 TC 浓度如下:
      TC con. = 胆固醇标准= (血浆样本 O.D.-空白 O.D)/(胆固醇标准 O.D.空白 O.D.
  5. TG 含量测量
    1. 将 TG 测定试剂盒中的彩色试剂瓶 (25 mL) 标记为"TG 工作解决方案"。
    2. 短暂涡旋冷藏样品。
    3. 将 2.5 μL 的 TG 标准 (2.26 mmol/L) 添加到稀释的等离子体或 2.5 μL 的蒸馏水(空白)中,以至 96 孔板的适当孔中。建议进行三次处理。
    4. 对所有油井添加250μL的颜色试剂。
    5. 在37°C孵育10分钟。
    6. 打开微孔板读卡器,让 10 分钟预热。
    7. 从培养箱中取出板,并在 510 nm 处读取微孔板读片器。
      注:确保微小井或板底部没有气泡或灰尘。
    8. 计算 TG 浓度如下:
      TG 公司 = TG 标准= (等离子样品 O.D.空白 O.D)/(TG 标准 O.D.空白 O.D)

5. 主动脉动脉粥样硬化病变的面分析

  1. 大数隔离和切除
    1. 在第12周,在一夜禁食后,用苯(三溴二苯乙醇;200毫克/千克;腹内)对小鼠进行麻醉。在这种深层麻醉条件下,通过宫颈错位使小鼠安乐死。
      注:我们每组使用3只老鼠。
    2. 用70%乙醇准备腹腔胸腔区域。使用剪刀和钳子打开胸腔,切断肋骨,直到跳动的心脏暴露。
    3. 在pH 7.4处用磷酸盐缓冲盐水填充50 mL注射器(见材料表)。将 25 G 的针头插入左心室,并切割右心房,以避免灌注产生的高压。
    4. 以0.05-0.08 mL/min的流速在原位灌注。用组织吸收灌注液。
    5. 用剪刀和钳子切除胸腔的肋骨和肺。然后,打开腹腔,取出里面的器官,以更好地查看主塔。
    6. 用微钳固定心脏,用微剪刀将主干从脊柱上分离,直到脊柱分叉,从而去除主干。
      注:解剖肾脏心房支附近时,使用微剪刀切开,以避免主塔损伤。
    7. 修复心脏和主塔48小时在4%的甲醛。主数在室温下或2-8°C将主数储存在盐水中几个小时。
      注:此过程将促进清洁。
  2. 大数的准备
    1. 取出心脏。在立体显微镜下,使用微钳和微剪刀小心地从主间中取出新食组织。在清洁过程中使用盐水保持组织湿润。
      注:小心不要撕裂或刻痕主动脉和一些重要的分支,如不分大动脉,左普通胡萝卜动脉,左下环动脉。
    2. 留下1毫米的内分,留下常见的胡萝卜动脉,切断整个左下腺动脉。
    3. 通过不分动脉切开外曲率,然后切至左侧常见的胡萝卜动脉,然后切至左侧亚克隆动脉。
    4. 沿着上升部分的内部曲率切开腹部底部。
    5. 将主盘固定到黑色塑料布上,并涂抹盐水,防止主干干燥。
  3. 主塔内点区域的图像
    1. 用立体显微镜拍摄面部大数的照片。在图像中包括一毫米刻度标尺以校准测量值。
    2. 在同一图像中包括弓形和胸腔区域,在另一个图像中包括腹部区域。将图像另存为 JPEG 或 TIFF。
      注:拱区是从心肌的交界处到3毫米远端从左下环动脉,胸区域是3毫米远至左下环动脉到最后一个间动脉,腹部区域是最后一个成本间动脉到伊利亚克分 岔。
  4. 动脉粥样硬化病变面法的定量
    1. 校准
      1. 使用图像分析软件打开图像(参见材料表),转到空间校准并按照说明进行操作。
      2. 通过将标尺定位在线条上,将参考单位更改为 mm。
    2. 测量
      1. 为每个图像设置正确的校准。
      2. 在尺子上测量 3 mm。
      3. 拱形和胸腔区域测量:从心肌结点到3毫米远端,从左下瓣动脉和胸腔区域从3毫米远端到左下尾动脉到最后一条间动脉,勾勒出拱区。在拱门和胸腔区域跟踪病变,并通过显微镜观察主塔。
      4. 腹部区域测量:勾勒出从胸腔区域末端到腹腔分叉的腹部区域。腹部区域的痕量病变,并通过显微镜观察主塔。
      5. 计算相对于主塔内表面的病变面积。
      6. 通过对研究组视而不见的第二个观察者验证定量。

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Representative Results

研究中使用的一种典型的实验治疗方案如图1所示。在产间(年龄28天),雌性apoE-/-C57BL/6J小鼠用非他林(三溴二苯醚乙醇;200毫克/千克;腹内)进行麻醉。小鼠通过1厘米背切口进行双边OVX或假手术。在双边OVX一周后,小鼠被喂食高胆固醇饮食(1.25%胆固醇,0%乔拉)12周。17°-雌二醇(0.1毫克+千克-1)或PPD(0.5毫克+kg-1)在治疗的最后9周内通过薄桃传播平行施用。所有老鼠每周都称重。如图2所示,评估了雌激素缺乏后外源雌激素(17°-雌二醇和PPD)对血浆脂和apoE-/-小鼠每周体重的影响。经过12周的高胆固醇饮食,OVX小鼠的血浆TC和TG浓度明显增加。OVX小鼠通过薄角传播以17°-雌二醇或PPD口服,其血浆TC浓度明显低于假操作小鼠(图2A)。OVX小鼠的血浆TG水平下降,使用17°-雌二醇,但不使用PPD(图2B)。如图2C所示,与假动小鼠相比,OVX小鼠的体重增加(BW)有增重趋势,而OVX小鼠体内的BW在高胆固醇饮食后通过17°-雌二醇或PPD通过薄荷传播进行口服。在OVX小鼠中表现出相反的趋势。然而,不同组小鼠的最终体重没有显著变化。

使用超声心动图评估心血管功能。如图3所示,在OVX小鼠中测量上升主数的最大斑块或IMT,通过17°-雌二醇或PPD通过薄角传播进行内给。B模式超声心动图观察了高胆固醇饮食-/-小鼠的主动脉弓。超声生物显微镜拍摄了上升主方的代表性纵向图像。红色箭头表示斑块。与假操作小鼠相比,OVX 小鼠表现出上升主大肠的最大斑块或 IMT 增加。在通过木耳传播对17°-雌二醇或PPD进行均匀分量后,与OVX小鼠相比,上升主大肠的最大斑块或IMT显著减少。(图3)我们还观察到在12周高胆固醇饮食喂养后对OVX反应的心脏功能障碍-/-小鼠(表1)。通过超声心动图检查心脏功能。在OVX小鼠中,通过紫杉醇传播对17°-雌二醇或PPD进行渗透,可以部分衰减显示心脏功能障碍的参数。

接下来,我们使用面部分析来确定主动脉粥样硬化病变。如前所述,12周后,高胆固醇饮食导致主动脉的亮度表面形成动脉粥样硬化斑块。如图4所示,OVX小鼠主动脉病变面积相对于整个主动脉区域的平均百分比显著增加。在通过17°-雌二醇或PPD通过薄荷传播进行过部后,主动脉病变面积与OVX小鼠相比明显减少。这一结果与图3所示的17°-雌二醇或PPD对动脉粥样硬化的发育的保护是一致的。

最后,建议的程序,使用双边卵巢切除术,通过双背侧切口在apoE-/-小鼠,适用于筛查绝经后心血管功能障碍的非侵入性外源雌激素治疗。它还特别适用于避免有害的肿瘤遗传能力。

Figure 1
图 1.小鼠治疗方案。在产间(年龄,28天),雌性apoE -/-C57BL/6J小鼠用避免素(三溴二苯醚乙醇;200毫克/千克;腹内)进行麻醉。小鼠通过1厘米背切口进行双卵细胞化(OVX)或假手术。在OVX一周后,老鼠被喂食高胆固醇饮食(1.25%胆固醇,0%乔拉)12周。17°-雌二醇(0.1毫克+千克-1)或PPD(0.5毫克+kg-1)在治疗的最后9周内通过薄桃传播平行施用。每周给老鼠称重。在第12周,使用超声心动图评估心血管功能分析。经过12周的高胆固醇饮食后,所有小鼠都被安乐死,血液样本和组织被采集,以便进一步调查。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2.各种外源雌激素对血浆脂和每周体重在apoE-/-小鼠的影响。沙姆老鼠接受了模拟手术,并接受了高胆固醇饮食。OVX小鼠进行双边卵巢切除术,然后随机分为以下组:OVX组,用高胆固醇饮食治疗;OVX/E2(17°-雌二醇)组,接受高胆固醇饮食12周,加上0.1毫克/千克E2通过过去9周治疗传播的过口服给液;和OVX/PPD组,接受高胆固醇饮食12周加0.5毫克/千克PPD通过通过单部给给通过薄荷传播的最后9周的治疗。血浆的总胆固醇和甘油三酯水平通过酶法(A-B)测量。数据以均值 = SEM n = 每组 5 个小鼠表示。每周体重从 -1 周到第 12 周 (C) 测量。数据以均值 = SEM n = 每组 8 个小鼠表示。单向ANOVA,然后是Dunnett的后位测试进行多次比较。*p < 0.05 与假组相比;#p < 0.05 与 OVX 组相比。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3.IMT 或最大斑块厚度测量在 apoE-/ -小鼠。介绍了B模式图像,显示apoE-/-小鼠的主动脉拱。上升主方的纵向图像是通过超声学生物显微镜获得的。测量了上升主塔(mm)的最大斑块或IMT。超声图像显示上升主塔的轻微曲率中的斑块;红色箭头表示斑块。数据以 n = 每组 8 个小鼠的平均值 = SEM 表示。单向ANOVA,然后是Dunnett的后位测试进行多次比较。*p < 0.05 与假组相比;#p < 0.05 与 OVX 组相比。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4.对apoE-/-小鼠主动脉粥样硬化病变的面分析。主动脉病变区域相对于整个主动脉区域的平均百分比在所有组中均进行了量化。显示了主塔的内伤病变(面部)的代表性显微图。数据以 n = 3 个小鼠的平均值 = SEM 表示。单向ANOVA,然后是Dunnett的后位测试进行多次比较。*p < 0.05 与假组相比;#P < 0.05 与 OVX 组相比。请点击此处查看此图的较大版本。

OVX OVX/E2 OVX/PPD
LVIDd (毫米) 3.72 ± 0.10 3.74 × 0。24 3.68 ± 0.16 3.88 × 0.16
LVD (毫米) 2.34 ± 0.11 2.16 × 0.22 2.12 ± 0.13 2.55 × 0.12×
IVSd (毫米) 0.83 ± 0.09 0.84 × 0.07 0.91 ± 0.05 0.74 × 0.06|
IVS (毫米) 1.24 ± 0.02 1.35 ± 0.06° 1.45 × 0.04× 1.09 ± 0.04|
PWTd (毫米) 0.7× 0.10 0.68 × 0.04 0.72 × 0.07 0.58 × 0.07|
PWT (毫米) 1.10 ± 0.12 1.17 ± 0.08 1.24 ± 0.04 0.98 × 0.08|
EDV (毫米3) 58.89 × 3.74 59.88 × 9.02 57.39 × 5.79 65.11 × 6.13
ESV (毫米3) 18.86 × 2.17 15.75 × 4.00 14.85 × 2.37 23.45 × 2.64|
EF (%) 67.84 × 1.52 73.91 [3 .63] 74.23 ± 1.50 63.91 × 3.61|
FS (%) 37.19 × 1.53 42.22 ± 1.17° 42.36 × 1.21 34.28 × 2.69|
LVIDd = 在直径期间的 LV 内径;LVID = LV 内径在 systole 期间;IVSd = 内部心室隔膜在透析期间;IVS = 内部心室隔膜在阴囊期间;PWTd = 隔膜期间的后壁厚度;PWTs = 在期间的后壁厚度 ;EF = 弹出分数;FS = 分数缩短;EDV = 端分体积;ESV = 端收缩体积。

表1:使用超声心动图进行心脏功能评估。从 M 模式跟踪以数字方式与心脏功能相关的参数在所有组中进行了量化。数据以 n = 每组 8 个小鼠的平均值 = SEM 表示。单向ANOVA,然后是Dunnett的后位测试进行多次比较。*p < 0.05 与假组相比;#p < 0.05 与 OVX 组相比。

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Discussion

这里描述的方法类似于在更年期妇女看到的脂质紊乱和动脉粥样硬化的小鼠模型。有充分证据表明,绝经后妇女的雌激素缺乏会加重先前存在或持续的高胆固醇血症的发病率,并逐渐复杂和广泛地出现动脉硬化病变1。为了模拟临床上容易发生动脉粥样硬化的情况,应用了缺乏动脉硬化的小鼠,这是一种可重复和方便的动物来源,用于研究23、24、25。如本研究所示,与卵巢功能完整的雌性apoE-/-小鼠相比,雌性OVX apoE-/-小鼠在分阴的动脉瘤中表现出动脉粥样硬化病变的增加。在这个动物模型中,我们还比较了各种外源雌激素替代疗法在受控饮食条件下对动脉粥样硬化病变大小的影响。

本文中介绍的双边卵巢切除术的双背侧切口在技术上更容易、更省时、更安全,与中背侧切口或中侧腹切口相比,在apoE-/-老鼠。通过中腹切口的双边卵巢切除术有一个主要缺点:它可能导致严重的腹腔粘附,进而影响药物的吸收。最近的报告显示,口服低剂量17°-雌二醇可预防脑缺血26。因此,我们选择通过本研究中传播的薄荷进行渗透管理。商业缓释颗粒是一种常用的管理模式,用于在小鼠模型中测试药理作用,但可能造成有害的脑损伤27。植入物容易感染,特别是如果小鼠通过双背侧切口接受双边OVX。虽然在切口前对皮肤进行仔细消毒,但感染是难以避免的。水管理和口服水是两种使用不太频繁的方法,已经过测试。通过饮用水管理激素是非常有益的,因为它是非常无创的,因为几乎不需要动物处理。然而,17°-雌二醇不溶于水,没有乳化剂。因此,我们使用浓度低于0.5%的DMSO,以方便其在饮用水中的溶液。然而,这种方法用于长期施用低剂量DMSO是难以控制和有毒的小鼠或人类。老鼠也可能在整个24小时的监测中喝水,这使得实际药物消耗难以确定。这种方法的另一个缺点是,个人取水量难以控制。口腔食道的最大缺点是,它给动物带来压力,并可能导致食管损伤,影响饮食行为。在本文描述的方法中,在实验前进行了为期5天的无激素花生传播训练。大约95%以上的小鼠将接受薄荷传播,如果训练在协议部分中提到的。一旦完全习惯,大多数老鼠会在几秒钟内消耗它。与先前的研究6,11一致,OVX小鼠的血浆E2水平与第4周假操作的对应物相比有所下降(数据未显示)。在确定后的第12周,我们观察到OVX手术小鼠子宫萎缩。然而,在本研究中OVX之后,没有监测循环雌激素水平。

在未检测到上升主动脉中的动脉粥样硬化病变的情况下,可以通过测量流明-中间界面与中端-发现界面之间的距离来评估主动脉IMT。这种测量是基于先前验证的人类28协议。来自三个站点的平均数据彼此相距约 100 μm。apoE-/-小鼠的OVX后心脏负荷增加,可能是由于单个心肌细胞的补偿性肥大增长,最终可能导致心脏输出增加(表1)。然而,在PPD的口服下,9周,补偿性心脏肥大衰减,EF%与假对应物相当。为了验证观察者内部或观察者间变异性,分析两个不同场合的一名操作员或不同操作员的动脉粥样硬化厚度测量和与心脏功能相关的参数的变异系数。

如我们的研究所介绍的,OVX小鼠通过薄角传播,通过17°-雌二醇或PPD口服,这往往会防止体重增加,减少雌激素缺乏相关的脂质紊乱,尽管最终体重没有显著差异。观察。先前的研究也表明,脂质参数的变化可能太小,无法解释激素抗动脉粥样硬化作用29。雌激素的有益作用并不限于脂蛋白特性的变化。雌激素30、31的一些非脂质作用,如炎症、内皮功能障碍和血液动力学停滞,可促进人类心血管疾病的心血管保护。考虑到本研究观察到的结果,对外源性雌激素的预防从动脉粥样硬化发展是部分独立于全身脂质水平。在内皮细胞中,PPD抑制粘附分子和炎症介质的表达(未显示数据)。此外,PPD可以抑制与内皮抗收缩密切相关的血管外脂肪形成。因此,PPD和17°-雌二醇的作用是不同的,其基本机制需要进一步探讨。毫无疑问,过度食用富含能源的食物,如胡桃,可能会导致体重增加。然而,本研究中提到的少量的薄荷(200毫克=kg-1=天-1)只能造成动物每日能量摄入的不到5%。此外,没有检测到明显的体重增加,通过使用这个数量的薄荷传播。使用17°分二醇和PPD主要用于心血管疾病的治疗。因为,在OVX手术的aopE-/-小鼠动脉粥样硬化过程中,从第4周到第12周,17°-雌二醇或PPD被口服。

HRT临床使用的一个不可忽视的点是其有害的副作用,包括卵巢癌和乳腺癌13,14。本研究中测试的植物雌激素是在迪奥斯卡植物中发现的类固醇皂苷化合物。据报道,PPD对某些癌细胞系抑制作用20。此外,PPD显示了与17°-雌二醇相当的抗动脉粥样硬化特性。我们目前介绍的模型可以帮助筛选潜在的候选化合物,包括植物雌激素,这对肿瘤增殖的影响最小。

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Disclosures

提交人声明没有利益冲突。

Acknowledgments

这项工作得到了国家自然科学基金(81202526至J.X.)、中国国家自然科学基金(81302769至B.S.)、北京市自然科学基金(47144226至B.S.)的支持。科学基金会(201110490325 至 J.X.)和中国教育部博士计划基金会 (201211106120031 至 B.S.)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17β-estradiol, >98% Sigma-Aldrich E8875-250MG Estrogen
Disposable syringes (with 25 G needles) Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd 0.5*19TWLB Cardiac bleeding
High-cholesterol mouse diet Huafukang Bio-Technology N/A 1.25% cholesterol, 0% cholate
High-Resolution In Vivo Micro-Imaging System VisualSonics Vevo®770 Measurements of intima-media thickness and cardiac dysfunction
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463-250ML Preparation of avertin
Micro Dissecting forceps, Curved 8mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting forceps, Straight 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Monofilament suture 4-0 1/2 5 x 12 19 mm Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd R413 Suture and ligation of the tissues
Nut cream (Nutella) Ferrero N/A Medium for peroral 17β-estradiol or PPD
OptiVisor optical glass binocular magnifier Dohegan Optical Company Inc. N/A Assistant of identifying the tissues during ovariectomy
Phosphate-buffered saline at pH 7.4 SIGMA P3813 Preparing 1 L saline
Pro MultiLabel Microplate Reader Tecan Infinite M1000 Plasma TC and TG determination
Pseudoprotodioscin Shanghai Winherb Medical S & T Development W-0427 CAS registry no. 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mL Pfizer Pharma GmbH 462986 Postoperative analgesia after ovariectomy
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547-1L Dissolving the 17β-estradiol or PPD
Solcoseryl Eye-Gel Menarini, Solco Basle Ltd. Eye protection during anesthesia
Stereo microscope MCALON MCL-6STV Image of the intimal region of aorta
Table model high speed centrifuge SIGMA 1-14K Preparation of plasma
Scissors, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Scissors, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402-5G Preparation of avertin
Triglycerides (TG) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A110-1 Plasma TG determination
Total cholesterols (TC) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A111-1 Plasma TC determination

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References

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